DE60312497T2

DE60312497T2 - Verwendung von protein maba (fabg1) aus mycobacterium tuberculosis zur herstellung und nachweis von antibiotika

Info

Publication number: DE60312497T2
Application number: DE60312497T
Authority: DE
Inventors: Annaik Quemard; Gilles Labesse; Mamadou Daffe; Hedia Marrakchi; Dominique Douguet; Martin Cohen-Gonsaud; Stephanie Ducasse
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite de Montpellier I; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite de Montpellier I; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 2002-03-29
Filing date: 2003-03-28
Publication date: 2007-09-20
Anticipated expiration: 2023-03-29
Also published as: FR2837836A1; AU2003258723A1; US20100240084A1; EP1490491A2; EP1490491B1; WO2003082911A2; US20060035294A1; DE60312497D1; WO2003082911A3; ATE356872T1; ES2283790T3; FR2837836B1; AU2003258723A8

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft hauptsächlich die Verwendung von Protein MabA und abgeleiteten Proteinen und insbesondere die kristallographischen Eckdaten dieser Proteine im Rahmen der Durchführung von Verfahren zum Designen und Screenen von Liganden dieser Proteine, vorteilhaft von die enzymatische Aktivität dieser Proteine hemmenden Liganden, nämlich Antibiotika, die bei der Behandlung von Mykobakteriosen verwendet werden können.
Die Tuberkulose ist eine der Hauptursachen der Sterblichkeit durch einen einzigen Infektionserreger, Mycobacterium tuberculosis. Außerdem ist seit etwa fünfzehn Jahren ein erneutes Aufflackern dieser Krankheit in den industrialisierten Ländern zu verzeichnen. Dieses Phänomen steht zum Teil mit dem Aufkommen antibiotikaresistenter Tuberkelstämme im Zusammenhang. So ist das Designen neuer Medikamente gegen Tuberkulose eine von der Weltgesundheitsorganisation erklärte Priorität geworden.
Die Angriffsziele der derzeit klinisch verwendeten Antibiotika gegen Tuberkulose gehören den Stoffwechselvorgängen zur Biosynthese der Hüllenbestandteile des Tuberkelbakteriums an. Insbesondere ist das Angriffsziel des Isoniazids (INH), eines Antituberkulotikums der ersten Wahl, an der Synthese von sehr langkettigen Fettsäuren (C60-C90), den Mykolsäuren, beteiligt. Das Isoniazid hemmt die Aktivität des Proteins InhA, das einem Enzymkomplex, FAS-II, angehört, dessen Funktion es ist, durch aufeinanderfolgende Verlängerungszyklen langkettige (C18-C32) Fettsäuren zu erzeugen, die Vorstufen von Mykolsäuren sind. InhA, eine 2-trans-Enoyl-ACP-Reduktase katalysiert die vierte Phase eines Verlängerungszyklus, der vier Phasen umfasst. Das INH ist ein Prodrug, das mit dem Coenzym von InhA, dem NADH, einen Addukt-Hemmstoff, INH-NAD(H), bildet. FAS-II umfasst mindestens 3 weitere Hauptenzyme, die folglich potenzielle Angriffsziele neuartiger Antibiotika darstellen. Das Protein MabA katalysiert die zweite Phase des Zyklus.
Die vorliegende Erfindung schafft Verfahren für das Designen von Antibiotika zur Behandlung von mykobakteriellen Infektionen, insbesondere Tuberkulose. Diese Erfindung steht im Zusammenhang mit dem Gen mabA (fabGl, Rv1483) von Mycobacterium tuberculosis, mit dem Produkt dieses Gens, das Protein MabA (FabG1), sowie mit Material und Methoden, die zur Produktion des Proteins in großer Menge, zur Bestimmung seiner dreidimensionalen Struktur im atomaren Bereich und zur Untersuchung seiner Wechselwirkungen mit verschiedenen Liganden oder ihres Einflusses auf seine enzymatische Aktivität verwendet werden. Die Erfindung hat zum Grundsatz, das Protein MabA als Antibiotika-Angriffsziel zu nutzen; insbesondere wird die Untersuchung der Wechselwirkung von MabA mit verschiedenen Liganden oder ihres Einflusses auf seine enzymatische Aktivität durch verschiedene Verfahren genutzt, um die enzymatische Aktivität von MabA hemmende Stoffe zu ersinnen.
Die vorliegende Erfindung liefert die methodologischen Werkzeuge und Ausrüstungen, die für das Designen von Molekülen erforderlich sind, die potenzielle Antibiotika gegen Mykobakterien und Antituberkulotika darstellen.
Die vorliegende Erfindung stellt das biologische Material und die Methodologien bereit, die für die Herstellung und die Aufreinigung, bei großen Mengen, eines potenziellen Angriffsziels von Antibiotika gegen Tuberkulose, des Proteins MabA, erforderlich sind. Außerdem können diese Schritte durch die Überproduktion von mit einem poly-Histidin-Tag versehenem MabA in Escherichia coli und seine Aufreinigung in einem einzigen Schritt durch Metallchelat-Chromatographie, wobei sich ein Protein mit einer hohen Reinheit ergibt, sehr schnell durchgeführt werden. Die Menge und die Qualität des gereinigten Proteins ermöglichen, zuverlässige Ergebnisse bei Untersuchungen der enzymatischen Aktivität oder der Anbindung von Liganden zu erhalten; sie ermög lichen aber auch die Kristallisation des Proteins, um seine dreidimensionale Struktur aufzuklären. Das Schaffen von Bedingungen, die das Erstarren von MabA-Kristallen in flüssigem Stickstoff ermöglichen, hat den Erhalt von Datensätzen bei atomarer Auflösung (2,05 Å gegenüber 2,6 Å bei Raumtemperatur) ermöglicht und macht den Weg frei für bessere Daten durch die Verwendung von Synchrotronstrahlung. Die erstarrte Kristallstruktur hat die Rolle von Verbindungen (insbesondere Cäsium), die für das Wachstum von MabA-Kristallen erforderlich sind, offenbart und ermöglicht, eine gezielte Optimierung der Kristallogenese in Aussicht zu nehmen. Auch ist das Screening in cristallo von Ligandenpools durchführbar. Die Menge an gereinigtem Protein ist außerdem ein wichtiges Kriterium bei der Durchführung von schnellen Screenings von Moleküldatenbanken (siehe nachstehend).
Die Tests der Aktivität des Proteins MabA und folglich die Tests der Hemmung durch potenzielle Hemmstoffe können leicht und schnell mittels Spektrophotometrie verfolgt werden, wobei die Oxidation des reduzierenden Coenzyms, NADPH, bei 340 nm überwacht wird. Daraus können die Hemmkonstanten (JC50 und Ki) und der Hemmmechanismus (kompetitive Hemmung, nicht-kompetitive Hemmung, unkompetitive Hemmung) für jedes Molekül gefolgert werden. Außerdem können auch Tests zur spezifischen Bindung von Liganden an das aktive Zentrum von MabA unkompliziert und schnell mittels Spektrofluorimetrie durchgeführt werden. Das Vorhandensein des einzigen Trp-Restes des Proteins im aktiven Zentrum ermöglicht, durch Anregung bei 303 nm anhand der Veränderung der Fluoreszenzemissionsintensität im Emissionsmaximum die Bindung eines Liganden festzustellen und daraus die Dissoziationskonstante (Kd) abzuleiten. Auf ähnliche Weise können FRET-(Fluorescence Resonance Energy Transfert) Versuche in Gegenwart des Coenzyms, NADPH, durchgeführt werden, die eine Schlussfolgerung ermöglichen, ob der Ligand die Bindungsstelle des NADPH besetzt oder nicht (Bindungskom petition). Die Einfachheit dieser Messverfahren und die verhältnismäßig kleinen Volumina, die sie erfordern, werden eine Miniaturisierung der Hemmtests oder Ligandenbindungstests für das schnelle automatische Screening von Moleküldatenbanken ermöglichen, mittels eines Automaten, der mit einem Spektrophotometer oder mit einem Spektrofluorimeter ausgestattet ist.
Der Vergleich der Struktur von MabA mit jener des Proteins InhA, das aus der gleichen strukturellen Überfamilie (RED) stammt und zu dem gleichen Enzymkomplex gehört (siehe unten), hat ermöglicht, auf eine hemmende Wirkung des Isoniazids auf die Aktivität von MabA zu schließen und die aktive Form des Isoniazids (Antituberkulotikum), das Addukt INH-NADP(H), nachzuweisen. Die Bindung des Addukts und die Hemmung der MabA-Aktivität sind dann experimentell bestätigt worden. Desgleichen wird aufgrund einer starken Ähnlichkeit der Struktur mit anderen Proteinen, die mit Liganden kristallisiert worden sind oder noch werden (beispielsweise Derivaten von Steroiden, die mit Steroiddehydrogenasen cokristallisiert sind), das gezielte Design von potenziellen MabA-Hemmstoffen schnell verwirklicht werden können.
Das Protein MabA ist von besonderem Interesse in der Eigenschaft als Angriffsziel von Antibiotika gegen Mykobakterien. Es gehört nämlich zu dem gleichen Enzymsystem wie das Protein InhA, welches das Angriffsziel des Medikaments gegen Tuberkulose der ersten Wahl, Isoniazid, ist. Andererseits ist bis heute kein zu MabA homologes Protein in tierischen Zellen nachgewiesen worden. Außerdem hat der Vergleich mit den homologen Proteinen, die bei Bakterien oder Pflanzen angetroffen werden, besondere Eigenschaften von MabA hervortreten lassen, die mit seiner Funktion zusammenhängen, da es langkettige Substrate verwertet. Diese Besonderheiten spiegeln sich in der Struktur seines aktiven Zentrums wider, was ermöglicht, das Design von MabA-spezi fischen Hemmstoffen (insbesondere im Hinblick auf den Raumbedarf und den hydrophoben Charakter) in Aussicht zu nehmen. Diese verschiedenen Punkte tragen zu den Kriterien für eine pharmakologische Glaubwürdigkeit des MabA bei.
Folglich hat die vorliegende Erfindung hauptsächlich zur Aufgabe:

– die Erforschung und das Design von Medikamenten, die gegen die fakultativ pathogenen mykobakteriellen Infektionen (M. avium, M. kansasii, M. fortuitum, M. chelonae...) wirksam sind, die in den Krankenhäusern (Sterilisation medizinischer Instrumente) und im Fall menschlicher Immunschwäche (AIDS, Einnahme von Immunsuppressoren bei einer Transplantation, bei Krebs usw.) Probleme bereiten;
– die Erforschung und das Design von Medikamenten, die gegen Tuberkuloseinfektionen wirksam sind, insbesondere von Medikamenten, die bei den Stämmen von M. tuberculosis, die gegen die derzeit bei der Tuberkulosebehandlung verwendeten Antibiotika resistent sind und sich in Risikopopulationen (Strafvollzug, sozial benachteiligte Bevölkerungsschichten usw.) ausbreiten, wirksam sind;
– die Erforschung und das Design von Medikamenten, die gegen andere bakterielle Infektionen wirksam sind, wobei als molekulare Angriffsziele zu MabA homologe Proteine genommen werden.

Biophysical Journal 82 (1, zweiter Teil), S. 453a, und Microbiology 144 (10), S. 2697-2704 führen die Kristallisation von MabA an, wobei sie das Mycobacterium tuberculosis beschreiben.
Die vorliegende Erfindung hat vor allem vom Protein MabA, auch als FabG1 bezeichnet, durch Mutation einer oder mehrerer Aminosäuren abgeleitete Proteine zum Gegenstand, wo bei die abgeleiteten Proteine in gereinigter Form vorliegen und eine NADPH-abhängige β-Ketoacylreduktaseaktivität aufweisen.
Insbesondere hat die Erfindung vom gereinigten rekombinanten MabA abgeleitete Proteine zum Gegenstand, wobei das Protein ein Mykobakterienprotein ist, etwa von Mycobacterium tuberculosis, und insbesondere vom M. tuberculosis-Stamm H37Rv.
Außerdem hat die Erfindung die oben erwähnten abgeleiteten rekombinanten Proteine in gereinigter Form zum Gegenstand, wie sie durch Transformation von E. coli-Stämmen mit einem Plasmid erhalten werden, das eine Sequenz enthält, die das Gen umfasst, das das Protein MabA kodiert, oder eine Sequenz umfasst, die ein von MabA abgeleitetes Protein, wie oben definiert, kodiert, gefolgt von einem Schritt der Aufreinigung, in dessen Verlauf:

– die oben genannten rekombinanten E. coli-Bakterien in einem Waschpuffer gewaschen werden, dann in einen Lyse-Puffer gelegt werden und durch einen Gefrier-Auftau-Zyklus in Gegenwart von Protease- und Lysozymhemmern lysiert werden,
– nach der Behandlung durch die DNaseI und die RNaseA in Gegenwart von MgCl₂ und durch Zentrifugieren der Überstand der Bakterienlyse, der im vorangegangenen Schritt gewonnen wurde und zu dem 10% (v/v) Glycerol gegeben wurden oder NADP⁺ 400 μM, auf eine Ni-NTA-Harz/Agarose-Säule gegeben wird,
– nach mehreren Waschungen mit dem Puffer mit 5 mM und dann mit 50 mM Imidazol das Protein MabA oder das abgeleitete Protein mit dem Elutionspuffer eluiert wird.

Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung werden die oben erwähnten abgeleiteten rekombinanten Proteine in gereinigter Form gemäß dem oben beschriebenen Verfahren erhalten, bei dem die verschiedenen Waschpuffer für Bakterien, die Lyse-Puffer, Waschpuffer und Elutionspuffer die Folgenden sind:

– Waschpuffer für Bakterien: 10 mM Kaliumphosphat, pH-Wert 7,8,
– Lyse-Puffer: 50 mM Kaliumphosphat, pH-Wert 7,8, enthaltend 500 mM NaCl, 5 mM Imidazol,
– Waschpuffer: 50 mM Kaliumphosphat, pH-Wert 7,8, enthaltend 500 mM NaCl, 5 und 50 mM Imidazol,
– Elutionspuffer: 50 mM Kaliumphosphat, pH-Wert 7,8, enthaltend 500 mM NaCl und 175 mM Imidazol.

Vorteilhaft werden die mit Hilfe der oben erwähnten Puffer erhaltenen Proteine bei Untersuchungen der Enzymkinetik für das Screening von Liganden gemäß den nachstehenden Verfahren verwendet.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden die oben erwähnten abgeleiteten rekombinanten Proteine in gereinigter Form gemäß dem oben beschriebenen Verfahren erhalten, bei dem die verschiedenen Waschpuffer für Bakterien, die Lyse-Puffer, Waschpuffer und Elutionspuffer die Folgenden sind:

– Waschpuffer für Bakterien: 10 mM Tris, pH-Wert 8,0,
– Lyse-Puffer: • 50 mM Tris-Puffer, pH-Wert 7,8, ergänzt durch 300 mM LiSO₄ und 5 mM Imidazol; • oder 50 mM Tris-Puffer, pH-Wert 8,0, ergänzt durch 300 mM KCl und 5 mM Imidazol,
– Waschpuffer: • 50 mM Tris-Puffer, pH-Wert 8,0, ergänzt durch 300 mM LiSO₄ und 5 oder 50 mM Imidazol, • oder 50 mM Tris-Puffer, pH-Wert 8,0, ergänzt durch 300 mM KCl und 5 oder 50 mM Imidazol,
– Elutionspuffer: • 20 mM MES-Puffer, pH-Wert 6,4, 300 mM LiSO₄ und 115 bis 750 mM Imidazol, • oder 20 mM PIPES-Puffer, pH-Wert 8,0, ergänzt durch 300 mM KCl und 175 bis 750 mM Imidazol.

Vorteilhaft werden die mit Hilfe der oben erwähnten Puffer erhaltenen Proteine bei kristallographischen Untersuchungen für das Design und das Screening von Liganden gemäß den nachstehend beschriebenen Verfahren verwendet.
Die Erfindung betrifft die oben erwähnten Proteine, die vom MabA-Protein abgeleitet sind, gekennzeichnet dadurch, dass sie dem MabA-Protein entsprechen, dessen Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 die Folgende ist:
bei der das Cystein an Position 60 durch einen Valinrest ersetzt wird und/oder das Glycin an Position 139 durch Alanin oder Serin ersetzt wird und/oder das Serin an Position 133 durch einen Leucinrest ersetzt wird.
Daher hat die Erfindung insbesondere das Protein, das vom MabA-Protein wie oben definiert abgeleitet ist, zum Gegenstand, gekennzeichnet dadurch, dass es dem MabA-Protein entspricht, bei dem das Cystein an Position 60 durch einen Valinrest ersetzt ist, wobei das abgeleitete Protein, auch als C(60)V bezeichnet, der folgenden Sequenz SEQ ID NO: 3 entspricht:
Daher hat die Erfindung insbesondere auch das Protein, das vom MabA-Protein wie oben definiert abgeleitet ist, zum Gegenstand, gekennzeichnet dadurch, dass es dem MabA-Protein entspricht, bei dem das Serin an Position 144 durch einen Leucinrest ersetzt ist, wobei das abgeleitete Protein, auch als S(144)L bezeichnet, der folgenden Sequenz SEQ ID NO: 5 entspricht:
Daher hat die Erfindung insbesondere auch das Protein, das vom MabA-Protein wie oben definiert abgeleitet ist, zum Gegenstand, gekennzeichnet dadurch, dass es dem MabA-Protein entspricht, bei dem das Cystein an Position 60 durch einen Valinrest ersetzt ist und das Serin an Position 144 durch einen Leucinrest ersetzt ist, wobei das abgeleitete Protein, auch als C(60)V/S(144)L bezeichnet, der folgenden Sequenz SEQ ID NO: 7 entspricht:
Die Erfindung hat insbesondere auch das Protein, das vom MabA-Protein wie oben definiert abgeleitet ist, zum Gegenstand, gekennzeichnet dadurch, dass es dem MabA-Protein entspricht, bei dem das Cystein an Position 60 durch einen Valinrest ersetzt ist, das Glycin an Position 139 durch ein Alanin oder ein Serin ersetzt ist und das Serin an Position 144 durch einen Leucinrest ersetzt ist, wobei das abgeleitete Protein, auch als C(60)V/G(139)[A oder S]/S(144)L bezeichnet, der folgenden Sequenz SEQ ID NO: 8 entspricht:
bei der X das A oder das S darstellt.
Die Erfindung betrifft außerdem das MabA-Protein, das der SEQ ID NO: 1 entspricht oder die Proteine, die vom MabA-Protein wie oben definiert abgeleitet sind, wie etwa die abgeleiteten Proteine, die den Sequenzen SEQ ID NO: 3, 5, 7 oder 8 entsprechen, gekennzeichnet dadurch, dass sie in der Weise modifiziert sind, dass sie eine oder mehrere Mutationen umfassen, die ermöglichen, die Spezifität des Proteins für NADPH in eine Spezifität für NADH zu verändern.
Die Erfindung hat insbesondere die oben erwähnten modifizierten MabA-Proteine zum Gegenstand, die den folgenden Sequenzen entsprechen:

– Sequenz SEQ ID NO: 9, die der SEQ ID NO: 1 entspricht, die die Mutationen N24D (oder E) und/oder H46D aufweist, das heißt die folgende Sequenz:
bei der X₁ das D oder E und X₂ das H oder D darstellt,
– Sequenz SEQ ID NO: 10, die der SEQ ID NO: 3 entspricht, die die Mutationen N24D (oder E) und/oder H46D aufweist, das heißt die folgende Sequenz:
bei der X₁ das D oder E und X₂ das H oder D darstellt,
– Sequenz SEQ ID NO: 11, die der SEQ ID NO: 5 entspricht, die die Mutationen N24D (oder E) und/oder H46D aufweist, das heißt die folgende Sequenz:
bei der X₁ das D oder E und X₂ das H oder D darstellt,
– Sequenz SEQ ID NO: 12, die der SEQ ID NO: 7 entspricht, die die Mutationen N24D (oder E) und/oder H46D aufweist, das heißt die folgende Sequenz:
bei der X₁ das D oder E und X₂ das H oder D darstellt,
– Sequenz SEQ ID NO: 13, die der SEQ ID NO: 8 entspricht, die die Mutationen N24D (oder E) und/oder H46D aufweist, das heißt die folgende Sequenz:
bei der X₁ das D oder E und X₂ das H oder D darstellt.

Die Erfindung hat außerdem das MabA-Protein, das der SEQ ID NO: 1 entspricht oder die Proteine, die vom MabA-Protein abgeleitet sind, wie oben definiert, wie etwa die abgeleiteten Proteine, die den Sequenzen SEQ ID NO: 3, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12 oder 13 entsprechen, zum Gegenstand, gekennzeichnet dadurch, dass sie durch Einfügung eines poly-Histidin-Tags an der N-Terminal-Seite modifiziert sind, wie durch die folgende Sequenz SEQ ID NO: 14: MGSSHHHHHH SSGLVPRGSH.
Die Erfindung hat insbesondere die oben erwähnten modifizierten MabA-Proteine zum Gegenstand, die den folgenden Sequenzen entsprechen:

– Sequenz SEQ ID NO: 15, die der Kombination aus der Sequenz SEQ ID NO: 14 und der Sequenz SEQ ID NO: 1 entspricht, das heißt der folgenden Sequenz:
– Sequenz SEQ ID NO: 16, die der Kombination aus der Sequenz SEQ ID NO: 14 und der Sequenz SEQ ID NO: 3 entspricht, das heißt der folgenden Sequenz:
– Sequenz SEQ ID NO: 17, die der Kombination aus der Sequenz SEQ ID NO: 14 und der Sequenz SEQ ID NO: 5 entspricht, das heißt der folgenden Sequenz:
– Sequenz SEQ ID NO: 18, die der Kombination aus der Sequenz SEQ ID NO: 14 und der Sequenz SEQ ID NO: 7 entspricht, das heißt der folgenden Sequenz:
– Sequenz SEQ ID NO: 19, die der Kombination aus der Sequenz SEQ ID NO: 14 und der Sequenz SEQ ID NO: 9 entspricht, das heißt der folgenden Sequenz:
bei der X₁ das D oder E und X₂ das H oder D darstellt,
– Sequenz SEQ ID NO: 20, die der Kombination aus der Sequenz SEQ ID NO: 14 und der Sequenz SEQ ID NO: 10 entspricht, das heißt der folgenden Sequenz:
bei der X₁ das D oder E und X₂ das H oder D darstellt,
– Sequenz SEQ ID NO: 21, die der Kombination aus der Sequenz SEQ ID NO: 14 und der Sequenz SEQ ID NO: 11 entspricht, das heißt der folgenden Sequenz:
bei der X₁ das D oder E und X₂ das H oder D darstellt,
– Sequenz SEQ ID NO: 22, die der Kombination aus der Sequenz SEQ ID NO: 14 und der Sequenz SEQ ID NO: 12 entspricht, das heißt der folgenden Sequenz:
bei der X₁ das D oder E und X₂ das H oder D darstellt,
– Sequenz SEQ ID NO: 23, die der Kombination aus der Sequenz SEQ ID NO: 14 und der Sequenz SEQ ID NO: 13 entspricht, das heißt der folgenden Sequenz:
bei der X₁ das D oder E und X₂ das H oder D darstellt.

Die Erfindung hat die Proteine, die vom MabA-Protein abgeleitet sind, wie oben definiert, zum Gegenstand, wie etwa die abgeleiteten Proteine, die den Sequenzen SEQ ID NO: 3, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12 oder 13 entsprechen, wobei sie N-terminal eine Sequenz GSH aufweisen, das heißt die folgenden Sequenzen:

– die folgende SEQ ID NO: 24, die der Kombination aus der GSH-Sequenz und der Sequenz SEQ ID NO: 1 entspricht,
– die folgende SEQ ID NO: 25, die der Kombination aus der GSH-Sequenz und der Sequenz SEQ ID NO: 3 entspricht,
– die folgende SEQ ID NO: 26, die der Kombination aus der GSH-Sequenz und der Sequenz SEQ ID NO: 5 entspricht,
– die folgende SEQ ID NO: 27, die der Kombination aus der GSH-Sequenz und der Sequenz SEQ ID NO: 7 entspricht,
– die folgende SEQ ID NO: 28, die der Kombination aus der GSH-Sequenz und der Sequenz SEQ ID NO: 9 entspricht,
bei der X₁ das D oder E und X₂ das H oder D darstellt,
– die folgende SEQ ID NO: 29, die der Kombination aus der GSH-Sequenz und der Sequenz SEQ ID NO: 10 entspricht,
bei der X₁ das D oder E und X₂ das H oder D darstellt,
– die folgende SEQ ID NO: 30, die der Kombination aus der GSH-Sequenz und der Sequenz SEQ ID NO: 11 entspricht,
bei der X₁ das D oder E und X₂ das H oder D darstellt,
– die folgende SEQ ID NO: 31, die der Kombination aus der GSH-Sequenz und der Sequenz SEQ ID NO: 12 entspricht,
bei der X₁ das D oder E und X₂ das H oder D darstellt,
– die folgende SEQ ID NO: 32, die der Kombination aus der GSH-Sequenz und der Sequenz SEQ ID NO: 13 entspricht,
bei der X₁ das D oder E und X₂ das H oder D darstellt.

Die Erfindung hat die Proteine, die vom MabA-Protein abgeleitet sind, wie oben definiert, zum Gegenstand, wie etwa die abgeleiteten Proteine, die den Sequenzen SEQ ID NO: 3, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12 oder 13 entsprechen, bei denen die sieben ersten Aminosäuren unterdrückt sind, das heißt die folgenden Sequenzen:

– die folgende Sequenz SEQ ID NO: 33, die der Sequenz SEQ ID NO: 1 entspricht, wobei die sieben ersten Aminosäuren unterdrückt sind:
– die folgende Sequenz SEQ ID NO: 34, die der Sequenz SEQ ID NO: 3 entspricht, wobei die sieben ersten Aminosäuren unterdrückt sind:
– die folgende Sequenz SEQ ID NO: 35, die der Sequenz SEQ ID NO: 5 entspricht, wobei die sieben ersten Aminosäuren unterdrückt sind:
– die folgende Sequenz SEQ ID NO: 36, die der Sequenz SEQ ID NO: 7 entspricht, wobei die sieben ersten Aminosäuren unterdrückt sind:
– die folgende Sequenz SEQ ID NO: 37, die der Sequenz SEQ ID NO: 9 entspricht, wobei die sieben ersten Aminosäuren unterdrückt sind:
bei der X₁ das D oder E und X₂ das H oder D darstellt,
– die folgende Sequenz SEQ ID NO: 38, die der Sequenz SEQ ID NO: 10 entspricht, wobei die sieben ersten Aminosäuren unterdrückt sind:
bei der X₁ das D oder E und X₂ das H oder D darstellt,
– die folgende Sequenz SEQ ID NO: 39, die der Sequenz SEQ ID NO: 11 entspricht, wobei die sieben ersten Aminosäuren unterdrückt sind:
bei der X₁ das D oder E und X₂ das H oder D darstellt,
– die folgende Sequenz SEQ ID NO: 40, die der Sequenz SEQ ID NO: 12 entspricht, wobei die sieben ersten Aminosäuren unterdrückt sind:
bei der X₁ das D oder E und X₂ das H oder D darstellt,
– die folgende Sequenz SEQ ID NO: 41, die der Sequenz SEQ ID NO: 13 entspricht, wobei die sieben ersten Aminosäuren unterdrückt sind:
bei der X₁ das D oder E und X₂ das H oder D darstellt.

Die Erfindung betrifft die oben erwähnten abgeleiteten Proteine, gekennzeichnet durch ihre enzymatische Aktivität, die für Substrate des langkettigen β-Ketoacyl-Typus spezifisch ist, insbesondere mit 8 bis 20 Kohlenstoffatomen, wie das β-Ketooctanoyl-CoA oder das β-Ketododecanoyl-CoA.
Die Erfindung hat insbesondere die oben erwähnten abgeleiteten Proteine zum Gegenstand, wovon die Hauptmerkmale ihrer Tertiärtruktur bei einer Auflösung von 1,6 bis 2,0 Ångström durch die Analyse anhand der Beugung der Röntgenstrahlen an den Kristallen der Proteine festgestellt werden, wobei diese derart sind, wie sie in 1 für das rekombinante Protein MabA, entsprechend der Sequenz SEQ ID NO: 15, in 2 für das abgeleitete Protein MabA C(60)V, entsprechend der Sequenz SEQ ID NO: 16, und in 3 für das abgeleitete Protein MabA C(60)V/S(144)L, entsprechend der Sequenz SEQ ID NO: 17, dargestellt sind.
Außerdem betrifft die Erfindung das MabA-Protein und die oben erwähnten abgeleiteten Proteine in kristallisierter Form.
Insbesondere betrifft die Erfindung die oben erwähnten Proteinkristalle, wie sie durch das Verfahren der Dampfdiffusion im hängenden Tropfen erhalten werden, indem die Proteine vermischt werden (1 μl einer Lösung aus 10 mg/ml) mit einer Polyethylenglycol-Lösung, CsCl (150 bis 300 mM) und Glycerol (zu 10%) in einem Puffer (PIPES) bei einem pH-Wert von 6,2.
Die Erfindung hat außerdem die oben erwähnten Proteinkristalle zum Gegenstand, wie sie gemäß dem oben beschriebenen Kristallisationsverfahren erhalten werden, wobei das Verfahren ausgehend von den Proteinen durchgeführt wird, die mit Hilfe der oben erwähnten Puffer gereinigt worden sind, die insbesondere verwendet werden, um Proteine der Erfindung zu erhalten, die für kristallographische Untersuchungen bestimmt sind.
Die Erfindung betrifft außerdem die oben erwähnten Kristalle des rekombinanten MabA-Proteins, entsprechend der Sequenz SEQ ID NO: 15, wobei die Atomkoordinaten der Ter tiärstruktur in 1 dargestellt sind und die folgenden Merkmale aufweisen:

– Maschenparameter: • a = 81,403 Ångström, b = 116,801 Ångström, c = 52,324 Ångström, • α = β = 90,00°, γ = 122,30°
– Raumgruppe: C2,
– Maximale Beugung = 2,05 Ångström.

Die Erfindung betrifft außerdem die oben erwähnten Kristalle des Proteins C(60)V, entsprechend der Sequenz SEQ ID NO: 16, wobei die Atomkoordinaten der Tertiärstruktur in 2 dargestellt sind und die folgenden Merkmale aufweisen:

– Maschenparameter: • a = 82,230 Ångström, b = 118,610 Ångström, c = 53,170 Ångström, • α = β = 90,00°, γ = 122,74°
– Raumgruppe: C2,
– Maximale Beugung = 2,6 Ångström.

Die Erfindung betrifft außerdem die oben erwähnten Kristalle des Proteins C(60)V/S(144)L, entsprechend der Sequenz SEQ ID NO: 18, wobei die Atomkoordinaten der Tertiärstruktur in 3 dargestellt sind und die folgenden Merkmale aufweisen:

– Maschenparameter: • a = 81,072 Ångström, b = 117,022 Ångström, c = 53,170 Ångström, • α = β = 90,00°, γ = 122,42°
– Raumgruppe: C2,
– Maximale Beugung = 1,75 Ångström.

Die Erfindung hat insbesondere die Kristalle der oben erwähnten abgeleiteten Proteine zum Gegenstand, bei denen die Proteine an einen Liganden gebunden sind, nämlich an ein Molekül, das in der Lage ist, sich an das MabA-Protein oder an Proteine, die von diesem Letzteren abgeleitet sind, zu binden, insbesondere an ihre aktive Stelle, die hauptsächlich durch die Aminosäuren, die sich an den folgenden Positionen befinden, begrenzt wird: 21 bis 28, 45 bis 48, 60 bis 63, 87 bis 100, 112, 138 bis 157, 183 bis 212 und 240 bis 247 der Proteine, die den Sequenzen SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 8, 9, 10, 11 oder 13 entsprechen, oder sich an den Positionen 41 bis 48, 65 bis 68, 80 bis 83, 107 bis 120, 132, 158 bis 177, 203 bis 232 und 260 bis 267 der Proteine befinden, die den Sequenzen SEQ ID NO: 15 bis 23 entsprechen, oder sich an den Positionen 24 bis 31, 48 bis 51, 63 bis 66, 90 bis 103, 115, 141 bis 160, 186 bis 215 und 243 bis 250 der Proteine befinden, die den Sequenzen SEQ ID NO: 24 bis 32 entsprechen, oder sich an den Positionen 14 bis 11, 38 bis 41, 53 bis 56, 80 bis 93, 105, 131 bis 150, 176 bis 205 und 233 bis 240 der Proteine befinden, die den Sequenzen SEQ ID NO: 33 bis 41 entsprechen, wobei die Kristalle jene sind, die durch Einweichen oder durch Co-Kristallisation des rekombinanten MabA-Proteins in gereinigter Form oder eines oben erwähnten rekombinanten Proteins, das vom MabA-Protein abgeleitet ist, in der Gegenwart des Liganden, insbesondere unter den oben definierten Bedingungen der Kristallisation erhalten werden.
Die Erfindung betrifft außerdem die Nukleotidsequenzen, die ein Protein kodieren, das vom MabA-Protein abgeleitet ist, wie oben definiert.
Daher hat die Erfindung insbesondere die Nukleotidsequenz zum Gegenstand, die das abgeleitete Protein (60)V (SEQ ID NO: 3) kodiert, wobei sie der folgenden Sequenz SEQ ID NO: 2 entspricht:
oder irgendeiner Sequenz, die durch Degeneration des genetischen Kodes abgeleitet ist und das Protein C(60)V kodiert.
Daher hat die Erfindung auch die Nukleotidsequenz zum Gegenstand, die das abgeleitete Proteine S(144)L (SEQ ID NO: 5) kodiert, wobei sie der folgenden Sequenz SEQ ID NO: 4 entspricht:
oder irgendeiner Sequenz, die durch Degeneration des genetischen Kodes abgeleitet ist und das Protein S(144)L kodiert.
Zudem hat daher die Erfindung die Nukleotidsequenz zum Gegenstand, die das abgeleitete Protein C(60)V/S(144)L (SEQ ID NO: 7) kodiert, wobei sie der folgenden Sequenz SEQ ID NO: 6 entspricht:
oder irgendeiner Sequenz, die durch Degeneration des genetischen Kodes abgeleitet ist und das Protein C(60)V/S(144)L kodiert.
Die Erfindung betrifft außerdem jede rekombinante Nukleotidsequenz, umfassend die Nukleotidsequenz, die das MabA-Protein kodiert, oder eine Nukleotidsequenz, die ein Protein, das vom MabA-Protein abgeleitet ist, kodiert, wie oben definiert, zusammen mit den notwendigen Elementen für die Transkription dieser Sequenz, insbesondere mit einem Transkriptionspromotor und einem Transkriptionsterminator.
Außerdem hat die Erfindung jeden Vektor, insbesondere jedes Plasmid, umfassend eine Nukleotidsequenz wie oben definiert, zum Gegenstand.
Die Erfindung betrifft außerdem die Wirtszellen, die durch einen oben erwähnten Vektor transformiert werden, wobei die Zellen insbesondere unter den Bakterien wie E. Coli ausgewählt werden, oder jeden anderen Mikroorganismus, der für die Produktion von Proteinen verwendet wird.
Die Erfindung hat außerdem ein Verfahren zum Aufbereiten des rekombinanten MabA-Proteins in gereinigte Form oder von rekombinanten Proteinen, die vom MabA-Protein abgeleitet sind, wie oben definiert, zum Gegenstand, gekennzeichnet dadurch, dass es die folgenden Schritte umfasst:

– Transformation der Zellen mit Hilfe eines oben er wähnten rekombinanten Vektors,
– Anlegen einer Kultur mit den auf diese Weise transformierten Zellen und Gewinnen der Proteine, die durch die Zellen produziert werden,
– Aufreinigen der Proteine nach dem oben beschriebenen Aufreinigungsverfahren.

Die Erfindung betrifft außerdem die Verwendung des rekombinanten MabA-Proteins in gereinigter Form oder von rekombinanten Proteinen, die vom MabA-Protein abgeleitet sind, wie oben definiert, oder von oben erwähnten Kristallen für die Durchführung von Verfahren zum Designen oder Screenen von Liganden des MabA-Proteins und insbesondere von Molekülen, die dazu neigen, sich spezifisch an die aktive Stelle des MabA-Proteins zu binden, oder von Proteinen mit ähnlicher Struktur wie das MabA-Protein, und die enzymatischen Aktivität dieses Letzteren hemmen, wobei diese Hemmstoffe insbesondere ausgewählt sind unter den

– Steroidderivaten,
– Derivaten des tuberkulosespezifischen Antibiotikums Isoniazid (Isonicotinsäurehydrazid) sowie den Derivaten des Isonicotinoyl-NAD(P)-Adduktes,
– Derivaten aus N-Acetyl-Cysteamin oder anderen Arten von simplifizierten Derivaten des Coenzyms A, umfassend einen gepfropften Fluorophor, der die Anwendung des Verfahrens der Fluoreszenzspektroskopie gestattet, für die Feststellung des Zusammenwirkens von Protein und Ligand insbesondere zeitaufgelöst,
– Derivaten, die das InhA-Protein des Mycobacterium tuberculosis hemmen.

Die Erfindung hat insbesondere die oben erwähnte Verwendung des rekombinanten MabA-Proteins in gereinigter Form oder der rekombinanten Proteine, die vom MabA-Protein abgeleitet sind, wie oben definiert, oder der oben erwähnten Kristalle für die Durchführung von Verfahren zum Designen oder Screenen von Liganden des MabA-Proteins zum Gegenstand, die in pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet werden können, insbesondere im Rahmen der Behandlung von Krankheiten, die in Verbindung stehen mit mykobakteriellen Infektionen wie die Tuberkulose, die verbunden ist mit der Infektion durch das Mycobacterium tuberculosis oder durch das Mycobacterium africanium, oder die Lepra, die in Verbindung steht mit der Infektion durch das Mycobacterium leprae, oder die Mykobakteriosen, die in Verbindung stehen mit der Infektion durch fakultativ pathogene Mykobakterien wie das Mycobacterium avium, das Mycobacterium fortuitum, das Mycobacterium kansasii und das Mycobacterium chelonae.
Die Erfindung betrifft außerdem jedes Verfahren zum Screenen von Liganden des MabA-Proteins, gekennzeichnet dadurch, dass es die folgenden Schritte umfasst:

– Bereitstellen des rekombinanten MabA-Proteins in gereinigter Form oder eines rekombinanten Proteins, das vom MabA-Protein abgeleitet ist, wie oben definiert,
– Feststellen der eventuellen Bindung zwischen dem Protein und dem getesteten Liganden durch Messung, nach Fluoreszenzanregung, insbesondere bei 300 nm, der Fluoreszenzintensität des Proteins, die zwischen 300 und 400 nm ausgestrahlt wird (im Wesentlichen der Fluoreszenzanregung des einzelnen Tryptophans W145 entsprechend), und Vergleichen mit der Fluoreszenzintensität, die bei einem Test in Abwesenheit des Liganden ausgestrahlt wird, wobei die Bindung eines Liganden an der aktiven Stelle des MabA durch ein Fluoreszenzquenching gekennzeichnet ist.

Die Erfindung hat außerdem jedes Verfahren zum Screenen von Liganden, die das MabA-Protein hemmen, zum Gegenstand, gekennzeichnet dadurch, dass es die folgenden Schritte umfasst:

– Bereitstellen des rekombinanten MabA-Proteins in gereinigter Form oder eines rekombinanten Proteins, das vom MabA-Protein abgeleitet ist, wie oben definiert, in einem Reaktionsmedium, das ein Substrat wie etwa ein β-Ketoacyl- Derivat wie oben definiert, das Coenzym NADPH und den getesteten Liganden enthält,
– Feststellen einer potenziellen Fähigkeit des getesteten Liganden als Hemmstoff durch Messen der enzymatischen Aktivität des Proteins durch kinetische Messung des Absorptionsgrades, insbesondere bei 340 nm, und Vergleichen des Anstiegs der Kurve der optischen Dichte als Funktion der Zeit mit dem Anstieg, der in einem Test ohne Vorhandensein des Liganden erhalten wurde.

Die Erfindung betrifft außerdem jedes Verfahren zum Screenen von Liganden des MabA-Proteins, gekennzeichnet dadurch, dass es die folgenden Schritte umfasst:

– Bereitstellen eines rekombinanten Proteins, das vom MabA-Protein abgleitet ist, wie oben definiert, mit dem getesteten Liganden,
– Analyse der Tertiärstruktur des Komplexes, der zwischen dem Protein und dem Liganden in löslicher Phase entstanden ist, insbesondere durch NMR- und Fluoreszenzspektroskopie.

Die Erfindung hat insbesondere jedes Verfahren zum Screenen von Liganden des MabA-Proteins zum Gegenstand, gekennzeichnet dadurch, dass es die folgenden Schritte umfasst:

– Co-Kristallisation des getesteten Liganden und eines rekombinanten Proteins, das vom MabA-Protein abgeleitet ist, wie oben definiert, insbesondere unter den oben definierten Kristallisationsbedingungen, so dass Kristalle wie oben erwähnt erhalten werden,
– oder Einweichen der Kristalle des MabA-Proteins oder eines abgeleiteten Proteins, wie oben definiert, in optimierten Lösungen, die potenzielle Liganden enthalten,
– Analyse der Tertiärstruktur der oben genannten Kristalle, insbesondere durch Beugung von Röntgenstrahlen (im Hinblick auf die Auswahl der Liganden, die eine optimale Kapazität aufweisen, die aktive Stelle der Proteine zu besetzen und zu blockieren).

Die Erfindung betrifft außerdem die Verwendung der Koordinaten der Tertiärstruktur eines rekombinanten Proteins, das vom MabA-Protein abgeleitet ist, wie oben definiert, wobei die Koordinaten in den 1 bis 3 dargestellt sind, gegebenenfalls in Verbindung mit den Koordinaten der aktiven Stelle dieser Proteine, wie oben definiert, für die Durchführung von Verfahren zum Designen oder Screenen von Liganden des Proteins MabA (vorteilhaft computergestützt).
Daher hat die Erfindung insbesondere jedes Verfahren zum Designen oder Screenen von Liganden des MabA-Proteins zum Gegenstand, umfassend die Verwendung von Koordinaten der Tertiärstruktur eines rekombinanten Proteins, das vom MabA-Protein abgeleitet ist, wie oben definiert, wobei die Koordinaten in den 1 bis 3 dargestellt sind, um in silico, vorteilhaft mit Hilfe geeigneter Datenverarbeitungssoftware, virtuelle Moleküldatenbanken potenzieller Liganden zu screenen, und die Erfassung und gezielte strukturelle Optimierung von Molekülen, die imstande sind, sich an das Protein zu binden.
Die Erfindung hat außerdem jedes Verfahren zum gezielten Designen wie oben definiert zum Gegenstand, das ausgehend von bekannten MabA hemmenden Stoffen oder von zu MabA homologe Proteine (aus der gleichen Strukturfamilie SDR oder RED, wobei sie eine Identität von über 10% mit MabA über die Gesamtheit der Peptidsequenz aufweisen) hemmenden Stoffen, für welche die dreidimensionale Feinstruktur des Komplexes aus dem Hemmstoff und dem rekombinanten MabA-Protein in gereinigter Form oder einem rekombinanten Protein, das vom MabA-Protein abgeleitet ist, wie oben definiert, bestimmt worden ist, durchgeführt wird, und die gezielte strukturelle Optimierung der Hemmstoffe. Es ist gezeigt worden, dass die MabA-Aktivität in vitro durch ein INH-NADP(H)-Addukt gehemmt wird. Dieser Mechanismus der Wirkung des Isoniazids (INH) auf MabA ist dem Mechanismus der Wir kung des Isoniazids auf das Protein InhA, das ein Angriffsziel von INH ist, ähnlich. Weitere Proteine, die zur Überfamilie der RED gehören, weisen eine Tertiärstruktur auf, die mit jener von MabA vergleichbar ist, darunter sind: eine Steroiddehydrogenase (PDB1HSD), Tropinonreduktasen (z.B. PDB1AE1), eine Trihydroxynaphthalenreduktase (PDB1YBV) und eine Mannitoldehydrogenase (PDB1H5Q); diese sind mit Hemmstoffen co-kristallisiert worden.
Die Erfindung wird weiter veranschaulicht mit Hilfe der folgenden ausführlichen Beschreibung des Erhalts des rekombinanten Proteins MabA und der Proteine MabA C(60)V, S(144)L und C(60)V/S(144)L in gereinigter Form, ihrer Enzymeigenschaften sowie der Kristalle dieser Proteine und ihrer Atomkoordinaten.
Die Atomkoordinaten des rekombinanten Proteins MabA (SEQ ID NO: 15 entsprechend) und der Proteine MabA C(60)V (SEQ ID NO: 16 entsprechend) und C(60)V/S(144)L (SEQ ID NO: 18 entsprechend) sind in jeweils in den 1 bis 3 dargestellt, wobei von links nach rechts die Nummer des Atoms, der Name des Restes, die Nummer der Kette, die Koordinaten x, y, z, die Besetzung und der Faktor B angegeben sind.
EXPERIMENTELLER TEIL
Die Tuberkulose, eine Infektionskrankheit, die durch Mycobacterium tuberculosis hervorgerufen wird, ist nach wie vor die Hauptursache für die Sterblichkeit weltweit, und zwar aufgrund eines einzigartigen Infektionserregers. Der Weltgesundheitsorganisation nach treten jedes Jahr 8 Millionen Tuberkulosefälle auf, die 3 Millionen Todesfälle zur Folge haben (Dolin u.a., 1994). Während die Tuberkulose schon immer ein ernstes Problem der Volksgesundheit in den Entwicklungsländern war, tritt sie in den entwickelten Ländern erneut auf. Prekäre Verhältnisse bestimmter Gruppen der Gesellschaft und die Verschlechterung der Gesundheitssysteme, Folgen der weltweiten Wirtschaftskrise, haben dieses Wiederaufflackern der Tuberkulose begünstigt. Ebenso haben die Endemie der Infektion mit dem Virus der menschlichen Immunschwäche (HIV) und das Auftreten von Stämmen von M. tuberculosis, die gegen ein oder mehrere Antibiotika resistent sind, stark zu diesem Phänomen beigetragen (Barnes u.a., 1991). Das Auftauchen der mehrfach resistenten Tuberkulose, definiert als die Resistenz gegenüber zwei Antibiotika, die der Behandlung der Tuberkulose zugrunde liegen, Isoniazid (Rimifon, INH) und Rifampicin (RMP), stellt eine Bedrohung der Beherrschung der Tuberkulose dar. Mit gegenüber mehreren Antibiotika resistenten Stämmen infizierte Patienten lassen sich extrem schwer heilen, und die erforderliche Behandlung ist toxisch und teuer. Bis zu 30% der Gesamtheit der klinischen Isolate resistenter M. tuberculosis sind gegenüber dem Isoniazid resistent (Cohn u.a., 1997). Es ist demnach wichtig, die Mechanismen der Resistenz gegenüber Isoniazid, die die Mykobakterien an den Tag legen, besser zu verstehen, um einerseits schnelle Techniken erarbeiten zu können, die den Nachweis der Resistenzen ermöglichen, und andererseits neuartige Wirkstoffe gegen Mykobakterien entwickeln zu können, die gegen die resistenten Stämme wirksam sind.
Ausgehend von zahlreichen Arbeiten über das Isoniazid konnte ein direktes Angriffsziel dieses Antibiotikums identifiziert werden; es handelt sich dabei um einen spezifischen Metabolismus der Mykobakterien, die Biosynthese von Mykolsäuren [(Winder & Collins, 1970); (Takayama u.a., 1972); (Quémard u.a., 1991)]. Diese sehr langkettigen Fettsäuren sind hauptsächliche und charakteristische Bestandteile der Hülle des Mykobakteriums. Mittels molekularbiologischer Werkzeuge ist bei M. tuberculosis ein molekulares Angriffsziel des Isoniazids, das Protein InhA, das wahrscheinlich am Biosyntheseweg der Mykolsäuren beteiligt ist, charakterisiert worden [(Banerjee u.a., 1994); (Qué mard u.a., 1995)]. InhA gehört zu einem Enzymsystem, das für die Verlängerung von Fettsäuren verantwortlich ist (Marrakchi u.a., 2000). Dieses System, das das Protein InhA, das Angriffsziel des Isoniazids, umfasst, ist an der Biosynthese von Mykolsäuren beteiligt und stellt deshalb einen Enzymkomplex dar, dessen Bestandteile zu untersuchen im Hinblick auf potenzielle Angriffsziele neuartiger Antibiotika gegen Tuberkulose interessant ist. Man hat deshalb die biochemischen Eigenschaften des MabA, eines der Proteine des Komplexes, der InhA umfasst, untersucht. Die Molekül-Modellierung der Tertiärstruktur dieses Proteins, das die Reduktion von β-Ketoacyl-Derivaten katalysiert, hat gezeigt, dass MabA und InhA der gleichen Strukturfamilie angehören. Die Untersuchung der Wirkung des Isoniazids auf die enzymatische Aktivität von MabA legt nahe, dass das Antibiotikum das Protein durch einen Mechanismus hemmt, welcher der Wirkung auf InhA ähnlich ist. Folglich stellt MabA ein interessantes Ziel beim Designen von die Fettsäurebiosynthese bei den Mykobakterien hemmenden Stoffen dar.
Im Rahmen der Arbeiten im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist das mabA-Gen von M. tuberculosis in E. coli, in einem Expressionsvektor, kloniert worden. Das Protein wird in großer Menge durch diesen rekombinanten Stamm erzeugt, wobei es als Fusionsprotein N-terminal ein poly-Histidin-Tag aufweist. Das Aufreinigen des Proteins wird in einem einzigen Schritt durch Säulenchromatographie durchgeführt, wobei sich mehrere mg gereinigtes Protein ergeben. Ein MabA-Monomer vom Wildtyp umfasst 247 Aminosäuren und hat eine Größe von 25,7 kDa; das durch Fusion entstandene Monomer umfasst 27,7 kDa. Verschiedene experimentelle Verfahren (analytisches Ultrazentrifugieren, Gelfiltration, Lichtstreuung, Kristallographie...) haben ermöglicht zu zeigen, dass das native Protein im Wesentlichen ein Tetramer ist, das sich durch spontane Zusammenlagerung zweier Dimere ergibt. Es sind physikalisch-chemische Eigenschaften (Be ständigkeit in verschiedenen Puffermedien, bei verschiedenen Temperaturen, Fluoreszenzemissionsspektren...) und die enzymatischen Haupteigenschaften des MabA (Kd, Km und kcat für das Coenzym und β-Ketoacyl-CoA-Substrate mit verschiedenen Kettenlängen) bestimmt worden. Das gereinigte rekombinante Protein ist funktionell; es ist eine β-Ketoacylreduktase, NADPH-abhängig und spezifisch für langkettige (C12 bis C20) Substrate. Es ist gezeigt worden, dass MabA zu einem System zur Verlängerung von mykobakteriellen Fettsäuren, FAS-II, gehört und die zweite Phase des Verlängerungszyklus katalysiert.
Die Tertiärstruktur des Proteins MabA ist durch Kristallographie mit einer Auflösung von 2,05 Å nach Einstellung der Bedingungen zur Kryostabilisierung der Kristalle bestimmt worden. MabA gehört zur strukturellen Überfamilie der SDR-(Short-Chain Reductases (engl.)) oder RED-(Reduktasen, Epimerasen, Dehydrogenasen) Proteine. Es ist homolog zu KARs (Ketoacyl-ACP-Reduktasen), stellt jedoch aufgrund der Struktur der Substratbindungstasche ein besonderes Mitglied dieser Familie dar. Seine Hydrophobie ist stärker ausgeprägt als bei homologen Proteinen. Das Vorhandensein des einzigen Tryptophanrestes in der Substratbindungstasche hat ermöglicht, fluoreszenzspektroskopische Versuche durchzuführen, die eine stärker ausgeprägte Affinität des MabA zu langkettigen (C8 bis C20) Substraten, im Vergleich zu einem Substrat mit vier Kohlenstoffatomen in der Kette (C4), gezeigt haben. Diese Ergebnisse, die mit den Werten der Enzymkinetik korrelieren, weisen eine Struktur-Funktion-Beziehung zwischen der Hydrophobie der Bindungsstelle des Substrats und der Affinität des MabA zu ungewöhnlich langkettigen Substraten bei den Bakterien nach.
Die Eigenschaften des MabA, die von jenen anderer, homologer Proteine verschieden sind, sind dafür verantwortlich, dass das Designen von potenziellen Antibiotika bei dem MabA ansetzt. Dieses Designen wird mehrere parallele Vorgehens weisen anwenden:

1. das gezielte Designen ausgehend von bekannten MabA oder homologe Proteine hemmenden Stoffen,
2. das schnelle Screening von virtuellen Moleküldatenbanken,
3. das schnelle Screening von realen Moleküldatenbanken.

Es ist gezeigt worden, dass die MabA-Aktivität in vitro durch ein INH-NADP(H)-Addukt gehemmt wird. Dieser Mechanismus der Wirkung des Isoniazids (INH) auf MabA ist dem Mechanismus der Wirkung des Isoniazids auf das Protein InhA, das ein Angriffsziel von INH ist, ähnlich. Weitere Proteine, die zur Überfamilie der RED gehören, weisen eine Tertiärstruktur auf, die mit jener des MabA vergleichbar ist, darunter sind: eine Steroiddehydrogenase (PDB1HSD), Tropinonreduktasen (z.B. PDB1AE1), eine Trihydroxynaphthalenreduktase (PDB1YBV) und eine Mannitoldehydrogenase (PDB1H5Q). Deshalb beruht die Vorgehensweise (1) auf der Nutzung der Struktur der Liganden (z.B. Isoniazid-Derivate, Steroide) dieser verschiedenen Proteine für das Design weiterer potenzieller MabA-Hemmstoffe mit abgeleiteten Strukturen. Das gezielte Designen setzt selbstverständlich die Verwendung der MabA-Kristallstruktur und des computergestützten Molekül-Docking-Verfahrens voraus. Ebenso werden die Vorgehensweisen (2) und (3), wenn sie zu neuartigen potenziellen Liganden führen, die Grundlage für neue, gezielte Designs sein.
Die Erfindung verhilft folglich zu einer konzeptuellen Vorgehensweise bei der Entwicklung von die Aktivität des Proteins MabA hemmenden Stoffen. Andererseits bietet sie ein Verfahren zur experimentellen Bestätigung zum einen der spezifischen Bindung dieses Moleküls an das aktive Zentrum von MabA (Fluoreszenzspektroskopie) und zum anderen des Hemmvermögens dieser Moleküle durch einen einfachen Enzymtest (mittels Spektrophotometrie verfolgte Enzymkinetik).
I) UNTERSUCHUNG DES PROTEINS MABA (zum Vergleich)
Es ist gezeigt worden, dass das kettenverlängernde FAS-II-System das Protein InhA, ein Angriffsziel des Isoniazids, enthält. Außerdem lässt die Tatsache, dass dieses System wahrscheinlich an der Biosynthese von Mykolsäuren, spezifischen Bestandteilen von Mykobakterien, beteiligt ist, FAS-II ein Ziel der Wahl für die Wirkstoffe gegen Mykobakterien werden. Die Untersuchung der Enzyme, die dieses System bilden, ist folglich eine interessante Vorgehensweise, um neue Angriffsziele für Antibiotika zu suchen.
Die starke Hemmung der Aktivität von FAS-II durch das Isoniazid und vor allem die Tatsache, dass sich unter der Wirkung von INH kein Zwischenprodukt der Biosynthese, und insbesondere kein InhA-Substrat, ansammelt, legen nahe, dass es neben dem InhA ein weiteres Angriffsziel des Antibiotikums geben könnte. Das Protein MabA, das durch ein an inhA angrenzendes Gen auf dem Chromosom des Bakteriums M. tuberculosis kodiert wird, gehört wahrscheinlich zum gleichen Enzymsystem wie das InhA. Verschiedene Daten lassen vermuten, dass MabA ein Angriffsziel des Isoniazids sein könnte. Andererseits haben Punktmutationen an der Initiationsstelle des mabA-inhA-Genorts klinischer Isolate von M. tuberculosis die Überproduktion von Proteinen stromabwärts zur Folge und korrelieren mit einem Phänotyp der Resistenz gegenüber INH. Dies legt nahe, dass zusätzlich zu der Überproduktion an InhA, die durch diese Mutationen hervorgerufen wird, auch die Überproduktion von MabA an der Resistenz beteiligt sein könnte, wenn dieses Protein mit Isoniazid in Wechselwirkung tritt. Andererseits hat die Untersuchung der Wirkung des Isoniazids (2 mM) auf die aufgereinigten Enzyme des aus M. avium isolierten FES-Systems gezeigt, dass zwei Phasen des Systems INH-empfindlich sind, die β-Ketoacylreduktase (93% Hemmung und Ki = 353 μM), die am empfindlichsten ist, und die Enoylreduktase (26% Hemmung und Ki = 5,5 mM) (Kikuchi u.a., 1989).
Es ist deshalb entschieden worden, das Protein MabA aufzureinigen und einige seiner biochemischen Eigenschaften zu untersuchen, wobei eine Strategie der Überproduktion des Proteins in einem prokaryotischen System gewählt wird.
1. ÜBERPRODUKTION VON MABA IN ESCHERICHIA COLI (zum Vergleich)
Eine Enzymstudie durchzuführen und anti-MabA-Antikörper für die intrazelluläre Lokalisierung des MabA zu erzeugen, erfordert die Gewinnung des reinen Proteins in löslicher Form und in großer Menge. Für eine Überproduktion von MabA ist ein Expressions- und Aufreinigungssystem in Escherichia coli verwendet worden, das einfach und für die Überexpression von prokaryotischen Genen sehr effizient ist. Die Entwicklung einer experimentellen Vorgehensweise, um eine ausreichende Überproduktion zu erreichen, wobei das Protein in löslicher Form gewonnen wird, erforderte die Optimierung auf mehreren Ebenen des Überexpressions- und Aufreinigungsschemas.
1.1 Klonieren des Gens mabA von Mycobacterium tuberculosis H37Rv (zum Vergleich)
Die Bestimmung der vollständigen Sequenz des Genoms von Mycobacterium tuberculosis H37Rv (Cole u.a., 1998) und die Entwicklung von molekularbiologischen Techniken, die die Manipulation rekombinanter DNA ermöglichen, haben die Erzeugung und die Untersuchung des Proteins, dem das Interesse gilt, MabA, vereinfacht.
1.1.1 Beschreibung des Systems der Expression von mabA in Escherichia coli
* Wahl des Expressionsvektors pET (plasmid for Expression by T7 RNA polymerase)
In dem verwendeten Expressionsvektor pET-15b (Novagen) wird das Zielgen unter der Kontrolle der Transkriptions- und Translationssignale des Bakteriophagen T7 kloniert. Das Gen mabA (fabG1) aus 741 Basenpaaren, das das Protein MabA kodiert, ist durch Kettenwachstumsreaktion (PCR) ausgehend vom Cosmid MTCY277 (Institut Pasteur) amplifiziert und zwischen den Spaltstellen NdeI und Xho des Plasmids kloniert worden. Dieses Plasmid bietet den Vorteil, dass bei NH2-terminaler Fusion des rekombinanten Proteins eine spaltbare poly-Histidin-Sequenz erhalten wird, die eine schnelle Aufreinigung des Proteins durch Affinitätschromatographie ermöglicht. Die Konstruktion umfasst folglich stromaufwärts des Gens mabA eine Sequenz, die 6 aufeinanderfolgende Histidine und die Spaltstelle für Thrombin kodiert.
* Wahl des Wirtsstammes
Der gewählte Wirtsstamm von E. coli, BL21(λDE3) (Novagen), hat den Vorteil, dass er zwei inaktive Gene, ompT und lon, besitzt. Die Gene ompT [(Studier & Moffatt, 1986); (Studier u.a., 1990)] und lon (Phillips u.a., 1984) kodieren die wandständige Protease (für den Abbau heterologer Proteine verantwortlich) und die in der Hauptsache zytoplasmatische Protease (für den Abbau schwach gefalteter oder instabiler Proteine verantwortlich). BL21(λDE3) ist für den Bakteriophagen DE3 (von λ abgeleitet) lysogen und überbringt deshalb eine chromosomale Kopie des Gens der T7-RNA-Polymerase unter der Kontrolle des lacUV5-Promotors, der durch IPTG (Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranosid) induzierbar ist. Die Zugabe von IPTG zu einer Kultur des Lysogens induziert die Expression der T7-RNA-Polymerase, die ihrerseits die Ziel-DNA auf das Plasmid transkribieren wird.
1.1.2 Transformation und Selektion
Die Transformation des kompetenten E. coli-Stammes BL21(λDE3) durch das pET-15b::mabA-Plasmid ist durch ther mischen Schock ausgeführt worden (Material und Methoden). Die Effizienz der erzielten Transformation beträgt 5,9 103 CFU/μg DNA. Es ist die geringe Transformationseffizienz zu beachten, die für coli B-Stämme, wovon BL21(IDE3) abgeleitet ist, charakteristisch ist.
Die Auswahl der Zellen, die das Plasmid aufgenommen haben, erfolgt anhand der erworbenen Ampicillinresistenz. Bei den Auswahlversuchen ist vorzugsweise Carbenicillin, ein stabiles β-Laktam verwendet worden, und eben nicht das Ampicillin, von dem bekannt ist, dass es durch die von den resistenten Bakterien sekretierten β-Laktamasen schnell abgebaut wird.
1.1.3. Überprüfung der Sequenz des klonierten mAbA-Gens
Um zu überprüfen, dass bei dem Schritt der Amplifikation des mabA mittels PCR keine Mutation eingeführt worden ist, wurde die Sequenz des klonierten Gens analysiert. Es wurde keine Mutation gefunden; die klonierte Sequenz ist mit jener identisch, die das ursprüngliche Cosmid trägt.
1.2. Heterologe Expression und Optimierung
Die Optimierung der Expression eines heterologen Gens erfordert eine vorausgehende Untersuchung in kleinem Maßstab, um die Wahl der Kultivierungsbedingungen und der Induktionsparameter (OD, Temperatur, Konzentration des Induktors und Induktionsdauer) zu treffen. Die Entwicklung dieser Bedingungen hat ermöglicht, die Prozedur zu definieren, die einzuhalten ist, um eine ausreichende Überproduktion des Proteins zu erzielen, das bei einer Gelelektrophorese (SDS-PAGE) sichtbar sein soll. Trotz aller Bemühungen, die Überexpression in größerem Maßstab zu reproduzieren, ist es jedoch nicht gelungen, das Protein MabA durch die induzierten Bakterien erzeugen zu lassen. Die plausibelste Hypothese war der Verlust des Plasmids trotz des Fortbestands der Kulturen in einem das Antibiotikum enthaltenden Medium. Angesichts dieses Problems bot der Plasmidstabilitätstest in einer Schale (Material und Methoden) einen schnellen und zuverlässigen Weg, um in den Kulturen vor einer Induktion einerseits das Vorhandensein des Zielplasmids und andererseits die Fähigkeit der kultivierten transformierten Bakterien, die heterologe DNA zu exprimieren, zu überprüfen.
Die heterologe Expression von mabA in E. coli hat sich als besonders empfindlich gegen Kultivierungsbedingungen erwiesen, die sich auf die Stabilität des Plasmids auswirken. Für eine optimale Expression ist es wichtig, dass zwei Bedingungen erfüllt werden:

– Die Transformanten-Kolonien müssen frisch sein (direkt von einer Transformation oder einer Ausplattierung in Streifen, ausgehend von einem bei -70°C aufbewahrten flüssigen Vorrat kommen).
– Die Anzahl der Generationen zwischen der Transformation der Bakterien durch das Plasmid und der Induktion der Expression muss auf ein Minimum reduziert sein (Vermeidung von Zwischenkulturen).

2. AUFREINIGUNG VON MABA (zum Vergleich)
2.1 Löslichkeit des überproduzierten Proteins und Optimierung
Für die Festlegung der Aufreinigungsstrategie ist es wichtig zu wissen, ob das Protein in löslicher Form erzeugt wird oder ob es sich in Einschlusskörpern (Proteinaggregaten) befindet.
Die Tests in kleinem Maßstab, um die Löslichkeit unter optimalen Induktionsbedingungen zu bestimmen, haben einige interessante und unerwartete Punkte enthüllt. Der erste ist, dass die Veränderungen, die an den Induktionsparametern (Temperatur, OD oder Induktionsdauer) mit dem Ziel vorgenommen wurden, die Löslichkeit zu verbessern, scheinbar keine wesentlichen Konsequenzen für die bevorzugte Erzeugung des Proteins MabA in der einen oder der anderen Form haben. Dagegen ist überraschenderweise festzustellen gewesen, dass die Technik, die angewendet wurde, um die Bakterien zu lysieren, die Verteilung des Proteins in die lösliche Fraktion und die unlösliche Fraktion modulierte. Beispielsweise ist die Beschallung bei niedriger Temperatur und kleinem Volumen (Konzentrationsfaktor der Kultur FC > 20) wahrscheinlich für die Ausfällung von MabA in den Rückstand (unlösliche Fraktion) verantwortlich. Die Wirkung von lokal erhöhten Temperaturen, die durch den Ultraschall verursacht sind, könnte dieses Phänomen der Aggregation-Ausfällung von MabA erklären. Die Lyse einer Bakteriensuspension mit einer geringeren Zelldichte ermöglicht, das Ausfällen von MabA bei der Beschallung zu vermeiden.
Eine zu den Wirkungen von Ultraschall auf die Enzyme durchgeführte Untersuchung (Coakley u.a., 1973) offenbart, dass die Zellextrakte, die durch Ultraschalldesintegration aufbereitet wurden, empfindlich gegen Schädigungen sind, die durch die freien Radikale verursacht sind, die wahrscheinlich durch den Ultraschall sowie durch die Wirkung lokal höherer Temperaturen erzeugt werden. Diese Autoren zeigen, dass die „schädigende" Wirkung während der Lyse der Bakterien durch eine Beschallung bei hoher Zellkonzentration und in Gegenwart von Bestandteilen des Medium wie etwa Zucker (als „Radikalfänger" wirkend) minimiert werden kann. Diese Folgerungen scheinen nicht mit den hier erzielten Ergebnissen konform zu sein, die nämlich zeigen, dass sich bei einer geringeren Zelldichte bei der Lyse des MabA das Protein in der „löslichen" Fraktion befindet. Hinsichtlich der Aktivität des Proteins unter diesen Bedingungen ist man jedoch nicht vorangekommen.
Nach einem Vergleich mehrerer Lysetechniken im angestrebten Produktionsmaßstab hat man sich für eine Lyse durch Lysozym, gefolgt von einem Gefrier-Auftau-Zyklus, entschieden. Nach diesem Protokoll befindet sich unter den gewählten Induktionsbedingungen [OD600 = 0,8, 2 h bei 37°C, 0,8 mM IPTG] ein großer Teil des Proteins MabA in der löslichen Fraktion.
2.2 Aufreinigungssystem
Der Erhalt des Proteins MabA mit einem poly-His-Tag (H-MabA) erleichtert sein Aufreinigen. Die starke Affinität der Histidinreste zu den Metallionen ermöglicht, das Metallchelatchromatographieverfahren (IMAC: Immobilized Metal Ion Affinity (engl.)) anzuwenden. Eine der wegen ihrer Effizienz am häufigsten verwendeten Matrizen ist Nickel-Nitrilotriacetat-(Ni-NTA-) Agarose (QIAGEN). Die NTA-Gruppe weist 4 Chelatbildungszentren auf, die mit 4 der 6 Koordinationszentren des Ni-Metallions in Wechselwirkung treten. Die Imidazolkerne der Histidinreste binden an Nickelionen auf der Ni-NTA-Matrix. Die Zugabe von Imidazolmolekülen ermöglicht, durch Konkurrieren mit den Histidinresten, die Bindungen zwischen den Proteinen und der Matrix zu sprengen und das angelagerte poly-His-Protein zu eluieren. Die Affinität eines Proteins zu der Ni-NTA-Agarose-Matrix ist von der Anzahl der Histidinreste, die es aufweist und die der Matrix ausgesetzt werden, abhängig. Folglich kann man durch Einstellen der Konzentration an Imidazol verschiedenen Proteinspezies eluieren, die unterschiedliche Affinitätsgrade repräsentieren. Die sehr starke Affinität der Proteine, die ein poly-His-Tag aufweisen, zu Nickel ermöglicht, sie von der Mehrheit der von E. coli mitproduzierten Proteine zu trennen. Wenn sich die Bindung des Proteins H-MabA als hinreichend spezifisch erweist, wird sich folglich die Aufreinigung auf einen einzigen Affinitätschromatographie-Schritt beschränken.
2.3 Aufreinigung von MabA unter nativen Bedingungen
Die Entwicklung von Bedingungen zur Elution des Proteins MabA über Ni-NTA-Harz-Agarose wird in kleinem Maßstab (50 μl) vorgenommen, wobei das sogenannte batchweise Harzabscheidungsverfahren angewendet wird. Durch diese Technik konnte man die verschiedenen Konzentrationen an Imidazol bestimmen, die für die Elution des Proteins MabA und für die Eliminierung der anderen Proteine erforderlich sind.
Das an einen größeren Maßstab angepasste Aufreinigen wird in der offenen Säule mit 500 μl Harz in Suspension (Material und Methoden) durchgeführt. Der Übergang von der batchweisen Aufreinigung zur Aufreinigung in der Säule hat einen zusätzlichen Entwicklungsschritt erfordert.
Die Proteinfraktionen, die den verschiedenen Reinigungsschritten entsprechen, werden mittels SDS-PAGE analysiert. Bei dem geklärten Lysat bekundet die Hauptbande, die zwischen 30 und 40 kDa erhalten wird und MabA entspricht, eine recht hohe Überproduktion des Proteins in löslicher Form, nämlich von mehr als 50% der löslichen Proteine von E. coli. Nach dem Schritt der Bindung der Proteine an das Harz ist die Fraktion, die nicht an die Säule gebundene Proteine enthält, frei von MabA, was eine wirksame Bindung des Proteins H-MabA an die Ni-NTA-Matrix anzeigt. Die Eliminierung weiterer schwach an die Matrix gebundener Proteine (durch das Vorhandensein von Histidinen, die in ihren Sequenzen verteilt sind) ist nach mehrmaligem extensivem Waschen mit 50 mM Imidazol erzielt. Es ist eine Imidazolkonzentration von 175 mM nötig, um das Protein H-MabA allein und in sehr großer Menge zu eluieren. Die aus seiner elektrophoretischen Wanderungsgeschwindigkeit gefolgerte scheinbare Masse des H-MabA wird auf 35 kDa veranschlagt.
2.4 Probleme des Ausfällens von MabA während der Aufreinigung
Man stellte fest, dass während der Aufreinigung das in sehr hoher Konzentration eluierte Protein MabA sogleich im Röhrchen ausfällte. Dieses häufig bei Proteinen mit einem poly-His-Tag beobachtete Verhalten ist wahrscheinlich auf unspezifische Protein-Protein-Wechselwirkungen infolge der sehr hohen lokalen Konzentration an Protein bei der Aufreinigung zurückzuführen (TALONTM Metal affinity Resin-User Manual CLONTECH).
Die Versuche, das eluierte Protein mit Detergenzien (Triton X-100, NP-40) löslich zu machen, waren vergeblich. Folglich ist es nötig, vor der Elution des Proteins einzugreifen. Um das Ausfällen des Proteins zu vermeiden, hat man vor und nach der Aufreinigung eine Aufbereitung durchgeführt. Zur Überprüfung, ob das Protein ausfällt, wird die Fraktion, die nach der Elution MabA enthält, zentrifugiert (5 min bei 12000 g), anschließend werden der Überstand und der Rückstand mittels SDS-PAGE analysiert (Material und Methoden). Die Aufbereitung vor dem Auf reinigen besteht darin, zu dem Lysat „milde Lösungsvermittler" zu geben. Nach dem Aufreinigen wird das eluierte Protein direkt in Glycerol (50 final) gewonnen (Glycerol ist ein Schutzstoff, der häufig eingesetzt wird, um die Aktivität der Enzyme zu bewahren).
Es sind drei Bedingungen getestet worden:

– 10% (v/v) Glycerol ohne Zusätze
– 10% (v/v) Glycerol + 0,1% (v/v) Triton X-100 (nicht-ionisches Detergenz)
– 10% (v/v) Glycerol + 0,05% (v/v) (7 mM) β-Mercaptoethanol (Reduktionsmittel).

Die drei Vorgehensweisen haben ermöglicht, die Löslichkeit des Proteins MabA zu verbessern. Es wird jedoch angemerkt, dass bei der Verwendung von 7 mM β-Mercaptoethanol das H-MabA zu Beginn mit einer Konzentration an Imidazol eluiert wird, die viel kleiner ist (50 mM anstelle von 175 mM).
Da das Löslichmachen von MabA in Gegenwart der drei getesteten Agenzien vergleichbar war, hat man sich für die Zugabe von 10%-igem Glycerol ohne Zusätze zu dem Lysat entschieden.
2.5 Optimiertes Protokoll für die Überproduktion und die Aufreinigung von H-MabA
Die Optimierung der Bedingungen für die Überproduktion und Aufreinigung von H-MabA ermöglichte, das folgende Protokoll in Betracht zu ziehen:

– Anlegen einer Kultur mit 200 ml von E.coli/h-mabA auf LB + CBC 50 μg/ml bis DO600 = 0,8;
– Induzieren der Expression mit 0,8 mM IPTG über einen Zeitraum von 2 h, bei 37°C;
– Absetzenlassen der Bakterien durch 15 min langes Zentrifugieren mit 10000 g bei 4°C; Zurücknehmen des Rückstands in 9 ml Lyse-Puffer (5 mM Imidazol und 500 mM NaCl);
– Zugeben des Lysozyms (0,5 mg/ml) und der Proteasehemmer (0,113 mg/ml);
– Tiefgefrieren, eine Nacht lang, bei -70°C;
– Auftauen 1 h bei Raumtemperatur und Behandeln mit DNaseI (5 μg/ml) und RNaseA (10 μg/ml) in Gegenwart von MgCl₂ (10 mM), 15 min bei 4°C;
– Zentrifugieren des Lysats bei 3000 g, dann bei 10000 g und Gewinnen der löslichen Fraktion;
– Zentrifugieren des Überstands 45 min lang bei 44000 g und 4°C und Gewinnen des „geklärten Lysats";
– Zugeben von 10% (v/v) reinem Glycerol zu der löslichen Fraktion und Aufbringen auf eine Minisäule (500 μl der Ni-NTA-Agarose-Phase); Inkubation 1 h bei 4°C unter behutsamem Rühren;
– Waschen der Phase mit 5 × 4 ml Elutionspuffer mit 5 mM Imidazol;
– Vorelution mit 8 × 500 μl 50 mM Imidazol;
– Elution mit 8 × 500 μl 175 mM Imidazol;
– Waschen mit 10 × 500 μl 250 mM Imidazol;
– Zusammenfassen der das Protein enthaltenden Fraktionen entsprechend ihrer Konzentration und ihrer Reinheit. Sammeln des Proteins direkt in einem Volumen, das gleich dem reinen Glycerol ist, Dialysieren gegen 50 mM Kaliumphosphatpuffer pH 7,2, der 50% Glyerol enthält, und Lagern bei -20°C.
– Elutionspuffer: 50 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,8.

2.6 Ausbeute der Aufreinigung
Durch das verwendete Expressions- und Aufreinigungssystem ist es möglich gewesen, das Protein H-MabA bis zur Homogenität in einem einzigen Schritt aufzureinigen. Um die ungefähre Konzentration der Proteinlösung zu erfahren, wurde ihr UV-Absorptionsgrad (Extinktion) bei 280 nm bestimmt. Bei Kenntnis des Absorptionsgrades des Tyrosinrestes und des Tryptophanrestes des Proteins (Material und Methoden) wurde der theoretische molare Extinktionskoeffizient von MabA gefolgert (ε₂₈₀ nm = 9530 M^-1cm^-1), und die Molarität der gereinigten Lösung wurde auf 40 μM geschätzt.
Die beste Aufreinigungsausbeute (Prozentsatz des gereinigten Proteins im Verhältnis zur Gesamtheit aller auf die Säule aufgebrachten Proteine), die erhalten wurde, beträgt 57%. Aus 200 ml der Kultur konnten ungefähr 20 mg reines Protein MabA erhalten werden (Ausbeute 100 mg/l Kultur), was sehr zufrieden stellend ist.
3. CHARAKTERISIERUNG DES GEREINIGTEN MABA-PROTEINS (zum Vergleich)
3.1. Überprüfung der Peptidsequenz
Das in pET-15 klonierte mabA-Gen wurde sequenziert, wobei keine Mutation festgestellt wurde. Die Primärsequenz des Proteins MabA vom Wildtyp weist 247 Aminosäuren auf. Das poly-Histidin-Tag des rekombinanten Proteins fügt ihr 19 Aminosäuren hinzu (insgesamt 266 Aminosäuren). Die Sequenzierung wurde für die ersten 20 Aminosäuren des überexprimierten MabA-Proteins durchgeführt (Biomérieux, Lyon). Man konnte die Identität des Proteins im aminoterminalen Teil bestätigen und den Verlust des ersten Methionin des poly-His-Tags nachweisen. Die Eliminierung des aminoterminalen Methionins der Proteine durch posttranslationale Proteolyse ist bei E. coli sehr häufig.
3.2. Kontrolle der Reinheit der Probe
Die Analyse durch denaturierende Elektrophorese (SDS-PAGE) und Coomassie-Blaufärbung des Eluats MabA zeigt eine einzige Bande, was auf die Homogenität der Zubereitung schließen lässt. Die Reinheit des Proteins ist außerdem durch SDS-PAGE nach Silbernitratfärbung bestätigt worden. Durch dieses sehr empfindliche Nachweisverfahren ist keine Bande verunreinigenden Proteins festgestellt worden.
Um die Masse des gereinigten Proteins genau zu bestimmen, wurde eine Elektrospray-Massenspektrometrie-(ESI-MS) Analyse durchgeführt.
3.3 Bestimmung der Molekülmasse
Die Massenspektrometrie ermöglicht, sehr schnell zu überprüfen, ob das exprimierte Protein die erwartete Masse aufweist. Man hat eine gereinigte Probe mittels Elektrospray-Ionisation/Massenspektrometrie (ESI/MS) in Zusammenarbeit mit B. Monsarrat (IPBS, Toulouse) analysiert. Bei dem verwendeten Gerätetyp bestimmt man die Molekülmasse eines Proteins mit einer Präzision von 0,01% (1/10000). Die aus der Sequenz des Gens vorhergesagte Masse des Proteins MabA (un ter Berücksichtigung des poly-His-Tags) beträgt 27860 Da. Die Analyse mittels ESI/MS bei direkter Einbringung ergibt eine Hauptmasse von 27728 ± 2 Da.
Der Unterschied zwischen der theoretischen Masse und der gemessenen Masse (131 Masseeinheiten) entspricht dem Verlust des ersten Methionins am aminoterminalen Ende, wie durch die Sequenzierung des N-Terminus des Proteins nachgewiesen. Die auf diese Weise bestimmte Molekülmasse des gereinigten Proteins H-MabA beträgt 27 728 Da.
Das Wandern des H-MabA, bei der denaturierenden Elektrophorese, zu 35000 Da könnte mit physikalisch-chemischen Eigenschaften des Proteins und/oder seiner nativen Form zusammenhängen.
3.4. Bestimmung der Quartärstruktur von MabA durch Gelfiltration
Die Ausschlusschromatographie ermöglicht, die native Form (Quartärstruktur) des Proteins in Lösung bei einer gegebenen Konzentration und unter definierten Bedingungen hinsichtlich der pH-Wertes und der Ionenstärke zu bestimmen. Durch diese Technik ist es möglich, über eine Kalibrationskurve eine Beziehung zwischen dem Elutionsvolumen des Proteins und seinem Molekülgewicht herzustellen. Aus Elutionsprofilen von Standard-Proteinen (Pharmacia) wird die Kalibrationskurve erstellt.
Die Elution des Proteins MabA (0,66 mg) ist unter den gleichen Bedingungen wie die der Standard-Proteine durchgeführt worden. In dem Chromatogramm ist ein eluierter asymmetrischer Peak in Richtung der hohen Molekülgewichte festzustellen. Das der Spitze des Peaks entsprechende Elutionsvolumen gibt an, dass die Hauptmolekülmasse (94,6 kDa) im Bereich zwischen 110916 Da und 83187 Da enthalten ist, was der Tetramerform bzw. Trimerform von H-MabA entspricht. Die leichte Schulter, die an dem Profil (etwa bei 57,7 kDa) zu erkennen ist, zeigt das Vorhandensein, in geringerem Anteil, einer Dimerform (55458 Da) des Proteins. Diese Ergebnisse legen nahe, dass es wahrscheinlich ein Dimer-Tetramer-Gleichgewicht des Proteins MabA gibt. Die Untersuchung der Tertiärstruktur durch Molekül-Modellierung des MabA gibt dieser Hypothese den Vorrang (siehe nachstehend). Es ist jedoch wichtig hervorzuheben, dass die Bestimmung der Oligomerstruktur durch Gelfiltration von den Testbedingungen und insbesondere von der Konzentration der Proteinlösung abhängig ist. Die Möglichkeit, dass das Protein MabA in vivo in Tetramerform vorliegt, wird nachstehend erörtert.
3.5 Physikalisch-chemische Eigenschaften des Proteins MabA
Einige physikalisch-chemische Eigenschaften des MabA können mit Hilfe eines Berechnungsprogramms, das im Internet zur Verfügung steht (aBi), aus seiner Peptidsequenz gefolgert werden. Die Sequenz von 266 Aminosäuren des erzeugten Proteins H-MabA ergibt eine berechnete Masse von 27729,37 Da. Sie entspricht bis auf eine Masseeinheit jener, die mittels ESI/MS bestimmt wurde. Weitere Eigenschaften sind in der nachfolgenden Tabelle I zusammengefasst.

(*)durch Berechnen anhand der Peptidsequenz bestimmt

Tabelle I: Physikalisch-chemische Eigenschaften des H-MabA
4. Katalytische Aktivität von MABA (zum Vergleich)
Bei der Zuschreibung einer potenziellen Aktivität zu einem Protein unbekannter Funktion wird sich oftmals an der Sequenzähnlichkeit, die es mit bekannten Proteinen hat, orientiert. Die Untersuchung der Primärstruktur des Proteins MabA offenbart eine ausgeprägte Identität mit der Sequenz der β-Ketoacyl-ACP-Reduktase FabG von E. coli (44 Identität über 241AA) sowie mit den β-Ketoacyl-ACP-Reduktasen anderer Bakterien oder Pflanzen. Diese enzymatische Aktivität entspricht einer der Phasen des herkömmlichen Biosyntheseweges von Fettsäuren. Die Verlängerung von Fettsäuren durch das mykobakterielle System FAS-II erfordert das Protein InhA, das die NADH-abhängige Phase der Enoyl-ACP-Reduktion katalysiert. Da das Verlängerungssystem FAS-II mehrere aggregierte Enzyme umfasst, war es logisch, das Vorhandensein des MabA-Proteins assoziiert an InhA in demselben Enzymkomplex in Betracht zu ziehen. Ein starkes Argument zugunsten der Verwicklung von MabA und InhA in denselben Stoffwechselweg beruht auf der Operon-Organisation der Gene mabA und inhA bei M. tuberculosis. Die an der Fettsäurebiosynthese beteiligten Gene sind oft in „Clustern" gruppiert, wie beispielsweise bei E. coli (Rawlings & Cronan, 1992) und bei Vibrio harveyi (Shen & Byers, 1996).
Der Nachweis der β-Ketoacylreduktase-Aktivität des gerei nigten Proteins MabA ist der erste Schritt zu seiner Charakterisierung als potenzieller Partner des InhA bei der Fettsäurebiosynthese.
4.1 ENZYMATISCHE CHARAKTERISIERUNG DES MABA-PROTEINS (zum Vergleich)
4.1.1. Nachweis der katalytischen Aktivität von MabA
4.1.1.1. Beschreibung des Enzymtests
Die Aktivität des gereinigten Proteins H-MabA ist zunächst in Gegenwart des einzigen im Handel erhältlichen Ketoacyl-CoA, Acetoacetyl-CoA, und NADPH als Elektronendonator getestet worden. Die Zugabe von reinem MabA zu den Substraten startet die Reaktion. Der Verlauf der Reaktion wird über 5 min durch Messen der Abnahme der Extinktion bei 340 nm, die das Verschwinden des Cosubstrats NADPH zugunsten seiner oxidierten Form NADP+ (die nicht bei dieser Wellenlänge absorbiert) wiedergibt, verfolgt.
Unter den definierten Standardenzymtestbedingungen (siehe Material und Methoden) ist H-MabA imstande, Acetoacetyl-CoA zu reduzieren. Das gereinigte Protein H-MabA ist folglich funktionell: Es entspricht einer β-Ketoacylreduktase (KAR). Das Vorhandensein des poly-His-Tags an der N-terminalen Position scheint seine Aktivität nicht zu beeinträchtigen.
Das Ersetzen des NADPH durch das NADH gleicher Konzentration bei dem Kinetiktest hat einen vollständigen Aktivitätsverlust zur Folge. Das Protein MabA ist folglich streng NADPH-abhängig. Das Vorhandensein eines Bindungsmotivs von NADP(H) in der Peptidsequenz des MabA bestätigt dieses Ergebnis. Die KARs anderer Organismen sind meist NADPH-abhängig und streng spezifisch für das Nukleotid-Coenzym.
4.1.1.2 Die Aktivität des Proteins MabA beeinflussende Parameter
Die Aktivität eines Enzyms wird direkt beeinflusst durch die Konzentration seiner Substrate, aber auch durch Parameter wie die Art des Puffers, pH-Wert, Ionenstärke, Temperatur. Um die Reaktionsbedingungen zu optimieren, hat man die Wirkung des pH-Wertes und der Ionenstärke auf die Aktivität von MabA untersucht.
* Wirkung des pH-Wertes
Die Wirkung des pH-Wertes auf die enzymatische Aktivität von MabA ist unter Verwendung von Natriumphosphatpufferlösungen mit einem pH-Wert von 5,0 bis 8,0 im Reaktionsmedium ermittelt worden. Der Vergleich der Ergebnisse für den gewählten pH-Bereich zeigt, dass die optimale Aktivität von MabA bei einem pH-Wert von 5,5 erhalten wird. Jedoch ist bei einem sauren pH (5,0 bis 6,5) das NADPH sehr instabil und wird spontan oxidiert, was eine Veränderung des Absorptionsgrades (Extinktion) im Laufe der Zeit in Abwesenheit von Enzym zur Folge hat. Man hat sich deshalb dafür entschieden, bei pH-Werten nahe dem physiologischen pH-Wert (zwischen 7,0 und 7,5) zu arbeiten, für welche die Basislinie eine gegenüber der Steigung der Katalyse zu vernachlässigende Steigung hat (weniger als 5 bis 10%). Andere β-Ketoacyl-ACP-Reduktasen weisen einen optimalen pH-Wert im sauren Bereich (um 6,0 bis 6,5) auf [(Shimakata & Stumpf, 1982); (Caughey & Kekwick, 1982)].
Wenn MabA eine höhere Aktivität bei einem pH-Wert von 5,5 aufweist, steht dies wahrscheinlich mit einer Protonierung im Zusammenhang, die an der Bindung der Substrate oder an der Katalyse beteiligt ist. Dieses Ereignis könnte zwei His-Reste des Proteins betreffen, H46 und H247, (pKa des Imidazolkerns des Histidinrestes ist gleich 6,0 bis 6,5), die nach dem Strukturmodell von MabA potenziell am aktiven Zentrum beteiligt sind.
* Wirkung der Ionenstärke
Die getestete MabA-Aktivität ist für Konzentrationen des Phosphatpuffers zwischen 20 und 100 mM konstant. Man hat sich für einem Puffer mit 80 mM, pH 7,0 entschieden.
* Wirkung einer Verdünnung
Die Enzymtests, die eine Vorinkubation des H-MabA benötigen, haben gezeigt, dass die katalytische Aktivität mit der Zeit schnell abnimmt, wenn das Enzym in einer geringen Konzentration (Molarität < 1 μM) inkubiert wird. Die Desaktivierung durch Verdünnen der β-Ketoacyl-ACP-Reduktasen von E. coli und von Pflanzen (Brassica napus, Persea americana) ist schon berichtet worden (Schulz & Wakil, 1971); (Sheldon u.a., 1990); (Sheldon u.a., 1992)].
4.1.2. Bestimmung der kinetischen Parameter von MabA
Die Charakterisierung eines Enzyms umfasst im Allgemeinen die Bestimmung der maximalen Reaktionsgeschwindigkeit Vmax und der „Michaelis-Konstanten" Km für jedes Substrat. Die Kenntnis dieser Parameter erweist sich als sehr nützlich für die biochemischen Untersuchungen (Vergleich der Affinität zu verschiedenen Substraten, Wechselwirkung mit anderen Molekülen, Vergleich von Isoenzymen verschiedener Organismen) und insbesondere, um die Wirksamkeit von Hemmstoffen oder von Aktivatoren des Enzyms zu definieren.
4.1.2.1 Messung von Km für das NADPH
Die Bestimmung der kinetischen Parameter Vmax und Km beginnt mit der Abschätzung des Wertes von Km, wobei zwei Substratkonzentrationen, eine niedrige und eine hohe, getestet werden. Die anfänglichen Reaktionsgeschwindigkeiten werden dann für einen Konzentrationsbereich des Substrats bestimmt, der vorzugsweise so groß ist, dass, falls möglich, der Bereich von Km/2 bis 5 Km abgedeckt wird. Es wurde die Gerade S/v = f(S) oder 1/v = f(1/S) aufgezeich net, um die Daten darzustellen; anschließend wurden die mittels dieser Methode berechneten Werte von Km und Vmax und jene, die mittels der Methode der kleinsten Fehlerquadrate erhaltenen worden waren, verglichen. Die erhaltenen Werte sind der Mittelwert von drei Versuchen. Die Bestimmung von S/v = f(S) führt zu Ergebnissen, die jenen nahekommen, die mittels der Methode der kleinsten Fehlerquadrate erhalten werden. Der für das NADPH erhaltene Km-Wert, 39 μM, ist ungefähr fünfmal größer als jener des Proteins InhA für seinen Cofaktor NADH (8 μM). Dieses höhere Km spiegelt wahrscheinlich eine weniger starke Affinität des MabA zu seinem Coenzym wider. Die Km-Werte von β-Ketoacylreduktasen anderer Organismen für ihren Cofaktor sind von gleicher Größenordnung wie jener, der für MabA erhalten wurde.
4.1.2.2 Messung von Km für Acetoacetyl-CoA
Der Km-Wert für das Acetoacetyl-CoA, in Gegenwart von NADPH bestimmt, beträgt 1582 μM. Dieser verhältnismäßig hohe Wert für Km ist deutlich höher als die für andere β-Ketoacyl-ACP-Reduktasen von Pflanzen beschriebenen Km-Werte. Die Tatsache, dass MabA ein höheres Km als diese Enzyme aufweist, die de novo-Synthesesystemen angehören, folglich spezifisch für kurzkettige Substrate sind, könnte daran denken lassen, dass MabA eine Präferenz für Substrate mit mehr als 4 Kohlenstoffatomen in der Kette haben könnte. Die Untersuchung der MabA-Spezifität für Substrate mit einer längeren Kohlenwasserstoffkette schien demnach doppelt bedeutsam, zum einen, um die enzymatische Aktivität dieses Proteins besser zu charakterisieren, und zum anderen, um die Substratspezifität von MabA mit jener von InhA zu vergleichen. Es ist gezeigt worden, dass das Protein InhA für Substrate mit langer Kette (12 bis 24 Kohlenstoffatome) spezifisch ist, wohingegen es in Gegenwart eines Substrats mit 4 Kohlenstoffatomen (Crotonoyl-CoA) selbst bei 8 mM keine Aktivität zeigt (Quémard u.a., 1995).
4.1.3. Bestimmung der kinetischen Konstanten für die langkettigen Substrate
Die Verwendung von langkettigen Substraten (C8 bis C20) erlegt Beschränkungen auf, die mit deren kritischer mizellaren Konzentration (CMC: Critical Micelle Concentration (engl.)) im Zusammenhang stehen. Die langkettigen Acyl-CoAs sind amphiphile Verbindungen und bilden nur bei niedriger Konzentration echte Lösungen. Jenseits der CMC bildet ein Teil der Moleküle Mizellen, und die Konzentration an Monomer ist an die CMC gebunden, folglich von der Gesamtkonzentration verschieden. Es war deshalb wichtig, Lösungen zu verwenden, deren Konzentrationen niedriger als die CMC sind. Bei einer Untersuchung der physikalischen Eigenschaften von Acyl-CoA (Constantinides & Steim, 1985) wurden die CMCs wässriger Lösungen von Palmitoyl-CoA (C16-CoA) und Stearoyl-CoA (C18-CoA) zu 70 bzw. 12 μM bestimmt. Das Vorhandensein eines ungesättigten Zustandes (an Position 9) im Fall des Oleyl-CoA (C18:1-CoA) erhöht seine CMC auf 33 ?M. Das Vorliegen einer Ketonfunktion an der Kette hätte theoretisch eine ähnliche Wirkung in Bezug auf die CMC. Unter Verwendung dieser Daten hat man versucht, β-Ketothioester-Lösungen herzustellen, deren Konzentration niedriger als die CMC sein sollte. Die Vorratslösungen, die für die kinetischen Tests verwendet werden, sind zu 400 μM und 100 μM für die C8- bzw. C12-β-Ketothioester.
4.1.3.1. Messung von Km bei C8- und C12-β-Ketoacyl-CoA
Es wurden die kinetischen Parameter von MabA für β-Ketooctanoyl-CoA (C8) und β-Ketododecanoyl-CoA (C12) gemessen. Das Protein weist ein Km (60 μM) für das C8-Substrat auf, das 25-mal kleiner als jenes des C4-Substrats (1582 μM) ist. Das C12-Derivat erweist sich allerdings als ein noch besseres Substrat (Km von 9 μM). Wiederum sind die Werte, die nach der Hanes-Methode erhalten wurden, und jene nach der „Methode der kleinsten Fehlerquadrate" nahe beieinander. Es wurde das Verhältnis Km/Vmax berechnet, das die Affinität des Enzyms zu diesen Substraten widerspiegelt. Km/Vmax ist desto so niedriger, umso länger die Kette des Substrats ist. Diese Korrelation ist nicht nur auf niedrigere Km-Werte zurückzuführen, sondern auch auf höhere Werte für Vmax bei längeren Ketten.
Für das C16-Substrat und das C20-Substrat konnten die kinetischen Konstanten Km und Vm nicht bestimmt werden. Bei diesen β-Ketoacyl-CoA mit mehr als 12 Kohlenstoffatomen stieß man auf Probleme der Hemmung durch das Substrat, die auch im Fall der Verwendung von InhA-Substraten mit einer Größe über C16 beschrieben sind. Folglich hat man die anfänglichen Reaktionsgeschwindigkeiten bei gleicher Konzentration (2 μM) in Gegenwart von verschiedenen β-Ketoacyl-CoAs (C4 bis C20) verglichen. Für die Messung der Aktivität war es erforderlich, unterschiedlich konzentrierte Enzymlösungen für die verschiedenen β-Ketothioester-Substrate zu verwenden. Das Protein MabA zeigt eine starke Präferenz für das Substrat mit 12 Kohlenstoffatomen, verglichen mit kurzkettigen Substraten, und die β-Ketothioester mit C16 und C20 erwiesen sich als mindestens genauso gute Substrate wie jene mit C8. Das Absinken der Reaktionsgeschwindigkeit, das bei den langkettigen β-Ketooester beobachtet wurde, könnte mit ihrer schwachen Löslichkeit zusammenhängen (in dem Fall, in dem die tatsächliche Konzentration an freien Molekülen niedriger als 2 μM wäre).
4.1.3.2. Substratspezifität und Beteiligung an einem Verlängerungsweg?
Obwohl es in Gegenwart von β-Ketoacyl mit 4 Kohlenstoffatomen eine Aktivität aufweist, zeigt das Protein MabA eine deutliche Präferenz für die Substrate mit 12 bis 16 Kohlenstoffatomen (C12 bis C16). Die Affinität von MabA zu den Substraten mit langer Kohlenwasserstoffkette ist mit der Größe und dem hydrophoben Charakter der Substratbindungstasche in Übereinstimmung. Was das Protein InhA angeht, so weist es eine geringfügig verschiedene Affinität auf, bei einer Präferenz für Substrate mit längeren Ketten (C16 bis C24) (Quémard u.a., 1995). Die Enzymeigenschaften von MabA und InhA, insbesondere ihre Spezifität für Substrate mit mittlerer bis langer Kette weisen in die Richtung ihrer Zugehörigkeit zu demselben System zur Fettsäurenverlängerung, FAS-II, das seinerseits für C12- bis C18-Substrate spezifisch ist.
Die Substratspezifität von InhA unterscheidet sich von jener der Enoylreduktasen der Systeme vom Typ II von Spinacea oleracea (Shimakata & Stumpf, 1982)) oder von E. coli (Weeks & Wakil, 1968), die eine Präferenz für Substrate mit 6 und 8 Kohlenstoffatomen (C6 und C8) haben. Außerdem ist die β-Hydroxyacyldehydratase des Systems vom Typ II von E. coli (Birge & Vagelos, 1972) spezifisch für Substrate mit kurzer Kette (C4 bis C12), wohingegen sie in Gegenwart eines C16-Substrats sehr wenig aktiv ist. Diese Daten unterstreichen die besondere Substratspezifität des mykobakteriellen FAS-II-Systems.
4.1.4. MabA- und ACP-Abhängigkeit?
Der InhA enthaltende Enzymkomplex, der als das Verlängerungssystem FAS-II identifiziert wurde, hat neben seiner Spezifität für die C12- bis C18-Substrate die Eigenschaft, ACP-abhängig zu sein. Die ACP-Abhängigkeit des Proteins InhA wird durch seine viel stärker ausgeprägte Affinität zu den vom ACP abgeleiteten Substraten illustriert (das Km für Octenoyl-ACP ist zwei Größenordnungen kleiner als jenes für das Derivat des CoA mit 8 Kohlenstoffatomen (C8)). Ein Bestimmen der Präferenz von MabA für ACP-Derivate erfordert die Synthese dieser (nicht im Handel erhältlichen) Derivate und den Vergleich der kinetischen Konstanten mit jenen der CoA-Derivate. Die KARs von Pflanzen sind ACP-abhängig, wo bei es sich um eine Eigenschaft handelt, die mit ihrer Zugehörigkeit zu einem System vom Typ II in Korrelation gebracht worden ist. Die zahlreichen Argumente zugunsten der Zugehörigkeit des MabA zu FAS-II legen die ACP-Abhängigkeit der β-Ketoacylreduktase sehr nahe.
Schlussfolgerung
Nach der Entwicklung der Überproduktion des MabA-Proteins in Escherichia coli und der Aufreinigung hat man eine enzymatische Untersuchung dieses Proteins durchgeführt. So ist gezeigt worden, dass seine katalytische Aktivität der NADPH-abhängigen Reduktion von β-Ketoestern entspricht, was einer der Etappen des Fettsäureverlängerungsweges entspricht. Die Bestimmung der MabA-Aktivität in Gegenwart von Substraten mit verschiedenen Kettenlängen hat ermöglicht, die Präferenz dieses Enzyms für Substrate mit einer Größe von mindestens 12 Kohlenstoffatomen zu zeigen, was in Übereinsstimmung mit seiner potenziellen Verwicklung in ein Fettsäureverlängerungssystem ist. Man hat also das Protein MabA in dem InhA enthaltenden Enzymkomplex FAS-II erforscht und die Verwicklung von MabA in die Verlängerungsaktivität dieses Systems untersucht.
5. BEITRAG DER MOLEKÜL-MODELLIERUNG ZUR UNTERSUCHUNG DES PROTEINS MABA (zum Vergleich)
Die Molekül-Modellierung ermöglicht, auf eine Menge von Informationen zuzugreifen, welche die Strukturmerkmale des Proteins, den Aufbau des katalytischen Zentrums betreffen, aber auch, die Möglichkeiten von Wechselwirkungen mit Liganden (Substraten, Hemmstoffen, affinen Molekülen) abzuschätzen. Die Erstellung des dreidimensionalen Modells des Proteins MabA ist nachstehend dargelegt.
5.1. Suche nach Proteinen, die eine starke Sequenzähnlichkeit mit MabA aufweisen
Die Suche nach Peptidsequenzen, die jener von MabA (M. tuberculosis) ähnlich sind, in den Datenbanken mit der Software Psi-blast (Altschul u.a., 1997) hat gezeigt, dass es bei weiteren Mykobakterienspezies (avium, smegmatis, leprae) β-Ketoacyl-ACP-Reduktasen gibt, die einen hohen Grad der Identität mit MabA aufweisen (87%, 84% bzw. 69%). Zu MabA homologe Proteine, FabG genannt, sind ebenfalls in weiteren Organismen vorhanden, insbesondere in Bakterien (beispielsweise in Streptomyces ceolicolor, 57% Identität) und Pflanzen. Es ist jedoch noch nie eine Struktur der β-Ketoacyl-ACP-Reduktase aufgelöst worden. Ein Molekülmodell von MabA zu erstellen, war folglich ein Anliegen bei der Untersuchung von FabG.
5.2. Erstellung des MabA-Modells
Die Strukturmodellierung von Maba ist unter Verwendung des Programms Modeller 4 (Sali & Blundell, 1993) durchgeführt worden. Das Modell basiert auf den Strukturen von Proteinen, die im Komplex mit NAD(P)(H) kristallisiert sind und den höchsten Identitätsgrad und die niedrigste Wahrscheinlichkeitsbewertung (Score, E) mit MabA aufweisen. Diese „Hilfsproteine", die durch die Software Psi-blast (Altschul u.a., 1997) aus der Proteinstruktur-Hauptdatenbank, der PDB (Protein Data Bank, (Berman u.a., 2000)), ausgewählt werden, sind: PDB2HSD (34%/NAD); PDB1YBV (33%/NADPH); PDB2AE2 (29%/NADP); PDB1FMC (28%/NADH); PDB1CYD (28%/NADPH) und PDB1BDB (27%/NAD). Diese Proteine verschiedenster Herkunft katalysieren alle entweder die Reduktion eines Carbonyls (wie MabA) oder die Rückreaktion. Das für die Modellierung verwendete Sequenzalignment wurde unter Berücksichtigung der gut erhaltenen Regionen zwischen MabA und den Hilfsproteinen einerseits und zwischen MabA und den anderen bekannten β-Ketoacyl-ACP-Reduktasen (FabG) andererseits durchgeführt. Um zu bestätigen, dass das Modell in energetischer Hinsicht stabil ist, wurden zwei Pro gramme verwendet: TITO (Labesse & Mornon, 1998) und Verify-3D (Luthy u.a., 1992), die zufriedenstellende Scores lieferten.
Die von dem MabA-Modell gelieferte Monomerstruktur lässt darauf schließen, dass das Protein der strukturellen Überfamilie α/β, mit sechs Helices α und sieben Strängen β angehört. Es wird angemerkt, dass die β6-α6''-Schleife zwei Helices umfasst, α6 und α6' genannt. MabA besitzt eine einzige Domäne, deren Topologie der Rossman-Faltung (β/α)₆ ähnlich ist, die typisch für Dinukleotiddiphosphat bindende Proteine (dinucleotide diphosphate-binding protein (engl.), DDBP) ist (Persson u.a., 1991). Jedoch gibt es im Gegensatz zu DDBPs mit zwei Domänen keine Symmetrie, da die Helices der C-terminalen Hälfte (α4, α5) länger als die Sekundärstrukturen des N-terminalen Teils sind. Diese Eigenschaften sowie das Vorhandensein eines zusätzlichen Strangs (β7) sind typisch für die Überfamilie der RED-(Reduktase/Epimerase/Dehydrogenase) Proteine (Labesse u.a., 1994). Das Vorhandensein eines einzigen Cysteins (C60), wahrscheinlich vergraben, in MabA schließt die Möglichkeit der Bildung einer intra- oder inter-Ketten-Disulfidbrücke innerhalb des Proteins aus.
Der gebundene Cofaktor NADPH befindet sich in einer erweiterten Konformation, die auf den C-terminalen Enden der Stränge β1 bis β5 beruht, die ein Blatt bilden. Der β2-Strang der RED-Proteine, der an der Bindung der Ribose beteiligt ist, die an das Adenin des Cofaktors gebunden wird, weist in der MabA-Sequenz das Motiv [***xxr]♣(♣*: hydrophober Rest, x: irgendeine Aminosäure. In Großbuchstaben und Kleinbuchstaben die streng bewahrten Reste bzw. die am häufigsten anzutreffenden Reste.) auf, das für NADP(H)-abhängige Enzyme spezifisch ist ((Labesse u.a., 1994). Dies ist mit den enzymatischen Daten übereinstimmend, zeigt die strenge Spezifität von MabA für das NADPH an und lässt darauf schließen, dass das zusätzliche Phosphat wahrscheinlich für die Stabilisierung des Cofaktors in der für die Katalyse richtigen Orientierung bedeutsam ist. Der positiv geladene Rest R47, Teil des Motivs [VAVTHR] des Strangs β2 ist wahrscheinlich an der Wechselwirkung des Protein mit dem Phosphat, durch elektrostatische Verbindungen, beteiligt.
Wie bei den anderen RED-Proteinen ist die Bindungsstelle des MabA-Substrats wahrscheinlich durch die C-terminalen Enden der Stränge β4, β5, β6, β7 und die Helices α4, α5, α6 (α6, α6', α6'') begrenzt (Fig. 5.18; (Labesse u.a., 1994)); der Nicotinamid-Teil des NADPH, an den Ionenaustauschvorgängen beteiligt, ist in Richtung des tiefsten Teils des Hohlraums orientiert. Die Reste der aktiven Stelle, die sehr gut bewahrt sind und einen Teil der Signatur der RED-Proteine bilden, sind im katalytischen Zentrum des MabA vorhanden: die katalytische Triade, S140, Y153, K157 und N112, T188.
5.3. Beziehung zwischen Struktur und Funktion bei MabA
Nach den Atomkoordinaten des MabA-Modells ist das einzige Tryptophan (W145), auf Höhe der β5-α5-Schleife befindlich, wahrscheinlich an der katalytischen Tasche beteiligt. Diese Letztere scheint stark hydrophob zu sein – wegen der Beteiligung des C-terminalen Arms (reich an hydrophoben Resten) an der Struktur dieser Tasche einerseits und durch das Vorhandensein von Resten, neben dem W145, wie etwa I147 und F205 andererseits. Bei den Proteinen FabG anderer Organismen sind diese zwei letzteren Reste, die spezifisch für kurzkettige Substrate sind, durch stärker polare Reste ersetzt, nämlich durch Asn (für I147) und Thr, Gln oder Asn (für F205). Die Spezifität von MabA für langkettige Substrate steht sehr wahrscheinlich mit dem hydrophoben Charakter der katalytischen Tasche im Zusammenhang, die dann eine günstige Umgebung für die Aufnahme von langen alipha tischen Ketten bildet; eine Struktur-Funktion-Beziehung zwischen der Hydrophobie und der Größe der Bindungstasche des Substrats und der Affinität zu langkettigen Molekülen ist schon für das Protein InhA herausgestellt worden, (Rozwarski u.a., 1999), das ebenfalls zu den REDs gehört.
Die Überlagerung des MabA-Modells mit der Kristallstruktur von InhA (InhA-NAD⁺-Substrat-Ternärkomplex bei C16 (Rozwarski u.a., 1999); PDB1BVR) offenbart, dass die Bindungstaschen für das Substrat bei den beiden Proteinen ähnliche Größen aufweisen – in Übereinstimmung mit ihrer Affinität zu Substraten, die ähnliche Kettenlängen haben (C₁₂ bis C₂₄ bei InhA, C₈ bis C₂₀ bei MabA; [(Rozwarski u.a., 1999); (Quémard u.a., 1995)]). Jedoch ist die Bindungstasche der Enoylreduktase InhA noch stärker hydrophob als jene von MabA, was die geringfügige Diskrepanz bei der Substratspezifität zwischen InhA (maximale spezifische Aktivität in Gegenwart von C₁₆) und MabA (maximale spezifische Aktivität in Gegenwart von C₁₂) erklären könnte.
Das Alignement der MabA-Sequenzen mit den Hilfsproteinen und mit allen bekannten Proteinen FabG gibt an, dass das aminoterminale Ende nicht erhalten bleibt; dieser Bereich „treibt" zur Außenseite des Proteins und entspricht keiner definierten Sekundärstruktur. Dies legt nahe, dass diese Domäne des Proteins Variationen tolerieren kann und dass sie für die Funktion des Proteins unwichtig ist. Experimentelle Daten, die mit dieser Aussage in Übereinstimmung sind, werden durch die Untersuchung der katalytischen Aktivität von H-MabA geliefert. Das Protein umfasst am NH₂-Terminus ein poly-Histidin-Tag, dessen Gegenwart die katalytische Aktivität nicht zu beeinflussen scheint.
5.4. Quartärstruktur von MabA
Wegen ihrer charakteristischen Sekundär- und Tertiärstrukturen sind alle beschriebenen RED-Proteine Dimere oder Tetramere (Dimere von Dimeren). Die C-terminale Region von MabA, der α6-β7-Schleife und dem β7-Strang entsprechend, weist eine sehr starke Ähnlichkeit mit der bedeutungsgleichen Region der bekannten tetrameren REDs auf, insbesondere mit jener von PDB2HSD, für die gezeigt worden ist, dass sie an der Dimer-Dimer-Schnittstelle des Heterotetramers beteiligt ist (Persson u.a., 1991). Die zweite Schnittstelle zwischen zwei Monomeren in PDB2HSD beteiligt die Helices α4 und α5. Die Beibehaltung des C-terminalen Endes und das Vorhandensein von hydrophoben Aminosäuren an der Oberfläche der Helices α4 und α5 bei MabA legen nahe, dass MabA tetramer ist. Diese Ergebnisse sind in Übereinstimmung mit der Analyse durch Ausschlusschromatographie, die ein Gleichgewicht zwischen den Dimer- und Tetramerformen von MabA nahelegt. Die Analyse von Monomer-Monomer- und Dimer-Dimer-Schnittstellen in einem Tetramer-Modell von MabA könnte ermöglichen, diese Schlussfolgerung zu untermauern.
5.5. Wechselwirkung mit Antibiotika
Es ist gezeigt worden, dass die aktive Form von INH, die das Protein InhA hemmt, ein Isonicotinoyl-NAD-Radikal oder -Anion sein könnte (Rozwarski u.a., 1998). Diese Autoren haben behauptet, dass das Isonicotinoyl-NAD-Addukt im katalytischen Zentrum von InhA gebildet wird, während Wilming und Johnsson gezeigt haben, dass diese Bildung bei Abwesenheit des Enzyms geschehen kann (Wilming & Johnsson, 1999). Daher bleibt ein Zweifel, was die genaue Wirkungsweise des INH auf InhA in vivo angeht. Die Überlagerung des MabA-Modells und der Struktur des binären Komplexes InhA-Isonicotinoyl-NAD (PDB1ZID) zeigt, dass es keine Unvereinbarkeit mit der Bindung von Molekülen wie etwa Isoniazid oder Ethionamid an das aktive Zentrum von MabA gibt. Ebenso wie an das Protein InhA könnte das Isonicotinoyl-NADP-Addukt a priori an MabA gebunden werden, sobald es gebildet wird. Jedoch kann in dem Fall, in dem sich das Addukt innerhalb des katalytischen Zentrums bilden würde, nicht vorhergesehen werden, ob das Isoniazid richtig orientiert wäre und mit dem Cofaktor NADPH in Wechselwirkung treten können. Auf jeden Fall muss eine Hemmung der Aktivität von MabA durch INH biochemisch überprüft werden, denn das Modell ermöglicht nicht, auf präzise Weise über die Topologie der Seitenketten der aktiven Stelle Auskunft zu geben.
6. HEMMUNG DER AKTIVITÄT VON MABA (zum Vergleich)
Es wurde die Wirkung des Isoniazids auf die β-Ketoacylreduktaseaktivität von MabA getestet, wobei sich für Versuchsbedingungen entschieden wurde, die jenen ähnlich sind, die ermöglichen, eine Hemmung der Aktivität des InhA zu beobachten. Das Protein MabA (150 nM) wird 2 Stunden in Gegenwart von 100 μM oder 2 mM Isoniazid, 100 μM NADPH und 1 μM MnCl₂ vorinkubiert. In Gegenwart von 100 μM INH wird die Aktivität von MabA, die sich im Vorhandensein von Acetoacetyl-CoA offenbart, um 44 ± 3%, verglichen mit der Kontrollprobe ohne INH, gehemmt, und die Zugabe von 2 mM Isoniazid hat eine Hemmung um 62 ± 6% zur Folge. Die Tatsache, dass auch in Gegenwart von 2 mM Isoniazid keine vollständige Hemmung der Aktivität von MabA zu beobachten ist, könnte durch eine sehr langsame Oxidation des Isoniazids durch die Mn³⁺-Ionen unter den verwendeten Bedingungen (in Abwesenheit eines Katalysators wie etwa KatG) und folglich eine Konzentration der aktiven Form des Antibiotikums, die nicht zur Ausgangskonzentration des Isoniazids proportional ist, erklärt werden. Diese Erklärung unterstellt, dass MabA durch einen Mechanismus gehemmt wird, der jenem ähnlich ist, der für InhA beschrieben wurde. Es wird daran erinnert, dass der Mechanismus der Hemmung des Proteins InhA durch das Isoniazid mindestens die Gegenwart des Cofaktors NADH, von Mn²⁺-Ionen und von molekularem Sauerstoff erfordert. Die Mn²⁺-Ionen würden zu Mn³⁺ oxidiert werden, die ihrerseits die Oxidation des Isoniazids katalysieren. Daher wurde die Wirkung der Abwesen heit von MnCl₂ oder von NADPH auf die Hemmung von MabA durch INH getestet. Fehlt MnCl₂ bei der Reaktion, wird eine unwesentliche Abnahme der Aktivität des Enzyms beobachtet, die darauf schließen lässt, dass die Mn²⁺-Ionen erforderlich sind, um eine Wirkung des INH zu erzielen. Die Bestimmung der Beteiligung von NADPH an dem Prozess der Hemmung ist schwieriger, denn die Vorinkubation des Proteins MabA in Abwesenheit dieses Cofaktors führt zu einer erheblichen Abnahme (-74%) der Aktivität nach 2 h Vorinkubation ohne Antibiotikum. Deshalb war es nicht möglich, die Beteiligung von NADPH an der Hemmung durch das Isoniazid zu beurteilen.
Die Ergebnisse zeigen, dass die Aktivität des Proteins MabA durch das Isoniazid gehemmt wird, und legen nahe, dass der Mechanismus der Wirkung dieses Antibiotikums auf MabA die Mn²⁺-Ionen eingreifen lassen könnte. In Anbetracht der Homologie der Struktur und Funktion dieser zwei Proteine ist es wahrscheinlich, dass der Hemmungsmechanismus zu jenem des InhA analog ist, wobei über die Bildung eines Isonicotinoyl-NADP⁺-Addukts gegangen wird.
Bei den Mykobakterien hat eine Mutation oder eine Überexpression des Gens inhA eine Kreuzresistenz gegen die zwei Antituberkulotika Isoniazid und Ethionamid (ETH) zur Folge. Das Ethionamid ist wahrscheinlich auch ein Prodrug, da die Hemmung des Proteins InhA durch dieses Antibiotikum in seiner nativen Form in vitro nicht beobachtet wurde. Die Art und Weise der Aktivierung des ETH ist jedoch nicht bekannt. Trotzdem wurde die Wirkung von Ethionamid auf die Aktivität von InhA unter den Versuchsbedingungen der Hemmung durch INH in Gegenwart von MnCl₂ und NADH getestet. In Gegenwart von 100 μM ETH ist die InhA-Aktivität unverändert. Das gleiche Ergebnis wird bei MabA erhalten. Wegen des hohen Absorptionsgrades (Extinktion) in dem Wellenlängenbereich, der für die Enzymtests verwendet wird, war es nicht möglich, höhere Konzentrationen an Antibiotika zu testen. Gleichwohl scheinen die Bedingungen für die Oxidation von INH in vitro, die für den Test von Ethionamid gewählt waren, nicht diejenigen zu sein, die für die Aktivierung des ETH erforderlich sind. Die Tatsache, dass die Katalase-Peroxydase KatG, die die Oxidation des Isoniazids beschleunigt, nicht der Aktivator von ETH ist [(Johnsson u.a., 1995); (Basso u.a., 1996)], steht im Einklang mit dieser Schlussfolgerung. Andererseits, falls eine Oxidation des ETH für seine Wirkung auf sein(e) Angriffsziel(e) erforderlich ist, erweist sich die Oxidation einer Thioamidfunktion als schwieriger als jene einer Hydrazidfunktion (INH) und sollte ein stärkeres Oxidationsmittel erfordern, als es die Mn³⁺-Ionen sind.
7. SCHLUSSFOLGERUNG UND DISKUSSION
Die Untersuchung der Tertiärstruktur von MabA durch Molekül-Modellierung hat ermöglicht zu zeigen, dass das Protein eine einzige Domäne aufweist, mit einer Sekundärstruktur vom Typ α/β, und dass es der strukturellen Überfamilie der RED (Reduktasen/Epimerasen/Dehydrogenasen) angehört. Das Protein MabA besitzt das Motiv, das für NADP(H) bindende Proteine spezifisch ist, und eine Bindungstasche für Substrat, deren Größe und Hydrophobie die Aufnahme von langkettigen β-Ketoestern begünstigen könnten. Diese von dem MabA-Modell gelieferten Strukturdaten sind im Einklang mit den vorher erhaltenen biochemischen Daten. Das MabA-Modell lässt darauf schließen, dass der Tryptophanrest (Trp) auf Höhe der β5-α5-Schleife an der Bindungstasche für das Substrat beteiligt sein könnte. Durch die Einzigartigkeit dieses Trp-Restes konnten Spektroskopie- und Fluoreszenzversuche durchgeführt werden. Sie haben ermöglicht, das MabA-Modell zu bestätigen, da sie einerseits die Beteiligung des Trp-Restes und mindestens eines der zwei Met-Reste des C-terminalen Endes in der Bindungstasche für das Substrat und andererseits die Spezifität des MabA für langkettige Substrate bestätigen. Die Überlagerung des MabA-Modells mit der Kristallstruktur von InhA (im Komplex mit NAD⁺ und dem C16-Substrat (Rozwarski u.a., 1999)) offenbart, dass die zwei Proteine Bindungsstellen für ein Substrat aufweisen, die von äquivalenter Größe wie und stärker hydrophob als ihre Entsprechungen bei anderen Organismen sind, die eine de novo-Synthese voraussetzen. Dies untermauert die Hypothese der gemeinsamen Beteiligung von MabA und InhA an demselben Komplex zur Verlängerung von Fettsäuren.
Das MabA-Modell legt nahe, dass das Protein in Lösung ein Tetramer ist, was im Einklang mit dem Ergebnis der Gelfiltrationsversuche ist, die nahelegen, dass es unter den getesteten Versuchsbedingungen ein Dimer-Tetramer-Gleichgewicht von MabA geben könnte. Jedoch ist die Zusammenlagerung von MabA mit InhA, jeweils in Tetramerform, in dem FAS-II-Komplex mit der geschätzten Größe des Systems unvereinbar. Da InhA und MabA ähnliche Topologien aufweisen, könnte folglich postuliert werden, dass diese zwei Proteine ein Heterotetramer innerhalb des FAS-II-Komplexes bilden. Um diese Hypothese zu überprüfen, könnte die Molekül-Modellierung eines MabA-InhA-Heterotetramerkomplexes unter Verwendung der tetrameren RED-Proteine als Hilfsproteine durchgeführt werden. Um die Möglichkeit, dass InhA und MabA sich im Komplex zusammenlagern können, zu bestätigen, könnte eine chemische Brückenbildung zwischen den beiden Proteinen in Gegenwart ihrer jeweiligen Cofaktoren versucht werden.
Die Kenntnis der dreidimensionalen Organisation, die durch das Modell geliefert wird, hat an eine mögliche Wechselwirkung zwischen MabA und dem Isoniazid denken lassen. Durch enzymatische Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass die Aktivität von MabA in vitro durch dieses Antibiotikum wirksam gehemmt wird und dass der Mechanismus der MabA-Hemmung wahrscheinlich mit jenem vergleichbar ist, der für das Protein InhA beschrieben ist.
II) MATERIAL UND METHODEN
M.1 ÜBEREXPRESSION DES GENS mabA IN E. COLI
M.1.1. Konstruktion des Expressionsplasmids pET-15b::mabA
Das mabA-Gen von M. tuberculosis wurde zwischen den Genorten NdeI und XHO des Plasmids pET-15b, stromabwärts einer 6 Histidine kodierenden Sequenz kloniert.
M.1.2. Transformation von E. coli BL21(λDE3) durch das Plasmid pET-15b::mabA
Nach einer Aufbereitung kompetenter Bakterien von E. coli BL21(λDE3) (Sambrook u.a., 1989) wird ein Aliquot (100 μl) in Gegenwart des pET-15b::mabA-Plasmids (39 ng) 30 min lang in Eis inkubiert. Die Transformation wird durch thermischen Schock (90 Sekunden bei 42°C, dann 2 min in Eis) bewirkt. Dann wird LB-Medium zugegeben, und die Suspension wird 45 min lang bei 37°C unter Rühren (250 Umdrehungen pro Minute) inkubiert, bevor sie auf LB-Agarplatten, die 50 μg/ml Carbenicillin enthalten, ausplattiert wird. Die Inkubation bei 37°C, über ungefähr 18 h, ermöglicht, Kolonien von mittlerer bis großer Größe zu erhalten.
M.1.3 Induktion der Expression des Zielgens
Es werden vier Kolonien mittlerer Größe verwendet, um vier Kulturen von 50 ml im LB-Medium + Carbenicillin anzulegen. Die Trübung des Mediums wird durch Spektrophotometrie bei 600 nm jede Stunde gemessen, bis die optische Dichte 0,8 erreicht ist (Mitte der exponentiellen Wachstumsphase), d.h. nach ungefähr 4 h Inkubation. Die Expression des Gens mAbA wird anschließend mit 0,8 mM IPTG zwei Stunden lang bei 37°C induziert, dann mittels SDS-PAGE überprüft. Es wird ein Aliquot der nicht induzierten Kultur aufbewahrt; er wird als Negativkontrolle der Induktion dienen.
M.1.4. Überprüfung der Überexpression
Wenn die mabA-Expression erst einmal induziert worden ist, wird ein Aliquot von 100 μl Kultur analysiert, um die Expression des Gens zu kontrollieren. Nach einem Zentrifugieren (5 min bei 12000 g) wird der Bakterienrückstand in den Testpuffer zurückgenommen (Laemmli, 1970), um auf 12% Polyacrylamid-Gel unter denaturierenden Bedingungen aufgebracht zu werden.
M.1.5. MabA-Protein-Löslichkeitstest in kleinem Maßstab
Die Bakterien (10 ml) werden durch 5 min langes Zentrifugieren bei 3000 g und 4°C gesammelt. Der Rückstand wird in Kaliumphosphatpuffer (100 mM, pH 7,2) in 1/20 des Anfangsvolumens der Kultur resuspendiert. Die Suspension wird mit Hilfe einer Mikrosonde (Vibracell, Bioblock) mit vier Impulsen von 10 Sekunden, bei einer zwischengeschalteten Pausenzeit von 40 Sekunden (relative Einschaltdauer: 60%, Grenze für Mikrospitze: 5) beschallt. Der erhaltene Gesamtextrakt wird 5 min lang bei 12000 g und 4°C zentrifugiert. Das Vorhandensein des Proteins MabA in den Fraktionen, die der Gesamtheit, dem (löslichen) Überstand und dem (unlöslichen) Rückstand, entsprechen, wird mittels SDS-PAGE (12 Polyacrylamid) analysiert.
M.2. AUFREINIGUNG VON MABA
Alle Schritte werden bei einer niedrigen Temperatur (0 bis 4°C) ausgeführt, um die Wirkung der Proteasen herabzusetzen.
M.2.1. Aufbereitung des Bakterienlysats

Alle Kulturen (4 × 50 ml) werden durch Zentrifugieren (15 min bei 16000 g und 4°C) gesammelt, dann gewaschen (50 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,8). Der erhaltene Rückstand (0,9 g/200 ml Kultur) wird in 9 ml Lyse-Puffer (50 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,8, 500 mM NaCl und 5 mM Imidazol enthaltend) zurückgenommen. Vor dem Einfrieren der Suspension bei -70°C (eine Nacht) werden ein Gemisch aus Proteasehemmern (0,113 mg/ml, siehe unten) und Lysozym (0,5 mg/ml) dazugegeben. Die Suspension wird unter behutsamem Rühren bei Raumtemperatur aufgetaut, anschließend mit der DNaseI (5 μg/ml) und RNaseA (10 μg/ml) in Gegenwart von 10 mM MgCl₂ 15 min lang bei 4°C unter behutsamem Rühren behandelt. Ganze Bakterien und Trümmer werden durch Zentrifugieren (15 min bei 3000 g und 4°C) entfernt. Ein letztes Ultrazentrifugieren bei 44000 g, 45 min bei 4°C, ermöglicht, alles unlösliche Material zu entfernen. 10% (v/v) Glycerol werden zu dem Überstand (geklärtes Lysat) gegeben, bevor er auf die Säule geladen wird.

Gemisch aus Proteasehemmern:
Leupeptin (Chymotrypsinhemmer):	0,0023 g/l
Soja (reversibler Trypsinhemmer)	0,02 g/l
TLCK (irreversibler Trypsinhemmer):	0,0518 g/l
Aprotinin:	0,0016 g/l
Pepstatin (Hemmer der Pepsinartigen)	0,0011 g/l
PMSF (irreversibler Hemmer des Chymotrypsins)	0,0362 g/l

Anmerkung: Bei diesen Versuchen ist das EDTA (Hemmer der metallabhängigen Proteasen) bei dem Gemisch aus Protasehemmern weggelasen worden, weil es bei der Aufreinigung über die Ni-NTA-Säule mit den Nickel-Ionen Chelate bilden könnte.

M.2.2. Aufreinigung von H-MabA in der Minisäule
In einer leeren Minisäule (Gesamtvolumen 7,5 ml, aus Polypropylen, Polylabo) werden 500 μl Ni-NTA-Harz-Agarose (QIAGEN) (d.h. 1 ml der Suspension zu 50%) mit viermal 2,5 ml Lyse-Puffer gewaschen. Vier ml geklärtes Bakterien lysat (ungefähr 15 mg Gesamtprotein) werden mit der Ni-NTA-Harz-Agarose unter behutsamem Rühren 1 h bei 4°C inkubiert. Das nicht an das Harz gebundene Material wird durch Dekantieren, anschließend durch „Waschungen" mit 32 Säulenvolumina des Lyse-Puffers rückgewonnen. Der Rest der verunreinigenden Proteine wird mit 8 Säulenvolumina des Puffers mit 50 mM Imidazol eluiert. Das Protein MabA wird mittels 8 Säulenvolumina des Puffers mit 175 mM Imidazol eluiert. Das Harz wird dann mit 10 Säulenvolumina des Puffers mit 250 mM Imidazol gereinigt und direkt in reinem Glycerol rückgewonnen, so dass sich 50% (v/v) des endgültigen Glycerols ergeben. Diese Vorsichtsmaßnahmen sind erforderlich, um das Ausfällen von MabA am Säulenausgang zu vermeiden.

Anmerkung: Alle hier verwendeten Puffer enthalten 50 mM Kaliumphosphat pH 7,8 und 500 mM NaCl.

M.2.3. Dialyse der Lösung von gereinigtem H-MabA
Die Lösung des MabA-Proteins nach Reinigung, rückgewonnen in 50% (v/v) Glycerol, ist zweimal 1 h gegen 40 Volumina 50 mM Kaliumphosphatpuffer pH 7,2, der 50% (v/v) Glycerol enthält, bei 4°C in einem Dialyseröhrchen dialysiert (Trennschwelle 8 bis 10 kDa, Spectra/Por, Spectrum) worden, das zuvor in einer 1 mM EDTA-Lösung ausgekocht wurde, um Schwermetallspuren zu beseitigen, anschließend mit Osmosewasser gespült wurde. Das Dialysat wird dann aliquotiert und bei -20°C aufbewahrt.
M.2.4. Bestimmung der Menge gereinigten Proteins mittels UV-Spektroskopie
Die Konzentration der Lösungen des gereinigten Proteins wurde nach dem Lambert-Beer'schen Gesetz (DO = ε l C) mit seinem theoretischen molaren Extinktionskoeffizienten und seiner Extinktion bei 280 nm ermittelt.
Theoretische Bestimmung des molaren Extinktionskoeffizienten (aus der Sequenz des Proteins abgeleitet)
Die molaren Extinktionskoeffizienten (MEK) des Proteins wurden nach Gill und Von Hippel (Gill & von Hippel, 1989) berechnet (in Gegenwart von 6 M Guanidinchlorid bei pH 6,5). Die Beziehung ist dann die folgende: MEK = (a·ETyr) + (b·ETrp) + (c·ECys), wobei a, b und c jeweils die Anzahl der Reste und Eaa ihre molaren Extinktionskoeffizient sind. Bei 280 nm sind sie: ETyr = 1280, ETrp = 5690, ECys = 120
Der MEK (ε) des MabA bei 280 nm beträgt 9530 M^-1cm^-1 und berücksichtigt nicht den einzigen Cys-Rest.
M.3. UNTERSUCHUNG DER EIGENSCHAFTEN VON MABA
M.3.1. Bestimmung der Masse von H-MabA durch Elektrospray-Ionisation/Massenspektrometrie (ESI/MS)
Ein Rückstand von 2 mg gereingten Proteins H-MabA, in Puffer ohne Glycerol ausgefällt, wird fünfmal mit Wasser gewaschen (5 min Zentrifugieren bei 12000 g). Es werden 200 μl Acetonitril/Wasser-Gemisch (50/50) + 0,1% (v/v) TFA zugegeben, anschließend wird das Ganze mit einem Vortex homogenisiert und 2 min lang bei 12000 g zentrifugiert. Ein gleiches Volumen eines Methanol/Wasser-Gemischs (50/50) + 0,5% (v/v) Essigsäure wird zu einem Aliquot des Überstands gegeben, das Ganze wird mit einem Vortex homogenisiert, dann 2 h lang bei 4°C gelagert, bevor es 2 min lang bei 12000 g zentrifugiert wird. 60 μl des Überstands werden mittels einer Spritzenpumpe (HARVARD) bei einem Förderstrom von 5 μl/min in die Quelle des Spektrometers eingebracht, um durch Elektrospray-Ionisation/Massenspektrometrie (ESI/MS) auf einem Finnigan MAT-Gerät (TSQ 700) analysiert zu werden. Die Parameter der ESI-Quelle entsprechen einer 5 kV-Speisung, einer Temperatur der Zwischenkapillaren von 250°C und 40 psi für den Stickstoff (Sprühgas).
M.3.2. Bestimmung der nativen Größe durch Gelfiltration
Die FPLC-Versuche sind mit dem System BioCAD SPRINT (PerSeptive Biosystems, Cambridge, MA) durchgeführt worden. Eine Sepharyl-Säule S-100 HR (HiPrep^TM 16/60 Sephacryl High Resolution, Pharmacia) ist mit einem Säulenvolumen des 50 mM Kaliumphosphatpuffers, pH 6,8, enthaltend 100 mM NaCl, äquilibriert worden. Fünf Standard-Proteine mit bekannten Molekülmassen, aufgelöst im gleichen Puffer, sind auf die Säule appliziert worden (0,5 bis 1 mg jedes Proteins): Alkoholdehydrogenase (150 kDa), Rinderserumalbumin (BSA, 67 kDa), Ovalbumin (43 kDa), Carboanhydrase (29 kDa) und RibonukleaseA (RNaseA, 13,7 kDA)). Es wurden zwei aufeinanderfolgende Elutionen mit unterschiedlicher Kombination der 3 Standardproteine durchgeführt, um eine bessere Auflösung der Peaks zu erzielen, und die Profile bei 280 nm wurden überlagert. Die Kalibrationskurve wurde durch Aufzeichnen des Elutionsvolumen jedes Standard-Proteins in Abhängigkeit vom Logarithmus der Molekülmasse erhalten. Eine H-MabA-Lösung mit 1,1 mg/ml (0,66 mg geladenes Protein) wird auf die Säule gegeben und unter den gleichen Bedingungen wie die Standard-Proteine eluiert. Die Molekülmasse von H-MabA wird anhand der Kalibrationskurve ermittelt.
M.4. ENZYMATISCHE UNTERSUCHUNG VON MABA
M.4.1. Kalibration der Reagenzlösungen
Die Bestimmung der kinetischen Parameter für verschiedene Substrate erfordert Enzymtestbedingungen, die von einem Versuch zum nächsten reproduzierbar sind. Die Konzentrationen der Lösungen von β-Ketoester-Substrat von CoA und Cofaktor (NADPH) werden folglich vor Verwendung bestimmt. Das zu kalibrierende Reagens (beispielsweise β-Ketoester von CoA) wird mit einer Konzentration zugesetzt, die weit niedriger als jene des zweiten Substrats (NADPH) ist. Die Reaktion wird mit einer Konzentration an Enzym gestartet, die ausreicht, um die schnelle Verwertung des Substrats in begrenzender Konzentration zu erzielen. Der beobachtete DO₃₄₀-Unterschied ermöglicht, die tatsächliche Konzentration dieses β-Ketoester-Substrats von CoA in der Reaktion zu folgern.
M.4.1.2. Beschreibung des Enzymtests
Die katalytische Aktivität des gereinigten MabA in Gegenwart von Acetoacetyl-CoA und NADPH ist durch Spektrophotometrie bewiesen worden.
Die Reaktionskinetik der β-Ketoacylreduktion wird durch Messen der Extinktion bei 340 nm, die mit der Oxidation des NADPH abnimmt, im Zeitablauf verfolgt. Die Enzymreaktion wird in einem Endvolumen von 1 ml (in einer Quarzküvette, Lichtweg 1 cm) durchgeführt. Das Spektrophotometer (UVIKON 923, Bio-Tek Kontron Instruments) ist mit einem thermostatgeregelten Bad verbunden, das ermöglicht, die Temperatur der Küvette auf 25°C konstant zu halten. In Abwesenheit des Enzyms wird eine Basislinie aufgenommen. Das Reaktionsgemisch umfasst 80 mM Natriumphosphatpuffer und variable Konzentrationen an NADPH und β-Ketoacyl-CoA. Die Reaktion wird durch die Zugabe des Enzyms (36 nM bis 144 nM) gestar tet. Die Messungen werden über 3 bis 5 min durchgeführt.
Das K_m für das NADPH wurde mit Konzentrationen an Coenzym bestimmt, die zwischen 5 und 200 μM variierten, und bei einer festen Konzentration (460 μM) an Acetoacetyl-CoA. Die K_m für die β-Ketoacyl-CoA wurden bei einer festen Konzentration, 100 μM, an NADPH bestimmt. Eine Konzentration über 100 μM hatte ein zu starkes Grundrauschen der Messungen zur Folge. Außerdem wurde überprüft, dass diese Konzentration sättigend ist.
K_m und V_max für die β-Ketoacyl-CoA wurden mit den folgenden Konzentrationen gemessen: bei Acetoacetyl-CoA (C₄) 100 bis 8570 μM; bei β-Ketooctanoyl-CoA (C₈) 4 bis 160 μM; bei β-Ketododecanoyl-CoA (C₁₂) 2 bis 32 μM. Bei β-Ketohexadecanoyl-CoA und β-Ketoeicosanoyl-CoA (C₂₀) haben Probleme der Hemmung durch das Substrat nicht zugelassen, die kinetischen Parameter zu bestimmen, und die Reaktionsgeschwindigkeit wurde bei einer festen Konzentration von 2 μM verglichen.
Für jeden kinetischen Parameter sind mindestens zwei Serien Messpunkte aufgenommen worden. Die Richtigkeit dieser Punkte ist graphisch durch die „zweifach inverse" Darstellung 1/v = f(1/[S] (Gleichung 1) überprüft worden. Die kinetischen Parameter sind dann graphisch nach der Hanes-Darstellung [S]/v = f([S]) (Gleichung (2)) oder durch Berechnen nach der Methode der kleinsten Fehlerquadrate mit der Software GraphPad Prism, Version 2.01, bestimmt worden. Gleichung (1) (Lineweaver-Burk)
Gleichung (2) (Hanes)
III) MUTAGENESE DES PROTEINS MabA UND OPTIMALE VERFAHREN ZUM AUFREINIGEN DES PROTEINS MabA UND DER PROTEINE MabA C(60)V, MabA S(144)L und MabA C(60)V/S(144)L
1) Mutagenese des Proteins MabA
Die Mutante MabA C(60)V wurde durch gesteuerte Mutagenese nach Durchführung einer inversen PCR erhalten. Die Primer wurden derart gewählt, dass das Codon 60 des Gens mabA modifiziert wurde, nämlich durch Ersetzen des TGT (Cystein) durch GTT (Valin). Das Plasmid pET15b::mabA wurde als Hilfsmittel für die PCR-Amplifikation mittels der DNA-Polymerase PfuTurbo (Stratagene, USA) verwendet.
Für die Auswahl der Plasmide, die das mutierte Gen umfassen, wurden die PCR-Produkte mit der Endonuclease Dpn1 verdaut. Das mutierte Gen wurde vollständig sequenziert, um das Nichtvorhandensein einer sekundären Mutation zu überprüfen. Das das Gen mabA C(60)V tragende Plasmid (pET15b::mabA C(60)V) wurde dann verwendet, um den überproduzierenden Stamm BL21(DE3) zu transformieren.
Die Mutanten MabA C(60)V/S(144)L und MabA S(144)L wurden nach dem gleichen Verfahren wie vorher erhalten.
2) Aufreinigen der Proteine MabA, MabA C(60)V und MabA C(60)V/S(144)L
Es werden vier Kulturen mit 50 ml im LB-Medium + Carbenicillin angelegt. Die Trübung des Mediums wird durch Spektrophotometrie bei 600 nm gemessen, bis die optische Dichte 0,8 erreicht (Mitte der exponentiellen Wachstumsphase), d.h. nach ungefähr 4 h Inkubation. Die Expres sion des Gens mAbA wird dann mit 0,8 mM IPTG 2 h bei 37°C induziert, dann mittels SDS-PAGE überprüft.
Alle Kulturen (4 × 50 ml) werden durch Zentrifugieren (15 min bei 16000 g und 4°C) gesammelt, dann gewaschen. Der erhaltene Rückstand wird in 4 ml Lyse-Puffer zurückgenommen (siehe nachstehend). Vor dem Einfrieren der Suspension bei -80°C (eine Nacht) werden ein Gemisch aus Proteasehemmern (0,113 mg/ml) und Lysozym (0,5 mg/ml) dazugegeben. Die Suspension wird unter behutsamem Rühren bei Raumtemperatur aufgetaut, anschließend mit der DNaseI (5 μg/ml) und RNaseA (10 μg/ml) in Gegenwart von 10 mM MgCl₂ 15 min lang bei 4°C unter behutsamem Rühren behandelt. Ganze Bakterien und Trümmer werden durch Zentrifugieren (15 min bei 3000 g und 4°C) entfernt. Ein letztes Ultrazentrifugieren bei 44000 g, 15 min bei 4°C, ermöglicht, alles unlösliche Material zu entfernen. Je nach Fall kann der Überstand (geklärtes Lysat), bevor er auf die Säule geladen wird, entweder durch 10% (v/v) Glycerol (Protein für kinetische Untersuchungen oder für die Kristallographie der weniger stabilen Proteine) oder aber durch 400 μM NADP⁺ (kristallographische Untersuchung des MabA-NADP-Komplexes) ergänzt werden.
Vier ml geklärtes Bakterienlysat (ungefähr 30 mg Gesamtprotein) werden zu einer Ni-NTA-Agarose-Säule (500 μl, QIAGEN) gegeben. Das nicht an das Harz gebundene Material wird durch „Waschungen" mit dem Puffer mit 5 mM, dann 50 mM Imidazol rückgewonnen. Das Protein MabA wird mit dem Elutionspuffer eluiert. Bei Verwendung des Phosphatpuffers wird das Protein direkt in 50% (v/v, final) Glycerol rückgewonnen, um das Ausfällen zu vermeiden. Für die Kristallographie wird das Protein durch Ultrafiltration auf 10 bis 15 mg/ml auf konzentriert.
Verwendete Puffer:
Proteine für kinetische Untersuchungen:

Lyse-Puffer: 50 mM Kaliumphosphat, pH-Wert 7,8, enthaltend 500 mM NaCl, 5 mM Imidazol,
Waschpuffer: 50 mM Kaliumphosphat, pH-Wert 7,8, enthaltend 500 mM NaCl, 5 und 50 mM Imidazol,
Elutionspuffer: 50 mM Kaliumphosphat, pH-Wert 7,8, enthaltend 500 mM NaCl und 175 mM Imidazol.

Proteine für Kristallographieuntersuchungen:

Lyse-Puffer: 50 mM Tris-Puffer, pH-Wert 8,0, ergänzt durch 300 mM LiSO₄ und 5 mM Imidazol; oder: 50 mM Tris-Puffer, pH-Wert 8,0, ergänzt durch 300 mM KCl und 5 mM Imidazol.
Waschpuffer: 50 mM Tris-Puffer, pH-Wert 8,0, ergänzt durch 300 mM LiSO₄ und 5 oder 50 mM Imidazol; oder: 50 mM Tris-Puffer, pH-Wert 8,0, ergänzt durch 300 mM KCl und 5 oder 50 mM Imidazol.
Elutionspuffer: 20 mM MES-Puffer, pH-Wert 6,4, 300 mM LiSO₄ und 175 bis 750 mM Imidazol; oder: 20 mM PIPES-Puffer, pH-Wert 8,0, ergänzt durch 300 mM KCl und 175 bis 750 mM Imidazol.
Anmerkung: Im Fall des Wildtyp-Proteins wird diesen Puffern 1 mM DTT beigemischt.
(MES = 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure; PIPES = Piperazin-N,N'-bis(ethansulfonsäure))

3) Peptidsequenzen der erhaltenen Proteine und Nukleotidsequenzen, die diese Proteine kodieren
Peptidsequenz des Wildtyp-Proteins MabA (FabG1) von M. tuberculosis H37Rv in Fusion mit einem poly-His-Tag (fett):
Peptidsequenz des Proteins MabA C60V (Mutation fett) in Fusion mit einem poly-His-Tag (fett):
Peptidsequenz des Proteins MabA C60V/S144L (Mutation fett) in Fusion mit einem poly-His-Tag (fett):
Nukleotidsequenz des Wildtyp-mabA-(fabG1-) Gens von M. tuberculosis, Stamm H37Rv, in Fusion mit einer Sequenz, die ein poly-Histidin-Tag (in Großbuchstaben) kodiert:
Nukleotidsequenz des Gens mabA (fabG1) C60V (mutiertes Codon fett) von M. tuberculosis, Stamm H37Rv, in Fusion mit einer Sequenz, die ein poly-Histidin-Tag (in Großbuchstaben) kodiert:
Nukleotidsequenz des Gens mabA (fabG1) C60V/S144L (mutierte Codone fett) von M. tuberculosis, Stamm H37Rv, in Fusion mit einer Sequenz, die ein poly-Histidin-Tag (in Großbuchstaben) kodiert:
4) Enzymeigenschaften
Die mit MabA durchgeführten enzymkinetischen Messungen sind die folgenden: Acetoacetyl-CoA (C₄: K_m = 1530 ± 81 μM, k_cat = 1,90 ± 0,0 s^-1), β-Ketooctanoyl-CoA (C₈: K_m = 70 ± 8 μM, k_cat = 3,5 ± 0,0 s^-1), β-Ketododecanoyl-CoA (C₁₂: K_m = 8,3 ± 0,8 μM, k_cat = 4,3 ± 0,2 s^-1).
5) Kristallographische Untersuchung
Die Atomkoordinaten der Tertiärstruktur der Kristalle des Proteins MabA sind in 1 dargestellt; die Kristalle weisen überdies die folgenden Eigenschaften auf:

– Maschenparameter: a = 81,403 Ångström, b = 116,801 Ångström, c = 52,324 Ångström, α = β = 90,00°, γ = 122,30°,
– Raumgruppe: C2,
– Maximale Beugung = 2,05 Ångström.

Die Atomkoordinaten der Tertiärstruktur der Kristalle des Proteins C(60)V sind in 2 dargestellt; die Kristalle weisen überdies die folgenden Eigenschaften auf:

– Maschenparameter: a = 82,230 Ångström, b = 118,610 Ångström, c = 53,170 Ångström, α = β = 90,00°, γ = 122,74°,
– Raumgruppe: C2,
– Maximale Beugung = 2,6 Ångström.

Die Atomkoordinaten der Tertiärstruktur der Kristalle des Proteins C(60)V/S(144)L sind in 3 dargestellt; die Kristalle weisen überdies die folgenden Eigenschaften auf:

– Maschenparameter: a = 81,072 Ångström, b = 117,022 Ångström, c = 53,170 Ångström, α = β = 90,00°, γ = 122,42°,
– Raumgruppe: C2,
– Maximale Beugung = 1,75 Ångström.

Literaturnachweis

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Proteine, die vom MabA-Protein abgeleitet sind, gekennzeichnet dadurch, dass diese dem MabA-Protein entsprechen, dessen Aminosäurensequenz SEQ ID NO: 1 die Folgende ist:
derart, dass: – das Cystein an Position 60 durch einen Valinrest ersetzt wird und/oder das Glycin an Position 139 durch Alanin oder Serin ersetzt wird und/oder das Serin an Position 144 durch einen Leucinrest ersetzt wird, und/oder – sie die Mutationen N24D (oder E) und/oder H46D umfasst, – sie durch die Einfügung eines Polyhistidin-Tags an der N-Terminal-Seite modifiziert ist, sowie auch die folgende Sequenz SEQ ID NO: 14: MGSSHHHHHH SSGLVPRGSH, – diese eine GSH-Sequenz am N-Terminal aufweist, – die sieben ersten Aminosäuren unterdrückt sind.
Protein, das vom MabA-Protein abgeleitet ist, nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, dass dieses dem MabA-Protein entspricht, bei dem das Cystein an Position 60 durch einen Valinrest ersetzt wird, wobei besagtes abgeleitetes Protein, das wiederum mit C(60)V bezeichnet wird, der folgenden Sequenz SEQ ID NO: 3 entspricht:
Protein, das vom MabA-Protein abgeleitet ist, nach Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, dass dieses dem MabA-Protein entspricht, bei dem das Serin an Position 144 durch einen Leucinrest substituiert wird, wobei besagtes abgeleitetes Protein, das wiederum mit S(144)L bezeichnet wird, der folgenden Sequenz SEQ ID NO: 5 entspricht:
Protein, das vom MabA-Protein abgeleitet ist, nach einem der Ansprüche 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, dass dieses dem MabA-Protein entspricht, bei dem das Cystein an Position 60 durch einen Valinrest ersetzt wird und das Serin an Position 144 durch einen Leucinrest, wobei besagtes abgeleitetes Protein, das wiederum mit C(60)V/S(144)L bezeichnet wird, der folgenden Sequenz SEQ ID NO: 7 entspricht:
Protein, das vom MabA-Protein abgeleitet ist, nach einem der Ansprüche 1 bis 4, gekennzeichnet dadurch, dass dieses dem MabA-Protein entspricht, bei dem das Cystein an Position 60 durch einen Valinrest ersetzt wird, das Glycin an Position 139 durch Alanin oder Serin ersetzt wird und das Serin an Position 144 durch einen Leucinrest ersetzt wird, wobei besagtes abgeleitetes Protein, das wiederum mit C(60)V/G(139)[A oder S]/S(144)L bezeichnet wird, der folgenden Sequenz SEQ ID NO: 8 entspricht:
bei der X das A oder das S darstellt.
Proteine, die vom MabA-Protein abgeleitet sind, nach einem der Ansprüche 1 bis 5, gekennzeichnet dadurch, dass diese auf eine Weise modifiziert sind, dass sie den folgenden Sequenzen entsprechen: – Sequenz SEQ ID NO: 9, die der Sequenz SEQ ID NO: 1 entspricht, die die Mutationen N24D (oder E) und/oder H46D aufweist, das heißt die folgende Sequenz:
bei der X₁ das D oder E und X₂ das H oder D darstellt. – oben genannte Sequenz SEQ ID NO: 9, bei der das Cystein an Position 60 durch einen Valinrest ersetzt wird und oder das Glycin an Position 139 durch Alanin oder Serin ersetzt wird und/oder das Serin an Position 144 durch einen Leucinrest ersetzt wird, – Sequenz SEQ ID NO: 10, die der Sequenz SEQ ID NO: 3 entspricht, die die Mutationen N24D (oder E) und/oder H46D aufweist, das heißt die folgende Sequenz:
bei der X₁ das D oder E und X₂ das H oder D darstellt. – Sequenz SEQ ID NO: 11, die der Sequenz SEQ ID NO: 5 entspricht, die die Mutationen N24D (oder E), und/oder H46D aufweist, das heißt die folgende Sequenz:
bei der X₁ das D oder E und X₂ das H oder D darstellt. – Sequenz SEQ ID NO: 12, die der Sequenz SEQ ID NO: 7 entspricht, die die Mutationen N24D (oder E) und/oder H46D aufweist, das heißt die folgende Sequenz:
bei der X₁ das D oder E und X₂ das H oder D darstellt. – Sequenz SEQ ID NO: 13, die der Sequenz SEQ ID NO: 8 entspricht, wobei diese die Mutationen N24D (oder E) und/oder H46D aufweist, das heißt die folgende Sequenz:
bei der X₁ das D oder E und X₂ das H oder D darstellt.
Proteine, die vom MabA-Protein abgeleitet sind, nach einem der Ansprüche 1 bis 6, gekennzeichnet dadurch, dass diese durch Einfügung eines Polyhistidin-Tags an der N-Terminal-Seite auf eine Weise modifiziert sind wie die folgende Sequenz SEQ ID NO: 14: MGSSHHHHHH SSGLVPRGSH.
MabA-Proteine, die modifiziert sind, nach Anspruch 7, wobei diese den folgenden Sequenzen entsprechen: – Sequenz SEQ ID NO: 15, die der Kombination aus der Sequenz SEQ ID NO: 14 und der Sequenz SEQ ID NO. 1 entspricht, das heißt der folgenden Sequenz:
– Sequenz SEQ ID NO: 16, die der Kombination aus der Sequenz SEQ ID NO: 14 und der Sequenz SEQ ID NO: 3 entspricht, das heißt der folgenden Sequenz:

– Sequenz SEQ ID NO: 17, die der Kombination aus der Sequenz SEQ ID NO: 14 und der Sequenz SEQ ID NO: 5 entspricht, das heißt der folgenden Sequenz:
– Sequenz SEQ ID NO: 18, die der Kombination aus der Sequenz SEQ ID NO: 14 und der Sequenz SEQ ID NO: 7 entspricht, das heißt der folgenden Sequenz:
– Sequenz SEQ ID NO: 19, die der Kombination aus der Sequenz SEQ ID NO: 14 und der Sequenz SEQ ID NO: 9 entspricht, das heißt der folgenden Sequenz:
bei der X₁ das D oder E und X₂ das H oder D darstellt, – Sequenz SEQ ID NO: 20, die der Kombination aus der Sequenz SEQ ID NO: 14 und der Sequenz SEQ ID NO: 10 entspricht, das heißt der folgenden Sequenz:

bei der X₁ das D oder E und X₂ das H oder D darstellt, – Sequenz SEQ ID NO: 21, die der Kombination aus der Sequenz SEQ ID NO: 14 und der Sequenz SEQ ID NO: 11 entspricht, das heißt der folgenden Sequenz:
bei der X₁ das D oder E und X₂ das H oder D darstellt, – Sequenz SEQ ID NO: 22, die der Kombination aus der Sequenz SEQ ID NO: 14 und der Sequenz SEQ ID NO: 12 entspricht, das heißt der folgenden Sequenz:
bei der X₁ das D oder E und X₂ das H oder D darstellt, – Sequenz SEQ ID NO: 23, die der Kombination aus der Sequenz SEQ ID NO: 14 und der Sequenz SEQ ID NO: 13 entspricht, das heißt der folgenden Sequenz:
bei der X₁ das D oder E und X₂ das H oder D darstellt.
Proteine, die vom MabA-Protein abgeleitet sind, nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei diese eine GSH-Sequenz am N-Terminal aufweisen, das heißt die folgenden Sequenzen: – die folgende Sequenz SEQ ID NO: 24, die der Kombination aus der GSH-Sequenz und der Sequenz SEQ ID NO: 1 entspricht,
– die folgende Sequenz SEQ ID NO: 25, die der Kombination aus der GSH-Sequenz und der Sequenz SEQ ID NO: 3 entspricht,
– die folgende Sequenz SEQ ID NO: 26, die der Kombination aus der GSH-Sequenz und der Sequenz SEQ ID NO: 5 entspricht,
– die folgende Sequenz SEQ ID NO: 27, die der Kombination aus der GSH-Sequenz und der Sequenz SEQ ID NO: 7 entspricht,
– die folgende Sequenz SEQ ID NO: 28, die der Kombination aus der GSH-Sequenz und der Sequenz SEQ ID NO: 9 entspricht,
bei der X₁ das D oder E und X₂ das H oder D darstellt, – die folgende Sequenz SEQ ID NO: 29, die der Kombination aus der GSH-Sequenz und der Sequenz SEQ ID NO: 10 entspricht,
bei der X₁ das D oder E und X₂ das H oder D darstellt, – die folgende Sequenz SEQ ID NO: 30, die der Kombination aus der GSH-Sequenz und der Sequenz SEQ ID NO: 11 entspricht,

bei der X₁ das D oder E und X₂ das H oder D darstellt, – die folgende Sequenz SEQ ID NO: 31, die der Kombination aus der GSH-Sequenz und der Sequenz SEQ ID NO: 12 entspricht,
bei der X₁ das D oder E und X₂ das H oder D darstellt, – die folgende Sequenz SEQ ID NO: 32, die der Kombination aus der GSH-Sequenz und der Sequenz SEQ ID NO: 13 entspricht,
bei der X₁ das D oder E und X₂ das H oder D darstellt.
Proteine, die vom MabA-Protein abgeleitet sind, nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei denen die ersten sieben Aminosäuren unterdrückt sind, das heißt die folgenden Sequenzen: – die folgende Sequenz SEQ ID NO: 33, die der Sequenz SEQ ID NO: 1 entspricht, wobei die sieben ersten Aminosäuren unterdrückt sind:
– die folgende Sequenz SEQ ID NO: 34, die der Sequenz SEQ ID NO: 3 entspricht, wobei die sieben ersten Aminosäuren unterdrückt sind:
– die folgende Sequenz SEQ ID NO: 35, die der Sequenz SEQ ID NO: 5 entspricht, wobei die sieben ersten Aminosäuren unterdrückt sind:
– die folgende Sequenz SEQ ID NO: 36, die der Sequenz SEQ ID NO: 7 entspricht, wobei die sieben ersten Aminosäuren unterdrückt sind:
– die folgende Sequenz SEQ ID NO: 37, die der Sequenz SEQ ID NO: 9 entspricht, wobei die sieben ersten Aminosäuren unterdrückt sind:

bei der X₁ das D oder E und X₂ das H oder D darstellt, – die folgende Sequenz SEQ ID NO: 38, die der Sequenz SEQ ID NO: 10 entspricht, wobei die sieben ersten Aminosäuren unterdrückt sind:
bei der X₁ das D oder E und X₂ das H oder D darstellt, – die folgende Sequenz SEQ ID NO: 39, die der Sequenz SEQ ID NO: 11 entspricht, wobei die sieben ersten Aminosäuren unterdrückt sind:
bei der X₁ das D oder E und X₂ das H oder D darstellt, – die folgende Sequenz SEQ ID NO: 40, die der Sequenz SEQ ID NO: 12 entspricht, wobei die sieben ersten Aminosäuren unterdrückt sind:

bei der X₁ das D oder E und X₂ das H oder D darstellt, – die folgende Sequenz SEQ ID NO: 41, die der Sequenz SEQ ID NO: 13 entspricht, wobei die sieben ersten Aminosäuren unterdrückt sind:
bei der X₁ das D oder E und X₂ das H oder D darstellt.
Rekombinante abgeleitete Proteine, die in gereinigter Form sind, nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wie sie durch Transformation der Bakterienstämme von E. Coli mit einem Plasmid erhalten werden, wobei dieses eine Sequenz enthält, die das Gen umfasst, das ein vom MabA-Protein ableitendes Protein kodiert, so wie es in einem der Ansprüche 1 bis 10 definiert wurde und gefolgt von einem Schritt der Reinigung, in dessen Verlauf: – die oben genannten rekombinanten E. Coli-Bakterien in einem Waschpuffer gewaschen werden, dann in einen Lyse-Puffer gelegt werden und durch einen Gefrier-Auftau-Zyklus in Gegenwart eines Protease- oder Lysozymhemmers lysiert werden, – nach der Behandlung durch die DNAse I und die RNAse A in Gegenwart von MgCl₂ und durch Zentrifugieren der Überstand der Bakterienlyse, der im vorangegangenen Schritt gewonnen wurde und zu dem 10% (v/v) Glycerol gegeben wurden oder NADP⁺ 400 μM, auf eine Ni-NTA-Agarose-Säule aus Harz gegeben wird, – nach mehreren Waschungen mit dem Puffer mit 5 mM und dann mit 50 mM Imidazol das MabA-Protein oder das abgeleitete Protein mit dem Elutionspuffer eluiert wird.
Rekombinante Proteine, die in gereinigter Form nach einem der Ansprüche 1 bis 10 auf eine Weise abgeleitet sind, wie sie gemäß dem Verfahren von Anspruch 11 erhalten werden, bei dem die verschiedenen Waschpuffer für Bakterien, die Lysepuffer, Waschpuffer und Elutionspuffer die Folgenden sind: – Waschpuffer für Bakterien: Potassiumphosphat 10 mM, pH-Wert 7,8, – Lyse-Puffer: Potassiumphosphat 50 mM, pH-Wert 7,8, enthaltend 500 mM NaCl, 5 mM Imidazol, – Waschpuffer: Potassiumphosphat 50 mM, pH-Wert 7,8, enthaltend 500 mM NaCl, 5 und 50 mM Imidazol, – Elutionspuffer: Potassiumphosphat 50 mM, pH-Wert 7,8, enthaltend 500 mM NaCl und 175 mM Imidazol.
Rekombinante Proteine, die in gereinigter Form nach einem der Ansprüche 1 bis 10 auf eine Weise abgeleitet werden, wie sie nach dem Verfahren von Anspruch 11 erhalten werden, bei dem die verschiedenen Waschpuffer für Bakterien, die Lysepuffer, Waschpuffer und Elutionspuffer die Folgenden sind: – Waschpuffer für Bakterien: 10 mM Tris, pH-Wert 8,0, – Lyse-Puffer: • 50 mM Tris-Puffer, pH-Wert 8,0, ergänzt durch 300 mM LiSO₄ und 5 mM Imidazol, • oder 50 mM Tris-Puffer, pH-Wert 8,0, ergänzt durch 300 mM KCl und 5 mM Imidazol, – Waschpuffer: • 50 mM Tris-Puffer, pH-Wert 8,0, ergänzt durch 300 mM LiSO₄ und 5 oder 50 mM Imidazol, • oder 50 mM Tris-Puffer, pH-Wert 8,0, ergänzt durch 300 mM KCl und 5 oder 50 mM Imidazol. – Elutionspuffer: • 20 mM MES-Puffer, pH-Wert 6,4, 300 mM LiSO₄ und 175 bis 750 mM Imidazol, • oder 20 mM PIPES-Puffer, pH-Wert 8,0, ergänzt durch 300 mM KCl und 175 bis 750 mM Imidazol.
Proteine nach einem der Ansprüche 1 bis 13, gekennzeichnet durch ihre enzymatische Aktivität, die für Substrate des langkettigen β-Cetoscyl-Typus spezifisch ist, insbesondere mit 8 bis 20 Kohlenstoffatomen, wie das β-Cetooctanoyl-CoA oder das β-Cetododecanoyl-CoA.
Proteine nach einem der Ansprüche 1 bis 14, deren Hauptmerkmale ihrer Tertiärtruktur bei einer Auflösung von 1,6 bis 2,0 Angström durch die Analyse anhand der Beugung der Röntgenstrahlen an den Kristallen der besagten Proteine festgestellt werden, wobei diese derart sind, wie sie in 1 für das rekombinante MabA-Protein, das entsprechend der Sequenz SEQ ID NO: 15 modifiziert wurde, dargestellt sind, und wie sie in 2 für das abgeleitete MabA-Protein C(60)V, das der Sequenz SEQ ID NO: 16 entspricht, dargestellt sind, und so, wie sie in 3 für das abgeleitete MabA-Protein C(60)V/S(144)L, das der Sequenz SEQ ID NO: 17 entspricht, dargestellt sind.
Proteine nach einem der Ansprüche 1 bis 15 in kristallisierter Form.
Proteinkristalle nach Anspruch 16, wie sie durch das Verfahren der Wasserdampfdiffusion mit einem hängenden Tropfen erhalten wurden, indem die besagten Proteine vermischt werden (1 μl einer Lösung aus 10 mg/ml) mit einer Polyethylen-Glycol-Lösung, CsCl (150 bis 300 mM) und Glycerol (zu 10%) in einem Puffer (PIPES) bei einem pH-Wert von 6,2.
Proteinkristalle nach Anspruch 16 oder 17, wie sie gemäß dem Verfahren der Kristallisation, das in Anspruch 17 beschrieben ist, erhalten werden, wobei besagtes Verfahren ausgehend von den gereinigten Proteinen nach Anspruch 13 durchgeführt wird.
Kristalle des rekombinanten MabA-Proteins entsprechend der Sequenz SEQ ID NO: 15 nach einem der Ansprüche 16 bis 18, wobei die Atomkoordinaten der Tertiärstruktur in 1 dargestellt sind und die folgenden Merkmale aufweisen: – Maschenparameter: • a = 81.403 Angström, b = 116.801 Angström, c = 52.324 Angström, • α = β = 90.00°, γ = 122.30°, – Raumgruppe: C2, – Maximale Beugung = 2,05 Angström.
Kristalle des C(60)V-Proteins entsprechend der Sequenz SEQ ID NO: 16 nach einem der Ansprüche 16 bis 18, wobei die Atomkoordinaten der Tertiärstruktur in 2 dargestellt sind und die folgenden Merkmale aufweisen: – Maschenparameter: • a = 82.230 Angström, b = 118.610 Angström, c = 53.170 Angström, • α = β = 90.00°, γ = 122.74°, – Raumgruppe: C2, – Maximale Beugung = 2,6 Angström.
Kristalle des C(60)V/S(144)L-Proteins entsprechend der Sequenz SEQ ID NO: 18 nach einem der Ansprüche 16 bis 18, wobei die Atomkoordinaten der Tertiärstruktur in 3 dargestellt sind und die folgenden Merkmale aufweisen: – Maschenparameter: • a = 81.072 Angström, b = 117.022 Angström, c = 53.170 Angström, • α = β = 90.00°, γ = 122.42°, – Raumgruppe: C2, – Maximale Beugung = 1,75 Angström.
Proteinkristalle nach einem der Ansprüche 17 bis 21, bei denen besagte Proteine an einen Liganden gebunden sind, nämlich an ein Molekül, das in der Lage ist, sich an das MabA-Protein oder an Proteine, die aus diesem zuletzt genannten Protein abgeleitet sind, zu binden, insbesondere an ihre aktive Stelle, die haupt sächlich durch die Aminosäuren, die sich an den folgenden Positionen befinden, begrenzt wird: 21 bis 28, 45 bis 48, 60 bis 63, 87 bis 100, 112, 138 bis 157, 183 bis 212, und 240 bis 247, sowie Proteine, die in einem der Ansprüche 1 bis 6 beschrieben sind oder sich an den Positionen 41 bis 48, 65 bis 68, 80 bis 83, 107 bis 120, 132, 158 bis 177, 203 bis 232, und 260 bis 267 befinden, sowie Proteine, die in einem der Ansprüche 7 oder 8 beschrieben sind oder sich an den Positionen 24 bis 31, 48 bis 51, 63 bis 66, 90 bis 103, 115, 141 bis 160, 186 bis 215, und 243 bis 250 befinden, sowie Proteine, die in Anspruch 9 beschrieben sind oder sich an den Positionen 14 bis 11, 38 bis 41, 53 bis 56, 80 bis 93, 105, 131 bis 150, 176 bis 205, und 233 bis 240 befinden, sowie Proteine, die in Anspruch 10 beschrieben sind, wobei besagte Kristalle durch Einweichen oder durch Co-Kristallisation eines rekombinanten Proteines erhalten werden, das vom MabA-Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 16 in der Gegenwart des besagten Liganden abgeleitet wurde, insbesondere unter den Bedingungen der Kristallisation, die in Anspruch 17 definiert sind.
Nukleotidsequenz, die ein Protein kodiert, das vom MabA-Protein abgeleitet wurde, wie es in einem der Ansprüche 1 bis 16 definiert ist.
Rekombinante Nukleotidsequenz, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein vom MabA-Protein ableitendes Protein kodiert, nach einem der Ansprüche 1 bis 16, zusammen mit den notwendigen Elementen für die Transkription dieser Sequenz, insbesondere mit einem Promotor und einem Transkriptionsterminator.
Vektor, insbesondere ein Plasmid, umfassend eine Nukleotidsequenz nach Anspruch 24.
Wirtszellen, die durch einen Vektor nach Anspruch 25 transformiert werden, wobei besagte Zellen insbesondere unter den Bakterien wie E. Coli ausgewählt werden, oder jeder andere Mikroorganismus, der für die Produktion von Proteinen verwendet wird.
Verfahren der Aufbereitung von rekombinanten Proteinen, die vom MabA-Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 16 abgeleitet sind, gekennzeichnet dadurch, dass dieses die folgenden Schritte umfasst: – Transformation der Zellen mit Hilfe eines rekombinanten Vektors nach Anspruch 25, – Anlegen einer Kultur mit der auf diese Weise transformierten Zellen und Gewinnen der besagten Proteine, die durch besagte Zellen produziert werden, – Reinigen der besagten Proteine nach dem Verfahren, das in den Ansprüchen 11 bis 13 beschrieben ist.
Verwendung von rekombinanten Proteinen, die vom MabA-Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 16 abgeleitet sind, oder von Kristallen nach einem der Ansprüche 17 bis 22 für die Durchführung von Verfahren zum Screening von Liganden des MabA-Proteins und insbesondere von Molekülen, die dazu neigen, sich spezifisch an die aktive Stelle des MabA-Proteins zu binden oder Proteine mit ähnlicher Struktur wie das MabA-Protein, und Hemmen der enzymatischen Aktivität dieses Letzteren, wobei diese Hemmstoffe insbesondere ausgewählt sind unter den: – Steroidderivaten, – Derivaten des Tuberkulose-spezifischen Antiobiotikums Isoniazid (Isonicotinsäure-Hydrazid), sowie den Derivaten des Isonicotinoyl-NAD(P)-Adduktes, – Derivaten aus N-Acetyl-Cysteamin oder anderen Arten von simplifizierten Derivaten des Coenzyms A, umfassend einen Fluorophor mit einem Pfropf, der die Anwendung des Verfahrens der Fluoreszenz-Spektroskopie gestattet, wobei diese für die Feststellung des Zusammenwirkens der Proteine und Liganden zeitlich aufgelöst ist, – Derivaten, die das InhA-Protein des Mycobacterium Tuberculosis hemmen.
Verwendung nach Anspruch 28 für die Durchführung von Verfahren zum Screening von Liganden des MabA-Proteins, die in pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet werden können, insbesondere im Rahmen der Behandlung von Krankheiten, die in Verbindung stehen mit mykobakteriellen Infektionen wie der Tuberkulose, die verbunden ist mit der Infektion durch das Mycobacterium Tuberculosis oder durch das Mycobacterium Africanium oder Lepra, die in Verbindung steht mit der Infektion durch das Mycobacterium Leprae oder die Mykobakteriose, die in Verbindung steht mit der Infektion durch fakultativ pathogene Mykobakterien wie das Mycobacterium avium, das Mycobacterium fortuitum, das Mycobacterium kansasii und das Mycobacterium Chelonae.
Verfahren zum Screening von Liganden des MabA-Proteins, gekennzeichnet dadurch, dass dieses die folgenden Schritte umfasst: – Herstellen eines rekombinanten Proteines, das vom MabA-Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 16 abgeleitet ist, – Feststellen der möglichen Bindung zwischen besagtem Protein und dem durch Messung getesteten Liganden infolge der Durchführung der Fluoreszenzanregung, insbesondere bei 300 nm, wobei die Intensität der ausgestrahlten Fluoreszenz des besagten Proteines zwischen 300 und 400 nm beträgt (im Wesentlichen gemäß der Fluoreszenzanregung des Einzeltryptophans W145) und Vergleich mit der Intensität der Fluoreszenz, die in einem Assay in der Abwesenheit des Liganden ausgestrahlt wurde, Fixieren eines Liganden an der aktiven Stelle des MabA, wobei dies durch ein Fluoreszenzquenching gekennzeichnet ist.
Verfahren zum Screening von Liganden, die das MabA-Protein hemmen, gekennzeichnet dadurch, dass dieses die folgenden Schritte umfasst: – Herstellen eines rekombinanten Proteines, das vom MabA-Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 16 abgeleitet ist, in einem Reaktionsmedium, das ein Substrat wie ein β-Cetoacyl-Derivat enthält, das in Anspruch 14 definiert ist, sowie das NADPH-Coenzym und den getesteten Liganden, – Feststellen einer potenziellen Fähigkeit des getesteten Liganden als Hemmstoff durch kinetische Messung des Absorptionsgrades, insbesondere bei 340 nm und Vergleich der Neigung der optischen Dichtekurve im Hinblick auf die Zeit mit der Neigung, die in einem Assay ohne Vorhandensein des Liganden erhalten wurde.
Verfahren zum Screening von Liganden des MabA-Proteins, gekennzeichnet dadurch, dass dieses die folgenden Schritte umfasst: – Herstellen eines rekombinanten Proteines, das vom MabA-Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 16 abgeleitet ist, mit dem getesteten Liganden, – Analyse der Tertiärstruktur des Komplexes, der zwischen besagtem Protein und besagtem Liganden in löslicher Phase entstanden ist, insbesondere durch NMR-Spektroskopie und durch Fluoreszenz.
Verfahren zum Screening von Liganden des MabA-Proteins, gekennzeichnet dadurch, dass dieses die folgenden Schritte umfasst: – Co-Kristallisation des getesteten Liganden und eines rekombinanten Proteines, das vom MabA-Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 16 abgeleitet wurde, insbesondere unter den Kristallisationsbedingungen, die in Anspruch 17 definiert sind und auf eine Weise, so dass Kristalle nach Anspruch 22 erhalten werden, – oder Einweichen der Kristalle eines rekombinanten Proteines, das nach einem der Ansprüche 17 bis 22 abgeleitet ist, in optimierten Lösungen, die den potenziellen Liganden enthalten, – Analyse der Tertiärstruktur der oben genannten Kristalle, insbesondere durch Beugung von Röntgenstrahlen (im Hinblick auf die Auswahl der Liganden, die eine optimale Kapazität aufweisen, die aktive Stelle der besagten Proteine zu besetzen und zu blockieren).