DE60304835T2

DE60304835T2 - Ein herpes simplex virus komplex

Info

Publication number: DE60304835T2
Application number: DE60304835T
Authority: DE
Inventors: Crusade Laboratories Limited Susanne Moira Glasgow BROWN; Crusade Laboratories Limited Joe Glasgow CONNER
Original assignee: Crusade Laboratories Ltd
Current assignee: Crusade Laboratories Ltd
Priority date: 2002-02-12
Filing date: 2003-02-12
Publication date: 2006-11-30
Anticipated expiration: 2023-02-13
Also published as: GB2386895B; US7943144B2; WO2003068809A8; EP1474521B2; JP2005532039A; GB2386895A; EP1474521B1; WO2003068809A2; WO2003068809A3; GB0203285D0; AU2003245765A1; DE60304835T3; US20050271620A1; JP4509572B2; GB0303188D0; AU2003245765B2; CA2475604C; CA2475604A1; US20110244576A1; DE60304835D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Herpex-simplex-Virus-(HSV-) Komplex, einschließlich seiner Produktion und Verwendung. Insbesondere, nicht aber ausschließlich, betrifft die Erfindung einen HSV Typ I, der eine Antikörperbindungsdomäne zum Targeting von Zellen, insbesondere Krebszellen, umfasst.
HSV ist ein eingehülltes, ikosaedrisches, doppelsträngiges Virus, das Säugetiere, einschließlich Menschen, infiziert. Wildtyp-HSV infiziert und repliziert in sowohl terminal differenzierte(n) Zellen als auch sich teilende(n) Zellen. Wildtyp-HSV ist neurovirulent und tritt in das periphere Nervensystem ein, wo eine aktive Virusreplikation unterdrückt wird, und das Virus persistiert latent in Neuronen. HSV kann aus dem latenten Zustand reaktiviert werden und infektiöse Läsionen verursachen. Es wird angenommen, dass das HSV-Neurovirulenzgen ICP34.5 die postmitotischen Zellen (insbesondere Neuronen) für eine Virusreplikation konditioniert (Thomson et al., Virology 172, 435–450 (1989); MacLean et al., J. Gen Virol. 72, 631–639 (1991); Harland und Brown, J. Gen Virol. 66, 1305–1321 (1985); und Taha et al., J. Gen Virol. 70, 705-716 (1989)). ICP34.5-Deletionsmutanten können nicht in terminal differenzierten Zellen replizieren, können sich teilende Zellen aber lytisch infizieren (S.M. Brown et al., 75, 2367–2377 (1994)). Der HSV-1-Mutantenstamm 1716 ist eine ICP34.5-Deletionsmutante (EP-B-0.571.410) des HSV-Typ-I-Stamms 17, der geringere Virulenz und deutlich geringere Letalität bei Mäusen aufweist, aber er repliziert in sich aktiv teilenden Gewebekulturzellen genauso effizient wie ein Wildtypvirus (A.R. Maclean et al., J. Gen Virol. 72, 631-639 (1991), S.M. Brown et al., J. Gen Virol. 75, 2367-2377 (1994)). Die Fähigkeit von ICP34.5-Deletionsmutanten, spezifisch auf sich teilende Zellen, und nicht auf postmitotische Zellen, zu zielen und diese zu lysieren, macht sie zu einem attraktiven Therapeutikum zur Behandlung von Krebs. Eine HSV-Infektion von sich rasch teilenden Krebszellen führt zum Tod der Zellen durch Lyse. Die 1716-Mutante tötet Tumorzelllinien in Gewebekulturen, und in einer Reihe von In-vivo-Krebsmodellen wurde nachgewiesen, dass das Virus eine Tumorregression induziert und die Überlebensdauer verlängert (S. Kesari, B.P. Randazzo und T. Valyi-Nagy, Lab Invest. 73, 636–648 (1995), E.A. MacKie et al., Br. J. Cancer 74, 745–752 (1996), B.P. Randazzo et al., J. Invest. Dermatol. 108, 933–937 (1997)). In klinischen Versuchen erwies sich die direkte Injektion von 1716 als wirksam bei der Behandlung von Patienten mit rekurrierenden Gliomen (R. Rampling et al., Gene Therapy 7 (10), 859–866 (2000)) und metastatischen Melanomen (R.M. MacKie, B. Stewart und S.M. Brown, The Lancet 357, 525–526 (2001)).
Bezeichnenderweise gab es in keinem der beiden Versuche Beweise für eine Ausbreitung von 1716 auf umliegendes normales Gewebe. Eine zweite HSV-1-ICP34.5-Deletionsmutante, G207, der außerdem das UL39-Gen fehlte, welches für die große Untereinheit der viralen Ribonucleotidreduktase kodiert, erwies sich ebenfalls als sicher und effektiv bei Patienten mit malignen Gliomen (J.M. Markert et al., Gene Therapy 7 (10), 867–874 (2000)).
Obwohl Stämme wie 1716 und G207, die eine beeinträchtigte Neurovirulenz aufweisen und selektiv sich teilende Zellen infizieren, großes therapeutisches Potenzial bei der Behandlung von menschlichen Malignitäten aufweisen, erwarteten die Erfinder einige Einschränkungen in Bezug auf ihre Anwendung. 1716 ist in der Lage, eine Reihe von Tumorzellen in einer Gewebekultur zu infizieren und abzutöten, aber sein in vivo zulässiger Bereich könnte stärker eingeschränkt sein. Beispielsweise wurde über keine 1716-Infektion von B- oder T-Zelllymphomen berichtet. Weiters könnte das Virus Tumorzellen in vivo weniger effizient infizieren als in einer Zellkultur. Den Erfindern war klar, dass die Überwindung bestimmter Zelltypeinschränkungen und eine Steigerung der Effizienz in Bezug auf die Infektion von Tumorzellen wünschenswert wäre, sodass modifiziertes HSV umfassender, effektiver und sicherer als In-vivo-Therapie eingesetzt werden kann.
Allgemein gesagt stellt die vorliegende Erfindung ein Mittel zur Veränderung oder Modifikation des Tropismus von HSV bereit, sodass auf eine bestimmte Gruppe von Zelltypen gezielt werden kann.
Im weitesten Sinne stellt die vorliegende Erfindung einen HSV-Komplex bereit, der ein modifiziertes HSV und ein Targeting-Mittel umfasst, das in der Lage ist, das modifizierte HSV auf einen spezifischen Zelltyp, vorzugsweise eine proliferierende Zelle wie z.B. eine Krebszelle, auszurichten. Weiters stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung des HSV-Komplexes und zur Verwendung des Komplexes bei der Behandlung von Erkrankungen wie Krebs bereit.
In einem ersten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung also einen HSV-Komplex bereit, der ein an ein Targeting-Mittel gebundenes HSV umfasst, der zum Zielen auf einen spezifischen Zelltyp in der Lage ist, wobei das Genom des HSV im terminalen Abschnitt von R_L innerhalb von BamH1 s(0–0,02 und 0,81–0,83 mu) modifiziert ist.
Das Targeting-Mittel ist geeigneterweise ein Antikörper oder eine Komponente eines Antikörpers, z.B. eine Antikörperbindungsdomäne. Der Antikörper ist vorzugsweise in der Lage, sich spezifisch an ein Zelloberflächenprotein des Zelltyps, auf den es gerichtet ist, zu binden. Dies ist nachstehend erläutert. Das Targeting-Mittel ist vorzugsweise über ein Virushüllprotein an das modifizierte Virus gebunden, sodass es auf der Oberfläche des Virus präsentiert ist. Ein bequemer Weg, um dies zu erreichen, besteht in der Bildung eines Fusionsproteins, welches das Targeting-Mittel und ein Virushüllprotein, wie z.B. ein Glykoprotein, umfasst. Alternativ dazu kann das Targeting-Mittel auch mithilfe von chemischen Mitteln, z.B. kovalent, oder eines Bindemittels, wie z.B. Avidin/Streptavidin und Biotin, an das Viruspartikel gebunden sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird für das Targeting-Mittel kodierende Nucleinsäure in das Virusgenom inkorporiert, sodass es als Fusionsprotein mit einem Virushüllprotein, z.B. einem Glykoprotein, exprimiert und als Ergebnis auf der Oberfläche des Partikels präsentiert wird.
Somit stellt die Erfindung ein HSV bereit, das in der Lage ist, auf einen spezifischen Zelltyp zu zielen, wobei dem HSV ein exprimierbares γ34.5-Gen fehlt, sodass Neurovirulenz fehlt, und worin das HSV ein Targeting-Mittel exprimiert.
Da eine Antikörperbindungsdomäne eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung darstellt, konzentriert sich die folgende Beschreibung auf die Verwendung von Anti körpern. Für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung ist jedoch offensichtlich, dass auch andere Targeting-Mittel eingesetzt werden können, wie beispielsweise Mitglieder eines spezifischen Bindungspaars, wie z.B. ein Rezeptor und sein Ligand.
Der Antikörper oder die Antikörperkomponente, der/die in die Virushülle inkorporiert ist, wirkt sich auf die Selektivität des Virus aus, indem er/sie die Effizienz der Virusinfektion eines bestimmten Zelltyps oder bestimmter Zelltypen steigert. Der HSV-Infektionsprozess wird durch Kontakt zwischen Glykoproteinen der Virushülle und Glykoproteinen der Target-Zellmembran initiiert. In der vorliegenden Erfindung werden Antikörper mit spezifischer Affinität für Membranproteine des gewählten Zelltyps in die HSV-Virushülle inkorporiert, wodurch die Affinität des HSV für die Oberfläche der gewählten Target-Zelle durch die zusätzliche Wechselwirkung zwischen dem Antikörper und dem Zelloberflächenprotein erhöht wird. Die Bindung der Antikörperbindungsdomäne an ihr Target-Antigen auf der Zelloberfläche bringt sowohl Virionen als auch Zellmembranen näher und ermöglicht es den Virushüllglykoproteinen, eine Fusion der Membranen zu initiieren, was zur Penetration in die Zelle führt.
Die HSV-1-Virionhülle enthält zumindest 10 wesentliche Membranglykoproteine, von denen einige den Eintritt in Säugetierzellen vermitteln. Die anfänglichen Wechselwirkungen zwischen dem Virus und der Zelle finden zwischen den viralen Glykoproteinen gB und/oder gC und den Zelloberflächen-Heparansulfatproteoglykanen statt, aber diese Wechselwirkung reicht für eine Viruspenetration nicht aus. Eine Fusion der Virus- und Zellmembranen erfordert gD, gB und einen gH/gL-Komplex, und diese Proteine wirken wahrscheinlich zusammen. Der spezifische rezeptorvermittelte Eintritt von HSV-1 umfasst eine Wechselwirkung von gD mit HVEM/HveA (Herpes-Virus-Eintrittsvermittler A), einem Lymphotoxinrezeptor und einem Mitglied der TNF-Rezeptorfamilie. Die Expression von HveA in CHO-Zellen, die normalerweise widerstandsfähig gegen eine Viruspenetration sind, machte diese permissiv. Unter Einsatz von nichtpermissiven CHO-Zellen wurden noch einige andere Rezeptoren identifiziert, einschließlich der mit dem Poliovirus-Rezeptor verwandten Proteine 1 und 2, die nun als HvecC bzw. HvecB umbenannt wurden. Für diese Arbeit konnten die Er finder eine Zelllinie, die normalerweise resistent gegen eine Infektion ist, für den Eintritt von HSV-1 permissiv machen.
Die vorliegende Erfindung nutzt ein HSV, das eine eingeschränkte Fähigkeit aufweist, terminal differenzierte, sich nicht teilende Zellen zu infizieren, darin zu replizieren oder diese zu lysieren. In dieser Form ist das Virus besonders gut zur Verwendung als Therapeutikum zur Behandlung von Erkrankungen im Zusammenhang mit proliferierenden Zellen, wie beispielsweise Krebs und Nichtkrebserkrankungen, wie z.B. die Crohn-Krankheit, geeignet. Die Erfinder sind der Ansicht, dass das modifizierte Virus gemäß der vorliegenden Erfindung insbesondere gut zum Zielen auf proliferierende T-Zellen in Krebs- und Nichtkrebssituationen geeignet ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform wurde das HSV so modifiziert, dass das für ICP 34.5 kodierende Gen (Gen γ34.5) nicht in der Lage ist, ein funktionelles Genprodukt zu exprimieren.
Das modifizierte Virus enthält vorzugsweise eine Modifikation in Bezug auf das Wildtypvirus innerhalb der Bam-HI-s-Region der internen Wiederholung R_L (0,81–0,83 mu) und innerhalb der Gegenstückregion des terminalen R_L (0–0,2 mu), sodass dem modifizierten Virus (der Variante) Neurovirulenz fehlt.
Die Modifikation des Virusgenoms kann durch Deletion eines oder mehrerer Nucleotide, Insertion von zusätzlichen Nucleotiden oder eine beliebige andere Veränderung der Nucleotidsequenz, wie beispielsweise Umordnung oder Substitution, erreicht werden. Vorzugsweise wird die Modifikation des HSV-Genoms durch Deletion eines oder mehrerer Nucleotide erreicht.
Das HSV kann eine spontan isolierte Deletionsvariante des Wildtyps oder ein Wildtypstamm sein, in den die gewünschte Modifikation eingeführt wurde. Solche Modifikationen im HSV können durch genetische Manipulation, beispielsweise durch ortsgerichtete Mutagenese, oder durch Exzision eines Abschnitts des Genoms mit oder ohne Substitution durch eine vorbereitete DNA-Kassette erfolgen, welche die gewünschte Modifikation enthält.
Vorzugsweise ist das HSV HSV Typ I (HSV-1), noch bevorzugter HSV-1-Stamm 17. In einer Ausführungsform weist der HSV-1-Stamm eine Deletion von zumindest 100 Nucleotiden in der Bam-HI-s'-Region zwischen der Alu-I-Stelle bei 125074 nb und 125972 nb sowie innerhalb der Gegenstücksequenz in TR_L auf.
Noch bevorzugter sind 0,5 bis 3 kb der Bam-HI-s'-Region und des Gegenstücks TR_L deletiert. Noch bevorzugter sind etwa 0,7 bis 2,5 kb deletiert.
Geeignetes modifiziertes HSV umfasst die HSV-1-Mutante 1716 oder G207. Die Produktion von HSV1716 ist in EP 571.410-B beschrieben, das durch Verweis hierin aufgenommen ist.
Außerdem ist den Erfindern klar, dass der HSV-Komplex gemäß der Erfindung zur Behandlung verschiedener Tumoren idealerweise in den Kreislauf eines Patienten verabreicht werden muss. Aber das Virus muss nicht nur die Tumorzellen finden (es kann viele verschiedene Zelltypen binden und von solchen absorbiert werden), sondern es muss sich auch gegen vorher vorhandene immunologische Abwehrmechanismen (z.B. neutralisierende Antikörper) durchsetzen, die darauf ausgerichtet sind, das Virus zu eliminieren. Vorher vorhandene immunologische Abwehrmechanismen sind ziemlich häufig, da die meisten Menschen schon vorher HSV-1 ausgesetzt waren. Davon ausgehend ist den Erfindern der vorliegenden Erfindung klar, dass Bedarf an der Entwicklung eines „Tarnkappenvirus" besteht, das einer immunologischen Detektion entgeht und spezifisch auf Tumorzellen zielen kann. Demgemäß entwickelten die Erfinder ein Tarnkappenvirus, indem sie die normalen viralen Glykoproteine auslöschten, die eine Zelladsorption vermitteln, und sie durch antikörpergerichtete, einen Eintritt vermittelnde Glykoproteine ersetzten, die in die Virionstruktur inkorporiert wurden. Die wichtigsten Virusglykoproteine, die am Zelleintritt beteiligt sind, stellen auch die wichtigsten neutralisierenden Epitope bereit, und ihre Entfernung minimiert die immunologische Aktivität gegen solch ein Virus. Somit kann ein gegen ein Tumorantigen gerichtetes HSV, z.B. HSV1716, das in den Kreislauf eingeführt wird, auf viele Tumortypen zielen, einschließlich disseminierter Krebsarten, die entweder unzugänglich oder zu zahlreich für eine direkte Injektion oder zu klein für eine Detektion sind.
Somit kann der oben beschriebene HSV-Komplex, z.B. HSV1716, der einen tumorspezifischen Targeting-Antikörper gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung aufweist, so modifiziert werden, dass die Gene, die für virale Glykoproteine kodieren, welche für einen normalen Zelleintritt wesentlich sind (z.B. hauptsächlich gD, aber auch gC und/oder gB, siehe unten), deletiert oder inaktiviert werden, wodurch das resultierende Virus von Tumorantigen/Antikörper-Wechselwirkungen als Hauptweg für Zellinfektionen abhängig gemacht wird. Die Deletion dieser Glykoproteine aus dem Viruspartikel entfernt auch die wichtigsten neutralisierenden Epitope und reduziert daher die immunologische Abwehr stark, wenn es systemisch verabreicht wird.
Deshalb kann der HSV-Komplex gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung weiter modifiziert werden, sodass ein oder mehrere virale Glykoproteine, z.B. gD, gC und/oder gB, so inaktiviert oder deletiert werden, dass sie nicht in der Lage sind, den Eintritt des Viruspartikels in Zellen zu vermitteln. Vorzugsweise sind das eine oder die mehreren Glykoproteine auf Genomebene modifiziert, sodass sie nicht exprimiert werden können oder nicht in funktioneller Form exprimiert werden können. Insbesondere bevorzugt ist das HSV-Genom so modifiziert, dass das eine oder die mehreren Glykoproteine überhaupt nicht exprimiert werden können, da dies eine HSV-Variante mit dem zusätzlichen Vorteil bereitstellt, dass sie jeglichem vorher vorhandenem immunologischem Abwehrmechanismus in vivo entkommen kann.
Wie oben erwähnt können die verschiedenen Glykoproteine im Viruspartikel modifiziert oder deletiert werden, vorzugsweise auf Nucleinsäureebene. Die Modifikation kann die Inkorporation von für das Targeting-Mittel kodierender Nucleinsäure umfassen, sodass das Targeting-Mittel auf der Oberfläche des Partikels exprimiert wird. So kann das HSV-Genom zusätzlich zum γ34.5-Gen so modifiziert werden, dass ein oder mehrere der Glykoproteine (z.B. gD, gC und/oder gB) das Targeting-Mittel exprimieren, z.B. die Antikörperbindungsdomäne.
Vorzugsweise ist der Antikörper oder die Antikörperkomponente für ein Tumoroberflächenantigen spezifisch, d.h. für ein Antigen, das auf der Oberfläche einer Tumorzelle vorkommt und mit dieser Zelle assoziiert ist, wobei dieses entweder nur auf Tumorzellen vorkommen kann oder auf Tumorzellen häufiger auftritt als auf allen Nichttumorzellen. Viele neue oder atypische Formen von normalen Proteinen werden von Tumorzellen exprimiert, und Antikörper, die gegen diese gerichtet sind, stellen Tumor-Targetingstrategien bereit. Das carcinoembryogene Antigen (CEA) ist beispielsweise ein wichtiger Marker auf vielen Tumorzellen, und manipulierte Antikörper gegen CEA wurden in klinischen Versuchen getestet (A. Mayer et al., J. Immunol. Methods 231, 261–273 (1999)). Manipulierte Antikörper, die gegen den Her2/neu-Wachstumsfaktor (Trastuzamab) und gegen CD20 (Rituximab) gerichtet sind, wurden für die Behandlung von Brustkrebs und Non-Hodgkin-Lymphomen genehmigt, P. Hollinger bzw. H. Hoogenboom, Nature Biotechnology 16, 1015 (1998). CD55 (Zerfallbeschleunigungsfaktor) wird von Tumorzellen überexprimiert, um eine Komplementaktivierung zu blockieren, und Antikörper, die gegen CD55 gerichtet sind, können therapeutisches Potenzial besitzen (L. Li et al., B. J. Cancer 84 (1), 80–86 (2001)). Die Inkorporation einer Antikörperbindungsdomäne, die spezifisch auf Tumorantigene, wie z.B. CEA, Her2, CD20 und CD55, zielt, in die Hülle von HSV bringt die Möglichkeit mit sich, seinen zellulären Tropismus zu verändern, wodurch die Infektion von nichtpermissiven Tumorzellen ermöglicht wird und möglicherweise seine Fähigkeit zur Infektion von anderen Tumorzellen verbessern wird. 1716-Virionen, die eine für CD20 spezifische Antikörperbindungsdomäne aufweisen, können beispielsweise in der Lage sein, B-Zell-Lymphome zu infizieren und abzutöten.
Außerdem infiziert HSV, z.B. HSV1716-Virionen, die Tumor-Targetingantikörper aufweisen und in denen die normalen HSV-1-Eintrittsglykoproteine deletiert: sind, nur die gewünschten Tumorzellen.
Die Antikörperbindungsdomäne kann spezifische Affinität für ein Zelloberflächenprotein aufweisen, das auf dem Zelltyp vorkommt, in dem der Tumor seinen Ursprung hat, im Falle eines Glioms wäre beispielsweise der Antikörper oder die Antikörperkomponente, der/die in die HSV-Virushülle inkorporiert ist, für ein Antigen spezifisch, das im Allgemeinen mit Gliazellen assoziiert wird. Die Spezifität des avirulenten HSV-Stamms in Bezug auf die Infektion von sich teilenden Zellen würde deshalb weiter modifiziert werden, sodass Gliazellen mehr als andere Arten von sich teilenden Zellen bevorzugt durch das Virus infiziert werden würden. Durch das Zielen auf sich teilende Gliazellen sollte das HSV Gliomzellen effizienter infizieren und lysieren als andere Zellen. Der Einsatz von Antikörpern oder Antikörperkomponenten gegen bestimmte Zelltypen kann auch genutzt werden, um den Tropismus von HSV auf Zelltypen auszuweiten, die sonst nicht effizient von HSV infiziert werden, sodass beispielsweise erwartet wird, dass Antikörper oder Antikörperkomponenten, die für ein Antigen spezifisch sind, das auf B-Zellen vorkommt, den Tropismus von HSV auf B-Zellen ausweiten würde. Antikörper oder Antikörperkomponenten mit unterschiedlichen Spezifitäten können gemeinsam in eine HSV-Virushülle aufgenommen werden. Es wäre zu erwarten, dass die Kombination dieser Spezifitäten zu einer größeren Spezifität beim Targeting auf den gewünschten Zelltyp führen würde.
Die Antikörperbindungsdomäne würde vorzugsweise an ein integrales Membranprotein in der Virushülle fusioniert werden, vorzugsweise an ein HSV-Glykoprotein. Die bevorzugten HSV-1-und HSV-2-Glykoproteine sind gB, gC und gD.
In einer bevorzugten Ausführungsform liegt die Antikörperbindungsdomäne in Form eines einkettigen variablen Fragments (scFv) vor.
In einem zweiten Aspekt umfasst die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines modifizierten HSV-Komplexes gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung, welches den Schritt des Infizierens einer Zelllinie, die das Fusionsprotein konstitutiv exprimiert, mit einem HSV, vorzugsweise einem modifizierten HSV, noch bevorzugter einem modifizierten HSV-1, umfasst.
In einem dritten Aspekt umfasst die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines modifizierten HSV-Komplexes gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung, welches den Schritt des Inkorporierens von für das Fusionsprotein kodierender DNA in das Virusgenom des modifizierten HSV umfasst.
In einem vierten Aspekt umfasst die vorliegende Erfindung die Verwendung eines modifizierten HSV-Komplexes gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung in einem medizinischen Behandlungsverfahren.
Vorzugsweise umfasst das Verfahren die Verabreichung des modifizierten HSV-Komplexes an einen Patienten, der an einer Erkrankung leidet, die mit der Proliferation von Zellen assoziiert ist, wie z.B. Krebs, worin der HSV-Komplex sich teilende Zelle selektiv lysiert.
Außerdem wird eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, die das modifizierte HSV gemäß der vorliegenden Erfindung und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die das modifizierte HSV umfassen, können intravenös oder direkt in einen Tumor oder eine infizierte Stelle injiziert werden.
Nachstehend werden Aspekte und Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung veranschaulicht, wobei auf die beiliegenden Figuren Bezug genommen wird. Für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung werden weitere Aspekte und Ausführungsformen offensichtlich sein. Alle in diesem Text angeführten Dokumente sind durch Verweis hierin aufgenommen.
1 zeigt (a) das HSV-1-Genom (wobei Karteneinheiten markiert sind) in der Prototyporientierung; und (b) eine Erweiterung von BamHI k(s + g). Die BamHI- (B) und Alu- (A) Stellen, welche die Deletion in 1714/1716 flankieren, sind markiert. Alle Koordinaten basieren auf der Nummerierung gemäß McGeoch et al. (1988). Auch die Positionen des 5'-Endes von IE1, der „a"-Sequenz, der DR₁/U_b-Grenze in der „a"- Sequenz, eines konservierten offenen 189-bp-Leserasters zwischen HSV-1 und HSV-2 (R_L ORF) und der Endpunkte der 759-bp-Delektion in 1714/1716 sind angegeben. Die Deletion erstreckt sich von der DR₁/U_b-Grenze aus, um die 107 5'-bp von R_L ORF zu entfernen.
2: Konstruktion des Vektors pEL4

a) Sequenz des 5'-99-mer-Oligonucleotids, das für eine PCR-Amplifikation von scFv-DNA und zur gleichzeitigen Insertion einer IgG-VH-Leader-Sequenz verwendet wurde. Die EcoRI-Stelle ist rot unterstrichen, und die SfiI-Stelle ist violett unterstrichen. Die Sequenz zwischen diesen beiden Stellen kodiert für die IgG-VH-Leader-Sequenz, die das exprimierte Protein auf den Sekretionsweg der Zelle ausrichten wird. Die Sequenz stromab von der SfiI-Stelle stammt von IgG-VH. Der 3'-Primer stammte von IgG-VL und insertiert eine NotI-Stelle, was eine PCR-Amplifikation von scFv-DNA mit 5'- und 3'-SfiI- bzw. -NotI-Stellen erlaubt. Nach der PCR wurde die scFv-DNA mit einem IgG-VH-Leader in die Plamid-pcDNA4A kloniert, um pEL4 zu erhalten.

3: Maßstabsgetreue Darstellung von durch PCR geschaffenen N-terminalen Deletionen von HSV-1-gC. Das gC-Protein voller Länge ist oben dargestellt, wobei das Signalpeptid (sp) und die Transmembrandomäne (tm) angegeben sind. Die darunter dargestellten 14-gC-Deletionen sind nach der Aminosäure an ihrem neuen N-Terminus bezeichnet. So sind in Δ164gC 163 Aminosäuren am N-Terminus deletiert, um ein gC-Fragment zu erhalten, das den Aminosäuren 164–511 entspricht.
4: 1% Agarosegel, das eine PCR-Amplifikation von sequentiell deletierten gC-DNAs zeigt (Spuren 1–14). M = DNA-Leiter, wobei die Position der 200-bp- und 1000-bp-Banden angegeben sind. Ein gemeinsamer 3'-PCR-Primer, der dem C-Terminus von gC aber ohne Stoppcodons entspricht, insertiert eine XbaI-Stelle und ermöglicht eine Klonierung im Leseraster mit dem Vektor myc und 6-his-Markierungen. Die eingesetzten 5'-Primer wurden zufällig aus der für gC kodierenden Sequenz ausgewählt, um sequentielle Deletionen von 6 bis 90 Nucleotiden zu erhalten. Der 5'-Primer insertiert eine NotI-Restriktionsstelle, die es der gC-DNA erlaubt, im gleichen Leseraster mit der scFv-DNA in pEL4 kloniert zu werden. NotI/XbaI-verdaute, PCR-amplifizierte DNAs wurden in pEL4 kloniert, das ebenfalls mit diesen Enzymen verdaut wurde, um scFv/gC-Fusionsprotein-Expressionskonstrukte zu erhalten.
5: Western-Blots, welche die Expression von scFv/gC-Fusionsproteinen in Ganzzellenextrakten und ihre Inkorporation in HSV1716-Viruspartikel zeigen. Die Spuren 5–8, 9–11, 16 und 17 sind Ganzzellenextrakte. Die Spuren 1–4, 12–15 und 18 sind Viruspräparate. Spuren 1 und 5 = Δ193gC, Spuren 2 und 6 = Δ 215gC, Spuren 3 und 7 = Δ251gC, Spuren 4 und 8 = Δ328gC, Spuren 9 und 13 = Δ410gC, Spuren 10 und 14 = Δ424gC, Spuren 11 und 15 = Δ362gC, Spur 12 = Δ 457gC, Spuren 16-18 = Δ227gC. Spuren 19 und 20 zeigen Mock-Viruspräparate aus Zelllinien, die Δ227gC bzw. Δ424gC exprimieren, und in diesen Proben wurden keine Banden detektiert. Es gilt anzumerken, dass die Δ251gC exprimierende Zelllinie eine starke Bande im Zellextrakt ergibt (Spur 7), im Viruspräparat aber nur eine schwache Bande aufweist (Spur 3). Im Gegensatz dazu wird Δ328gC in der Zelllinie mittelstark exprimiert, ergibt im Viruspräparat aber eine starke Bande. Die Gesamtergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefasst.
Beispiel 1 – Verfahren zur Herstellung von HSV-1-1716-Stämmen, worin Fusionsproteine zwischen Antitumor-scFvs und Hüllglykoproteinen B, C und D in die Virionhülle inkorporiert werden
Rekombinante scFv-Varianten von monoklonalen Antikörper, die unterschiedliche extrazelluläre Epitope von CD55 binden, werden durch Standardprotokolle erhalten (siehe A.R. Pope, M.J. Embleton und R. Mernaugh, in: Antibody Engineering, 1–40, McCafferty, Hoogenboom und Chiswell (Hrsg.), Practical Approach Series, Oxford University Press Inc., Oxford (1996)). scFv sind besonders gut für die Inkorporation in das Fusionsprotein geeignet, weil für sie eine einzelne Nucleotidsequenz kodiert. scFv kann leicht unter Einsatz von Antikörper-Rekombinationsverfahren (H.R. Hoo genboom und Chames, P. Immunology Today 21 (8), 371–377 (2000)) hergestellt werden. Rekombinante Antikörper werden hauptsächlich unter Verwendung von mRNA hergestellt, die aus Hybridomen oder Populationen von Lymphozyten isoliert wurde, die entweder aus der Milz von immunisierten Tieren oder aus menschlichem peripherem Blut isoliert wurden. DNA-Fragmente, die für Bindungsstellen von schweren (V_H) und leichten (V_L) Immunglobulinketten kodieren, werden separat durch RT-PCR amplifiziert und fusioniert, um Fragmente herzustellen, die für Einketten-Antikörpermoleküle (die scFv) kodieren. Das scFv-Polypeptid erschafft die Antigen-Erkennungsstelle wirksam neu in einem einzelnen Protein, das eine Bindung mit hoher Affinität beibehält. Das klonierte scFv kann leicht genetisch mit den Domänen von anderen Proteinen fusioniert werden, beispielsweise mit dem M13-gIII-Hüllprotein zur Präsentation auf Phagen oder mit der Enzymcarboxypeptidase G2 für eine antigengerichtete Enzym-Prodrug-Therapie (ADEPT).
Nach der RT-PCR-Klonierung, Sequenzierung und Bindung der Antikörper-VH und -VL für die einzelnen monoklonalen Antikörper werden die für scFv kodierenden DNAs unter Einsatz von PCR-Primern amplifiziert, die SfiI- und NotI-Restriktionsenzymstellen am 5'- bzw. 3'-Ende inkorporieren, und zwar zur Klonierung in den Phagemidvektor pHEN2 oder zur Konstruktion von Fusionsproteinen. Die Wahl der Restriktionsenzymstellen hängt von der Sequenz des scFv und der Glykoproteine ab, die eingesetzt werden. E.-coli-HB2151 wird mit den Phagemidvektoren und scFvs transformiert, die durch IPTG-Induktion exprimiert werden. Aus pHEN2 exprimierte scFv weisen c-myc- und 6-his-Markierungen für eine Reinigung/Detektion auf. Die Reaktivität der rekombinanten scFv wird durch Western-Blotting und FACS-Analysen unter Einsatz von CHO-Zellen, die stabil mit Plasmid transfiziert wurden, welches ihre Target-Antigene exprimiert, mit ihren jeweiligen monoklonalen Gegenstücken verglichen.
DNA, die für ein scFv mit einer IgG-VH-Leader-Sequenz kodiert, wurde in die Plasmid-pCDNA4 (Invitrogen) kloniert, um den Vektor pEL4 zu schaffen (2). Der 5'-Primer, der zur Amplifikation der scFv-DNA verwendet wurde, inkorporiert eine IgG-VH-Leader-Sequenz, die durch eine SfiI-Stelle an die scFv-DNA gebunden ist. Der Primer insertiert außerdem eine EcoRI-Stelle 5' zur IgG-VH-Leader-Sequenz. Die scFv-DNA kann entfernt und durch SfiI/NotI-Verdauung durch alternative scFv-DNAs ersetzt werden. Die Leader-Sequenz kann durch EcoRI/SfiI-Verdauung entfernt und durch andere Leader-Sequenzen, z.B. gC-Signalpeptidsequenzen, ersetzt werden. Solche Leader-Sequenzen mit EcoRI/SfiI-Restriktionsstellen können entweder durch PCR unter Einsatz geeigneter Primer oder durch die Verwendung von chemisch synthetisierten komplementären Oligonucleotiden erhalten werden.
Eine Reihe von HSV-1-Stamm-17⁺-gB-, -gC- und -gD-DNA-Fragmenten werden aus dem Virusgenom unter Einsatz von Verfahren PCR-kloniert, die sich schon vorher bei anderen Herpes-Virus-Proteinen als erfolgreich herausgestellt haben (Y. Sun und J. Conner, The U28 ORF of human herpesvirus-7 does not encode a functional ribonuceotide reductase R1 subunit, Journal of General Virology 80, 2713–2718 (1999); Y. Sun und J. Conner, Characterisation of hetero-subunit complexes formed by herpex simplex type 1 and equine herpes virus type 4 ribonucleotide reductase R1 and R2 subunits, Biochem. J. 347, Nr. 1, 97–104 (2000); durch Verweis hierin aufgenommen). Die Primer, die zur Amplifikation der DNAs eingesetzt werden, inkorporieren geeigneten Restriktionsenzymstellen zur Fusion an die scFv-DNA und Klonierung in pEL4. PCR-Primer zur Amplifikation von Glykoprotein-DNA wird so entworfen, dass eine Reihe von zufälligen, sequentiell deletierten, N-terminal trunkierten Proteinen exprimiert wird, wobei jede Deletion etwa 2–30 Aminosäuren bis zur Region entfernt, die für die Transmembrandomäne kodiert. Beispielsweise umfasst gC 511 Aminosäuren, wobei sich die Transmembranregion stromab von der Aminosäure 479 befindet, eine Familie von 14 sequentiell deletierten N-terminal trunkierten Polypeptiden (3) für die Fusion an scFvs wurde kloniert. Beispiele für PCR-amplifizierte gC-DNAs sind in 4 dargestellt. Die für die PCR-Amplifikation der gC-DNA-Fragmente verwendeten Primer inkorporierten NotI- und SbaI-Stellen am 5' bzw. 3'-Ende. PCR-amplifizierte DNA wurde direkt mit den geeigneten Enzymen (d.h. NotI/XbaI für gC-Fragmente) verdaut und in pEL4 kloniert, das auch mit diesen Enzymen verdaut worden war. Die resultierenden Konstrukte exprimieren scFv/gC-Fusionsproteine mit C-terminalen myc- und 6-his-Markierungen, und zwar unter Kontrolle des CMV-IE-Promotors. Der Promotor und die Markierungen werden durch das pCDNA4-Rückgrat von pEL4 bereitgestellt, ebenso wird ein Zeocin-Resistenzgen bereitgestellt, das die Produktion von stabilen Zelllinien unter Einsatz von Antibiotikaselektion erlaubt. DNA-Fragmente wurden auch in den PCR-Klonierungsvektor pGEM-T Easy kloniert und sequenziert, um sicherzustellen, dass keine PCR-induzierten Mutationen inkorporiert wurden.
BHK-Zellen wurden vorübergehend unter Einsatz von Lipofectamin mit den einzelnen pEL4-Konstrukten transfiziert, und nach 48 h wurde eine Zeocin-Selektion (10 μg/ml) initiiert. Zellen wurden mit Zeocin etwa 21 Tage lang selektiert, und Extrakte für Western-Blotting wurden hergestellt. Für jede Zelllinie wurde ein Polypeptid mit der geeigneten Molekülgröße für das scFv/gC-Fusionsprotein mit dem monoklonalen Anti-myc-Markierungsantikörper 9B11 (New England Biolabs) detektiert.
Beispiele für die Expression sind in 5 zu sehen, und Schätzungen für die Expressionswerte in den einzelnen Zelllinien unter Einsatz von Western-Blotting sind in Tabelle 1 dargelegt. Immunfluoreszenz unter Verwendung von 9B11 und eines Anti-Maus-IgG/FITC-Konjugats zeigte eine perinucleäre/Golgi-Lokalisierung für alle exprimierten Fusionsproteine. Die Inkorporation von scFv/Glykoprotein-Fusionsproteinen in die HSV1716-Hülle unter Verwendung von stabil transfizierten, BHK exprimierenden Zelllinien wurde durch Western-Blotting mit 9B11 analysiert. HSV1716 bei 10 pfu/Zelle wurde verwendet, um die einzelnen Zelllinien zu infizieren, und ein 24-48 h später aus dem Kulturmedium geerntetes Virus wurde durch Western-Blotting mit 9B11 analysiert. Beispiele sind in 5 dargestellt, und Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefasst. In ähnlichen Präparaten aus mock-infizierten Zellen wurden keine myc-markierten Proteine detektiert. Die meisten scFv/gC-Fusionsproteine wurden in das Virus inkorporiert (1). Einige wurden effizienter inkorporiert als andere (z.B. Δ328gC und Δ457gC werden in den jeweiligen Zelllinien mittelstark exprimiert, sind aber in ihren Viruspräparaten als starke Banden vorhanden), während die Inkorporation von anderen, die in ihrer Zelllinie stark exprimiert wurden, gering war (z.B. Δ251gC).
Rekombinante Viren, welche die geeignetsten scFv/Glykoprotein-Fusionen exprimieren, werden unter Verwendung einer Variante von 1716 hergestellt, die das grün fluoreszierende Protein (GFP) exprimiert. Die Inkorporation von scFv/Glykoprotein-Fusionen wird wie oben beschrieben bestätigt.
Beispiel 2 – Infektion von BHK-Zellen durch HSV-1, das scFv-Glykoprotein-Fusionsproteine inkorporiert
Die Fähigkeit der Viren, die eine scFv-Glykoprotein-Fusion (wie in Beispiel 1 hergestellt) inkorporieren, BHK-Zellen zu infizieren, wird durch Einschritt-Wachstumsversuche analysiert und mit 1716 vergleichen. Der Tropismus dieser scFv-Glykoprotein-Fusionsviren wird unter Verwendung von CHO-Zellen untersucht, die CD55 konstitutiv exprimieren. Die Penetration der Viren in CHO-Zellen wird mithilfe einer GFP-Reportergenanalyse bestätigt.
Ergebnisse in CHO-Zellen identifizieren die Faktoren, die eine antikörpervermittelte Virusinfektion erlauben, und rekombinante Viren werden durch Klonieren der geeigneten scFv/Glykoprotein-DNA in das Virusgenom geschaffen. Die Genome dieser Viren können durch Deletion oder Inaktivierung von Glykoproteingenen, wie z.B. gD, gC und gB, weiter modifiziert werden, beispielsweise unter Einsatz von homologer Rekombination.
Durch die Akkumulation von monoklonalen Antikörpern an tumorspezifischen Antigenen, wie z.B. CEA oder CD20, ist es dann möglich, ein Panel von onkolytischen Herpes-Viren mit verbesserttem Targeting in Bezug auf den gewählten Tumor zu konstruieren.
Tabelle 1: Expression von scFv/gC-Fusionsproteinen in Zellen und ihre Inkorporation in HSV1716. Die Expression in Zellen und die Inkorporation in das Virus wurden durch Western-Blotting bestimmt.

+++ = starke Reaktivität, ++ = mittel, + = schwach und – = nicht detektiert

Claims

HSV-Komplex, der in der Lage ist, auf einen spezifischen Zelltyp zu zielen, wobei der Komplex ein HSV, das im terminalen Abschnitt von R_L innerhalb von BamH1 s (0–0,02 und 0,81–0,83 mu) so modifiziert ist, dass Neurovirulenz fehlt, und ein Targeting-Mittel, das mit dem modifizierten HSV verbunden ist, umfasst, worin das Targeting-Mittel eine Antikörperbindungsdomäne umfasst.
HSV-Komplex nach Anspruch 1, worin die Antikörperbindungsdomäne in Form eines einkettigen variablen Fragments (ScFv) vorliegt.
HSV-Komplex nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin das Targeting-Mittel ein Antikörper ist.
HSV-Komplex nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin das Targeting-Mittel in der Lage ist, sich spezifisch an ein Zelloberflächenprotein des Zelltyps, auf den es gerichtet ist, zu binden.
HSV-Komplex nach Anspruch 4, worin das Zelloberflächenprotein ein Tumorassoziiertes Antigen ist.
HSV-Komplex nach Anspruch 5, worin das Tumor-assoziierte Antigen CEA, Her2, CD20 oder CD55 ist.
HSV-Komplex nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin das Targeting-Mittel an den modifizierten Virus über ein Virushüllprotein gebunden ist.
HSV-Komplex nach Anspruch 7, worin das Targeting-Mittel und das Virushüllprotein ein Fusionsprotein bilden.
HSV-Komplex nach Anspruch 7 oder Anspruch 8, worin das Virushüllprotein ein HSV-Glykoprotein ist.
HSV-Komplex nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin das HSV so modifiziert wurde, dass das Gen γ34.5 nicht in der Lage ist, ein funktionelles Produkt zu exprimieren.
HSV-Komplex nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin das HSV HSV-I ist.
HSV-Komplex nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin das HSV HSV-I-Stamm 17 ist.
HSV-Komplex nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin das HSV HSV1716 ist.
HSV, das in der Lage ist, auf einen spezifischen Zelltyp zu zielen, worin HSV ein exprimierbares y34.5-Gen fehlt, sodass Neurovirulenz fehlt, und worin das HSV ein Targeting-Mittel exprimiert, worin das Targeting-Mittel eine Antikörperbindungsdomäne umfasst.
HSV nach Anspruch 14, worin das Targeting-Mittel als ein Fusionsprotein mit einem viralen Glykoprotein exprimiert wird.
HSV nach Anspruch 14 oder Anspruch 15, weiters umfassend die zusätzliche Modifikation eines oder mehrerer viraler Glykoproteine.
HSV nach Anspruch 16, worin das zusätzliche eine oder die zusätzlichen mehreren viralen Glykoproteine deletiert sind.
HSV nach Anspruch 16, worin das zusätzliche eine oder die zusätzlichen mehreren viralen Glykoproteine durch Inkorporation des Targeting-Mittels modifiziert sind.
HSV nach einem der Ansprüche 16 bis 18, worin die zusätzlichen Glykoproteine gD, gC und/oder gB sind.
HSV nach einem der Anspruche 14 bis 19, worin die Antikörperbindungsdomäne in Form eines einkettigen variablen Fragments (ScFv) vorliegt.
HSV nach einem der Ansprüche 14 bis 20, worin das Targeting-Mittel ein Antikörper ist.
HSV nach einem der Ansprüche 14 bis 21, worin das Targeting-Mittel in der Lage ist, sich spezifisch an ein Zelloberflächenprotein des Zelltyps, auf den es gerichtet ist, zu binden.
HSV nach Anspruch 22, worin das Zelloberflächenprotein ein Tumor-assoziiertes Antigen ist.
HSV nach Anspruch 23, worin das Tumor-assoziierte Antigen CEA, Her2, CD20 oder CD55 ist.
HSV nach einem der Ansprüche 14 bis 24, worin das HSV HSV-I ist.
HSV nach einem der Ansprüche 14 bis 25, worin das HSV HSV-1-Stamm 17 ist.
HSV nach einem der Ansprüche 14 bis 26, worin das HSV HSV1716 ist.
Verfahren zur Herstellung eines HSV nach einem der Ansprüche 14 bis 27, die folgenden Schritte umfassend: (a) das Modifizieren des HSV-Genoms, um die Expression eines funktionellen Proteins durch γ34.5-Gen zu unterbinden; (b) das Modifizieren des HSV-Genoms durch Inkorporieren von Nucleinsäure, die für ein Targeting-Mittel kodiert, sodass das Targeting-Mittel als ein Fusionsprotein mit einem Virushüllprotein exprimiert wird, worin das Targeting-Mittel eine Antikörperbindungsdomäne umfasst; (c) das Exprimieren des modifizierten HSV in einer Zelle.
Verfahren nach Anspruch 28, worin die Antikörperbindungsdomäne in Form eines einkettigen variablen Fragments (ScFv) vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 28, worin das Targeting-Mittel ein Antikörper ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 28 bis 30, worin das Targeting-Mittel in der Lage ist, sich spezifisch an ein Zelloberflächenprotein des Zelltyps, auf den es gerichtet ist, zu binden.
Verfahren nach Anspruch 31, worin das Zelloberflächenprotein ein Tumor-assoziiertes Antigen ist.
Verfahren nach Anspruch 32, worin das Tumor-assoziierte Antigen CEA, Her2, CD20 oder CD55 ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 28 bis 33, worin das Targeting-Mittel über ein Virushüllprotein an das modifizierte Virus gebunden ist.
Verfahren nach Anspruch 34, worin das Targeting-Mittel und das Virushüllprotein ein Fusionsprotein bilden.
Verfahren nach Anspruch 34 oder Anspruch 35, worin das Virushüllprotein ein HSV-Glykoprotein ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 28 bis 36, worin das HSV HSV-1 ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 28 bis 37, worin das HSV HSV-I-Stamm 17 ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 28 bis 38, worin das HSV HSV1716 ist.
HSV-Komplex nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Verwendung in einem Verfahren medizinischer Behandlung.
HSV nach einem der Ansprüche 14 bis 27 zur Verwendung in einem Verfahren medizinischer Behandlung.
Verwendung eines HSV-Komplexes nach einem der Ansprüche 1 bis 13 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Erkrankung, die mit der Proliferation von Zellen assoziiert ist.
Verwendung eines HSV nach einem der Ansprüche 14 bis 27 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Erkrankung, die mit der Proliferation von Zellen assoziiert ist.
Verwendung nach Anspruch 42 oder Anspruch 43, worin die Erkrankung Krebs ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen HSV-Komplex nach einem der Ansprüche 1 bis 13 oder ein HSV nach einem der Ansprüche 14 bis 27 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.