ES2283790T3 - Utilizacion de la proteina maba (fabg1) de micobacterium tuberculosis para la concepcion y la deteccion sistematica de antibioticos. - Google Patents
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Abstract
Proteínas derivadas de la proteína MabA, caracterizadas porque corresponden a la proteína MabA cuya secuencia de aminoácidos SEC ID nº: 1 que es la siguiente: es tal que: - la cisteína en la posición 60 se sustituye por un resto valina, y/o la glicina en la posición 139 se sustituye por una alanina o una serina, y/o la serina en la posición 144 se sustituye por un resto leucina, y/o - comprende las mutaciones N24D(o E), y/o H46D, - se modifica mediante inserción del lado N-terminal de una etiqueta poli-Histidina tal como la secuencia SEC ID nº: 14 siguiente: MGSSHHHHHH SSGLVPRGSH, - representa una secuencia GSH en N-terminal, - se suprimen los siete primeros aminoácidos.
Description
Utilización de la proteína MabA (FabG1) de
Mycobacterium tuberculosis para la concepción y la detección
sistemática de antibióticos.
El objetivo de la presente invención consiste
principalmente en la utilización de la proteína MabA, y de proteínas
derivadas, y más particularmente de las coordenadas cristalográficas
de estas proteínas, en el campo de la implementación de métodos de
concepción y de detección sistemática de ligandos de estas proteínas
y, ventajosamente, de ligandos inhibidores de la actividad
enzimática de estas proteínas, a saber, de antibióticos susceptibles
de ser usados en el ámbito del tratamiento de micobacteriosis.
La tuberculosis es una de las mayores causas de
mortalidad mediante agente infeccioso único, Mycobacterium
tuberculosis. Además, desde hace unos quince años, existe un
recrudecimiento de esta enfermedad en los países industrializados.
Este fenómeno se debe, en parte, a la aparición de cepas de bacilos
tuberculosos resistentes a los antibióticos. Así, la concepción de
nuevos medicamentos antituberculosos empezó a ser una prioridad para
la Organización Mundial de la Salud.
Los objetivos de los antibióticos
antituberculosos usados actualmente en clínica forman parte de
metabolismos de biosíntesis de componentes de la cubierta del bacilo
tuberculoso. En particular, el objetivo de la isoniazida (INH),
antituberculoso de primera línea, está implicado en la síntesis de
ácidos grasos de cadena muy larga (C60-C90), los
ácidos micolicos. La isoniazida inhibe la actividad de la proteína
InhA, que pertenece a un complejo enzimático,
FAS-II, cuya función es producir, mediante ciclos de
elongación sucesivas, de los ácidos grasos de cadenas largas
(C18-C32), precursores de los ácidos micolicos. La
InhA, una
2-trans-enoil-ACP
reductasa, cataliza la cuarta etapa de un ciclo de elongación, que
comprende 4 etapas. El INH es un profármaco que forma, con la
coenzima de InhA, el NADH, un aducto inhibidor, el
INH-NAD(H). FAS-II comprende
al menos otras 3 enzimas principales, éstas representan, por lo
tanto, dianas potenciales para nuevos antibióticos. La proteína MabA
cataliza la segunda etapa del ciclo.
La presente invención suministra métodos para la
concepción de antibióticos para el tratamiento de infecciones
micobacterianas, en particular la tuberculosis. La presente
invención se refiere al gen mabA (fabG1, Rv1483) de
Mycobacterium tuberculosis, al producto de este gen, la
proteína MabA (FabG1), así como al material y a los métodos usados
para la producción de la proteína en grandes cantidades, la
determinación de su estructura tridimensional a escala atómica y el
estudio de sus interacciones con distintos ligandos o de sus efectos
sobre su actividad enzimática. La invención utiliza la proteína MabA
como diana de antibióticos; en particular, se usa el estudio de la
interacción de MabA con distintos ligandos o de sus efectos sobre su
actividad enzimática, mediante distintos métodos, para realizar
inhibidores de la actividad enzimática de MabA.
La presente invención proporciona las
herramientas metodológicas y los materiales necesarios para la
concepción de moléculas que representan potenciales antibióticos
anti-micobacterianos y antituberculosos.
La presente invención proporciona el material
biológico y las metodologías, necesarios para la producción y la
purificación en grandes cantidades, de una diana potencial de
antibióticos antituberculosos, a proteína MabA. Además, estas etapas
se pueden realizar muy rápidamente gracias a la superproducción de
MabA provista de una etiqueta poli-Histidina en
Escherichia coli, y su purificación en una sola etapa
mediante cromatografía de quelación de metales, dando una proteína
con alto grado de pureza. La cantidad y la calidad de la proteína
purificada permiten obtener resultados fiables durante los estudios
de la actividad enzimática o de fijación de ligandos, pero permite
asimismo la cristalización de la proteína para resolver su
estructura tridimensional. La implementación de condiciones que
permiten la congelación de los cristales de MabA en nitrógeno
líquido permitió obtener combinaciones de datos de resolución
atómica (2,05 \ring{A} contra 2,6 \ring{A} a temperatura
ambiente), y abre la posibilidad a mejores datos gracias a la
utilización de radiaciones de sincrotón. La estructura cristalina
congelada ha dado a conocer el papel de los compuestos
(especialmente el cesio) necesarios para el crecimiento de los
cristales de MabA, y permite prever una optimización racional de la
cristalogénesis. También se puede realizar la detección sistemática
in cristallo de "lotes" de ligandos. La cantidad de
proteína purificada es asimismo un criterio importante para la
realización de detecciones sistemáticas de alto rendimiento de
quimiotecas (véase a continuación).
Los ensayos de la actividad de la proteína MabA,
y por consiguiente los ensayos de la inhibición mediante inhibidores
potenciales, se pueden monitorizar fácil y rápidamente, mediante
espectrometría, siguiendo la oxidación de la coenzima de reducción,
el NADPH, a 340 nm. Se pueden deducir las constantes de inhibición
(IC50 y Ki) y el mecanismo de inhibición (inhibición competitiva, no
competitiva, acompetitiva) para cada molécula. Además, se pueden
realizar asimismo ensayos de fijación específica de ligandos al
sitio activo de MabA de manera fácil y rápida, mediante
espectrofluorimetría. La presencia del único residuo Trp de la
proteína en el sitio activo permite, mediante excitación a 303 nm,
detectar, a partir de la variación de intensidad de emisión de
fluorescencia en el máximo de emisión, la fijación de un ligando, y
deducir la constante de disociación (Kd). De manera similar, se
pueden realizar experimentos de FRET (Transferencia de energía por
fluorescencia de resonancia) en presencia de la coenzima, el NADPH,
permitiendo concluir si el ligando ocupa o no el sitio de fijación
del NADPH (competición de fijación). La simplicidad de estos métodos
de medición, y los volúmenes relativamente bajos que necesitan,
permitirán una miniaturización de los ensayos de inhibición o de
fijación del ligando, para la automática detección sistemática de
alto rendimiento de quimiotecas, gracias a un autómata dotado de un
espectrofotómetro o de un espectrofluorímetro.
La comparación de la estructura de MabA con la
de la proteína InhA, proteína de la misma superfamilia estructural
(RED) y que pertenece al mismo complejo enzimático (véase
anteriormente), permitió sugerir un efecto inhibidor de la
isoniazida sobre la actividad de MabA, y detectar la forma activa de
la isoniazida (antituberculoso), el aducto
INH-NADP(H). Después, se confirmó la fijación
del aducto y la inhibición de la actividad de MabA
experimentalmente. De la misma manera, gracias a una alta similitud
de estructura con otras proteínas, que fueron cristalizadas o se
cristalizaron con ligandos (por ejemplo, derivados de esteroides,
cocristalizados con esteroides deshidrogenasas), la concepción
racional de inhibidores potenciales de MabA se podrá realizar
rápidamente.
La proteína MabA presenta un interés particular
como diana de antibióticos antimicobacterianos. En efecto, pertenece
al mismo sistema enzimático que la proteína InhA, diana del
medicamento antituberculoso de primera línea, la isoniazida. Por
otra parte, hasta ahora, no se ha detectado proteína homóloga a MabA
en las células animales. Además, la comparación con las proteínas
homólogas, encontradas en las bacterias o en las plantas, destacó
propiedades particulares de MabA, relacionadas con su función,
debido a que usa sustratos de cadena larga. Estas particularidades
se reflejan en la estructura de su sitio activo, lo que permite
prever la concepción de inhibidores específicos a
MabA (especialmente en término de impedimento y de carácter hidrófobo), y, por lo tanto, de antibióticos con espectro estrecho. Estos distintos puntos aportan a MabA criterios de credibilidad farmacológica.
MabA (especialmente en término de impedimento y de carácter hidrófobo), y, por lo tanto, de antibióticos con espectro estrecho. Estos distintos puntos aportan a MabA criterios de credibilidad farmacológica.
Así, la presente invención tiene principalmente
por objetivo:
- -
- la búsqueda y la concepción de medicamentos eficaces contra las infecciones micobacterianas oportunistas (M. avium, M. Kansasii, M. fortuitum, M. chelonae, etc.) que son problemáticas en los hospitales (esterilización del instrumental médico), y en el caso de inmunodeficiencia humana (SIDA, toma de inmunosupresores durante un injerto, en el caso de cánceres, etc.).
- -
- la búsqueda y la concepción de medicamentos eficaces contra las infecciones tuberculosas, especialmente de medicamentos eficaces sobre las cepas de M. tuberculosis resistentes a los antibióticos usados actualmente en terapia antiberculosa, y que se propagan en poblaciones con riesgo (entorno carcelario, entorno económico desfavorecido, etc.).
- -
- la búsqueda y la concepción de medicamentos eficaces contra otras infecciones bacterianas, tomando como dianas moleculares unas proteínas homólogas a MabA.
Biophysical Journal, 82 (1, segunda parte),
página 453a, y Microbiology, 144 (10) páginas
2697-2704, hacen referencia a la cristalización del
MABA que deriva de la bacteria Mycobacterium
tuberculosis.
La presente invención tiene principalmente por
objeto derivados de la proteína MabA, también denominada proteína
FabG1, mediante mutación de uno o varios aminoácidos, estando dichas
proteínas derivadas en forma purificada, y teniendo una actividad
dependiente de \beta-cetoacilo reductasa
NADPH.
La invención tiene más particularmente por
objeto derivados de la proteína MabA recombinante purificada, siendo
dicha proteína una proteína de micobacterias, tal como
Mycobacterium tuberculosis, y más particularmente de M.
tuberculosis cepa H37Rv.
La invención tiene asimismo por objeto dichas
proteínas recombinantes derivadas, en forma purificada, tales como
las obtenidas mediante transformación de cepas de E. coli con
un plásmido que contiene una secuencia que comprende el gen que
codifica la proteína MabA, o que comprende una secuencia que
codifica una proteína derivada de MabA tal como se define
anteriormente, seguido de una etapa de purificación durante la
cual:
- -
- dichas bacterias E. coli recombinantes se lavan en un tampón de lavado, y después se recogen en un tampón de lisis, y se lisan mediante un ciclo de congelación/descongelación en presencia de inhibidores de proteasas y de lisozima,
- -
- después del tratamiento mediante ADNasa I y ARNasa A, en presencia de MgCl_{2}, y centrifugación, el sobrenadante de lisis de las bacterias obtenido en la etapa anterior, al que se le añade 10% (p/p) de glicerol, o 400 \muM de NADP^{+}, se dispone en una columna de resina agarosa Ni-NTA,
- -
- después de varios lavados con 5 mM de tampón y después 50 mM de imidazol, la proteína MabA, o la proteína derivada, se eluye con el tampón de elución.
Según un modo de realización de la invención,
dichas proteínas recombinantes derivadas, en forma purificada, se
obtienen según el procedimiento descrito anteriormente, en el que
los distintos tampones de lavado de las bacterias, de lisis, de
lavado y de elución, son los siguientes:
- -
- Tampón de lavado de las bacterias: 10 mM de fosfato de potasio, pH 7,8,
- -
- Tampón de lisis: 50 mM de fosfato de potasio, pH7,8, que contiene 500 mM de NaCl, 5 mM de imidazol,
\newpage
- -
- Tampón de lavado: 50 mM de fosfato de potasio, pH 7,8, que contiene 500 mM de NaCl, 5 y 50 mM de imidazol,
- -
- Tampón de elución: 50 mM de fosfato de potasio, pH 7,8, que contiene 500 mM de NaCl y 175 mM de imidazol.
Ventajosamente, las proteínas obtenidas con la
ayuda de dichos tampones, se usan en el ámbito de estudios de
cinética enzimática para la detección sistemática de ligandos según
los métodos descritos a continuación.
Según otro modo de realización de la invención,
dichas proteínas recombinantes derivadas, en forma purificada, se
obtienen según el procedimiento descrito anteriormente, en el que
los distintos tampones de lavado de las bacterias, de lisis, de
lavado y de elución, son los siguientes:
- -
- tampón de lavado de las bacterias: 10 mM de Tris, pH 8,0,
- -
- tampón de lisis:
- \bullet
- 50 mM de tampón de Tris, pH 8,0, adicionado con 300 mM de LiSO_{4} y 5 mM de imidazol;
- \bullet
- o 50 mM de tampón de Tris, pH 8,0, adicionado con 300 mM de KCl y 5 mM de imidazol.
- -
- tampón de lavado:
- \bullet
- 50 mM de tampón de Tris, pH 8,0, adicionado con 300 mM de LiSO_{4} y 5 ó 50 mM de imidazol;
- \bullet
- o 50 mM de tampón de Tris, pH 8,0, adicionado con 300 mM de KCl y 5 ó 50 mM de imidazol.
- -
- tampón de elución:
- \bullet
- 20 mM de tampón de MES, pH 6,4, 300 mM de LiSO_{4} y 175-750 mM de imidazol,
- \bullet
- o 20 mM de tampón de PIPES, pH 8,0, adicionado con 300 mM de KCl y 175-750 mM de imidazol.
Ventajosamente, las proteínas obtenidas con la
ayuda de dichos tampones, se usan en el ámbito de estudios de
cristalografía para la concepción y la detección sistemática de
ligandos según los métodos descritos a conti-
nuación.
nuación.
La invención se refiere a dichas proteínas
derivadas de la proteína MabA, y se caracterizan porque corresponden
a la proteína MabA cuya secuencia de aminoácidos SEC ID nº: 1 es la
siguiente:
en la que la cisteína en posición
60 se sustituye por un resto valina, y/o la glicina en posición 139
se sustituye por alanina o serina, y/o la serina en posición 144 se
sustituye por un resto
leucina.
Por eso, la invención tiene más particularmente
por objeto la proteína derivada de la proteína MabA tal como se
define anteriormente, y está caracterizada porque corresponde a la
proteína MabA en la que la cisteína en posición 60 se sustituye por
un resto valina, correspondiendo dicha proteína derivada, también
denominada C(60)V, a la secuencia SEC ID nº 3
siguiente:
\newpage
Con este fin, la invención tiene más
particularmente por objeto la proteína derivada de la proteína MabA
tal como se ha definido anteriormente, y está caracterizada porque
corresponde a la proteína MabA en la que la serina en la posición
144 se sustituye por un resto leucina, correspondiendo dicha
proteína derivada, también denominada
S(144)L, a la secuencia SEC ID nº 5 siguiente:
S(144)L, a la secuencia SEC ID nº 5 siguiente:
Con este fin también, la invención tiene más
particularmente por objeto la proteína derivada de la proteína MabA
tal como se define anteriormente, y está caracterizada porque
corresponde a la proteína MabA en la que la cisteína en la posición
60 se sustituye por un resto valina, y la serina en la posición 144
se sustituye por un resto leucina, correspondiendo dicha proteína
derivada, también designada
C(60)V/S(144)L, a la secuencia SEC ID nº
7 siguiente:
La invención tiene más particularmente por
objeto asimismo la proteína derivada de la proteína MabA tal como se
define anteriormente, y está caracterizada porque corresponde a la
proteína MabA, en la que la cisteína en la posición 60 se sustituye
por un resto valina, la glicina en la posición 139 se sustituye por
una alanina o una serina, y la serina en la posición 144 se
sustituye por un resto leucina, correspondiendo dicha proteína
derivada, también denominada
C(60)V/G(139)[A o S]/S(144)L, a la secuencia SEC ID nº 8 siguiente:
C(60)V/G(139)[A o S]/S(144)L, a la secuencia SEC ID nº 8 siguiente:
en la que X representa A o
S.
La invención se refiere asimismo a la proteína
MabA que corresponde a la secuencia SEC ID nº: 1, o a las proteínas
derivadas de la proteína MabA definidas anteriormente, tales como
las proteínas derivadas que corresponden a las secuencias SEC ID nº:
3, 5, 7 u 8, caracterizadas porque se modifican de tal manera que
comprenden una o varias mutaciones que permiten cambiar la
especificidad de la proteína del NADPH hacia NADH.
La invención tiene más particularmente por
objeto dichas proteínas MabA modificadas, que corresponden a las
siguientes secuencias:
- -
- la secuencia SEC ID nº: 9, que corresponde a la secuencia SEC ID nº: 1, que comprende las mutaciones N24D(o E), y/o H46D, a saber, la siguiente secuencia:
- en la que X_{1} representa D o E, y X_{2} representa H o D,
\newpage
- -
- la secuencia SEC ID nº: 10, que corresponde a la secuencia SEC ID nº: 3, que comprende las mutaciones N24D(o E), y/o H46D, a saber, la siguiente secuencia:
- en la que X_{1} representa D o E, y X_{2} representa H o D,
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- la secuencia SEC ID nº: 11, que corresponde a la secuencia SEC ID nº: 5, que comprende las mutaciones N24D (o E), y/o H46D, a saber, la siguiente secuencia:
- en la que X_{1} representa D o E, y X_{2} representa H o D,
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- la secuencia SEC ID nº: 12, que corresponde a la secuencia SEC ID nº: 7, que comprende las mutaciones N24D (o E), y/o H46D, a saber, la siguiente secuencia:
- en la que X_{1} representa D o E, y X_{2} representa H o D,
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- la secuencia SEC ID nº: 13, que corresponde a la secuencia SEC ID nº: 8, que comprende las mutaciones N24D (o E), y/o H46D, a saber, la siguiente secuencia:
- en la que X_{1} representa D o E, y X_{2} representa H o D.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención tiene asimismo por objeto la
proteína MabA que corresponde a la secuencia SEC ID nº: 1, o a las
proteínas derivadas de la proteína MabA definidas anteriormente,
tales como las proteínas derivadas que corresponden a las secuencias
SEC ID nº: 3, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ó 13, caracterizadas porque se
modifican mediante inserción, en el lado N-terminal,
de una etiqueta poli-Histidina tal como la secuencia
SEC ID nº: 14 siguiente: MGSSHHHHHH SSGLVPRGSH.
\newpage
La invención tiene más particularmente por
objeto dichas proteínas MabA modificadas, que corresponden a las
siguientes secuencias:
- -
- la secuencia SEC ID nº: 15, que corresponde a la combinación de la secuencia SEC ID nº: 14 y la secuencia SEC ID nº: 1, a saber, la siguiente secuencia:
- -
- la secuencia SEC ID nº: 16, que corresponde a la combinación de la secuencia SEC ID nº: 14 y la secuencia SEC ID nº: 3, a saber, la siguiente secuencia:
- -
- la secuencia SEC ID nº: 17, que corresponde a la combinación de la secuencia SEC ID nº: 14 y la secuencia SEC ID nº: 5, a saber, la siguiente secuencia:
- -
- la secuencia SEC ID nº: 18, que corresponde a la combinación de la secuencia SEC ID nº: 14 y la secuencia SEC ID nº: 7, a saber, la siguiente secuencia:
- -
- la secuencia SEC ID nº: 19, que corresponde a la combinación de la secuencia SEC ID nº: 14 y la secuencia SEC ID nº: 9, a saber, la siguiente secuencia:
- en la que X_{1} representa D o E, y X_{2} representa H o D,
- -
- la secuencia SEC ID nº: 20, que corresponde a la combinación de la secuencia SEC ID nº: 14 y la secuencia SEC ID nº: 10, a saber, la siguiente secuencia:
- en la que X_{1} representa D o E, y X_{2} representa H o D,
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- la secuencia SEC ID nº: 21, que corresponde a la combinación de la secuencia SEC ID nº: 14 y la secuencia SEC ID nº: 11, a saber, la siguiente secuencia:
- en la que X_{1} representa D o E, y X_{2} representa H o D,
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- la secuencia SEC ID nº: 22, que corresponde a la combinación de la secuencia SEC ID nº: 14 y la secuencia SEC ID nº: 12, a saber, la siguiente secuencia:
- en la que X_{1} representa D o E, y X_{2} representa H o D,
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- la secuencia SEC ID nº: 23, que corresponde a la combinación de la secuencia SEC ID nº: 14 y la secuencia SEC ID nº: 13, a saber, la siguiente secuencia:
- en la que X_{1} representa D o E, y X_{2} representa H o D,
\newpage
La invención tiene las proteínas derivadas de la
proteína MabA definidas anteriormente, tales como las proteínas
derivadas que corresponden a las secuencias SEC ID nº: 3, 5, 7, 8,
9, 10, 11, 12 ó 13, que presentan una secuencia GSH en
N-terminal, a saber, las siguientes secuencias:
- -
- la secuencia SEC ID nº: 24 siguiente, que corresponde a la combinación de la secuencia GSH y la secuencia SEC ID nº: 1,
- -
- la secuencia SEC ID nº: 25 siguiente, que corresponde a la combinación de la secuencia GSH y la secuencia SEC ID nº: 3,
- -
- la secuencia SEC ID nº: 26 siguiente, que corresponde a la combinación de la secuencia GSH y la secuencia SEC ID nº: 5,
- -
- la secuencia SEC ID nº: 27 siguiente, que corresponde a la combinación de la secuencia GSH y la secuencia SEC ID nº: 7,
- -
- la secuencia SEC ID nº: 28 siguiente, que corresponde a la combinación de la secuencia GSH y la secuencia SEC ID nº: 9,
- en la que X_{1} representa D o E, y X_{2} representa H o D,
\newpage
- -
- la secuencia SEC ID nº: 29 siguiente, que corresponde a la combinación de la secuencia GSH y la secuencia SEC ID nº: 10,
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- en la que X_{1} representa D o E, y X_{2} representa H o D,
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- la secuencia SEC ID nº: 30 siguiente, que corresponde a la combinación de la secuencia GSH y la secuencia SEC ID nº: 11,
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- en la que X_{1} representa D o E, y X_{2} representa H o D,
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- la secuencia SEC ID nº: 31 siguiente, que corresponde a la combinación de la secuencia GSH y la secuencia SEC ID nº: 12,
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- en la que X_{1} representa D o E, y X_{2} representa H o D,
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- la secuencia SEC ID nº: 32 siguiente, que corresponde a la combinación de la secuencia GSH y la secuencia SEC ID nº: 13,
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- en la que X_{1} representa D o E, y X_{2} representa H o D,
\newpage
La invención tiene por objeto las proteínas
derivadas de la proteína MabA definidas anteriormente, tales como
las proteínas derivadas que corresponden a las secuencias SEC ID nº:
3, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ó 13, en las que se suprimen los siete
primeros aminoácidos, a saber, las siguientes secuencias:
- -
- la secuencia SEC ID nº: 33 siguiente, que corresponde a la secuencia SEC ID nº: 1, de la cual se suprimen los siete primeros aminoácidos:
- -
- la secuencia SEC ID nº: 34 siguiente, que corresponde a la secuencia SEC ID nº: 3, de la cual se suprimen los siete primeros aminoácidos:
- -
- la secuencia SEC ID nº: 35 siguiente, que corresponde a la secuencia SEC ID nº: 5, de la cual se suprimen los siete primeros aminoácidos:
- -
- la secuencia SEC ID nº: 36 siguiente, que corresponde a la secuencia SEC ID nº: 7, de la cual se suprimen los siete primeros aminoácidos:
- -
- la secuencia SEC ID nº: 37 siguiente, que corresponde a la secuencia SEC ID nº: 9, de la cual se suprimen los siete primeros aminoácidos:
- en la que X_{1} representa D o E, y X_{2} representa H o D,
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- la secuencia SEC ID nº: 38 siguiente, que corresponde a la secuencia SEC ID nº: 10, de la cual se suprimen los siete primeros aminoácidos:
- en la que X_{1} representa D o E, y X_{2} representa H o D,
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- la secuencia SEC ID nº: 39 siguiente, que corresponde a la secuencia SEC ID nº: 11, de la cual se suprimen los siete primeros aminoácidos:
- en la que X_{1} representa D o E, y X_{2} representa H o D,
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- la secuencia SEC ID nº: 40 siguiente, que corresponde a la secuencia SEC ID nº: 12, de la cual se suprimen los siete primeros aminoácidos:
- en la que X_{1} representa D o E, y X_{2} representa H o D,
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- la secuencia SEC ID nº: 41 siguiente, que corresponde a la secuencia SEC ID nº: 13, de la cual se suprimen los siete primeros aminoácidos:
- en la que X_{1} representa D o E, y X_{2} representa H o D.
La invención se refiere a dichas proteínas
derivadas, caracterizadas por su actividad enzimática específica de
los sustratos de tipo \beta-cetoacilo de cadena
larga, especialmente de entre 8 a 20 átomos de carbono, tal como
\beta-cetooctanoil-CoA, o
\beta-cetododecanoil-CoA.
La invención tiene más particularmente por
objeto dichas proteínas, cuyas características principales de su
estructura tridimensional a una resolución de
1,6-2,0 ángstrom, demostradas mediante el análisis
por difracción con rayos X de los cristales de dichas proteínas, son
tales como se representan en la figura 1 para la proteína MabA
recombinante que corresponde a la secuencia SEC ID nº: 15, en la
figura 2 para la proteína derivada MabA C(60)C que
corresponde a la secuencia SEC ID nº: 16, y en la figura 3 para la
proteína derivada MabA C(60)V/S(144)L
que corresponde a la secuencia SEC ID nº: 17.
La invención se refiere asimismo a la proteína
MabA y a dichas proteínas derivadas, en forma cristalizada.
La invención se refiere más particularmente a
los cristales de dichas proteínas, tales como las obtenidas mediante
el método de difusión de vapor en gota suspendida, mezclando dichas
proteínas (1 \mul de una disolución al 10 mg/ml) con una
disolución de polietilenglicol, de CsCl (150-300
mM), y de glicerol (al 10%) en un tampón (PIPES) con pH 6,2.
La invención tiene asimismo por objeto dichos
cristales de proteínas, tales como los obtenidos según el método de
cristalización descrito anteriormente, estando dicho método
realizado a partir de las proteínas purificadas con la ayuda de
dichos tampones, más particularmente usados para la obtención de
proteínas de la invención destinadas a estudios de
cristalografía.
La invención se refiere asimismo a dichos
cristales de la proteína MabA recombinante que corresponde a la
secuencia SEC ID nº: 15, cuyas coordenadas atómicas de la estructura
tridimensional se representan en la figura 1, y que presenta las
siguientes características:
- -
- parámetro de células:
- \bullet
- a = 81,403 ángstrom, b = 116,801 ángstrom, c = 52,324 ángstrom,
- \bullet
- \alpha = \beta = 90,00º, \gamma = 122,30º,
- -
- grupo espaciador: C2,
- -
- difracción máxima = 2,05 ángstrom.
La invención se refiere asimismo a dichos
cristales de la proteína C(60)V que corresponden a la
secuencia SEC ID nº: 16, cuyas coordenadas atómicas de la estructura
tridimensional se representan en la figura 2, y que presentan las
siguientes características:
- -
- parámetro de células:
- \bullet
- a = 82,230 ángstrom, b = 118,610 ángstrom, c = 53,170 ángstrom,
- \bullet
- \alpha = \beta = 90,00º, \gamma = 122,74º,
- -
- grupo espaciador: C2,
- -
- difracción máxima = 2,6 ángstrom.
La invención tiene asimismo por objeto dichos
cristales de la proteína C(60)V/S(144)L
que corresponde a la secuencia SEC ID nº: 18, cuyas coordenadas
atómicas de la estructura tridimensional se representan en la figura
3, y que presenta las siguientes características:
- -
- parámetro de células:
- \bullet
- a = 81,072 ángstrom, b = 117,022 ángstrom, c = 53,170 ángstrom,
- \bullet
- \alpha = \beta = 90,00º, \gamma = 122,42º,
- -
- grupo espaciador: C2,
- -
- difracción máxima = 1,75 ángstrom.
La invención tiene más particularmente por
objeto los cristales de dichas proteínas derivadas, en los cuales
dichas proteínas están unidas a un ligando, a saber, una molécula
capaz de unirse a la proteína MabA o a las proteínas derivadas de
esta última, más particularmente, a nivel de su sitio activo
principalmente delimitado por los aminoácidos situados en las
posiciones 21 a 28, 45 a 48, 60 a 63, 87 a 100, 112, 138 a 157, 183
a 212 y 240 a 247 de las proteínas que corresponden a las secuencias
SEC ID nº: 1, 3, 5, 7, 8, 9, 10, 11 ó 13, o en las posiciones 41 a
48, 65 a 68, 80 a 83, 107 a 120, 132, 158 a 177, 203 a 232 y 260 a
267, de las proteínas que corresponden a las secuencias SEC ID nº:
15 a 23, o en las posiciones 24 a 31, 48 a 51, 63 a 66, 90 a 103,
115, 141 a 160, 186 a 215, y 243 a 250, de las proteínas que
corresponden a las secuencias SEC ID nº: 24 a 32, o en las
posiciones 14 a 11, 38 a 41, 53 a 56, 80 a 93, 105, 131 a 150, 176 a
205, y 233 a 240, de las proteínas que corresponden a las secuencias
SEC ID nº: 33 a 41, siendo dichos cristales como los obtenidos
mediante inmersión o cocristalización de la proteína MabA
recombinante en forma purificada, o de una proteína recombinante
derivada de dicha proteína MabA, en presencia de dicho ligando,
especialmente en las condiciones de cristalización definidas
anteriormente.
\newpage
La invención se refiere asimismo a las
secuencias nucleotídicas que codifican una proteína derivada de la
proteína MabA tal como se ha definido anteriormente.
Con este fin, la invención tiene más
particularmente por objeto la secuencia nucleotídica que codifica la
proteína derivada C(60)V (SEC ID nº: 3), y que
corresponde a la secuencia SEC ID nº: 2 siguiente:
o cualquier secuencia derivada
mediante degeneración del código genético y que codifica la proteína
C(60)V.
Con este fin también, la invención tiene por
objeto la secuencia nucleotídica que codifica la proteína
derivada
S(144)L (SEC ID nº: 5), y que corresponde a la secuencia SEC ID nº: 4 siguiente:
S(144)L (SEC ID nº: 5), y que corresponde a la secuencia SEC ID nº: 4 siguiente:
o cualquier secuencia derivada
mediante degeneración del código genético y que codifica la proteína
S(144)L.
Con este fin también, la invención tiene por
objeto la secuencia nucleotídica que codifica la proteína
derivada
C(60)V/S(144)L (SEC ID nº: 7), y que corresponde a la secuencia SEC ID nº: 6 siguiente:
C(60)V/S(144)L (SEC ID nº: 7), y que corresponde a la secuencia SEC ID nº: 6 siguiente:
o cualquier secuencia derivada
mediante degeneración del código genético y que codifica la proteína
C(60)V/
S(144)L.
S(144)L.
La invención se refiere asimismo a cualquier
secuencia nucleotídica recombinante que comprende la secuencia
nucleotídica que codifica la proteína MabA, o que comprende una
secuencia nucleotídica que codifica una proteína derivada de la
proteína MabA, tales como se definen anteriormente, en asociación
con los elementos necesarios para la transcripción de esta
secuencia, especialmente con un promotor y un terminador de
transcripción.
La invención tiene asimismo por objeto cualquier
vector, especialmente plásmido, que contiene una secuencia
nucleotídica tal como se define anteriormente.
La invención se refiere asimismo a las células
huéspedes transformadas mediante un vector citado anteriormente,
eligiéndose dichas células, especialmente, entre las bacterias tales
como E. coli, o cualquier otro microorganismo usado para la
producción de proteínas.
La invención tiene asimismo por objeto un
procedimiento de preparación de la proteína MabA recombinante en
forma purificada, o de proteínas recombinantes derivadas de la
proteína MabA, tales como se definen anteriormente, caracterizado
porque comprende las siguientes etapas:
- -
- transformar células con la ayuda de un vector recombinante citado anteriormente,
- -
- cultivar células así transformadas, y recuperar dichas proteínas producidas por dichas células,
- -
- purificar dichas proteínas según el procedimiento de purificación descrito anteriormente.
La invención se refiere asimismo a la
utilización de la proteína MabA recombinante en forma purificada, o
de proteínas recombinantes derivadas de la proteína MabA tales como
se definen anteriormente, o cristales anteriormente citados, para la
implementación de concepción o de detección sistemática de ligandos
de la proteína MabA, y más particularmente de moléculas susceptibles
de unirse específicamente a nivel del sitio activo de la proteína
MabA, o de proteínas de estructura próxima a la de la proteína MabA,
e inhibir la actividad enzimática de esta última, eligiéndose estos
inhibidores especialmente entre:
- -
- los derivados de esteroides,
- -
- los derivados del antibiótico antituberculoso isoniazida (hidrácido del ácido isonicotínico), tales como los derivados del aducto isonicotinoil-NAD(P),
- -
- los derivados de la N-acetilcisteamina o de otros tipos de derivados simplificados de la coenzima A, que comprenden un fluóforo injertado que permite usar el método de espectroscopia de fluorescencia, en particular, resuelta en el tiempo para la detección de interacciones proteína-ligando,
- -
- los derivados inhibidores de la proteína InhA de Mycobacterium tuberculosis.
La invención tiene más particularmente por
objeto la utilización anteriormente citada de la proteína MabA
recombinante en forma purificada, o de proteínas recombinantes
derivadas de la proteína MabA tales como se definen anteriormente, o
de dichos cristales, para la implementación de métodos de concepción
o de detección sistemática de ligandos de la proteína MabA
susceptibles de ser usados en composiciones farmacéuticas,
especialmente en el ámbito del tratamiento de patologías
relacionadas con infecciones micobacterianas, tales como la
tuberculosis relacionada con la infección mediante micobacterium
tuberculosis, o mediante Micobacterium africanium, o la
lepra relacionada con la infección mediante Mycobacterium
leprae, o las micobacteriosis relacionadas con la infección
mediante micobacterias oportunistas, tales como Mycobacterium
avium, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium kansasii,
Mycobacterium chelonae.
La invención se refiere asimismo a cualquier
método de detección sistemática de ligandos de la proteína MaBa,
caracterizado porque comprende las siguientes etapas:
- -
- presentar la proteína MabA en forma purificada, o una proteína recombinante derivada de la proteína MabA, tales como se definen anteriormente,
- -
- detectar la eventual unión entre dicha proteína y el ligando ensayado mediante la medición, después de la excitación de fluorescencia, especialmente a 300 nm, de la intensidad de fluorescencia de dicha proteína emitida entre 300 y 400 nm (que corresponde esencialmente a la emisión de fluorescencia del único triptófano W145), y comparar la intensidad de fluorescencia emitida en un ensayo sin ligando, estando la fijación de un ligando en el sitio activo MabA caracterizada por una extinción de fluorescencia.
La invención tiene asimismo por objeto cualquier
método de detección sistemática de ligandos inhibidores de la
proteína MabA, caracterizado porque comprende las siguientes
etapas:
- -
- presentar la proteína MabA recombinante en forma purificada, o una proteína recombinante derivada de la proteína MabA, tales como se definen anteriormente, en un medio de reacción que comprende un sustrato, tal como un derivado \beta-cetoacilo definido anteriormente, la coenzima NADPH y el ligando ensayado,
- -
- detectar un poder inhibidor potencial del ligando ensayado, mediante la medición de la actividad enzimática de dicha proteína midiendo la cinética de la absorbancia, especialmente a 340 nm y, comparar la pendiente de la curva de densidad óptica en función del tiempo con la pendiente obtenida en un ensayo sin ligando.
La invención se refiere asimismo a cualquier
método de detección sistemática de ligandos de la proteína MabA,
caracterizado porque comprende las siguientes etapas:
- -
- presentar una proteína recombinante derivada de la proteína MabA, tal como se define anteriormente, con el ligando ensayado,
- -
- analizar la estructura tridimensional del complejo formado en fase soluble entre dicha proteína y dicho ligando, especialmente mediante RMN, y mediante fluorescencia.
La invención tiene más particularmente por
objeto cualquier método de detección sistemática de ligandos de la
proteína MabA, caracterizado porque comprende las siguientes
etapas:
- -
- cocristalizar el ligando ensayado y una proteína recombinante derivada de la proteína MabA, tales como se definen anteriormente, especialmente en las condiciones de cristalización definidas anteriormente, a fin de obtener dichos cristales,
- -
- o, sumergir los cristales de la proteína MabA o una proteína derivada tales como se definen anteriormente, en disoluciones optimizadas que contienen potenciales ligandos,
- -
- analizar la estructura tridimensional de dichos cristales, especialmente mediante difracción de rayos X (en vista a seleccionar los ligandos que tienen una capacidad óptima de ocupación y de bloqueo del sitio activo de dichas proteínas).
La invención se refiere asimismo a la
utilización de las coordenadas de la estructura tridimensional de
una proteína recombinante derivada de la proteína MabA, tal como se
define anteriormente, estando dichas coordenadas representadas en
las figuras 1 a 3, en asociación, llegado el caso, con las
coordenadas del sitio activo de estas proteínas tales como se
definen anteriormente, para la implementación de métodos de
concepción o de detección sistemática de ligandos de la proteína
MabA (ventajosamente asistidos por ordenador).
Con este fin, la invención tiene más
particularmente por objeto cualquier método de concepción o de
detección sistemática de ligandos de la proteína MabA, que comprende
la utilización de las coordenadas de la estructura tridimensional de
una proteína recombinante derivada de la proteína MabA, tales como
se definen anteriormente, estando dichas coordenadas representadas
en las figuras 1 a 3, para detectar sistemáticamente in
silico quimiotecas virtuales de ligandos potenciales,
ventajosamente con la ayuda de programas informáticos apropiados, y
la detección y optimización estructural racional de las moléculas
susceptibles de unirse a dicha proteína.
La invención tiene asimismo por objeto cualquier
método de concepción racional, tal como se define anteriormente,
efectuado a partir de inhibidores conocidos de MabA o de inhibidores
de proteínas homólogas a MabA (de la misma familia estructural de
SDR o RED, y que presentan un porcentaje de identidad mayor que 10%
con MabA en el conjunto de la secuencia peptídica), para los cuales
se determinó la estructura tridimensional adecuada del complejo
entre dicho inhibidor y la proteína MabA recombinante en forma
purificada, o una proteína recombinante derivada de la proteína
MabA, tales como se definen anteriormente, y optimización
estructural racional de dichos inhibidores. Se ha demostrado que la
actividad de MabA estaba inhibida in vitro mediante un aducto
INH-NADP(H). Este mecanismo de acción de la
isoniazida (INH) sobre MabA es similar al mecanismo de acción de la
isoniazida sobre la proteína InhA, diana de INH. Otras proteínas que
pertenecen a la superfamilia de RED tienen una estructura
tridimensional comparable a la de MabA, incluyendo un esteroide
deshidrogenasa (PDB1HSD), tropinona reductasas (ej.: PDB1AE1),
tri-
hidroxinaftaleno reductasa (PDB1YBV) y manitiol deshidrogenasa (PDB1H5Q), y se cocristalizaron con inhibidores.
hidroxinaftaleno reductasa (PDB1YBV) y manitiol deshidrogenasa (PDB1H5Q), y se cocristalizaron con inhibidores.
La invención se ilustrará con mayor claridad
mediante la ayuda de la descripción detallada siguiente de la
obtención de la proteína MabA recombinante, y de las proteínas MabA
C(60)V, S(144)L y
C(60)V/S(144)L, en forma purificada, de
sus propiedades enzimáticas, así como de los cristales de estas
proteínas y de sus coordenadas atómicas.
Las coordenadas atómicas de la proteína MabA
recombinante (que corresponde a SEC ID nº: 15), y de las proteínas
MabA C(60)V (que corresponde a SEC ID nº: 16), y
C(60)V/S(144)L (que corresponde a SEC ID
nº: 18), se representan, respectivamente, en las figuras 1 a 3, en
las que se indican de izquierda a derecha el número de átomo, el
nombre de los restos, el número de cadena, las coordenadas x, y, z,
la ocupación y el factor B.
La tuberculosis, enfermedad infecciosa provocada
por Mycobacterium tuberculosis, sigue siendo la mayor causa
de mortalidad en el mundo, debido a un agente infeccioso único.
Según la Organización Mundial de la Salud, aparecen cada año 8
millones de caso de tuberculosis, dando como resultado 3 millones de
fallecimientos (Dolin et al., 1994). Aunque haya dado siempre
graves problemas de salud pública en los países en vías de
desarrollo, la tuberculosis reaparece en los países desarrollados.
Las condiciones precarias de ciertos grupos en la sociedad y el
deterioro de los sistemas de salud, consecuencia de la crisis
económica mundial, han favorecido este recrudecimiento de la
tuberculosis. Además, la endemia de la infección mediante el virus
de la inmunodeficiencia humana (VIH) y la aparición de cepas de
M. tuberculosis resistentes a uno o varios antibióticos,
también ha contribuido altamente a este fenómeno (Barnes et
al., 1991). La emergencia de la tuberculosis multiresistente,
definida como la resistencia a dos antibióticos base del tratamiento
antituberculoso, isoniazida (Rimifon, INH) y rifampicina (RMP), es
una amenaza para el control de la tuberculosis. Los pacientes
infectados por las cepas resistentes a varios antibióticos son
extremadamente difíciles de curar, y el tratamiento necesario es
tóxico y costoso. Hasta el 30% del conjunto de los aislados clínicos
de M. tuberculosis resistentes lo son a la isoniazida (Cohn
et al., 1997). Por lo tanto, es importante entender mejor los
mecanismos de resistencia a la isoniazida implementados por las
micobacterias, a fin de poder, por una parte, elaborar técnicas
rápidas que permitan la detección de las resistencias y, por otra
parte, el desarrollo de nuevos agentes antimicobacterianos eficaces
contra las cepas resistentes.
A partir de numerosos trabajos realizados sobre
la isoniazida, se pudo identificar una diana directa de este
antibiótico: se trata de un metabolismo específico de las
micobacterias, la biosíntesis de los ácidos micólicos [(Winder y
Collins, 1970); (Takayama et al., 1972); (Quémard et
al., 1991)]. Estos ácidos grasos de cadena muy larga son unos
constituyentes importantes y característicos de la cubierta
micobacteriana. Gracias al uso de herramientas de biología molecular
en M. tuberculosis, se caracterizó una diana molecular de la
isoniazida, la proteína InhA, implicada probablemente en la vía de
biosíntesis de los ácidos micólicos [(Banerjee et al., 1994);
(Quémard et al., 1995)]. InhA pertenece a un sistema
enzimático responsable de la elongación de los ácidos grasos
(Marrakchi et al., 2000). Este sistema que contiene la
proteína InhA, diana de la isoniazida, participa a la biosíntesis de
los ácidos micólicos, y representa así un complejo enzimático cuyos
componentes son interesantes de estudiar, como dianas potenciales de
nuevos antibióticos antituberculosos. Por lo tanto, se estudiaron
las propiedades bioquímicas de MabA, una de las proteínas del
complejo que contiene InhA. La modelización molecular de la
estructura tridimensional de esta proteína, que cataliza la
reducción de derivados \beta-cetoacilos, mostró
que MabA e InhA pertenecen a la misma familia estructural. El
estudio del efecto de la isoniazida sobre la actividad enzimática de
MabA sugiere que el antibiótico inhibe la proteína mediante un
mecanismo similar a la acción sobre InhA. Así, MabA representa una
diana interesante para la concepción de inhibidores de la
biosíntesis de ácidos grasos en las micobacterias.
En el campo de los trabajos de la presente
invención, se clonó el gen MabA de M. tuberculosis en E.
coli, en un vector de expresión. La proteína se produce en
grandes cantidades mediante esta cepa recombinante, como proteína de
fusión que posee una etiqueta poli-Histidina en
N-terminal. La purificación de la proteína se
efectúa en una sola etapa, mediante cromatografía sobre columna,
dando varios mg de proteína purificada. Un monómero salvaje de MabA
posee 247 aminoácidos, y tiene un tamaño de 25,7 kDa; el monómero de
fusión es de 27,7 kDa. Varios métodos experimentales
(ultracentrifugación analítica, permeación sobre gel, difusión de la
luz, cristalografía, etc.) permitieron demostrar que la proteína
natural era principalmente tetramérica, procediendo de la
autoasociación de dos dímeros. Se determinaron propiedades
fisicoquímicas (estabilidad en distintos medios de tampones, a
distintas temperaturas, espectros de emisión de fluorescencia, etc.)
y las principales propiedades enzimáticas de MabA (Kd, Km y Kcat
para la coenzima y sustratos -\betacetoacil-CoA-
de diferentes longitudes de cadena). La proteína recombinante
purificada es funcional; es una \beta-cetoacil
reductasa, dependiente de NADPH, y específica de sustratos de cadena
larga (C12-C20). Se ha demostrado que MabA
pertenecía al sistema de elongación de ácido graso micobacteriano,
FAS-II, y cataliza la segunda etapa del ciclo de
elongación.
La estructura tridimensional de la proteína MabA
se resolvió mediante cristalografía a 2,05 \ring{A} de resolución
después de la implementación de condiciones de crioestabilización de
los cristales. MabA pertenece a la superfamilia estructural de las
proteínas SDR (reductasa de cadena corta) o RED (reductasas,
epimerasas, deshidrogenasas). Es homóloga a las KAR
(queoacil-ACP reductasas), pero representa un
miembro particular de esta familia, debido a la estructura de la
bolsa de fijación del sustrato. Ésta tiene un carácter más hidrófobo
que la de las proteínas homólogas. La presencia del resto triptófano
único en la bolsa de fijación del sustrato permitió realizar
experimentos de espectroscopia de fluorescencia, destacando una
afinidad más marcada de MabA para sustratos de cadena larga
(C8-C20) con relación al sustrato en C4. Estos
resultados, que se correlacionan con los datos de cinética
enzimática, demuestran una relación
estructura-funcional entre la hidrofobicidad del
sitio de fijación del sustrato y la afinidad de MabA para sustratos
inhabitualmente largos en las bacterias.
Las propiedades distintas de MabA con relación a
otras proteínas homólogas hacen de ella una diana de calidad para la
concepción de potenciales antibióticos. Esta concepción necesitará
la realización de varias etapas en paralelo:
- 1.
- la concepción racional a partir de inhibidores conocidos de MabA o de proteínas homólogas
- 2.
- la detección sistemática de alto rendimiento de quimiotecas virtuales
- 3.
- la detección sistemática de alto rendimiento de quimiotecas reales.
Se ha demostrado que la actividad de MabA estaba
inhibida in vitro mediante un aducto
INH-NADP(H). Este mecanismo de acción de la
isoniazida (INH) sobre MabA es similar al mecanismo de acción de la
isoniazida sobre la proteína InhA, diana de INH. Otras proteínas que
pertenecen a la superfamilia de RED tienen una estructura
tridimensional comparable a la de MabA, incluyendo un esteroide
deshidrogenasa (PDB1HSD), tropinona reductasas (ej.: PDB1AE1), una
trihidoxinaftalena reductasa (PDB1YBV) y un manitiol deshidrogenasa
(PDB1H5Q). Así, la etapa (1) se basa en el uso de la estructura de
los ligandos (ej.: derivados de la isoniazida, esteroides) de estas
distintas proteínas para la concepción de otros inhibidores
potenciales de MabA, de estructuras derivadas. La concepción
racional implica, por supuesto, el uso de la estructura cristalina
de MabA y del método de ensamblaje molecular asistido por ordenador.
De la misma manera, si las etapas (2) y (3) aportan nuevos tipos de
ligandos potenciales, éstos podrán ser la base de nuevas
concepciones racionales.
La invención proporciona, por lo tanto, uno paso
conceptual para el desarrollo de inhibidores de la actividad de la
proteína MabA. Por otra parte, proporciona un método de validación
experimental, por una parte, de la fijación específica de estas
moléculas al sitio activo de MabA (espectroscopia de fluorescencia)
y, por otra parte, del poder inhibidor de estas moléculas mediante
un ensayo enzimático simple (cinética enzimática mediante
monitorización de espectrofotometría).
Se ha demostrado que el sistema de elongación
FAS-II contiene la proteína InhA, una diana de
isoniazida. Además, el hecho de que este sistema esté aparentemente
implicado en la biosíntesis de los ácidos micólicos, componentes
específicos de las micobacterias, hace de FAS-II una
diana de calidad para agentes antimicobacterianos. El estudio de las
enzimas que componen este sistema es, por lo tanto, un enfoque
interesante para buscar nuevas dianas de antibióticos.
La alta inhibición de la actividad de
FAS-II mediante la isoniazida, y sobre todo, el
hecho de que ningún intermedio de biosíntesis, y en particular los
sustratos de InhA, se acumule bajo el efecto de INH sugiere que
podría existir otra diana del antibiótico además de InhA. La
proteína MabA, codificada por un gen contiguo a InhA sobre el
cromosoma de M. tuberculosis, pertenece probablemente al
mismo sistema enzimático que InhA. Varios datos dejan suponer que
MabA podría ser una diana de isoniazida. Por otra parte, mutaciones
puntuales en la región promotora del locus mabA-inhA
de aislados clínicos de M. tuberculosis conlleva la
superproducción de las proteínas aguas abajo y se correlacionan con
un fenotipo de resistencia a INH. Esto sugiere que además de la
superproducción de InhA, inducida por estas mutaciones, la
superproducción de MabA podría asimismo participar en la
resistencia, si esta proteína interactúa con isoniazida. Por otra
parte, el estudio del efecto de isoniazida (2 mM) sobre las enzimas
purificadas del sistema FES aislado de M. avium mostró que
dos etapas del sistema son sensibles a INH, la
\beta-cetoacil reductasa (93% de inhibición y Ki
=353 \muM), que es la más sensible, y la enoil reductasa (26% de
inhibición y Ki = 5,5 mM) (Kikuchi et al., 1989).
Por lo tanto, se decidió purificar la proteína
MabA y estudiar algunas de sus propiedades bioquímicas, adoptando
una estrategia de superproducción de la proteína en un sistema
procariota.
Realizar un estudio enzimático y producir
anticuerpos anti-MabA para la localización
intracelular de MabA, imponía la obtención de la proteína pura, en
forma soluble y en gran cantidad. Para superproducir en gran
cantidad MabA, se usó un sistema de expresión y de purificación en
Escherichia coli, sencillo y muy eficaz para la
superproducción de genes procariotas. La implementación de un
procedimiento experimental, a fin de alcanzar una superproducción
suficiente, obteniendo al mismo tiempo la proteína en forma soluble,
necesitó la optimización en varios niveles del esquema de
sobreexpresión y de purificación.
La determinación de la secuencia completa del
genoma de Mycobacterium tuberculosis H37Rv (Cole et
al., 1998) y el desarrollo de las técnicas de biología molecular
que permiten la manipulación de ADN recombinante, facilitaron la
producción y el estudio de la proteína de interés, MabA.
* Elección del vector de expresión pET
(plásmido para la expresión mediante ARN polimerasa T7)
En el vector de expresión usado,
pET-15b (Novagen), el gen diana se clona bajo el
control de las señales de transcripción y de traducción del
bacteriófago T7. Se amplificó el gen mabA (fabG1) de 741 pares de
bases, que codifica la proteína MabA mediante reacción de
polimerización en cadena (PCR) a partir del cósmido MTCY277
(Instituto Pasteur), y se clonó entre los sitios de restricción NdeI
y Xho del plásmido. Este plásmido tiene la ventaja de poder obtener,
en fusión NH2-terminal de la proteína recombinante,
una secuencia poli-Histidina, que se puede romper,
permitiendo una purificación rápida de la proteína mediante
cromatografía de afinidad. La construcción comprende, por lo tanto,
aguas arriba del gen mabA, una secuencia que codifica 6
histidinas sucesivas y el sitio de ruptura por trombina.
* Elección de la cepa huésped
La cepa huésped de E. coli elegida, BL21
(\lambdaDE3) (Novagen), presenta la ventaja de tener los 2 genes
ompT e Ion desactivados. Los genes ompT
[(Studier y Moffatt, 1986); (Studier et al., 1990)] e Ion
(Phillips et al., 1984) codifican, respectivamente, la
proteasa parietal (responsable de la degradación de las proteínas
heterólogas) y la proteasa principal citoplásmica (responsable de la
degradación de las proteínas mal replegadas o inestables). BL21
(\lambdaDE3) es el lisógeno para el bacteriófago DE3 (derivado de
\lambda), y lleva, por lo tanto, una copia cromosómica del gen del
ARN polimerasa T7 bajo el control del promotor lacUV5, que es
inductible a IPTG
(isopropil-\beta-D-tiogalactopiranosidasa).
La adición de IPTG a un cultivo del lisógeno induce la expresión del
ARN polimerasa T7, que, a su vez, va a transcribir el ADN diana
sobre el plásmido.
La transformación de la cepa E. coli
BL21(\lambdaDE3) competente por el plásmido
pET-15b::mabA se efectuó mediante choque
térmico (Material y Métodos). La eficacia de transformación obtenida
es de 5,9 103 CFUu/\mug de ADN. Se observa la baja eficacia de
transformación que caracteriza las cepas de coli B de las
cuales deriva BL21(\lambdaDE3).
La selección de las células, que han incorporado
el plásmido, se realiza gracias a la adquisición de la resistencia a
la ampicilina. En los experimentos de selección, se prefirió usar la
carbenicilina, una \beta-lactama estable, en lugar
de la ampicilina que se conoce por ser rápidamente degradada
mediante las \beta-lactamasas segregadas por las
bacterias resistentes.
Con el fin de verificar que ninguna mutación
haya sido introducida durante la etapa de amplificación por PCR de
mabA, se analizó la secuencia del gen clonado. No se encontró
ninguna mutación; la secuencia clonada es idéntica a la portada por
el cósmido de origen.
La optimización de la expresión de un gen
heterólogo necesita un estudio previo a pequeña escala, para
determinar la elección de las condiciones de cultivo y de los
parámetros de la inducción (DO, temperatura, concentración del
inductor y tiempo de inducción). La implementación de estas
condiciones permitió definir el procedimiento a seguir para obtener
una superproducción suficiente de la proteína que fuera visible en
SDS-PAGE. Sin embargo, a pesar de los esfuerzos para
reproducir la sobreexpresión a mayor escala, no se consiguió
producir la proteína MabA mediante las bacterias inducidas. La
hipótesis más plausible fue la pérdida del plásmido, a pesar del
mantenimiento de los cultivos en un medio que contiene el
antibiótico. Frente a este problema, el ensayo de estabilidad de
plásmido sobre caja (Material y Métodos) ofrecía un medio rápido y
fiable de verificar, en los cultivos anteriores a la inducción, la
presencia del plásmido diana por una parte, y la capacidad de las
bacterias transformadas, en cultivo, para expresar el ADN
heterólogo, por otra parte.
La expresión heteróloga de mabA en E.
coli se mostró particularmente sensible a las condiciones de
cultivo que afectan a la estabilidad del plásmido. Para una
expresión óptima, es importante respetar dos condiciones:
- \bullet
- Las colonias transformantes deben ser frescas (procediendo directamente de una transformación o de un esparcimiento en línea a partir de un stock líquido conservado a -70ºC).
- \bullet
- El número de generaciones entre la transformación de las bacterias por el plásmido y la inducción de la expresión se debe reducir al mínimo (evitar los cultivos intermedios).
Para establecer la estrategia de purificación,
es importante saber si la proteína está producida en forma soluble,
o localizada en cuerpos de inclusión (agregados de proteínas).
Los ensayos a pequeña escala para determinar la
solubilidad en las condiciones de inducción óptimas, dieron a
conocer algunos puntos interesantes e inesperados. El primero fue
que las variaciones realizadas sobre los parámetros de inducción
(temperatura, DO o tiempo de inducción), destinadas a mejorar la
solubilidad, no parecían tener consecuencias significativas sobre la
producción preferencial de la proteína MabA en una forma u otra. Sin
embargo, fue una sorpresa constatar que la técnica adoptada para
lisar las bacterias modulaba la repartición de la proteína entre las
fracciones solubles e insolubles. Por ejemplo, la sonicación en frío
en un volumen reducido (factor de concentración del cultivo
FC>20) es aparentemente responsable de la precipitación de MabA
en el residuo (fracción insoluble). El efecto de las temperaturas
locales elevadas generadas por los ultrasonidos podría explicar este
fenómeno de agregación-precipitación de MabA. La
lisis de una suspensión bacteriana en densidad celular más baja
permite evitar la precipitación de MabA durante la sonicación.
Un estudio realizado sobre los efectos de los
ultrasonidos en las enzimas (Coakley et al., 1973) da a
conocer que los extractos celulares preparados mediante
desintegración ultrasónica son sensibles a los daños causados por
los radicales libres, que se generan probablemente por los
ultrasonidos, así como por el efecto de temperaturas locales
elevadas. Estos autores muestran que el efecto "dañoso" durante
la lisis de las bacterias se puede minimizar mediante una sonicación
con alta concentración de células y en presencia de componentes del
medio, tales como los azúcares (actuando como "carroñeros" de
radicales). Estas conclusiones no parecen coincidir con nuestros
resultados que muestran que, en una más baja densidad celular
durante la lisis de MabA, la proteína se encuentra en la fracción
"soluble". Sin embargo, no se puede avanzar nada en cuanto a la
actividad de la proteína en estas condiciones.
Después de la comparación de varias técnicas de
lisis en la escala de producción deseada, se optó para una lisis
mediante el lisozima, seguido de un ciclo de
congelación-descongelación. Según este protocolo, y
en las condiciones de inducción adoptadas [DO600 = 0,8, 2 h a 37ºC,
0,8 mM de IPTG], gran parte de la proteína MabA se encuentra en la
fracción soluble.
La obtención de la proteína MabA con una
etiqueta poli-His (H-MabA) facilita
su purificación. En efecto, la alta afinidad de los restos de
histidina para los iones metálicos permite usar el método de
cromatografía de afinidad sobre ión metálico inmovilizado (IMAC).
Una de las matrices más usada para su eficacia es el triacetato de
níquel-nitrilo
Ni-NTA-agarosa (Qiagen). El grupo
NTA presenta 4 sitios de quelación que interactúan con 4 de los 6
sitios de coordinación del ión metálico Ni. Los núcleos imidazol de
los restos de histidina se unen a los iones de níquel sobre la
matriz Ni-NTA. La adición de moléculas de imidazol
permite, mediante competición con los restos de histidina, romper
las uniones entre las proteínas y la matriz, y eluir la proteína
poli-His fijada. La afinidad de una proteína para la
matriz Ni-NTA-agarosa está en
función del número de restos de histidina que posee y que están
expuestos a la matriz. Así, haciendo uso de la concentración en
imidazol, se pueden eluir diferentes especies de proteínas que
presentan grados de afinidad distintos. La afinidad muy elevada de
las proteínas que presentan una etiqueta poli-His
para el níquel permite separarlas de las mayoría de las proteínas
coproducidas mediante E. coli. Así, si la fijación de la
proteína H-MabA resulta ser suficientemente
específica, la purificación se limitará a la única etapa de
cromatografía de afinidad.
La implementación de las condiciones de elución
de la proteína MabA sobre resina
Ni-NTA-agarosa se efectúa a escala
pequeña (50 \mul), usando el método por sedimentación de resina,
denominado "batch". Gracias a está técnica, se pudieron
determinar las diferentes concentraciones en imidazol necesarias
para la elución de la proteína MabA y para la eliminación de otras
proteínas.
La purificación adaptada a mayor escala se
efectúa sobre una columna abierta con 500 \mul de resina en
suspensión (Material y Métodos). El paso de la purificación
"batch" hacia la purificación en columna necesitó una etapa de
ajuste suplementaria.
Se analizan las fracciones proéticas que
corresponden a las distintas etapas de purificación mediante
SDS-PAGE. En el lisado clarificado, la banda
mayoritaria obtenida entre 30 y 43 kDa y que corresponde a MabA,
demuestra una superproducción bastante importante de la proteína en
forma soluble, mayor que 50% de las proteínas solubles de E.
coli. Después de la etapa de fijación de las proteínas sobre la
resina, la fracción que contiene las proteínas no fijadas sobre la
columna está desprovista de MabA, indicando una fijación eficaz de
la proteína H-MabA a la matriz
Ni-NTA. La eliminación de otras proteínas débilmente
fijadas a la matriz (por la presencia de histidinas dispersadas en
sus secuencias), se obtiene después de los lavados extensivos a 50
mM en imidazol. Se necesita una concentración en imidazol igual a
175 mM para evaluar la proteína H-MabA sola y en
cantidades muy elevadas. La masa aparente de H-MabA
deducida de su migración electroforética se estima en 35 kDa.
Durante la purificación, se constató que la
proteína MabA, eluida con una concentración muy alta, precipitaba en
seguida en el tubo. Este comportamiento, frecuentemente observado
para las proteínas con una etiqueta poli-His, se
debe probablemente a interacciones proteína-proteína
no específicas, debido a la muy alta concentración local en proteína
durante la purificación (TALONTM Metal affinity Resin - User manual
CLONTECH).
Las tentativas de solubilización de la proteína
eluida con detergentes (Triton X-100,
NP-40) resultaron vanas. Por lo tanto, había que
intervenir antes de la elución de la proteína. A fin de prevenir la
precipitación de la proteína, se efectuó un tratamiento antes y
después de la purificación. Para verificar si la proteína precipita,
se centrifuga la fracción que contiene MabA después de la elución (5
min., a 12000 g), y después se analizan el sobrenadante y el resto
mediante SDS-PAGE (Material y Métodos). El
tratamiento prepurificación consiste en añadir al lisado agentes
"solubilizantes" suaves. Después de la purificación, se
recupera la proteína eluida directamente en glicerol (50% final) (el
glicerol es un agente protector, muy usado para la preservación de
la actividad de las enzimas).
Se ensayaron tres condiciones:
- \bullet
- 10% (p/p) de glicerol solo
- \bullet
- 10% (p/p) de glicerol + 0,1% (p/p) de Triton X-100 (detergente no iónico)
- \bullet
- 10% (p/p) de glicerol + 0,05% (p/p) (7 mM) de \beta-mercaptoetanol (agente reductor).
\global\parskip0.950000\baselineskip
Los tres procedimientos permitieron mejorar la
solubilidad de la proteína MabA. Se observa, sin embargo, que
durante el uso del \beta-mercaptoetanol al 7 mM,
que H-MabA empieza a ser eluida con una
concentración en imidazol mucho más baja (50 mM en lugar de 175
mM).
Siendo la solubilización de MabA en presencia de
los tres agentes ensayados comparable, se optó por la adición de 10%
de glicerol solo al lisado.
La optimización de las condiciones de
sobreexpresión y de purificación de H-MabA permitió
retener el protocolo siguiente:
- \bullet
- Cultivar 200 ml de E. coli/h-mabA sobre LB + CBC 50 \mug/ml hasta DO600 = 0,8;
- \bullet
- Inducir la expresión con 0,8 mM de IPTG durante 2 h, a 37ºC;
- \bullet
- Sedimentar las bacterias por centrifugación durante 15 min. a 10.000 g, a 4ºC. Volver a coger el residuo en 9 ml de tampón de lisis (5 mM de imidazol y 500 mM de NaCl);
- \bullet
- Añadir la lisozima (0,5 mg/ml) y los inhibidores de proteasas (0,113 mg/ml);
- \bullet
- Congelar una noche a -70ºC;
- \bullet
- Descongelar 1 h a temperatura ambiente, y tratar mediante Dnasal (5 \mug/ml) y RnasaA (10 \mug/ml) en presencia de MgC12 (10 mM), 15 min. a 4ºC;
- \bullet
- Centrifugar el lisado a 3.000 g, y después a 10.000 g, y recuperar la fracción soluble;
- \bullet
- Centrifugar el sobrenadante durante 45 min. a 44.000 g, a 4ºC, y recuperar el "lisado clarificado";
- \bullet
- Añadir 10% de glicerol puro (p/p) a la fracción soluble y depositarla sobre una minicolumna (500 \mul de fase Ni-NTA-agarosa). Incubar durante 1 h a 4ºC con agitación suave;
- \bullet
- Lavar la fase con 5 x 4 ml de tampón de elución con 5 mM de imidazol;
- \bullet
- Pre-eluir con 8 x 500 \mul a 50 mM de imidazol;
- \bullet
- Eluir con 8 x 500 \mul a 175 mM de imidazol;
- \bullet
- Lavar con 10 x 500 \mul a 250 mM de imidazol;
- \bullet
- Reunir las fracciones que contienen la proteína según su concentración y su pureza. Recolectar la proteína directamente en un volumen igual de glicerol puro, dializar contra tampón de fosfato de potasio al 50 mM, pH 7,2, que contiene 50% de glicerol, y conservar a -20ºC.
- \bullet
- Tampón de elución: 50 mM de tampón de fosfato de potasio, pH 7,8.
Gracias al sistema de expresión y de
purificación usado, fue posible purificar la proteína
H-MabA hasta homogeneidad en una sola etapa. Para
conocer aproximadamente la concentración de la disolución de
proteína, se determinó su absorbancia en ultravioleta a 280 nm.
Conociendo la absorbancia de los restos de tirosina y de triptófano
de la proteína (Material y Métodos), se dedujo el coeficiente de
extinción molar teórico de MabA (\varepsilon_{280 \ nm} = 9530
M^{-1}cm^{-1}), y se estimó la concentración molar de la
disolución purificada en 40 \muM.
El mejor rendimiento de purificación obtenido
(porcentaje de proteína purificada con relación al conjunto de las
proteínas totales depositadas sobre la columna) es de 57%. A partir
de 200 ml de cultivo, se obtuvieron aproximadamente 20 mg de
proteína MabA pura (rendimiento 100 mg/ml de cultivo), lo que es muy
satisfactorio.
Se secuenció el gen mabA clonado en
pET-15b, no se encontró ninguna mutación. La
secuencia primaria de la proteína MabA salvaje presenta 247
aminoácidos. La etiqueta poli-Histidina de la
proteína recombinante le adiciona 19 aminoácidos (266 aminoácidos
total). Se realizó la secuenciación de los 20 primeros aminoácidos
de la proteína MabA sobreexpresada (Biomérieux, Lyon). Se pudo
verificar la identidad de la proteína sobre la parte
amino-terminal y se pudo demostrar la pérdida de la
primera metionina de la etiqueta poli-His. La
eliminación de la metionina amino-terminal de
proteínas mediante proteólisis postraduccional es muy frecuente en
E. coli.
\global\parskip1.000000\baselineskip
El análisis mediante electroforesis
desnaturalizadora (SDS-PAGE) y la coloración con
azul de Coomassie del eluido MabA muestra una única banda, indicando
la homogeneidad de la preparación. Se verifico asimismo la pureza de
la proteína mediante SDS-PAGE tras la coloración con
nitrato de plata. No se detectó ninguna banda de proteína
contaminante mediante esta técnica de revelación muy sensible.
Con el fin de determinar la masa de la proteína
purificada con precisión, se realizó el análisis mediante
espectrometría de masa por electropulverización
(ESI-MS).
La espectrometría de masa permite verificar muy
rápidamente que la proteína expresada presenta la masa esperada. Se
analizó una muestra purificada mediante espectrometría de
masa/ionización por electropulverización (ESI/MS), en colaboración
con B. Monsarrat (IPBS, Toulouse). En el tipo de instrumento usado,
se determina la masa molecular de una proteína con una precisión de
0,01% (1/10.000). La masa de la proteína MabA prevista según la
secuencia del gen (teniendo en cuenta la etiqueta
poli-His) es de 27.860 Da. El análisis mediante
ESI/MS en introducción directa da a conocer una masa mayoritaria de
27.728 \pm 2 Da.
La diferencia entre la masa teórica y la masa
medida (131 unidades de masa) corresponde a la pérdida de la primera
metionina en el extremo amino-terminal, demostrado
por la secuenciación N-terminal de la proteína. La
masa molecular de la proteína H-MabA purificada así
determinada es de 27.728 Da.
La migración de H-MabA en
electroforesis desnaturalizadora hacia 35.000 Da podría relacionarse
con las características fisicoquímicas de la proteína y/o a su forma
natural.
La cromatografía de exclusión permite determinar
la forma natural (estructura cuaternaria) de la proteína en
disolución con una concentración dada, y en condiciones definidas de
pH y de fuerza iónica. Gracias a esta técnica, es posible establecer
una relación entre el volumen de elución de la proteína y su peso
molecular, mediante el intermedio de una curva de calibración. A
partir de los perfiles de elución de las proteínas estándares
(Pharmacia), se deduce la curva de calibración.
La elución de la proteína MabA (0,66 mg) se
efectuó en las mismas condiciones que aquellas de las proteínas
estándares. En el cromatograma, se observa un pico asimétrico eluido
hacía los altos pesos moleculares. El volumen de elución que
corresponde al pico de la cresta, indica que la masa molecular
mayoritaria (94,6 kDa) está comprendida entre 110.916 Da y 83.187
Da, lo que corresponde a la forma tetramérica o trimérica de
H-MabA, respectivamente. El ligero resalte que se
observa en el perfil (hacia 57,7 kDa) muestra la presencia, en
proporción menor, de una forma dimérica (55.458 Da) de la proteína.
Estos resultados sugieren que existe probablemente un equilibrio
dímero-tetrámero de la proteína MabA. El estudio de
la estructura tridimensional mediante modelización molecular de MabA
favorece esta hipótesis (véase a continuación). Sin embargo, es
importante subrayar que la determinación de la oligomería por
filtración sobre gel depende de las condiciones ensayadas, y
especialmente, de la concentración de la disolución de proteína. Se
hablará a continuación de la posibilidad de presencia de la proteína
MabA in vivo en forma tetramérica.
Se pueden deducir algunas propiedades
fisicoquímicas de MabA de su secuencia peptídica con la ayuda de los
programas de cálculo disponibles en Internet (aBi). La secuencia de
266 aminoácidos de la proteína H-MabA producida da
una masa calculada igual a 27.729,37 Da. Esta corresponde a la
determinada mediante ESI/MS, con 1 unidad de masa superior o
inferior, aproximadamente. Las otras características se resumen en
la tabla I siguiente.
La atribución de una actividad potencial a una
proteína de función desconocida está frecuentemente orientada por la
similitud de secuencia que presenta con proteínas conocidas. El
examen de la estructura primaria de la proteína MabA demuestra una
alta identidad con la secuencia de
\beta-cetoacil-ACP reductasa FabG
de E. coli (44% de identidad sobre 241AA), así como con
\beta-cetoacil-ACP reductasa de
otras bacterias o plantas. Esta actividad enzimática corresponde a
una de las etapas de la vía clásica de biosíntesis de ácidos grasos.
La elongación de ácidos grasos mediante el sistema micobacteriano
FAS-II implica la proteína InhA, que cataliza la
etapa de enoil-ACP reductasa dependiente de NADH.
Estando el sistema de elongación FAS-II compuesto de
varias enzimas agregadas, era lógico prever la presencia de la
proteína MabA asociada con InhA en el mismo complejo enzimático. Un
argumento de peso a favor de la implicación de MabA e InhA en la
misma vía metabolítica descansa en la organización en operón de los
genes mabA e InhA en M. tuberculosis. Los genes
implicados en la biosíntesis de ácidos grasos se agrupan
frecuentemente en "cluster" como por ejemplo en E. coli
(Rawlings y Cronan, 1992) y en Vibrio harveyi (Shen y Byers,
1996).
Demostrar la actividad
\beta-cetoacil reductasa de la proteína MabA
purificada es la primera etapa de su caracterización como pareja
potencial de InhA en la biosíntesis de ácidos grasos.
La actividad de la proteína
H-MabA purificada se ensayó en primer lugar en
presencia de \beta-cetoacil-CoA
solo, comercializado, acetoacetil-CoA y NADPH como
donante de electrones. La adición de MabA puro a los sustratos
activa la reacción. La evolución de la reacción se monitoriza
durante 5 min. midiendo el decrecimiento de la absorbancia hasta 340
nm, traduciendo la desaparición del co-sustrato
NADPH a favor de su forma oxidada NADP^{+} (que no absorbe en esta
longitud de onda).
En las condiciones de ensayo enzimático estándar
definidas (véase Material y Métodos), H-MabA es
capaz de reducir la acetoacetil-CoA. La proteína
purificada H-MabA es, por lo tanto, funcional:
corresponde a una \beta-cetoacil reductasa (KAR:
Keto-acil reductasa). La presencia de la etiqueta
poli-His en posición N-terminal no
parece poner trabas a su actividad.
La sustitución del NADPH por el NADH con la
misma concentración en el ensayo cinético conlleva una pérdida total
de la actividad. La proteína MabA es, por lo tanto, estrictamente
dependiente de NADPH. La presencia en la secuencia peptídica de MabA
de un motivo de fijación del NADP(H) confirma este resultado.
Los KAR de otros organismos son lo más frecuentemente dependientes
de NADPH, y presentan una especificidad estricta para la coenzima
nucleotídica.
La actividad de una enzima está directamente
afectada por la concentración de sus sustratos, pero asimismo por
parámetros tales como la naturaleza del tampón, el pH, la fuerza
iónica y la temperatura. Con el fin de optimizar las condiciones de
reacción, se estudió el efecto del pH y de la fuerza iónica sobre la
actividad de MabA.
* Efecto del pH
Se evaluó el efecto del pH sobre la actividad
enzimática de MabA usando, en el medio de reacción, disoluciones de
tampón de fosfato de sodio de pH 5,0 a 8,0. La comparación de los
resultados para el intervalo de pH elegido muestra que la actividad
óptima de MabA se obtiene para un pH igual a 5,5. Sin embargo, con
un pH ácido (5,0 a 6,5), el NADPH es muy inestable y se oxida
espontáneamente, lo que conlleva una variación de la absorbancia a
lo largo del tiempo en ausencia de enzima. Por lo tanto, se decidió
trabajar con pH próximos del pH fisiológico (entre 7,0 y 7,5), para
los cuales la línea base presenta una pendiente irrelevante con
relación a la pendiente de catálisis (menor que
5-10%). Otras
\beta-cetoacil-ACP reductasas
presentan un pH óptimo ácido (alrededor de 6,0-6,5)
[(Shimakata y Stumpf, 1982); (Caughey y Kekwick, 1982)].
Si MabA presenta una mejor actividad con un pH
de 5,5, se debe probablemente a un evento de protonación implicado
en la fijación de los sustratos o en la catálisis. Este evento
podría referirse a dos restos His de la proteína, H46 y H247 (el pKa
del núcleo de imidazol del resto de histidina es igual a
6,9-6,5), potencialmente implicados en el sitio
activo, según el modelo estructural de MabA.
* Efecto de la fuerza iónica
La actividad de MabA ensayada es constante para
concentraciones en tampón de fosfato que oscilan entre 20 y 100 mM.
Se optó por un tampón de 80 mM, pH 7,0.
\newpage
* Efecto de dilución
Los ensayos enzimáticos que necesitan una
preincubación de H-MabA a lo largo del tiempo,
dieron a conocer que la actividad catalítica decrece rápidamente si
la enzima se incuba con baja concentración (concentración molar <
1 \muM). Ya se ha descrito la desactivación por dilución de las
\beta-cetoacil-ACP reductasas de
E. coli y de plantas (Brassica napus, Persea
americana) [(Schulz y Wakil, 1971); (Sheldon et al.,
1990); (Sheldon et al., 1992)].
La caracterización de una enzima comprende
generalmente la determinación de la velocidad de reacción máxima,
Vmax, y de la "constante de Michaelis", Km, para cada sustrato.
El conocimiento de estos parámetros parece muy útil para los
estudios bioquímicos (comparación de la afinidad para diferentes
sustratos, interacción con otras moléculas, comparación de
isoenzimas de diferentes organismos) y, especialmente, para definir
la eficacia de inhibidores o activadores de la enzima.
La determinación de los parámetros cinéticos
Vmax y Km empieza por la estimación del valor del Km, ensayando dos
concentraciones de sustrato, una baja y otra alta. Después, las
velocidades de reacción iniciales se determinan para un intervalo de
concentración en sustrato, preferentemente largo, que cubre, si
puede ser, de Km/2 hasta 5Km. Se trazó la recta S/v = f(S) o
1/v = f(1/S) para visualizar los datos, después se compararon
los valores de Km y Vmax calculados para este método y los obtenidos
mediante el método de mínimos cuadrados. Los valores obtenidos son
la media de tres manipulaciones. La determinación S/v = f(S)
da resultados próximos a los obtenidos mediante el método de
mínimos cuadrados. El valor de Km obtenido para NADPH, 39 \muM,
es, aproximadamente, cinco veces mayor que aquel de la proteína InhA
para su cofactor NADH (8 \muM). Este Km más elevado se debe
probablemente al reflejo de una afinidad menos importante de MabA
para su coenzima. Los Km de las \beta-cetoacil
reductasas de otros organismos para su cofactor son del mismo tamaño
que aquel obtenido para MabA.
El Km para acetoacetil-CoA,
determinado en presencia de NADPH, es de 1582 \muM. Este Km,
relativamente elevado, es muy superior a los Km descritos para otras
\beta-cetoacil-ACP reductasas de
plantas. El hecho de que MabA presente un Km más elevado que estas
enzimas que pertenecen a sistemas de síntesis de novo, por lo
tanto, específicos de los sustratos de cadena corta, sugería que
MabA podía tener una preferencia por los sustratos con más de 4
carbonos. El estudio de la especificidad de MabA para sustratos de
cadena hidrocarbonada más larga parecía así doblemente importante,
por una parte para caracterizar mejor la actividad enzimática de
esta proteína y, por otra parte, para comparar la especificidad de
sustrato de MabA y la de InhA. La proteína InhA se mostró específica
de los sustratos de cadena larga (12-24 átomos de
carbono), sin presentar ninguna actividad en presencia del sustrato
con 4 carbonos (crotonoil-CoA), incluso con 8 mM
(Quémard et al., 1995).
El uso de sustratos de cadena larga (C8 a C20)
plantea obligaciones relacionadas con su concentración micilar
crítica (CMC). Las acil-CoA de cadena larga son
compuestos amfifílicos y forman disoluciones reales sólo a baja
concentración. Más allá de la CMC, una parte de las moléculas forman
micelas, y la concentración en monómero se fija a la CMC, por lo
tanto, diferente de la concentración total. Por lo tanto, era
importante usar disoluciones con concentraciones menores que la CMC.
En un estudio de las propiedades físicas de las
acil-CoA (Constantinides y Steim, 1985), las CMC de
disoluciones acuosas de palmitoil-CoA
(C16-CoA) y de estearoil-CoA
(C18-CoA) determinadas son, respectivamente, de 70 y
12 \muM. La presencia de una insaturación (en la posición 9) en el
caso de oleil-CoA (C18:1-CoA) sube
su CMC a 33 \muM. La presencia de una función cetona en la cadena
tendría, en teoría, un efecto similar con relación a la CMC. Usando
estos datos, se intentó preparar disoluciones de
\beta-cetotioéster cuya concentración estuviera
por debajo de la CMC. Las disoluciones bases usadas para los ensayos
de cinéticas son de 400 \muM y 100 \muM para las
\beta-cetotioésteres de C8 y C12,
respectivamente.
Se midieron los parámetros de cinéticas de MabA
para la \beta-cetooctanoil-CoA
(C8) y la \beta-cetododecanoil-CoA
(C12). La proteína presenta un Km (60 \muM), para el sustrato de
C8, 25 veces menor que aquel de C4 (1582 \muM). El derivado de C12
parece ser un sustrato mucho mejor (Km de 9 \muM). Allí también,
los valores obtenidos mediante el método de Hanes y el de "mínimos
cuadrados" están próximos. Se calculó la relación Km/Vmax que
refleja la afinidad de la enzima para estos sustratos. Km/Vmax es
más corta cuanto más larga es la longitud de cadena de sustrato.
Esta correlación se debe no sólo a Km más débiles, sino a Vmax más
elevadas en las cadenas más largas.
No se pudieron determinar las constantes de
cinéticas Km y Vmax para C16 y C20. Para estas
\beta-cetoacil-CoA de más de 12
átomos de carbono, se encontraron problemas de inhibición por el
sustrato, descritos asimismo en el caso del uso de sustratos de InhA
de tamaño mayor que C16. Por lo tanto, se compararon las velocidades
iniciales de reacción con una misma concentración (2 \muM), en
presencia de diferentes
\beta-cetoacil-CoA (C4 a C20).
Para medir la actividad, fue necesario usar disoluciones de enzimas
con diferentes concentraciones para los diversos sustratos
\beta-cetotioésteres. La proteína MabA presenta
una alta preferencia por el sustrato con 12 carbonos frente a los
sustratos cortos, y las \beta-cetotioésteres de
C16 y C20 parecen ser al menos tan buenos sustratos como el C8. La
bajada de velocidad de reacción observada para las cadenas largas de
\beta-cetoésteres se podría relacionar con su baja
solubilidad (en el caso en el que la concentración real en moléculas
libres sea menor que 2 \muM).
Aunque presenta una actividad en presencia de
\beta-cetoacil con 4 carbonos, la proteína MabA
muestra, sin embargo, una clara preferencia por los sustratos de
C12-C16. La afinidad de MabA para los sustratos de
cadena larga hidrocarbonada es compatible con el tamaño y la
naturaleza hidrófoba de la bolsa de fijación del sustrato. La
proteína InhA presenta, por su parte, una afinidad ligeramente
diferente, con una preferencia por los sustratos más largos
C16-C24 (Quémard et al., 1995). Las
propiedades enzimáticas de MabA e InhA, especialmente su
especificidad para sustratos de cadena media a larga, secundan su
pertenencia al mismo sistema de elongación de ácidos grasos,
FAS-II, que es específico de sustratos de
C12-C18.
La especificidad de sustrato de InhA difiere de
aquella de las enoil reductasas de los sistemas de tipo II de
Spinacea oleracea (Shimakata y Stumpf, 1982) o de E.
coli (Weeks y Wakil, 1968), que tienen una preferencia por
sustratos de C6 y C8. Además, la \beta-hidroxiacil
deshidratasa del sistema de tipo II de E. coli (Birge y
Vagelos, 1972) es específica de sustratos de cadena corta (C4 a
C12), mientras que es muy poco activa en presencia de sustrato de
C16. Estos datos demuestran la especificidad de sustrato particular
del sistema FAS-II micobacteriano.
El complejo enzimático que contiene InhA que se
identificó como el sistema de elongación FAS-II,
además de su especificidad para los sustratos
C12-C18, tiene como propiedad ser dependiente de
ACP. La dependencia de ACP de la proteína InhA se ilustra mediante
su afinidad mucho más marcada con los sustratos derivados de ACP (la
Km para octenoil-ACP es del orden de 2 tamaños
menores que aquel derivado de CoA de C8). Determinar la preferencia
de MabA para derivados de ACP necesita la síntesis de estos
derivados (no comerciales), y la comparación de las constantes de
cinéticas con aquellas de los derivados de CoA. Las KAR de plantas
son dependientes de ACP, propiedad que se correlacionó con su
pertenencia a un sistema de tipo II. Los numerosos argumentos a
favor de la pertenencia de MabA a FAS-II sugieren
fuertemente la dependencia a ACP de la
\beta-cetoacil reductasa.
Después de la realización de la superproducción
de la proteína MabA en Escherichia coli y de la purificación,
se realizó un estudio enzimático de esta proteína. Así, se demostró
que su actividad catalítica corresponde a la reducción de
\beta-cetoésteres dependiente de NADPH, lo que
corresponde a una de las etapas de la vía de elongación de ácidos
grasos. La determinación de la actividad de MabA en presencia de
sustratos de varias longitudes de cadena permitió mostrar la
preferencia de esta enzima por sustratos de tamaños mayores o
iguales que 12 átomos de carbono, de acuerdo con su implicación
potencial en un sistema de elongación de ácidos grasos. Por lo
tanto, se buscó la proteína MabA en el complejo enzimático
FAS-II que contiene InhA, y se estudió la
implicación de MabA en la actividad de elongación de este
sistema.
La modelización molecular permite acceder a un
conjunto de informaciones relativas a las características
estructurales de la proteína, la arquitectura del sitio catalítico,
pero también apreciar las posibilidades de interacción con ligandos
(sustratos, inhibidores, moléculas afines). La elaboración del
modelo tridimensional de la proteína MabA se representa a
continuación.
La búsqueda de secuencias peptídicas similares a
aquellas de MabA (M. tuberculosis) en los bancos de datos con
el programa Psi-blast (Altschul et al., 1997)
mostró que existían
\beta-cetoacil-ACP reductasas que
presentaban un alto porcentaje de identidad con MabA (87%, 84%, 69%,
respectivamente) en otras especies micobacterianas (avium,
smegmatis, leprae). Proteínas homólogas a MabA, denominadas FabG,
están asimismo presentes en otros organismos, esencialmente
bacterias (por ejemplo en Streptomyces ceolicolor, 57% de identidad)
y plantas. Sin embargo, no se ha resuelto nunca ninguna estructura
de \beta-cetoacil-ACP reductasa.
Por lo tanto, realizar un modelo molecular de MabA resultaba de
interés en el estudio de las FabG.
La modelización estructural de MabA se efectuó
usando el programa Modeller 4 (Sali y Blundell, 1993). El modelo se
basa en la estructura de proteínas cristalizadas en conjunto con
NAD(P)(H) y que presenta el más alto porcentaje de identidad
y el más bajo resultado de probabilidad (E) con MabA. Estas
proteínas "soporte", seleccionadas gracias al programa
Psi-blast (Altschul et al., 1997) en el
principal banco de datos de estructuras protéicas, la PDB (Protein
Data Bank, (Berman et al., 2000)), son: PDB2HSD (34%/NAD);
PDB1YBV (33%/NADPH); PDB2AE2 (29%/NADP); PDB1FMC (28%/NADH); PDB1CYD
(28%/NADPH) y PDB1BDB (27%/NAD). Estas proteínas, de origen muy
diverso, catalizan todas la reducción de un carbonilo (tal como
MabA) o bien la reacción inversa. La alineación de secuencias usada
para la modelización se realizó considerando las regiones bien
conservadas entre MabA y los soportes, por una parte, y entre MabA y
las demás \beta-cetoacil-ACP
reductasa (FabG) conocidas, por otra parte. Para verificar que el
modelo es energéticamente estable, se usaron dos programas, TITO
(Lávese y Momon, 1998) y Verify-3D (Luthy et
al., 1992), que dieron resultados satisfactorios.
La estructura monomérica dada por el modelo de
MabA indica que la proteína pertenece a la superfamilia estructural
\alpha/\beta, con seis hélices \alpha y siete hebras \beta.
Se nota que el bucle \beta6-\alpha6'' comprende
dos hélices denominadas \alpha6 y \alpha6'. MabA posee un solo
dominio, cuya topología es similar al repliegue
(\beta/\alpha)_{6} de Rossmann (Rossmann et al.,
1974), típico de las proteínas que fijan un dinucleótido difosfato
(DDBP) (Persson et al., 1991). Sin embargo, contrariamente a
los DDBP de dos dominios, no se respeta la simetría, puesto que las
hélices de la mitad C-terminal (\alpha4,
\alpha5) son más largas que las estructuras secundarias de la
parte N-terminal. Estas características, así como la
presencia de una hebra suplementaria (\beta7), son típicas de la
superfamilia de las proteínas RED
(Reductasa/Epimerasa/Deshidrogenasa) (Labesse et al., 1994).
La presencia de una cisteína única (C60), probablemente oculta, en
MabA excluye la posibilidad de formación de un puente disúlfuro
intra o intercadena en el seno de la proteína.
\ding{168} El cofactor NADPH fijado se
encuentra en una conformación extendida que descansa sobre los
extremos C-terminales de las hebras
\beta1-\beta5 que forman una lámina. La hebra
\beta2 de las proteínas RED que está implicada en la fijación de
la ribosa unida a la adenina del cofactor, presenta en la secuencia
de MabA el motivo [***xxr] \ding{168}, específico de las enzimas
dependientes de NADP(H) (Labesse et al., 1994). Esto
está en consonancia con los datos enzimáticos que muestran la
especificidad estricta de MabA para NADPH, e indica que el fosfato
suplementario es probablemente importante para la estabilización del
cofactor en la buena orientación para la catálisis. El resto R47
cargado positivamente, que pertenece al motivo [VAVTHR] de la hebra
\beta2, está probablemente implicado en la interacción de la
proteína con el fosfato, mediante uniones electroestáticas. *:
residuo hidrófobo, x: cualquier aminoácido. En letras mayúsculas y
minúsculas: los residuos estrictamente conservados y los más
frecuentemente encontrados, respectivamente.
Tal como en las demás proteínas RED, el sitio de
unión del sustrato de MabA está probablemente delimitado por los
extremos C-terminales de las hebras \beta4,
\beta5, \beta6, \beta7 y las hélices \alpha4, \alpha5,
\alpha6 (\alpha6, \alpha6', \alpha6'') (Fig. 5.18; (Labesse
et al., 1994)); la parte nicotinamida del NADPH, implicada en
los intercambios iónicos, está orientada hacia el fondo de la
cavidad. Los restos del sitio activo muy bien conservados, y que
constituyen en parte la firma de las proteínas RED, están presentes
en el sitio catalítico de MabA: la triada catalítica, S140, Y153,
K157 y N112, T188.
Según las coordenadas atómicas del modelo de
MabA, el único triptófano (W145), situado a nivel del bucle
\beta5-\alpha5, está probablemente implicado en
la bolsa catalítica. Esta aparece muy hidrófoba debido a la
implicación del brazo C-terminal (rico en residuos
hidrófobos) en la estructura de esta bolsa, por una parte, y por la
presencia, además de W145, de restos tales como I147 y F205, por
otra parte. En las proteínas FabG de otros organismos y específicos
de sustratos de cadena corta, estos dos últimos restos se sustituyen
por restos más polares, Asn (para 1147) y Thr, Gln o Asn (para
F205). La especificidad de MabA para sustratos de cadena larga está
muy probablemente relacionada con el carácter hidrófobo de la bolsa
catalítica que constituye así un entorno favorable para la recepción
de cadenas largas alifáticas, una relación
estructura-función entre la hidrofobicidad y el
tamaño de la bolsa de fijación del sustrato, y ya se demostró la
afinidad para moléculas de cadena larga para la proteína InhA
(Rozwarski et al., 1999), que es asimismo parte de las
RED.
La superposición del modelo de MabA con la
estructura cristalina de InhA (complejo ternario
InhA-NAD^{+}-sustrato de C16,
(Rozwarski et al., 1999); PDB1BVR) da a conocer que las
bolsas de unión del sustrato de dos proteínas presentan tamaños
similares, de acuerdo con su afinidad para sustratos que poseen
longitudes de cadena similares (C_{12}-C_{24}
para InhA, C_{8}-C_{20} para MabA; [(Rozwarski
et al., 1999); (quémard et al., 1995)]. Sin embargo,
la bolsa de unión de la enoil reductasa InhA es todavía más
hidrófoba que la de MabA, lo que podría explicar el ligero desfase
en la especificidad de sustratos entre InhA (actividad específica
máxima en presencia de C_{16}, (Quémard et al., 1995)) y
MabA (actividad específica máxima en presencia de C_{12}).
El alineamiento de secuencias de MabA con las
proteínas soportes y con el conjunto de las proteínas FabG conocidas
indica que el extremo amino-terminal no se conservó;
esta región "flota" en el exterior de la proteína y no
corresponde a una estructura secundaria definida. Esto sugiere que
este dominio de la proteína pueda tolerar variaciones, y que no es
importante para la función de la proteína. Un dato experimental de
acuerdo con esta proposición se suministra mediante el estudio de la
actividad catalítica de H-MabA. La proteína
comprende una etiqueta poli-Histidina en
NH_{2}-terminal cuya presencia no parece afectar
la actividad catalítica.
Debido a sus estructuras secundarias y
terciarias características, todas las proteínas descritas son
diméricas o tetraméricas (dímero de dímeros). La región
C-terminal de MabA, que corresponde al bucle
\alpha6-\beta7 y a la hebra \beta7, presenta
una muy alta similitud con la región equivalente de las RED
tetraméricas conocidas, en particular con la de PDB2HSD para la cual
se demostró que está región estaba implicada en el interfaz
dímero-dímero del heterotetrámero (Persson et
al., 1991). La segunda interfaz entre dos monómeros en PDB2HSD
implica las hélices \alpha4 y \alpha5. La conservación en MabA
del extremo C-terminal y la presencia de aminoácidos
hidrófobos en la superficie de las hélices \alpha4 y \alpha5
sugieren que MabA es tetramérica. Estos resultados están en
consonancia con el análisis mediante cromatografía de exclusión,
sugiriendo un equilibrio entre las formas dimérica y tetramérica de
MabA. El análisis de las interfaces
monómero-monómero y dímero-dímero en
un modelo tetramérico de MabA podría permitir reforzar está
conclusión.
Se demostró que la forma activa de INH que
inhibe la proteína InhA sería un radical o anión
isonicotinoil-NAD (Rozwarski et al., 1998).
Estos autores sugieren que el aducto
isonicotinoil-NAD se forma en el sitio catalítico de
InhA, mientras que Wilming y Johnsson demostraron que su formación
se puede realizar en ausencia de la enzima (Wilming y Johnsson,
1999). Así, subsiste una duda en cuanto al modo de acción exacto de
INH sobre InhA in vivo. La superposición del modelo de MabA
con la estructura del complejo binario
InhA-isonicotinoil-NAD (PDB1ZID)
muestra que no existe compatibilidad para la fijación, en el sitio
activo de MabA, de moléculas tales como la isoniazida o la
etionamida. Al igual que para la proteína InhA, el aducto
isonicotinoil-NADP podría, a priori, fijarse
sobre MabA, una vez formado. Sin embargo, en el caso de que el
aducto se forme en el seno del sitio catalítico, no se podría prever
si la isoniazida tendría una orientación adecuada y podría
interactuar con el cofactor NADPH. En cualquier caso, se debe
verificar bioquímicamente una inhibición de la actividad de MabA por
INH, porque el modelo no permite informar de manera precisa sobre la
topología de las cadenas laterales del sitio activo.
Se ensayó el efecto de la isoniazida sobre la
actividad \beta-cetoacil reductasa de MabA
adoptando condiciones experimentales similares a aquellas que
permiten observar una inhibición de la actividad de InhA. La
proteína MabA (150 nM) se preincuba durante 2 horas en presencia de
100 \muM o 2 mM de isoniazida, 100 \muM de NADPH y 1 \muM de
MnCl_{2}. En presencia de 100 \muM en INH, la actividad de MabA,
detectada en presencia de acetoacetil-CoA, se inhibe
de 44 \pm 3% con relación al testigo sin INH, y la adición de 2 mM
de isoniazida conlleva una inhibición de 62 \pm 6%. El hecho de
que no se observe ninguna inhibición total de la actividad de MabA,
incluso en presencia de 2 mM de isoniazida, se podría explicar
mediante una oxidación muy lenta de la isoniazida por los iones
Mn^{3+} en las condiciones usadas (en ausencia de catalizador tal
como KatG) y, por lo tanto, una concentración en forma activa del
antibiótico que no es proporcional a la concentración de comienzo de
isoniazida. Esta explicación supone que MabA se inhibe mediante un
mecanismo similar a aquel descrito para InhA. Se recuerda que el
mecanismo de inhibición de la proteína InhA mediante la isoniazida
necesita, como mínimo, la presencia del cofactor NADH, de iones
Mn^{2+} y del oxígeno molecular. Los iones Mn^{2+} se oxidarían
en Mn^{3+}, que catalizan la oxidación de la isoniazida. Así, se
ensayó el efecto de la ausencia de MnCl_{2} o de NADPH sobre la
inhibición de MabA mediante INH. En ausencia de MnCl_{2} en la
reacción, se observa una disminución no significativa de la
actividad de la enzima, lo que indica que los iones Mn^{2+} son
necesarios para obtener un efecto del INH. La determinación de la
implicación del NADPH en el proceso de inhibición es más delicada de
realizar, debido a que la preincubación de la proteína MabA en
ausencia de este cofactor conlleva a una disminución importante
(-74%) de la actividad después de 2 h de preincubación sin
antibiótico. Por lo tanto, no se pudo evaluar la implicación del
NADPH en la inhibición mediante isoniazida.
Los resultados muestran que la actividad de la
proteína MabA está inhibida por la isoniazida, y sugieren que el
mecanismo de acción de este antibiótico sobre MabA haría intervenir
los iones Mn^{2+}. Dada la homología de estructura y de función de
las dos proteínas, es probable que el mecanismo de inhibición sea
análogo a aquel de InhA, pasando por la formación de un aducto
isonicotinoil-NADP^{+}.
En las micobacterias, una mutación o una
sobreexpresión del gen inhA conlleva una resistencia cruzada
de los dos antituberculosos isoniazida y etionamida (ETH). La
etionamida es probablemente también un profármaco debido a que no se
observó in Vitro la inhibición de la proteína InhA mediante
este antibiótico en su forma natural. Sin embargo, no se conoce el
modo de activación de ETH. No obstante, se ensayó el efecto de la
etionamida sobre la actividad de InhA, en las condiciones
experimentales de inhibición por INH, en presencia de MnCl_{2} y
de NADH. En presencia de 100 \muM de ETH, la actividad de InhA no
cambia. El mismo resultado se obtiene sobre MabA. No fue posible
ensayar concentraciones mayores de antibiótico debido a la fuerte
absorbancia que presenta en la región de longitud de onda usada para
los ensayos enzimáticos. Sin embargo, las condiciones de oxidación
de INH in vitro, adoptadas para el ensayo de la etionamida,
no parecen las requeridas para la activación de ETH. El hecho de que
la catálisis-peroxidasa KatG, que acelera la
oxidación de la isoniazida no sea activador de ETH [(Johnsson et
al., 1995); (Basso et al., 1996)] está en consonancia con
esta conclusión. Por otra parte, si se requiera una oxidación de
ETH para su acción sobre su(s)
diana(s), la oxidación de una función tioamida parece más difícil que la de una función hidrazida (INH), y debería necesitar un oxidante más fuerte que los iones Mn^{3+}.
diana(s), la oxidación de una función tioamida parece más difícil que la de una función hidrazida (INH), y debería necesitar un oxidante más fuerte que los iones Mn^{3+}.
El estudio de la estructura tridimensional de
MabA mediante modelización molecular permitió demostrar que la
proteína presenta un solo dominio, con una estructura secundaria de
tipo \alpha/\beta, y que pertenece a la superfamilia estructural
de RED (reductasa/epimerasas/deshidrogenasas). La proteína MabA
posee el motivo específico de las proteínas que fijan NADP(H)
y una bolsa de fijación del sustrato cuyo tamaño e hidrofobicidad
favorecería la recepción de \beta-cetoésteres de
larga cadena. Estos datos estructurales suministrados por el modelo
MabA están en consonancia con los resultados bioquímicos obtenidos
anteriormente. El modelo de MabA indica que el resto triptófano
(Trp), situado a nivel del bucle \beta5-\alpha5,
estaría implicado en la bolsa de fijación del sustrato. Gracias a la
unicidad de este resto Trp, se pudieron realizar experimentos de
espectroscopia en fluorescencia. Permitieron validar el modelo de
MabA, confirmando, por una parte, la implicación del Trp y de al
menos uno de los dos Met del extremo C-terminal en
la bolsa de fijación del sustrato, y la especificidad de MabA para
sustratos de cadena larga, por otra parte. La superposición del
modelo de MabA con la estructura cristalina de InhA (en complejo con
NAD^{+} y el sustrato de C16, (Rozwarski et al., 1999) da a
conocer que las dos proteínas presentan sitios de unión del sustrato
de tamaño equivalente y más hidrófobos que sus homólogos de otros
organismos, implicados en una síntesis de novo. Esto confirma la
hipótesis de coimplicación de MabA e InhA en el mismo complejo de
elongación de ácidos grasos.
El modelo de MabA sugiere que la proteína en
disolución es tetramérica, lo que está en consonancia con el
resultado de los experimentos de filtración sobre gel, habiendo
sugerido que existía, en las condiciones experimentales ensayadas,
un equilibrio dímero-tetrámero de MabA. Sin embargo,
la asociación de MabA con InhA, cada una en forma tetramérica en el
complejo FAS-II, es incompatible con el tamaño
estimado del sistema. Así, como InhA y MabA presentan topologías
similares, se podría pretender que estas dos proteínas forman un
heterotetrámero en el seno del complejo FAS-II. Para
ensayar esta hipótesis, se podrá realizar la modelización molecular
de un complejo heterotetrámero MabA-InhA, usando las
proteínas RED tetraméricas como soporte. Para confirmar la
posibilidad de que InhA y MabA pudiesen asociarse conjuntamente, se
podrá intentar un puente químico entre las dos proteínas, en
presencia de sus cofactores respectivos.
El conocimiento de la organización
tridimensional dada mediante el modelo permitió sugerir una posible
interacción entre MabA e isoniazida. Se pudo demostrar, mediante
estudios enzimáticos, que la actividad de MabA estaba efectivamente
inhibida in vitro mediante este antibiótico, y que el
mecanismo de inhibición de MabA es probablemente comparable a aquel
descrito para la proteína InhA.
El gen mabA de M. tuberculosis se
clonó entre los sitios NdeI y Xho del plásmido
pET-15b, aguas abajo de una secuencia que codifica 6
histidinas.
Después de la preparación de las bacterias
competentes de E. coli BL21 (\lambdaDE3) (Sambrook et
al., 1989), se incubó una alícuota (100 \mul) en presencia del
plásmido pET-15b::mabA (39 ng) durante 30
minutos, en hielo. La transformación se efectúa por choque térmico
(90 s a 42ºC, y después 2 min. en hielo). Entonces, se añade un
medio LB, y se incuba la suspensión durante 45 min. a 37ºC con
agitación (250 rpm) antes de ser extendido sobre la caja
LB-agar que contiene 50 \mug/ml de carbenicilina.
La incubación a 37ºC durante 18 horas aproximadamente permite
obtener colonias de tamaño medio a grande.
Se usan cuatro colonias de tamaño medio para
inocular cuatro cultivos de 50 ml en medio LB + carbenicilina. La
turbidez del medio se mide mediante espectrofotometría a 600 nm cada
hora hasta que la densidad óptica llegue a 0,8 (medio de la fase
exponencial de crecimiento), es decir, después de aproximadamente 4
h de incubación. Entonces, se induce la expresión del gen
mabA con 0,8 mM de IPTG durante 2 h a 37ºC, y después se
verifica mediante SDS-PAGE. Se conserva una alícuota
de cultivo no inducida que servirá de control negativo de la
inducción.
Una vez inducida la expresión de mabA, se
analiza una alícuota de 100 \mul de cultivo para controlar la
expresión del gen. Después de la centrifugación (5 min. a 12000 g),
el resto bacteriano se recoge en un tampón de carga (Laemmli, 1970)
para ser depositado sobre el gel de poliacrilamida al 12% en
condiciones desnaturalizantes.
Se colectan las bacterias (10 ml) mediante
centrifugación durante 5 min. a 3000 g, a 4ºC. El resto se
resuspende en un tampón de fosfato de potasio (100 mM, pH 7,2) en
1/20 del volumen de partida del cultivo. La suspensión se sonica con
la ayuda de una microsonda (Vibracell, Bioblock), en cuatro pulsos
de 10 s intercalados con tiempos de reposo de 40 s (duty cycle: 60%,
microtip limit: 5). El extracto total obtenido se centrifuga durante
5 min. a 12000 g, a 4ºC. La presencia de la proteína MabA en las
fracciones que corresponden al total, sobrenadante (soluble) y resto
(insoluble), se analizan mediante SDS-PAGE (12% de
poliacrilamida).
Todas la etapas se efectúan en frío
(0-4ºC), para reducir la acción de las
proteasas.
Se colectan los cultivos reunidos (4 x 50 ml)
mediante centrifugación (15 min. a 16000 g, a 4ºC), y después se
lavan (50 mM de tampón de fosfato de potasio, pH 7,8). Se recoge el
resto obtenido (0,9 g/200 ml de cultivo) en 9 ml de tampón de lisis
(50 mM de tampón de fosfato de potasio, pH 7,8, que contiene 500 mM
de NaCl y 5 mM de imidazol). Antes de congelar la suspensión a -70ºC
(una noche), se añade una mezcla de inhibidores de proteasas (0,113
mg/ml, véase anteriormente) y lisozima (0,5 mg/ml). La suspensión se
descongela, con agitación suave, a temperatura ambiente, y después
se trata con DNasal (5 \mug/ml) y RNasaA (10 \mug/ml) en
presencia de 10 mM de MgCl_{2} durante 15 min. a 4ºC, con
agitación suave. Se eliminan las bacterias enteras y los restos
mediante centrifugación (15 min. a 3000 g, 4ºC). Una última
centrifugación a 44000 g, durante 45 min. a 4ºC, permite eliminar
cualquier material insoluble. Se añaden 10% (p/p) de glicerol al
sobrenadante (lisado clarificado) antes de ser cargado sobre la
columna.
Mezcla de inhibidores de proteasas:
| \ding{168} leupeptina (inhibidor de la quimiotripsina): | 0,0023 g/l |
| \ding{168} Soybean (inhibidor reversible de la tripsina): | 0,02 g/l |
| \ding{168} TLCK (inhibidor irreversible de la tripsina): | 0,0518 g/l |
| \ding{168} Aprotinina | 0,0016 g/l |
| \ding{168} Pepstatina (inhibidor de tipo pepsina): | 0,0011 g/l |
| \ding{168} PMSF (inhibidor irreversible de la quimiotripsina): | 0,0362 g/l |
Observación: En estos experimentos, se omite el
EDTA (inhibidor de las proteasas dependientes de metal) de la mezcla
de inhibidores de proteasas, debido a su capacidad en quelatar los
iones níquel durante la purificación sobre columna
Ni-NTA.
En una minicolumna vacía (volumen total de 7,5
ml de polipropileno, Polylabo), se lavan 500 \mul de resina
Ni-NTA agarosa (QIAGEN) (es decir 1 ml de suspensión
al 50%) con 4 veces 2,5 ml de tampón de lisis*. Se incuban cuatro ml
de lisado bacteriano clarificado (aproximadamente 15 mg de proteínas
totales) con la resina Ni-NTA con agitación suave,
durante 1 h a 4ºC. Se recupera el material no fijado a la resina
mediante decantación, y después mediante "lavados" con 32 VC
(volúmenes de columna) de tampón de lisis. Se eluye el resto de las
proteínas contaminantes con 8 VC de tampón con 50 mM de imidazol. La
proteína MabA se eluye mediante 8 VC de tampón con 175 mM de
imidazol. Después, la resina se limpia con 10 VC de tampón con 250
mM de imidazol y se recupera directamente en glicerol puro a fin de
obtener 50% (p/p) de glicerol final. Estos cuidados son necesarios
para evitar la precipitación de MabA en la salida de la columna.
Observación: todos los tampones usados aquí
contienen 50 mM de fosfato de potasio, pH 7,8 y 500 mM de NaCl.
* tampón de lisis: 50 mM de tampón
de fosfato de potasio, pH 7,8, que contiene 500 mM de NaCl y 5 mM de
imidazol.
La disolución de proteína MabA después de la
purificación, recuperada en glicerol al 50% (p/p), se dializa 2
veces durante 1 h contra 40 volúmenes de 50 mM de tampón de fosfato
de potasio, pH 7,2, que contiene 50% (p/p) de glicerol, a 4ºC, en un
tubo de diálisis (límite de corte 8-10 kDa,
Spectra/Por, Spectrum) previamente hervido en una disolución de 1 mM
de EDTA para eliminar las trazas de metales pesados, y después se
aclara con agua osmoseada. Después, el dialisado se alicuota y se
conserva a -20ºC.
Se estimó la concentración de las disoluciones
de proteína purificada según la ley de Beer-Lambert
(DO = \varepsilon1C*) con su coeficiente de extinción molar
teórico y su absorbancia a 280 nm.
* s: coeficiente de extinción
molar, 1: longitud del trayecto óptico y C: concentración
molar.
Los coeficientes de extinción molar (CEM) de la
proteína se calculan según Gill y von Hippel (Gill y von Hippel,
1989) (en presencia de 6 M de cloruro de guanidina con pH 6,5). La
relación es entonces la siguiente:
CEM = (a * ETyr) + (b * ETrp) + (c * ECys), en
los que a, b y c son, respectivamente, el número de restos, y Eaa
sus coeficientes de extinción molar. A 280 nm, son respectivamente
iguales a: ETyr=1280, ETrp=5690 y ECys=120.
CEM (\varepsilon) de MabA a 280 nm es de 9530
M^{-1}cm^{-1}, y no tiene en cuenta el único resto Cys.
Se lava un resto de 2 mg de proteína
H-MabA purificada, precipitada en un tampón sin
glicerol, 5 veces con agua (5 min. de centrifugación a 12000 g). Se
añaden 200 \mul de mezcla acetonitrilo/agua (50/50) + TFA al 0,1%
(p/p), después el conjunto se pone en remolino y se centrifuga 2
min. a 12000 g. Se añade un volumen igual de una mezcla metanol/agua
(50/50) + ácido acético al 0,5% (p/p) a una alícuota de
sobrenadante, el conjunto se pone en remolino y después se guarda 2
h a 4ºC antes de ser centrifugado durante 2 min. a 12000 g. Se
introducen 60 \mul del sobrenadante en la fuente del espectrómetro
mediante una jeringa bomba (HARVARD), con un caudal de 5
\mul/min., para ser analizado mediante espectrometría de
masa/ionización por electropulverización (ESI/MS) en el aparato
Finnigan MAT (TSQ 700). Correspondiendo los parámetros de la fuente
ESI a una alimentación de 5 kV, una temperatura del capilar
intermedio de 250ºC y a 40 psi para el nitrógeno (gas de
nebulización).
Se realizaron los experimentos de FPLC con el
sistema BioCAD SPRINT (PerSeptive Biosystems, Cambridge, MA). Se
equilibró una columna Sephacryl S-100 HR
(HiPrep^{TM} 16/60 Sephacryl High Resolution, Pharmacia) con 1 VC
de 50 mM de tampón de fosfato de potasio, pH 6,8 que contiene 100 mM
de NaCl. Se aplicaron cinco proteínas estándares de masas
moleculares conocidas, diluidas en este mismo tampón, sobre la
columna (0,5 a 1 mg de cada proteína); alcohol deshidrogenasa (150
kDa), albúmina de suero bovino (BSA, 67 kDa), ovalbumina (43 kDa),
anhidrasa carbónica (29 kDa) y ribonucleasaA (RNasaA, 13,7 kDa). Se
efectuaron dos elusiones sucesivas con una combinación diferente de
3 proteínas estándares para obtener una mejor resolución de los
picos, y se superpusieron los perfiles a 280 nm. La curva de
calibración se obtuvo reportando el volumen de elución de cada
proteína estándar en función del logaritmo de la masa molecular. Se
dispone una disolución de H-MabA al 1,1 mg/ml (0,66
mg de proteína cargada) sobre la columna, y se eluye en las mismas
condiciones que las proteínas estándares. La masa molecular de
H-MabA se estima basándose en la curva de
calibración.
La determinación de los parámetros de cinéticas
para los diferentes sustratos exige condiciones de ensayo enzimático
reproductibles de una manipulación a otra. Las concentraciones de
las disoluciones de sustrato \beta-cetoéster de
CoA y de cofactor (NADPH) se determinan, por lo tanto, antes del
uso. Se añade el reactivo a calibrar (por ejemplo
\beta-cetoéster de CoA) a una concentración mucho
menor que la del segundo sustrato (NADPH). La reacción se inicia con
una concentración de enzima suficiente para obtener el uso rápido
del sustrato en concentración limitante. La diferencia de DO_{340}
observada permite deducir la concentración real de este sustrato
\beta-cetoéster de CoA en la reacción.
La actividad catalítica de MabA purificada se
demostró mediante espectrofotometría en presencia de
acetoacetil-CoA y de NADPH.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La cinética de la reacción de
\beta-cetoacil reductasa se continúa mediante la
medida de la absorbancia a 340 nm a lo largo del tiempo, que
disminuye con la oxidación del NADPH. La reacción enzimática se
efectúa en un volumen final de 1 ml (en cuba de cuarzo, trayecto
óptico 1 cm). El espectrofotómetro (UVIKON 923,
Bio-Tek Kontron Instruments) se une a un baño con
termostato que permite regular la temperatura de la cuba hasta 25ºC.
Se efectúa una línea base en ausencia de enzima. La mezcla de
reacción comprende 80 mM de tampón de fosfato de sodio, y
concentraciones variables de NADPH y
\beta-cetoacil-CoA. La reacción se
inicia mediante adición de la enzima (36 nM a 144 nM). Las medidas
se efectúan entre 3 y 5 min.
La K_{m} para NADPH se determinó con
concentraciones de coenzima que oscilan de 5 a 200 \muM, y con una
concentración fija (460 \muM) de acetoacetil-CoA.
Las K_{m} para los
\beta-cetoacil-CoA se determinaron
con una concentración fija, 100 \muM de NADPH. Una concentración
mayor que 100 \muM llevaría a un ruido de fondo demasiado
importante a nivel de las medidas. Se verificó, además, que esta
concentración era saturante.
Las K_{m} y V_{max} para
\beta-cetoacil-CoA se midieron con
las siguientes concentraciones: para acetoacetil-CoA
(C_{4}), 100-8570 \muM; para
\beta-cetooctanoil-CoA (C_{8}),
4-160 \muM; para
\beta-cetododecanoil-CoA
(C_{12}), 2-32 \muM. Para
\beta-cetohexadecanoil-CoA y
\beta-cetoeicosanoil-CoA
(C_{20}), problemas de inhibición no permitieron determinar los
parámetros de cinéticas y la velocidad de reacción se comparó con
una concentración fija de 2 \muM.
Se realizaron al menos dos series de puntos
experimentales para cada parámetro de cinética. La veracidad de
estos puntos se verificó gráficamente mediante la representación
"de dobles inversas", 1/v = f(1/[S])(ecuación (1)).
Después, los parámetros de cinéticas se determinaron gráficamente
según la representación de Hanes [S]/v = f([S]) (ecuación (2)), o
mediante el cálculo según el método de mínimos cuadrados, con el
programa GraphPad Prism. Versión
2.01.
2.01.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El mutante MabA C(60)V se obtuvo
mediante mutagénesis dirigida después de haber realizado una PCR
inversa. Los cebadores nucleotídicos se eligieron a fin de modificar
el codón 60 del gen mabA, a saber la sustitución de TGT
(cisteína) en GTT (valina). El plásmido pET15b::mabA se uso
como soporte para la amplificación PCR mediante el ADN polimerasa
Pfu Turbo (Stratagene, USA).
Los productos PCR se digirieron con endonucleasa
Dpn1 a fin de seleccionar los plásmidos que comprenden el gen
mutado. El gen mutado se secuenció totalmente a fin de verificar la
ausencia de mutación secundaria. Después, se uso el plásmido que
lleva el gen mabA C(60)V (pET15b::mabA
C(60)V) para transformar la cepa superproductora BL21
(DE3).
La obtención de los mutantes MabA
C(60)V/S(144)L y MabA
S(144)L se efectuó según el mismo método que
anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se efectuaron cuatro cultivos de 50 ml en medio
LB + carbenicilina. La turbidez del medio se midió mediante
espectrofotometría a 600 nm hasta que la densidad óptica alcanzó 0,8
(medio de la fase exponencial de crecimiento), es decir, después de
aproximadamente 4 h de incubación. Entonces, la expresión del gen
mabA se induce con 0,8 mM de IPTG durante 2 h a 37ºC, y
después se verifica mediante SDS-PAGE.
Los cultivos reunidos (4 x 50 ml) se colectan
mediante centrifugación (15 min. a 16000 g, a 4ºC) y después se
lavan. El resto obtenido se recoge en 4 ml de tampón de lisis (véase
a continuación). Antes de congelar la suspensión a -80ºC (una
noche), se añade una mezcla de inhibidores de proteasas (0,113
mg/ml) y lisozima (0,5 mg/ml). La suspensión se descongela, con
agitación suave, a temperatura ambiente, y después se trata con
DNasal (5 \mug/ml) y RNasaA (10 \mug/ml) en presencia de 10 mM
de MgCl_{2} durante 15 min. a 4ºC, con agitación suave. Las
bacterias enteras y los restos se eliminan mediante centrifugación
(15 min. a 3000 g, a 4ºC). Una última ultracentrifugación a 44000 g,
durante 15 min. a 4ºC, permite eliminar cualquier material
insoluble. Según los casos, antes de ser cargado sobre la columna,
el sobrenadante (lisado clarificado) se puede complementar con 10%
(p/p) de glicerol (proteína para estudios de cinéticas, o para la
cristalografía de las proteínas menos estables), o bien 400 \muM
de NADP^{+} (estudio cristalográfico del complejo
MabA-NADP).
Se añaden cuatro ml de lisado bacteriano
clarificado (aproximadamente 30 mg de proteínas totales) a una
columna Ni-NTA agarosa (500 \mul, QIAGEN). Se
recupera el material no fijado a la resina mediante "lavados"
con 5 mM de tampón, y después 50 mM de imidazol. La proteína MabA se
eluye con el tampón de elución. Cuando el tampón de fosfato se usa,
la proteína se recupera directamente en 50% (p/p) de glicerol final,
para evitar la precipitación. Para la cristalografía, la proteína se
concentra a 10-15 mg/ml por ultrafiltración.
\newpage
- Tampón de lisis: 50 mM de fosfato de potasio, pH 7,8, que contiene 500 mM de NaCl, 5 mM de imidazol
- Tampón de lavado: 50 mM de fosfato de potasio, pH 7,8, que contiene 500 mM de NaCl, 5 y 50 mM de imidazol
- Tampón de elución: 50 mM de fosfato de potasio, pH 7,8, que contiene 500 mM de NaCl, y 1,75 mM de imidazol.
\vskip1.000000\baselineskip
- Tampón de lisis: 50 mM de tampón Tris, pH 8,0, adicionado con 300 mM de LiSO_{4} y 5 mM de imidazol;
- o: 50 mM de tampón Tris, pH 8,0, adicionado con 300 mM de KCl y 5 mM de imidazol.
- Tampón de lavado: 50 mM de tampón Tris, pH 8,0, adicionado con 300 mM de LiSO_{4} y 5 ó 50 mM de imidazol;
- o: 50 mM de tampón Tris, pH 8,0, adicionado con 300 mM de KCl y 5 ó 50 mM de imidazol.
- Tampón de elución: 20 mM de MES buffer, pH 6,4, 300 mM de LiSO_{4} y 175-750 mM de imidazol;
- o: 20 mM de tampón PIPES, pH 8,0, adicionado con 300 mM de KCl y 175-750 mM de imidazol. Observación: se añade 1 mM de DTT a estos tampones en el caso de la proteína salvaje.
(MES = ácido
2-[N-morfolino]etanosulfónico; PIPES =
piperazin-N,N'-bis[ácido
2-etanosulfónico])
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia peptídica de la proteína MabA (FabG1)
salvaje de M. tuberculosis H37Rv en fusión con un tag
poli-His (en negrita):
Secuencia peptídica de la proteína MabA C60V
(mutación en negrita) en fusión con un tag poli-His
(en negrita):
Secuencia peptídica de la proteína MabA
C60V/S144L (mutaciones en negrita) en fusión con un tag
poli-His (en negrita):
Secuencia nucleotídica del gen mabA
(fabG1) salvaje de M. tuberculosis cepa H37Rv, en fusión con
una secuencia que codifica un tag poli-Histidina (en
mayúscula):
Secuencia nucleotídica del gen mabA
(fabG1) C60V (codón mutado en negrita) de M. tuberculosis
cepa H37Rv, en fusión con una secuencia que codifica un tag
poli-Histidina (en mayúscula):
Secuencia nucleotídica del gen mabA
(fabG1) C60V/S144L (codones mutados en negrita) de M.
tuberculosis cepa H37Rv, en fusión con una secuencia que
codifica un tag poli-Histidina (en mayúscula):
Las medidas de las cinéticas enzimáticas
efectuadas con MabA son las siguientes:
acetoacetil-CoA (C_{4}: K_{m} = 1530 \pm 81
\muM, k_{cat} = 1,9 \pm 0,0 S^{-1}),
\beta-quetooctancil-CoA (C_{8}:
K_{m} = 70 \pm 8 \muM, k_{cat} = 3,5 \pm 0,0 s^{-1}),
\beta-quetododecanoil-CoA
(C_{12}: K_{m} = 8,3 \pm 0,8 \muM, k_{cat} = 4,3 \pm 0,2
s^{-1}).
\vskip1.000000\baselineskip
Las coordenadas atómicas de la estructura
tridimensional de los cristales de la proteína MabA se representan
en la figura 1, presentando dichos cristales, además, las siguientes
características:
- -
- parámetro de células:
- \bullet
- a = 81,403 ángstrom, b = 116,801 ángstrom, c = 52,324 ángstrom,
- \bullet
- \alpha = \beta = 90,00º, \gamma = 122,30º,
- -
- grupo espaciador: C2
- -
- difracción máxima = 2,05 ángstrom.
Las coordenadas atómicas de la estructura
tridimensional de los cristales de la proteína C(60)V
se representan en la figura 2, presentando dichos cristales, además,
las siguientes características:
- -
- parámetro de células:
- \bullet
- a = 82,230 ángstrom, b = 118,610 ángstrom, c = 53,170 ángstrom,
- \bullet
- \alpha = \beta = 90,00º, \gamma = 122,74º,
- -
- grupo espaciador: C2,
- -
- difracción máxima = 2,6 ángstrom.
Las coordenadas atómicas de la estructura
tridimensional de los cristales de la proteína
C(60)V/S(144)L se representan en la
figura 3, presentando dichos cristales, además, las siguientes
características:
- -
- parámetro de células:
- \bullet
- a = 81,072 ángstrom, b = 117,022 ángstrom, c = 53,170 ángstrom,
- \bullet
- \alpha = \beta = 90,00º, \gamma = 122,42º,
- -
- grupo espaciador: C2,
- -
- difracción máxima = 1,75 ángstrom.
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\vskip0.400000\baselineskip
<110> CNRS
\vskip0.400000\baselineskip
<120> UTILIZACIÓN DE LA PROTEÍNA MabA
(FABG1) DE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS PARA LA REALIZACIÓN Y
LA DETECCIÓN SISTEMÁTICA DE ANTIBIÓTICOS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> IFB 02 AY CNR MABA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> FR0204018
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
29-03-2002
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 247
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mycobacterium
tuberculosis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
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<211> 741
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
artificial: secuencia que codifica una proteína derivada de la
proteína MabA de Mycobacterium tuberculosis
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> CDS
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<222> (1)..(741)
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 247
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
artificial: secuencia que codifica una proteína derivada de la
proteína MabA de Mycobacterium tuberculosis
\newpage
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<400> 3
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<211> 741
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
artificial: secuencia que codifica una proteína derivada de la
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<223> Descripción de la Secuencia
artificial: secuencia que codifica una proteína derivada de la
proteína MabA de Mycobacterium tuberculosis
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<223> Descripción de la Secuencia
artificial: secuencia que codifica una proteína derivada de la
proteína MabA de Mycobacterium tuberculosis
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<220>
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<222> (1)..(741)
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<223> Descripción de la Secuencia
artificial: secuencia que codifica una proteína derivada de la
proteína MabA de Mycobacterium tuberculosis
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<223> Mutante de la proteína MabA
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<223> Etiqueta
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<223> Mutante de la proteína MabA
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<222> (49) .. (49)
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
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<211> 250
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Mutante de la proteína MabA
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<220>
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<221> MISC_FEATURE
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<222> (27)..(27)
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<223> Asp o Glu
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<220>
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<221> MISC_FEATURE
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<222> (49)..(49)
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<223> Asp o His
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<400> 29
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Mutante de la proteína MabA
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<221> MISC_FEATURE
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<222> (27)..(27)
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<223> Asp o Glu
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<221> MISC_FEATURE
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<222> (49).. (49)
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<223> Asp o His
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<210> 31
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<212> PRT
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<223> Mutante de la proteína MabA
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<222> (49)..(49)
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<223> Asp o His
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<212> PRT
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<223> Mutante de la proteína MabA
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<222> (27)..(27)
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<223> Asp o Glu
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<220>
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<221> MISC_FEATURE
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<222> (49)..(49)
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<223> Asp o His
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\vskip1.000000\baselineskip
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Mutante de la proteína MabA
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
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<211> 240
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Mutante de la proteína MabA
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 34
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<210> 35
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Mutante de la proteína MabA
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<400> 35
\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 240
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Mutante de la proteína MabA
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Mutante de la proteína MabA
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<220>
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<221> MISC_FEATURE
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<222> (17)..(17)
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<223> Asp o Glu
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<220>
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<221> MISC_FEATURE
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<222> (39)..(39)
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<223> Asp o His
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<400> 37
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 240
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Mutante de la proteína MabA
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<220>
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<221> MISC_FEATURE
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<222> (17)..(17)
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<223> Asp o Glu
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<220>
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<221> MISC_FEATURE
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<222> (39)..(39)
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<223> Asp o His
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<400> 38
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 39
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<211> 240
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Mutante de la proteína MabA
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<220>
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<221> MISC_FEATURE
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<222> (17)..(17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Asp o Glu
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (39)..(39)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Asp o His
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 240
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Mutante de la proteína MabA
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<220>
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<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (17).. (17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Asp o Glu
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (39)..(39)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Asp o His
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<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Mutante de la proteína MabA
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<220>
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<221> MISC_FEATURE
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<222> (17)..(17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Asp o Glu
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (39)..(39)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Asp o His
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (33)
1. Proteínas derivadas de la proteína MabA,
caracterizadas porque corresponden a la proteína MabA cuya
secuencia de aminoácidos SEC ID nº: 1 que es la siguiente:
es tal
que:
- -
- la cisteína en la posición 60 se sustituye por un resto valina, y/o la glicina en la posición 139 se sustituye por una alanina o una serina, y/o la serina en la posición 144 se sustituye por un resto leucina, y/o
- -
- comprende las mutaciones N24D(o E), y/o H46D,
- -
- se modifica mediante inserción del lado N-terminal de una etiqueta poli-Histidina tal como la secuencia SEC ID nº: 14 siguiente: MGSSHHHHHH SSGLVPRGSH,
- -
- representa una secuencia GSH en N-terminal,
- -
- se suprimen los siete primeros aminoácidos.
2. Proteína derivada de la proteína MabA según
la reivindicación 1, caracterizada porque corresponde a la
proteína MabA en la que la cisteína en la posición 60 se sustituye
por un resto valina, correspondiendo dicha proteína derivada,
también denominada C(60)V, a la secuencia SEC ID nº 3
siguiente:
3. Proteína derivada de la proteína MabA según
una de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque
corresponde a la proteína MabA en la que la serina en la posición
144 se sustituye por un resto leucina, correspondiendo dicha
proteína derivada, también denominada S(144)L, a la
secuencia SEC ID nº: 5 siguiente:
4. Proteína derivada de la proteína MabA según
una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque
corresponde a la proteína MabA en la que la cisteína en la posición
60 se sustituye por un resto valina, y la serina en la posición 144
se sustituye por un resto leucina, correspondiendo dicha proteína
derivada, también denominada
C(60)V/S(144)L, a la secuencia SEC ID nº
7 siguiente:
\newpage
5. Proteína derivada de la proteína MabA según
una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque
corresponde a la proteína MabA, en la que la cisteína en la posición
60 se sustituye por un resto valina, la glicina en la posición 139
se sustituye por una alanina o una serina, y la serina en la
posición 144 se sustituye por un resto leucina, correspondiendo
dicha proteína derivada, también denominada
C(60)V/G(139)[A o S]/S(144)L, a
la secuencia SEC ID nº 8 siguiente:
- en la que X representa A o S.
6. Proteínas derivadas de la proteína MabA según
una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizadas porque se
modifican de tal forma que corresponden a las siguientes
secuencias:
- -
- la secuencia SEC ID nº: 9, que corresponde a la secuencia SEC ID nº: 1, que comprende las mutaciones N24D(o E), y/o H46D, a saber, la siguiente secuencia:
- en la que X_{1} representa D o E, y X_{2} representa H o D,
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- la secuencia SEC ID nº: 9 anterior, en la que la cisteína en la posición 60 se sustituye por un resto valina y/o la glicina en la posición 139 se sustituye por una alanina o una serina, y/o la serina en la posición 144 se sustituye por un resto leucina,
- -
- la secuencia SEC ID nº: 10, que corresponde a la secuencia SEC ID nº: 3, que comprende las mutaciones N24D (o E), y/o H46D, a saber, la siguiente secuencia:
- en la que X_{1} representa D o E, y X_{2} representa H o D,
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- la secuencia SEC ID nº: 11, que corresponde a la secuencia SEC ID nº: 5, que comprende las mutaciones N24D (o E), y/o H46D, a saber, la siguiente secuencia:
- en la que X_{1} representa D o E, y X_{2} representa H o D,
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- la secuencia SEC ID nº: 12, que corresponde a la secuencia SEC ID nº: 7, que comprende las mutaciones N24D (o E), y/o H46D, a saber, la siguiente secuencia:
- en la que X_{1} representa D o E, y X_{2} representa H o D,
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- la secuencia SEC ID nº: 13, que corresponde a la secuencia SEC ID nº: 8, que comprende las mutaciones N24D (o E), y/o H46D, a saber, la siguiente secuencia:
- en la que X_{1} representa D o E, y X_{2} representa H o D.
7. Proteínas derivadas de la proteína MabA según
una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizadas porque se
modifican mediante inserción, en el lado N-terminal,
de una etiqueta poli-Histidina tal como la secuencia
SEC ID nº: 14 siguiente: MGSSHHHHHH SSGLVPRGSH.
8. Proteínas MabA modificadas según la
reivindicación 7, que corresponden a las siguientes secuencias:
- -
- la secuencia SEC ID nº: 15, que corresponde a la combinación de la secuencia SEC ID nº: 14 y de la secuencia SEC ID nº: 1, a saber, la siguiente secuencia:
- -
- la secuencia SEC ID nº: 16, que corresponde a la combinación de la secuencia SEC ID nº: 14 y de la secuencia SEC ID nº: 3, a saber, la siguiente secuencia:
- -
- la secuencia SEC ID nº: 17, que corresponde a la combinación de la secuencia SEC ID nº: 14 y de la secuencia SEC ID nº: 5, a saber, la siguiente secuencia:
- -
- la secuencia SEC ID nº: 18, que corresponde a la combinación de la secuencia SEC ID nº: 14 y de la secuencia SEC ID nº: 7, a saber, la siguiente secuencia:
- - la secuencia SEC ID nº: 19, que corresponde a la combinación de la secuencia SEC ID nº: 14 y de la secuencia SEC ID nº: 9, a saber, la siguiente secuencia:
- en la que X_{1} representa D o E, y X_{2} representa H o D,
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- la secuencia SEC ID nº: 20, que corresponde a la combinación de la secuencia SEC ID nº: 14 y de la secuencia SEC ID nº: 10, a saber, la siguiente secuencia:
- en la que X_{1} representa D o E, y X_{2} representa H o D,
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- la secuencia SEC ID nº: 21, que corresponde a la combinación de la secuencia SEC ID nº: 14 y de la secuencia SEC ID nº: 11, a saber, la siguiente secuencia:
- en la que X_{1} representa D o E, y X_{2} representa H o D,
\newpage
- -
- la secuencia SEC ID nº: 22, que corresponde a la combinación de la secuencia SEC ID nº: 14 y de la secuencia SEC ID nº: 12, a saber, la siguiente secuencia:
- en la que X_{1} representa D o E, y X_{2} representa H o D,
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- la secuencia SEC ID nº: 23, que corresponde a la combinación de la secuencia SEC ID nº: 14 y de la secuencia SEC ID nº: 13, a saber, la siguiente secuencia:
- en la que X_{1} representa D o E, y X_{2} representa H o D.
9. Proteínas derivadas de la proteína MabA según
una de las reivindicaciones 1 a 6, que presentan una secuencia GSH
en N-terminal, a saber, las siguientes
secuencias:
- -
- la secuencia SEC ID nº: 24 siguiente, que corresponde a la combinación de la secuencia GSH y de la secuencia SEC ID nº: 1,
- -
- la secuencia SEC ID nº: 25 siguiente, que corresponde a la combinación de la secuencia GSH y de la secuencia SEC ID nº: 3,
\newpage
- -
- la secuencia SEC ID nº: 26 siguiente, que corresponde a la combinación de la secuencia GSH y de la secuencia SEC ID nº: 5,
- -
- la secuencia SEC ID nº: 27 siguiente, que corresponde a la combinación de la secuencia GSH y de la secuencia SEC ID nº: 7,
- -
- la secuencia SEC ID nº: 28 siguiente, que corresponde a la combinación de la secuencia GSH y de la secuencia SEC ID nº: 9,
- en la que X_{1} representa D o E, y X_{2} representa H o D,
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- la secuencia SEC ID nº: 29 siguiente, que corresponde a la combinación de la secuencia GSH y de la secuencia SEC ID nº: 10,
- en la que X_{1} representa D o E, y X_{2} representa H o D,
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- la secuencia SEC ID nº: 30 siguiente, que corresponde a la combinación de la secuencia GSH y de la secuencia SEC ID nº: 11,
- en la que X_{1} representa D o E, y X_{2} representa H o D,
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- la secuencia SEC ID nº: 31 siguiente, que corresponde a la combinación de la secuencia GSH y de la secuencia SEC ID nº: 12,
- en la que X_{1} representa D o E, y X_{2} representa H o D,
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- la secuencia SEC ID nº: 32 siguiente, que corresponde a la combinación de la secuencia GSH y de la secuencia SEC ID nº: 13,
- en la que X_{1} representa D o E, y X_{2} representa H o D.
10. Proteínas derivadas de la proteína MabA
según una de las reivindicaciones 1 a 6, en las que se suprimen los
siete primeros aminoácidos, a saber, las siguientes secuencias:
- -
- la secuencia SEC ID nº: 33 siguiente, que corresponde a la secuencia SEC ID nº: 1, de la cual se suprimen los siete primeros aminoácidos:
- -
- la secuencia SEC ID nº: 34 siguiente, que corresponde a la secuencia SEC ID nº: 3, de la cual se suprimen los siete primeros aminoácidos:
- -
- la secuencia SEC ID nº: 35 siguiente, que corresponde a la secuencia SEC ID nº: 5, de la cual se suprimen los siete primeros aminoácidos:
- -
- la secuencia SEC ID nº: 36 siguiente, que corresponde a la secuencia SEC ID nº: 7, de la cual se suprimen los siete primeros aminoácidos:
- -
- la secuencia SEC ID nº: 37 siguiente, que corresponde a la secuencia SEC ID nº: 9, de la cual se suprimen los siete primeros aminoácidos:
- en la que X_{1} representa D o E, y X_{2} representa H o D,
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- la secuencia SEC ID nº: 38 siguiente, que corresponde a la secuencia SEC ID nº: 10, de la cual se suprimen los siete primeros aminoácidos:
- en la que X_{1} representa D o E, y X_{2} representa H o D,
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- la secuencia SEC ID nº: 39 siguiente, que corresponde a la secuencia SEC ID nº: 11, de la cual se suprimen los siete primeros aminoácidos:
- en la que X_{1} representa D o E, y X_{2} representa H o D,
\newpage
- -
- la secuencia SEC ID nº: 40 siguiente, que corresponde a la secuencia SEC ID nº: 12, de la cual se suprimen los siete primeros aminoácidos:
- en la que X_{1} representa D o E, y X_{2} representa H o D,
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- la secuencia SEC ID nº: 41 siguiente, que corresponde a la secuencia SEC ID nº: 13, de la cual se suprimen los siete primeros aminoácidos:
- en la que X_{1} representa D o E, y X_{2} representa H o D.
11. Proteínas recombinantes derivadas en forma
purificada, según una de las reivindicaciones 1 a 10, tales como las
obtenidas mediante transformación de cepas de E. coli con un
plásmido que contiene una secuencia que comprende el gen que
codifica una proteína derivada de MabA, tal como se define en una de
las reivindicaciones 1 a 10, seguido de una etapa de purificación
durante la cual:
- -
- las bacterias E. coli recombinantes mencionadas anteriormente se lavan en un tampón de lavado, y después se recogen en un tampón de lisis, y se lisan mediante un ciclo de congelación/descongelación en presencia de inhibidores de proteasas y de lisozima,
- -
- después del tratamiento mediante ADNasa I y ARNasa A, en presencia de MgCl_{2}, y centrifugación, el sobrenadante de lisis de las bacterias obtenido en la etapa anterior, al que se le añade 10% (p/p) de glicerol, o 400 \muM de NADP^{+}, se dispone en una columna de resina Ni-NTA agarosa,
- -
- después de varios lavados con 5 mM de tampón y después 50 mM de imidazol, la proteína MabA, o la proteína derivada, se eluye con el tampón de elución.
12. Proteínas recombinantes derivadas, en forma
purificada, según una de las reivindicaciones 1 a 10, tales como las
obtenidas según el procedimiento de la reivindicación 11, en el que
los distintos tampones de lavado de las bacterias, de lisis, de
lavado y de elución son los siguientes:
- -
- tampón de lavado de las bacterias: 10 mM de fosfato de potasio, pH 7,8,
- -
- tampón de lisis: 50 mM de fosfato de potasio, pH 7,8, que contiene 500 mM de NaCl, 5 mM de imidazol,
- -
- tampón de lavado: 50 mM de fosfato de potasio, pH 7,8, que contiene 500 mM de NaCl, 5 y 50 mM de imidazol,
- -
- tampón de elución: 50 mM de fosfato de potasio, pH 7,8, que contiene 500 mM de NaCl y 175 mM de imidazol.
13. Proteínas recombinantes derivadas, en forma
purificada, según una de las reivindicaciones 1 a 10, tales como las
obtenidas según el procedimiento de la reivindicación 11, en el que
los distintos tampones de lavado de las bacterias, de lisis, de
lavado y de elución son los siguientes:
- -
- tampón de lavado de las bacterias: 10 mM de Tris, pH 8,0,
- -
- tampón de lisis:
- \bullet
- 50 mM de tampón de Tris, pH 8,0, adicionado con 300 mM de LiSO_{4} y 5 mM de imidazol;
- \bullet
- o 50 mM de tampón de Tris, pH 8,0, adicionado con 300 mM de KCl y 5 mM de imidazol.
- -
- tampón de lavado:
- \bullet
- 50 mM de tampón de Tris, pH 8,0, adicionado con 300 mM de LiSO_{4} y 5 ó 50 mM de imidazol;
- \bullet
- 50 mM de tampón de Tris, pH 8,0, adicionado con 300 mM de KCl y 5 ó 50 mM de imidazol.
- -
- tampón de elución:
- \bullet
- 20 mM de tampón de MES, pH 6,4, 300 mM de LiSO_{4} y 175-750 mM de imidazol,
- \bullet
- o 20 mM de tampón de PIPES, pH 8,0, adicionado con 300 mM de KCl y 175-750 mM de imidazol.
14. Proteínas según una de las reivindicaciones
1 a 13, caracterizadas por su actividad enzimática específica
de los sustratos de tipo \beta-cetoacil de cadena
larga, especialmente entre 8 a 20 átomos de carbono, tal como
\beta-cetooctanoil-CoA, o
\beta-cetododecanoil-CoA.
15. Proteínas según una de las reivindicaciones
1 a 14, cuyas características principales de su estructura
tridimensional con una resolución de 1,6-2,0
ángstrom, demostrado mediante el análisis por difracción con rayos X
de los cristales de dichas proteínas, son tales como se representan
en la figura 1 para la proteína MabA recombinante modificada, que
corresponde a la secuencia SEC ID nº: 15, en la figura 2 para la
proteína MabA C(60)V que corresponde a la secuencia
SEC ID nº: 16, y en la figura 3 para la proteína derivada MabA
C(60)V/S(144)L que corresponde a la
secuencia SEC ID nº: 17.
16. Proteínas según una de las reivindicaciones
1 a 15, en forma cristalizada.
17. Cristales de proteínas según la
reivindicación 16, tales como los obtenidos mediante el método de
difusión de vapor en gota suspendida, mezclando dichas proteínas (1
\mul de una disolución al 10 mg/ml) con una disolución de
polietilenglicol, de CsCl (150-300 mM), y de
glicerol (al 10%) en un tampón (PIPES) con pH 6,2.
18. Cristales de proteínas según la
reivindicación 16 ó 17, tales como los obtenidos según el método de
cristalización descrito en la reivindicación 17, efectuándose dicho
método a partir de las proteínas purificadas según la reivindicación
13.
19. Cristales de la proteína MabA recombinante
que corresponde a la secuencia SEC ID nº: 15, según una de las
reivindicaciones 16 a 18, cuyas coordenadas atómicas de la
estructura tridimensional se representan en la figura 1, y que
presentan las siguientes características:
- -
- parámetro de células:
- \bullet
- a = 81,403 ángstrom, b = 116,801 ángstrom, c = 52,324 ángstrom,
- \bullet
- \alpha = \beta = 90,00º, \gamma = 122,30º,
- -
- grupo espaciador: C2
- -
- difracción máxima = 2,05 ángstrom.
20. Cristales de la proteína
C(60)V que corresponden a la secuencia SEC ID nº: 16,
según una de las reivindicaciones 16 a 18, cuyas coordenadas
atómicas de la estructura tridimensional se representan en la figura
2, y que presentan las siguientes características:
- -
- parámetro de células:
- \bullet
- a = 82,230 ángstrom, b = 118,610 ángstrom, c = 53,170 ángstrom,
- \bullet
- \alpha = \beta = 90,00º, \gamma = 122,74º,
- -
- grupo espaciador: C2,
- -
- difracción máxima = 2,6 ángstrom.
\newpage
21. Cristales de la proteína
C(60)V/S(144)L que corresponde a la
secuencia SEC ID nº: 18, según una de las reivindicaciones 16 a 18,
cuyas coordenadas atómicas de la estructura tridimensional se
representan en la figura 3, y que presentan las siguientes
características:
- -
- parámetro de células:
- \bullet
- a = 81,072 ángstrom, b = 117,022 ángstrom, c = 53,170 ángstrom,
- \bullet
- \alpha = \beta = 90,00º, \gamma = 122,42º,
- -
- grupo espaciador: C2,
- -
- difracción máxima = 1,75 ángstrom.
22. Cristales de proteínas según una de las
reivindicaciones 17 a 21, en los que dichas proteínas se lisan con
un ligando, es decir, una molécula capaz de unirse a la proteína
MabA o a las proteínas derivadas de esta última, más particularmente
a nivel de su sitio activo principalmente delimitado por los
aminoácidos situados en las posiciones 21 a 28, 45 a 48, 60 a 63, 87
a 100, 112, 138 a 157, 183 a 212 y 240 a 247 de las proteínas
descritas en una de las reivindicaciones 1 a 6, o en las posiciones
41 a 48, 65 a 68, 80 a 83, 107 a 120, 132, 158 a 177, 203 a 232 y
260 a 267, de las proteínas descritas en una de las reivindicaciones
7 u 8, o en las posiciones 24 a 31, 48 a 51, 63 a 66, 90 a 103,
115, 141 a 160, 186 a 215, y 243 a 250, de las proteínas descritas
en la reivindicación 9, o en las posiciones 14 a 11, 38 a 41, 53 a
56, 80 a 93, 105, 131 a 150, 176 a 205, y 233 a 240, de las
proteínas descritas en la reivindicación 10, siendo dichos cristales
tales como se obtienen mediante inmersión o cocristalización de una
proteína recombinante derivada de la proteína MabA según una de las
reivindicaciones 1 a 16, en presencia de dicho ligando,
especialmente en las condiciones de cristalización definidas en la
reivindicación 17.
23. Secuencia nucleotídica que codifica una
proteína derivada de la proteína MabA tal como se define en una de
las reivindicaciones 1 a 16.
24. Secuencia nucleotídica recombinante que
comprende una secuencia nucleotídica que codifica una proteína
derivada de la proteína MabA según una de las reivindicaciones 1 a
16, en asociación con los elementos necesarios para la transcripción
de esta secuencia, especialmente con un promotor y un terminador de
transcripción.
25. Vector, especialmente plásmido, que contiene
una secuencia nucleotídica según la reivindicación 24.
26. Células huéspedes transformadas mediante un
vector según la reivindicación 25, eligiéndose dichas células
especialmente entre las bacterias tales como E. coli, o
cualquier otro microorganismo usado para la producción de
proteínas.
27. Procedimiento de preparación de proteínas
recombinantes derivadas de la proteína MabA, según una de las
reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque comprende las
siguientes etapas:
- -
- transformar células con la ayuda de un vector recombinante según la reivindicación 25,
- -
- cultivar células así transformadas, y recuperar dichas proteínas producidas por dichas células,
- -
- purificar dichas proteínas según el procedimiento descrito en las reivindicaciones 11 a 13.
28. Utilización de proteínas recombinantes
derivadas de la proteína MabA según una de las reivindicaciones 1 a
16, o de cristales según una de las reivindicaciones 17 a 22, para
la implementación de métodos de detección sistemática de ligandos de
la proteína MabA, y más particularmente de moléculas susceptibles de
unirse específicamente a nivel del sitio activo de la proteína MabA,
o de proteínas de estructura próxima a la de la proteína MabA, e
inhibir la actividad enzimática de ésta, seleccionándose
especialmente estos inhibidores de entre:
- -
- los derivados de esteroides,
- -
- los derivados del antibiótico antituberculoso isoniazida (hidrácido del ácido isonicotínico), tales como los derivados del aducto isonicotinoil-NAD(P),
- -
- los derivados de N-acetil cisteamina o de otros tipos de derivados simplificados de la coenzima A, comprendiendo un fluóforo injertado que permite usar el método de espectroscopia de fluorescencia, en particular resuelta en el tiempo, para la detección de interacciones proteína-ligando,
- -
- los derivados inhibidores de la proteína InhA de Mycobacterium tuberculosis.
29. Utilización según la reivindicación 28, para
la implementación de métodos de detección sistemática de ligandos de
la proteína MabA susceptibles de ser usados en composiciones
farmacéuticas, especialmente en el ámbito del tratamiento de
patologías relacionadas con infecciones micobacterianas, tales como
la tuberculosis relacionada con la infección mediante
Mycobacterium tuberculosis, o mediante Mycobacterium
africanium, o la lepra relacionada con la infección mediante
Mycobacterium leprae, o las micobacteriosis relacionadas con
la infección mediante micobaterias oportunistas, tales como
Mycobacterium avium, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium
kansasii, Mycobacterium chelonae.
30. Método de detección sistemática de ligandos
de la proteína MabA, caracterizado porque comprende las
siguientes etapas:
- -
- presentar una proteína recombinante derivada de la proteína MabA según una de las reivindicaciones 1 a 16,
- -
- detectar la eventual unión entre dicha proteína y el ligando ensayado mediante medición, después de la excitación de fluorescencia, especialmente a 300 nm, de la intensidad de fluorescencia de dicha proteína emitida entre 300 y 400 nm (que corresponde esencialmente a la emisión de fluorescencia del único triptófano W145), y comparar la intensidad de fluorescencia emitida en un ensayo sin ligando, caracterizándose la fijación de un ligando en el sitio activo MabA mediante una extinción de fluorescencia.
31. Método de detección sistemática de ligandos
inhibidores de la proteína MabA, caracterizado porque
comprende las siguientes etapas:
- -
- presentar una proteína recombinante derivada de la proteína MabA según una de las reivindicaciones 1 a 16, en un medio de reacción que comprende un sustrato, tal como un derivado \beta-cetoacil definido en la reivindicación 14, la coenzima NADPH y el ligando ensayado,
- -
- detectar un poder inhibidor potencial del ligando ensayado, midiendo la actividad enzimática de dicha proteína mediante medición de la cinética de la absorbancia, especialmente a 340 nm y, comparar la pendiente de la curva de densidad óptica en función del tiempo con la pendiente obtenida en un ensayo sin ligando.
32. Método de detección sistemática de ligandos
de la proteína MabA, caracterizado porque comprende las
siguientes etapas:
- -
- presentar una proteína recombinante derivada de la proteína MabA según una de las reivindicaciones 1 a 16, con el ligando ensayado,
- -
- analizar la estructura tridimensional del complejo formado en fase soluble entre dicha proteína y dicho ligando, especialmente mediante RMN, y mediante fluorescencia.
33. Método de detección sistemática de ligandos
de la proteína MabA, caracterizado porque comprende las
siguientes etapas:
- -
- cocristalizar el ligando ensayado y una proteína recombinante derivada de la proteína MabA según una de las reivindicaciones 1 a 16, especialmente en las condiciones de cristalización definidas en la reivindicación 17, a fin de obtener los cristales según la reivindicación 22,
- -
- o, sumergir cristales de una proteína recombinante derivada según una de las reivindicaciones 17 a 22, en disoluciones optimizadas que contienen potenciales ligandos,
- -
- analizar la estructura tridimensional de dichos cristales, especialmente mediante difracción de rayos X (con vista a seleccionar los ligandos que tienen una capacidad óptima de ocupación y de bloqueo del sitio activo de dichas proteínas).
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