DE60225310T2

DE60225310T2 - Differenzierung vom gesamten knochenmark

Info

Publication number: DE60225310T2
Application number: DE60225310T
Authority: DE
Inventors: John S. Los Angeles YU; Peter Los Angeles KABOS; Moneeb Nashville EHTESHAM
Original assignee: Cedars Sinai Medical Center
Current assignee: Cedars Sinai Medical Center
Priority date: 2001-10-25
Filing date: 2002-10-18
Publication date: 2009-03-12
Anticipated expiration: 2022-10-19
Also published as: DE60225310D1; WO2003035855A1; EP1438393A1; EP1956079A1; US20030082160A1; ATE387491T1; ATE513901T1; US20060148083A1; US20060205074A1; EP1438393B1; US8071366B2; EP1956079B1; US20060148082A1; US7504100B2; JP2008099709A; US20060029580A1; JP2005531279A; US7129034B2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung richten sich auf ein Verfahren zum Erzeugen eines klinisch signifikanten Volumens von neuralen Vorläuferzellen von Gesamtknochenmark von Säugern. Weitere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung richten sich auf die Behandlung von neurologischen Erkrankungen unter Verwendung neuraler Vorläuferzellen, die auf diese Weise kultiviert wurden.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Nahezu jede Zelle in dem Körper eines Tieres von der neuralen über Blut bis zum Knochen verdankt ihre Existenz einer Stammzelle. Eine Stammzelle wird allgemein definiert als eine Zelle, die (i) in der Lage ist, sich zu erneuern, und (ii) über eine asymmetrische Zellteilung zu mehr als einen Typ einer Zelle führen kann (d. h. eine differenzierte Zelle). Siehe hierzu F. M. Watt und B. L. Hogan, "Out of Eden: Stem Cells and Their Niches," Science, 284, 1427–1430 (2000). Stammzellen führen zu einem Typ von einer Stammzelle, die als Vorläuferzelle bezeichnet wird, und Vorläuferzellen wiederum vermehren sich zu differenzierten Zellen, die den Körper besiedeln.
Auf dem Fachgebiet wird die Entwicklung von der Stammzelle zu differenzierten Zellen verschiedener Gewebe im ganzen Körper beschrieben. Die US-P-5811301 beschreibt beispielsweise einen Prozess der Hämatopoese, der Entwicklung der verschiedenen Zellen, die das Blut ausmachen. Der Prozess beginnt mit dem, was man eine pluripotente Stammzelle bezeichnen kann, eine Zelle, die sich zu jeder Zelle eines Organismus entwickeln kann (es gibt lediglich ehre einzige Zelle, die eine größere Entwicklungsplastizität zeigt als eine pluripotente Stammzelle, das ist eine befruchtete weibliche Keimzelle, eine einzelne, totipotente Stammzelle, die bei Implantation in den Uterus einen gesamten Organismus entwickeln kann). Die pluripotente Stammzelle liefert eine myeloische Stammzelle. Bestimmte, die Reifung fordernde Polypeptide bewirken, dass sich die myeloische Stammzelle zu Präkursorzellen differenziert, die sich wiederum zu verschiedenen Vorläuferzellen differenzieren. Es sind die Vorläuferzellen, die sich zu den verschiedenen Lymphozyten, Neutrophilen, Markrophagen und anderen Zellen vermehren, die das Blutgewebe des Körpers ausmachen.
Diese Beschreibung der Hämatopoese ist selbstverständlich zu großen Teilen unvollständig: Die Biologie hat noch die komplette Entwicklungslinie all der Zellen des Bluts zu ermitteln (z. B. müssen noch all die Präkursorzellen zwischen der myeloischen Stammzelle und den Vorläuferzellen identifiziert werden, zu denen sie führen), und es muss noch exakt ermittelt werden, wie und warum sich die myeloische Zelle zu Vorläuferzellen differenziert. Ebenso ist die Hämatopoese besonders gut studiert worden, wenn auch weniger von der Entwicklung anderer Organsysteme bekannt ist. Beispielsweise beschreibt im Zusammenhang mit dem Gehirn und seiner Entwicklung die US-P-6040180 das "gegenwärtige mangelnde Verständnis der Histogenese im Verlaufe der Entwicklung des Gehirns". Die US-P-5849553 beschreibt "die auf dem Fachgebiet bestehende Unsicherheit im Zusammenhang mit dem Entwicklungspotential neuraler Leistenzellen".
Die Identifikation und Isolation von Stammzellen hat die Wissenschaftler seit Jahrzehnten umgetrieben. Bis zum heutigen Tag hat niemand eine einzelne neurale Stammzelle oder hämatopoetische Stammzelle identifiziert. Siehe F. H. Gage, "Mammalian Neutral Stem Cells," Science, 287, 1433–1488 (2000). Es bestehen zwei hauptsächliche Schwierigkeiten. Erstens, sind Stammzellen rar. Im Knochenmark, wo es beispielsweise zur Hämatopoese kommt, gibt es lediglich eine Stammzelle für jede von mehreren Milliarden Knochenmarkzellen. Siehe G. Vogel, "Can Old Cells Learn New Tricks" Science, 287, 1418–1419 (2000). Zweitens, was noch wichtiger ist, waren Wissenschaftler nicht in der Lage, Molekularmarker zu identifizieren, die für Stammzellen eindeutig sind; für den typischen Immunoassay sehen die meisten Stammzellen aus wie jede andere Zelle (ebenda). Was dieses Problem erschwert ist, dass sich undifferenzierte Stammzellen in einem Ruhezustand befinden können. Als Ergebnis können sie wenige Molekülmarker exprimieren. Siehe F. H. Gage, supra.
Eine Methode, um Stammzellen wirksam zu isolieren und sie in klinisch signifikanten Mengen zu kultivieren, wäre von immenser Bedeutung. Wissenschaftler haben bereits unter der Annahme, dass sie neurale Stammzellen enthalten, unausgereifte Neuronen von Humanföten in erwachsenen Patienten mit neurodegenerativer Erkrankung transplantiert. Die Prozedur hat die Symptome bis zu 50% in Patienten mit Parkinson-Krankheit in einer der Untersuchungen vermindert. Siehe M. Barinaga, "Fetal Neuron Grafts Pave the Way for Stem Cell Therapies," Science, 287, 1421–1422 (2000). Viele der Nachteile dieser Prozedur und einschließlich die ethischen und praktischen Schwierigkeiten der Verwendung von Material, das von Föten kommt, und der diesen innewohnenden Komplikationen der Gewinnung von Material aus erwachsenem Hirngewebe, ließen sich unter Verwendung von Kulturen isolierter Stammzellen oder Stammzellen angehen, die von erwachsenen Personen erhalten werden. Siehe D. W. Pincus et al., Ann. Neurol. 43: 576–585 (1998); C. B. Johansson et al., Exp. Cell. Res. 253: 733–736 (1999) und S. F. Pagano et al., Stem Cells 18: 295–300 (2000). Allerdings ist die effiziente und umfangreiche Erzeugung neuraler Vorläuferzellen zur Verwendung in der Behandlung neurologischer Erkrankungen eine Herausforderung gewesen.
Neuere Aussagen lassen vermuten, dass Vorläuferzellen außerhalb des Zentralnervensystems und Knochenmarkzellen im Speziellen über die Fähigkeit zur Erzeugung entweder von Neuronen oder Gliazellen in vivo verfügen. Siehe J. G. Toma et al., Nat. Cell Biol. 3: 778–783 (2001); E. Mezey et al., Science 290: 1779–1782 (2000); T. R. Brazleton et al., Science 290: 1775–1779 (2000) und M. A. Eglitis et al., Proc Natl. Acad. Sci. 94: 4080–4085 (1997). Knochenmark-Stromazellen haben gezeigt, dass sie zur Differenzierung in Neuronen und Gliazellen in vitro nach einem komplizierten und zeitaufwändigen Kultivierungsprozess in der Lage sind, der sich über mehrere Wochen erstreckt. Siehe hierzu Sanchez, Ramos et al., 2000, exp. Neurol., 164–247. Die Erzeugung von neuralen Vorläuferzellen von Gesamtknochenmark ist jedoch noch nicht veröffentlicht worden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die hiermit beschriebene Erfindung gewährt eine wirksame Methode zum Erzeugen einer klinisch signifikanten Menge neuraler Vorläuferzellen. Diese neuralen Vorläuferzellen lassen sich aus Knochenmark oder anderen geeigneten Quellen erzeugen und können zur Behandlung einer Vielzahl von Erkrankungen verwendet werden und speziell von neuropathologischen Erkrankungen. Auf Grund der Fähigkeit der nauralen Vorläuferzellen, erkranktes oder beschädigtes neurales Nervengewebe aufzuspüren und darüber hinaus die verlorene Funktion eines solchen Gewebes wieder einzusetzen, sind die Zellen der vorliegenden Erfindung besonders nützlich in der Behandlung von Erkrankungen, bei denen Nervengewebe selbst beschädigt ist.
In noch weiteren Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung von neuralen Vorläuferzellen beschrieben, die auf die Zuführung verschiedener Verbindungen zu beschädigtem oder erkranktem Nervengewebe zielen. Neurale Vorläuferzellen können dazu gebracht werden, ein Gen zu führen, das die Zellen selbst zur Abscheidung solcher Verbindungen veranlasst, oder auf andere Weise die lokale Erzeugung derartiger Verbindungen beispielsweise dadurch bewirkt, dass ein spezieller biochemischer Weg initiiert oder gefördert wird. Da die neuralen Vorläuferzellen, die diese Gene führen, erkranktes oder beschädigtes Nervengewebe aufspüren können, kann die Zuführung der speziellen Verbindung dementsprechend auf ein solches Gewebe gerichtet werden. Eine doppelte Behandlungswirkung wird erzielt, wenn die neuralen Vorläuferzellen eine verlorengegangene oder beschädigte Funktion des Nervengewebes sowohl wieder herstellen, als auch gleichzeitig die gezielte Zuführung einer therapeutischen Verbindung bewirken.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
Die vorliegende Patentschrift enthält mindestens eine in Farbe ausgeführte Zeichnung. Kopien der vorliegenden Patentschrift mit Farbzeichnung(en) werden bei Nachfrage und Zahlung der erforderlichen Gebühr durch das "Patent and Trademark Office" bereitgestellt.
1 zeigt neurale Vorläuferzellen, die aus menschlichem Knochenmark entsprechend einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erhalten wurden. 1A zeigt Zellen aus Gesamtknochenmark, die beim Aufziehen auf Poly-D-Lysin eine Monoschicht bilden, die nach vier Tagen in Kultur zu unterscheidbaren zellulären Kügelchen (Spheres) führt. 1B zeigt die Kügelchen von 1A mit einer größeren Vergrößerung, wobei die Zellen leicht aufgenommen, in Subkultur genommen und separat in Gegenwart von Wachstumsfaktoren vermehrt werden können. 1C zeigt, dass die Kügelchen, sobald sie differenziert sind, anhaften und die Zellen nach außen zu wandern beginnen (die Pfeile zeigen die migrierenden Zellen). 1D zeigt, dass die gebildeten Kügelchen sich von dem Boden ablösen und danach frei fließend bleiben.
2 ist in Farbe dargestellt und zeigt neurale Vorläuferzellen, die von menschlichem Knochenmark entsprechend einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erhalten wurden. 2A und 2B zeigen, dass Neurokügelchen (d. h. von neuralen Zellen abgeleitete Kügelchen) und von Knochenmark abgeleitete Kügelchen morphologisch nicht unterscheidbar sind. 2C und 2D zeigen, dass die Muster von Nestin-Expression (rot) sowohl in Neurokügelchen als auch in von Knochenmark abgeleiteten Kügelchen ähnlich sind. Die Kerne der Zellen erscheinen blau, da sie mit 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) gegengefärbt sind.
3 ist in Farbe ausgeführt und zeigt neurale Vorläuferzellen, die von menschlichem Knochenmark entsprechend einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erhalten wurden. 3A zeigt, dass die von Knochenmark abgeleiteten Kügelchen den ektodermalen Marker Vimentin exprimieren. Wie in 3B gezeigt ist, ist auch eine schwache Färbung auf Fibronectin in den neuralen Vorläuferzellen zu beobachten. Wie in 3C dargestellt wird, zeigen die von Knochenmark abgeleiteten Kügelchen eine starke Expression von CD90, während die Mehrzahl der Zellen in den Kügelchen, wie in 3D gezeigt ist, eine nukleäre Expression von Neurogenin 1 zeigt.
4 ist in Farbe ausgeführt und zeigt eine Differentiation von Knochenmark-derivierten Zellen in Neuronen und Glia gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. Nach dem Aufziehen auf ein Substrat in einem Medium, dem Wachstumsfaktoren fehlen, hafteten die Knochenmark-derivierten Kügelchen an und wanderten von der primären Anhaftungsstelle weg und zeigten mehrfache Morphologien, wie in 4A gezeigt wird. 4B und 4C zeigen neurale Vorläuferzellen der vorliegenden Erfindung, welche den glialen Zellmarker als gliales fibrilliäres, saures Protein (GFAP) nach acht bzw. neun Tagen Differentiation exprimieren (zelluläre Nuclei gegengefärbt mit DAPI). Die 4D und 4E zeigen neurale Vorläuferzellen der vorliegenden Erfindung, welche den neuronalen Marker Neuron Specific Enolase (NSE) nach acht Tagen der Differenzierung exprimieren (zellulärer Nuclei gegengefärbt mit DAPI). Vereinzelte Zellen exprimieren auch den letzteren neuronalen Marker MAP2, wie in 4F gezeigt wird. Nach Transplantation der von Knochenmark derivierten Kügelchen in den Hippocampus eines syngenetischen Tieres wurden Zellen gefunden, die NeuN exprimieren, wie in 4G gezeigt wird. Einige dieser Zellen scheinen in die Hippocampus-Struktur integriert zu sein, wie in 4H gezeigt wird. Die 41, 4J und 4K zeigen eine ähnliche Differentiation der von Knochenmark derivierten Zellen mit für die Immunozytochemie verwendeten alternierenden Antikörper. 4I zeigt die Verwendung des Oligodendrozyten-Markers CNPase (1:400 Sigma) bei einer 40-fachen Vergrößerung, während 4J und 4K die Verwendung des neuronalen Markers NF200 (1:100 Chemicon) in einer Vergrößerung von 20-fach bzw. 40-fach zeigen.
5 ist in Farbe ausgeführt und zeigt einen Gentransfer zu neuralen Vorläuferzellen unter Verwendung eines β-Galactosidase-Gens-führenden replikationsdefizienten adenoviralen Vektor entsprechend einer Ausführungsform der Erfindung.
6 ist in Farbe ausgeführt und zeigt neurale Vorläuferzellen infiziert mit grünem fluoreszentem Protein(GFP)-führenden doppelten Herpes simplex-Virus Typ I entsprechend einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
7 ist in Farbe ausgeführt und zeigt Neurokügelchen, die aus einer primären fatalen Hirnkultur entsprechend einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erzeugt sind. 7A zeigt neurale Vorläuferzellen, die zu kugelförmigen Aggregaten aufgezogen wurden. 7B zeigt eine Nestin-Expression mit Hilfe dieser Neurokügelchen (Nuclei gegengefärbt mit DAPI). Neuronen exprimierten β-III-Tubulin, Astrozyten exprimierten GFAP und Oligodendrozyten exprimierten CNPase (7C, 7D bzw. 7E). 7F zeigt eine Expression von β-Galactosidase durch neuronale Vorläuferzellen infiziert in vitro mit AdLacZ. Die Vergrößerungen für die 7B, 7C, 7D und 7E betragen 400-fach und für die 7A und 7F 100-fach.
8 ist in Farbe ausgeführt und zeigt eine intraarterielle Zuführung von neuronalen Vorläuferzellen in eine experimentell induzierte, ischämische Läsion entsprechend einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. Die einzelnen Zellen sind über das Gehirngewebe weit verbreitet (8A). Transplantierte Zellen zeigen Tropismus bei verletzten basalen Ganglien (8B mit 400facher Vergrößerung).
9 ist in Farbe ausgeführt und zeigt neurale Vorläuferzellen, die in vivo entsprechend einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung Tumorzellen aufspüren. 9A zeigt eine dünne Auskeimung von Tumorzellen tief in angrenzendes normales Hirn hinein. 9B zeigt eine direkte Ausdehnung von Tumormasse in angrenzendes Gewebe hinein. 9C zeigt eine Migration von Gliomzellen weg von dem primären Tumorbett zusammen mit der Spur einer weißen Substanz. 9D zeigt unabhängig von der Haupttumormasse einen Tumor-Mikrosatellit. 9E zeigt eine hochauflösende Mikrophotographie des in 9D abgebildeten Mikrosatelliten und zeigt ferner β-Galactose-positive neurale Vorläuferzellen gemischt mit Tumorzellen. 9F zeigt eine Inokulation von neuralen Vorläuferzellen (linke Seite) und eine Tumormasse (rechte Seite) in die hinein neurale Vorläuferzellen von der gegenüberliegenden Hemisphäre (eingefügtes Kästchen) migrierten. Neurale Vorläuferzellen erscheinen blau (exprimieren β-Galactosidase), während Tumorzellen rot erscheinen (hyperzelluläre Bereiche, intensiv gefärbt mit Neutralrot). "T" stellt Tumormasse dar, Auskeimungen und Mikrosatelliten. Die Pfeile zeigen sich ausbreitende neurale Vorläuferzellen, die dicht migrierenden Tumortaschen folgen.
10 ist in Farbe ausgeführt und zeigt eine intratumorale CD4+- und CD8+-T-Zellen-Infiltration entsprechend einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. 10A zeigt eine Analyse der Durchflusszytometrie, die eine intratumorale T-Zelleninfiltration im Gehirngewebe behandelt mit neuralen Vorläuferzellen zeigt, die IL-12 (linke Seite) und 3T3-IL-12 (mittleres Feld) ausscheiden und ein vergleichsweises Fehlen von Infiltration in Gewebe, das mit neuralen Vorläuferzellen behandelt wurde, die LacZ (rechte Seite) ausscheiden. Eine CD4+ (linke Seite) und CD8+ (rechte Seite)-intratumorale Infiltration ist in Gewebe dargestellt, das mit neuralen Vorläuferzellen behandelt wurde, die 3T3-IL-12, LacZ und IL-12 ausscheiden (10B, 10C bzw. 10D). Aggregate, die entlang der Grenze Tumor/Normalgewebe in mit neuralen Vorläuferzellen behandeltem Gewebe erschienen, scheiden IL-12 aus (10D, die Pfeile zeigen die Aggregate). 10E zeigt einen Vergleich einer T-Zelleninfiltration in vergleichbaren Auskeimungen aus einem primären Tumorbett für Gewebe, das mit neuralen Vorläuferzellen behandelt wurde, die IL-12 und 3Y3-IL-12 ausscheiden (10E, linke bzw. rechte Seite). "T" bezeichnet den Tumor und "N" bezeichnet normales Hirngewebe. Die Vergrößerung in den 10B, 10C und 10D beträgt 100-fach und in 10E 200-fach.
11 ist in Farbe ausgeführt und zeigt die Transplantation von neuralen, GFP-exprimierenden Vorläuferzellen in Hippocampus entsprechend einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. 11A zeigt eine Migration von transplantierten Zellen (grün). 11B zeigt einzelne Zellen, die NSE (rot) und GFP zusammen mit NSE (gelb) exprimieren. Transplantierte Zellen wurden auf NSE angefärbt und zeigten GFP (grün), NSE (rot) und des verschmolzenen Bildes von grünem fluoreszenten Protein (GFP) und NSE (grün und rot) (11C, 11D bzw. 11E). Die Vergrößerung für 11A ist 100-fach, für 11B 630-fach und für die 11C, 11D und 11E 200-fach.
12 ist in Farbe ausgeführt und zeigt neurale Vorläuferzellen, angefärbt auf LacZ, die sich in Tumorauswuchs finden, der aus der Haupttumormasse wächst, und zwar in einer 10fachen Vergrößerung (12A) und 40-fachen Vergrößerung (12B). Die Schnitte wurden mit Hämatoxylin gegengefärbt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung beruhen auf Erwachsenen-Knochenmark als eine überlebensfähige alternative Quelle für neurale Vorläuferzellen, die in therapeutischen Strategien für eine Vielzahl von neuropathologischen Erkrankungen verwendet werden können.
Entsprechend den Verfahren der vorliegenden Erfindung kann jede beliebige Population von Zellen verwendet werden, wo der Verdacht besteht, neurale Vorläuferzellen anzutreffen. Diese Populationen von Zellen können beispielsweise Knochenmark von Säugern einschließen, Gehirngewebe oder ein beliebiges geeignetes fötales Gewebe. Bevorzugt werden Zellen aus dem Knochenmark eines nichtfötalen Säugers erhalten und am Meisten bevorzugt von einem Menschen. In den US-P-6204053 B1 und 5824489 sind weitere Quellen von Zellen identifiziert, die Stammzellen enthalten können oder von denen man meint, dass sie diese enthalten, wobei alle diese Zellen entsprechend dem Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Anwendung gelangen können.
In einer der Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kann eine Masse von Zellen von einer entsprechenden Quelle geerntet oder auf andere Weise erhalten werden, wie beispielsweise von Knochenmark erwachsener Menschen. Die Masse von Zellen kann danach in Kultur aufgezogen und weiter nach Erfordernis in Subkultur genommen werden, um weitere Massen von Zellen zu erzeugen. Gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung kann jedes beliebige geeignete Kulturmedium verwendet werden, wie beispielsweise serumfreies modifiziertes Dulbecco's Eagle-Medium (DMEM)/F-12-Medium.
In das Medium der vorliegenden Erfindung können zahlreiche Medium-Anreicherungsmittel, Wachstumsfaktoren, Antibiotika und zusätzliche Verbindungen einbezogen werden. In Anreicherungsmittel können beispielsweise B27-Anreicherung und/oder N2-Anreicherung einbezogen sein (beide verfügbar bei Invitrogen Corporation); Wachstumsfaktoren, in die beispielsweise Fibroblast-Wachstumsfaktor-2 (FGF-2) einbezogen ist, epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) und/oder Leukämie inhibierender Faktor (LIF); sowie Antikörper, in die beispielsweise Penicillin und/oder Streptomycin einbezogen sein können. In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind Wachstumsfaktoren in einer Menge von etwa 15 ng/ml bis etwa 25 ng/ml einbezogen. Weitere Verbindungen, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, schließen beispielsweise Interleukin-3 (IL-3) ein, Stammzellenfaktor-1 (SCF-1), Stammzellenfaktor Sonic hedgehog (Shh) und fms-ähnliche Tyrosinkinase-3 (Flt3)-Ligand. Ohne an irgendeine Theorie gebunden sein zu wollen, wird davon ausgegangen, dass diese speziellen Verbindungen die Erzeugung von Kügelchen entsprechend den Verfahren der vorliegenden Erfindungen verstärken können. Weitere oder ergänzende Zusatzstoffe, Wachstumsfaktoren, Antibiotika und zusätzliche Verbindungen, die zur Verwendung in Verbindung mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung geeignet sind, lassen sich vom Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet mühelos erkennen, so dass diese in den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung als einbezogen gelten. In einer am Meisten bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Kulturmedium DMEM/F-12-Medium, angereichert mit B27, das zusätzlich 10 ng/ml sowohl von FGF-2 als auch EGF enthält sowie Penicillin und Streptomycin.
Nach Ablauf einer ausreichenden Zeitdauer (im Allgemeinen etwa drei bis etwa sechs Tage) können sich Cluster von neuralen Vorläuferzellen (z. B. Kügelchen) in einem Kulturmedium bilden, in das Stammzellen, die in der vorstehend beschriebenen Weise erhalten wurden, einbezogen sind. Einzelne Cluster von neuralen Vorläuferzellen können aus dem Medium entfernt und separat voneinander in Subkultur genommen werden. Eine solche Auftrennung kann in einer beliebig gewünschten Zahl wiederholt werden, um ein klinisch signifikantes Volumen von neuralen Vorläuferzellen zu erzeugen. Diese neuralen Vorläuferzellen können in der Lage sein, zu einer Vielzahl von neuralen Zellen zu differenzieren, wie beispielsweise Astrozyten, Neuronen und Oligoendroglia.
Wie hierin verwendet, ist ein "klinisch signifikantes Volumen" eine Menge von Zellen, die ausreichend ist, um in einer therapeutischen Behandlung eines Krankheitszustandes genutzt zu werden, einschließlich ein neuropathologischer Zustand. Wie hierin darüber hinaus verwendet, schließt eine "Behandlung" die Milderung einer Erkrankung ein, die Verringerung der Schwere ihrer Komplikationen, das Verhüten ihrer Manifestation, das Verhindern des Wiederauftretens, das bloße Verhindern ihrer Verschlechterung, die Abschwächung einer unerwünschten biologischen Reaktion (z. B. Entzündung), die darin einbezogen sind, oder ein therapeutisches Bemühen, eine der vorgenannten herbeizuführen, selbst dann, wenn ein solches therapeutisches Bemühen schließlich nicht erfolgreich ist, ohne insgesamt darauf beschränkt zu sein.
Die neuralen Vorläuferzellen der vorliegenden Erfindung verfingen über eine Menge von potentiellen klinischen und therapeutischen Anwendungen sowie Anwendungen in der medizinischen Forschung. Zwei mögliche therapeutische Mechanismen schließen ein: (1) Verwendung der Zellen als Zuführungsvehikel für Genprodukte, indem man den Vorteil ihrer Fähigkeit nutzt, nach Transplantation zu migrieren; und (2) Verwendung der Zellen zum Austausch von beschädigtem oder fehlendem neuralen Gewebe, wodurch die Gewebefunktion wieder hergestellt oder verbessert wird.
Wie in dem beigefügten Beispielen diskutiert wird und im Zusammenhang mit dem ersten, vorstehend angegebenen therapeutischen Mechanismus, sind die neuralen Vorläuferzellen der vorliegenden Erfindung in der Lage, erkranktes oder beschädigtes Gewebe in vivo "aufzuspüren". Die Zellen können daher verwendet werden, um die gezielte Zuführung verschiedener in der Behandlung von erkranktem oder beschädigtem Gewebe verwendbarer Verbindungen zu unterstützen. Die Zuführung derartiger Verbindungen kann erzielt werden, indem die Zellen mit einem Gen transfiziert werden, welches die Zelle beispielsweise dazu veranlasst, konstitutiv diese Verbindung selbst abzuscheiden oder einen biochemischen Weg zu unterstützen, der eine örtliche Erzeugung dieser Verbindung herbeiführt.
So können in einer der Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung neurale Vorläuferzellen mit einem speziellen Gen transfiziert oder auf andere Weise dazu veranlasst werden, dieses zu führen, wie beispielsweise mit jeder beliebigen konventionellen Vorgehensweise. Derartige Vorgehensweisen können das Einführen eines speziellen Gens in die neuralen Vorläuferzellen einschließen, wie beispielsweise ein Plasmid, oder mehr bevorzugt die Verwendung eines somatischen Zell-Gentransfers, um die Zellen unter Nutzung von viralen Vektoren zu transfizieren, die entsprechende Gensequenzen enthalten. Geeignete virale Vektoren können Expressionsvektoren auf Basis rekombinanter Adenoviren, Adeno-assoziierter Viren, Retroviren oder Lentiviren einschließen, ohne in irgendeiner Weise auf diese beschränkt zu sein, obgleich nichtvirale Vektoren alternativ verwendet werden können. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung setzt man Vektoren auf Basis von Adenovirus-Serotyp 5 ("Ad5") (verfügbar bei Quantum Biotechnology, Inc., Montreal, Quebec, Kanada) ein, um gewünschte Gensequenzen in die neuralen Vorläuferzellen der vorliegenden Erfindung einzuführen und zu exprimieren. Sobald sie dazu gebracht wurden, das gewünschte Gen zu führen, lassen sich die neuralen Vorläuferzellen in einen Säuger implantieren oder auf andere Weise verabreichen.
Unter Einsatz dieser therapeutischen Mechanismen lassen sich die neuralen Vorläuferzellen der vorliegenden Erfindung zur Behandlung einer Vielzahl pathologischer Zustände verwenden, und zwar potentiell jede beliebige Erkrankung, an der neurales Gewebe von Säugern erkrankt oder durch diese beschädigt ist bis zu dem Punkt, von dem neurale Vorläuferzellen diese aufspüren. Im Bereich der neuropathologischen Erkrankungen kann diese therapeutische Modalität in der Behandlung zahlreicher Krankheitszustände angewendet werden, von denen einige Beispiele einbezogen werden können: Gehirntumore (z. B. durch Targeting der Zuführung von Zytokinen oder anderen Mitteln, die die Immunreaktion verstärken, oder durch Targeting der Zuführung von Verbindungen, die gegenüber den Tumorzellen auf andere Weise toxisch sind); Mangeldurchblutung des Gehirns (z. B. durch Targeting der Zuführung von neuroprotektiven Substanzen, wie beispielsweise Hirn-abstammender Wachstumsfaktor (BDNF), Nervenwachstumsfaktor (NGF) und Neurotopin-3, -4 und -5 (NT-3, NT-4, NT-5)); Rückenmarksverletzung (z. B. wiederum durch Targeting der Zuführung neuroprotektiver Substanzen oder durch Targeting der Zuführung von Substanzen, die ein Neuritenwachstum einleiten, wie beispielsweise basischer Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF), insulinähnlicher Wachstumsfaktor-1 (IGF-1) und gliaderivierter neurotropher Faktor (GDNF) sowie neurodegenerative Erkrankungen, wie beispielsweise Alzheimer oder Parkinson Krankheit (z. B. wiederum durch Targeting der Zuführung von neuroprotektiven Substanzen oder Wachstumsfaktoren oder durch Targeting der Zuführung anderer neuroprotektiver Faktoren, wie beispielsweise Amyloid-Präkursorproteine oder Protease Nexin-1).
Wie in den beigefügten Beispielen in Verbindung mit dem zweiten therapeutischen Mechanismus, wie er vorstehend genannt wurde, diskutiert wird, sind die neuralen Vorläuferzellen der vorliegenden Erfindung außerdem in der Lage, Neuronen und Glia in vivo wieder herzustellen. Die Zellen können daher verwendet werden, um erkranktes oder beschädigtes Nervengewebe wieder herzustellen, wobei die Zellen auf Grund des zusätzlichen Vermögens der Zellen zum Aufspüren von erkranktem oder beschädigtem Gewebe in vivo, sobald sie verabreicht sind, sich selbst auf eine geeignete physiologische Stelle konfigurieren können, um diesen therapeutischen Mechanismus herbeizuführen.
Angesichts der Fähigkeit der neuralen Vorläuferzellen der vorliegenden Erfindung, eine verlorengegangene oder geschädigte Funktion des Nervengewebes wieder herzustellen, können diese Zellen bei der Behandlung zahlreicher neuropathologischer Zustande nützlich sein, von denen viele ähnlich sind wie die vorstehend aufgezählten. Die Zellen können beispielsweise selbst in einem Zustand, wo die Zellen nicht transfiziert worden sind oder auf andere Weise dazu veranlasst worden sind, ein spezielles Gen zu führen, in der Behandlung von Gehirntumoren, Mangeldurchblutung des Gehirns, Rückenmarksverletzung und verschiedene neurodegenerative Erkrankungen verwendet werden.
Neurale Vorläuferzellen, die faktisch transfiziert oder auf andere Weise veranlasst wurden, ein wünschenswertes Gen zu führen, können auch die in diesem Mechanismus diskutierte zusätzliche Fähigkeit der Wiederherstellung der Funktion der Nervenzelle gewähren, wodurch eine doppelte Behandlungswirkung für den Empfänger erzielt wird. Die doppelte Behandlungswirkung kann die Wiederherstellung einer verlorengegangenen oder beschädigten Zellfunktion einschließen (z. B. wie bei dem zweiten therapeutischen Mechanismus) in Verbindung mit der gezielten Zuführung einer nützlichen Verbindung zu der gleichen Region (z. B. wie bei dem ersten therapeutischen Mechanismus). Die neuralen Vorläuferzellen können daher in dem anschaulichen Fall der Behandlung eines Gehirntumors mit einem Gen transfiziert werden, welches die Abscheidung von Zytokinen auslöst (z. B. Tumornekrose-Faktor (TNF) oder Interleuhin-1 (IL-1) und können implantiert oder auf andere Weise dem Gehirn des Empfängers verabreicht werden. Sobald sie verabreicht sind, können die Zellen das durch den Tumor geschädigte Gewebe aufspüren, mindestens einen Teil der verlorengegangenen Funktion wieder herstellen, während gleichzeitig Zytokine ausgeschieden werden, die eine Immunreaktion gegen die Tumorzellen auslösen können. Diese doppelte Behandlungswirkung wird eingehender in den beigefügten Beispielen beschrieben.
In einen Säuger können neurale Vorläuferzellen, die durch die vorstehend beschriebene Kultur entwickelt wurden, implantiert oder auf andere Weise verabreicht werden, um die bereits diskutierten therapeutischen Mechanismen zu bewirken. Sobald sie implantiert oder auf andere Weise verabreicht sind, können sich diese Zellen zu einem Bereich des erkrankten Gewebes verlagern, wie beispielsweise zu Gehirntumoren, zu durch Schlaganfall beschädigtem Gewebe oder anderen neurodegenerativen Erkrankungen u. dgl., ohne auf diese beschränkt zu sein. Darüber hinaus können sich die neuralen Vorläuferzellen in vivo vervielfältigen und das erkrankte Gewebe bei seiner Ausbreitung weiter verfolgen (z. B. wenn sich der Tumor ausbreitet). Die Implantation kann mit Hilfe jeder beliebigen geeigneten Methode ausgeführt werden, die der Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet ohne übermäßige Experimentation herausfinden kann, wie beispielsweise durch Injektion, Beimpfung, Infusion, direkte operative Zuführung oder mit Hilfe einer beliebigen Kombination davon.
BEISPIELE
Bei den folgenden Beispielen handelt es sich um typische Prozeduren, die man zur Kultivierung neuraler Vorläuferzellen entsprechend dem Verfahren der vorliegenden Erfindung anwenden kann. Weitere Beispiele sind typisch für die Prozeduren, die man zur Ausführung eines Gentransfers in diese Zellen und/oder Implantation dieser Zellen in einen Patienten zur Behandlung einer neurologischen Erkrankung gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung anwenden kann. Modifikationen dieser Beispiele sind für den Fachmann auf dem Gebiet offensichtlich.
BEISPIEL 1
ISOLATION UND HERSTELLUNG NEURALER VORLÄUFERZELLEN
Gesamtknochenmark wurde aus den Oberschenkelknochen erwachsener Fisher-Ratten im Alter zwischen 16 und 24 Wochen geerntet. Es wurden Kulturen auf mit Poly-D-Lysin beschichteten 24-Multititerplatten in einer Dichte von 106 Zellen pro Mulde aufgezogen. Die Zellen wurden in serumfreiem Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium (DMEM)/F-12-Medium ergänzt mit B27 (erhalten von Gibco BRL; Gaithersburg, MD), 20 ng/ml FGF-2 und 20 ng/ml EGF (beide verfügbar bei Sigma Chemical Co.; St. Louis, MO; nachfolgend bezeichnet als "Sigma") zusammen mit Penicillin und Streptomycin (beide verfügbar bei Omega Scientific, Inc.; Tarzana, CA) kultiviert.
Nach 4 Tagen der Inkulturnahme waren zahlreiche aufschwemmende Kügelchen mit zwischen etwa 10 bis etwa 100 Zellen deutlich sichtbar getrennt von einer darunterliegenden anhaftenden Monoschicht (1A. Diese Kügelchen wurden aufgenommen und separat in Subkultur genommen (1B). Die zellularen Aggregate expandierten weiterhin und die Proliferationsgeschwindigkeit blieb sogar nach mehrfachen Dissoziationen und Passagen stabil. Zahlreiche Zellen in diesen Kügelchen wurden positiv auf Nestin getestet (2C und 2D), ein bekannter Marker für neuronale Stammzellen. U. Lendahl et al., Cell 60: 585–595 (1990).
Es wurden nach vier Tagen der Subkultur Kügelchen genommen und auf mit Laminin beschichteten 24-Multititerplatten in Medium aufgezogen, dem Wachstumsfaktoren fehlten. Die Kügelchen hafteten aneinander und Zellen an den äußeren Grenzen jedes Kügelchen begannen Prozesse zu entwickeln und wanderten von der Primärstelle der Anhaftung weg (1C). Geformte Kügelchen wurden von dem Boden der Platten abgelöst und blieben danach freifließend (1D); sie zeigten mehrfache Morphologien (4A). Neuronale Vorläuferzellen exprimierten GFAP (4B und 4C) und den frühen neuronalen Marker NeuN (4D und 4E). Zerstreute Zellen exprimierten ebenfalls den späteren neuronalen Marker MAP2 (4F). Von Knochenmark derivierte Kügelchen wurden in den Hippocampus eines syngenetischen Tieres transplantiert, und es wurden Zellen gefunden, die NeuN exprimierten (4G); einige dieser Zellen integrierten sich in die Hippocampusstruktur (4H). Die Daten wurden ebenfalls unter Nutzung anderer Antikörper für die Immunozytochemie aufgenommen, einschließlich CNPase (4I) und NF200 (4J und 4K).
Es waren "Neurokügelchen" (d. h. von Nervengewebe derivierte Zellen) und von Knochenmark deriviertes "Kügelchen" morphologisch nicht unterscheidbar (2A und 2B). Das Muster der Nestin-Expression war in Beiden ähnlich (2C und 2D), obgleich von Knochenmark deriviertes " Kügelchen" den ektodermalen Marker Vimentin (3A) exprimierten und außerdem eine schwache Anfärbung auf Fibronectin zeigten (3B). Darüber hinaus zeigten die von Knochenmark derivierten" Kügelchen" eine starke Expression von CD90 (3C), wobei die Mehrzahl der Zellen in den "Kügelchen" auch eine nukleare Expression von Neurogenin-1 zeigten (3D).
BEISPIEL 2
GENTRANSFER IN NEURALE VORLÄUFERZELLEN UNTER NUTZUNG VON REPLIKATIONSDEFIZIENTEN ADENOVIRALEN VEKTOREN
Replikationsdefiziente adenovirale Vektoren vom Typ 5, die entweder das Reportergen für β-Galactosidase oder das Gen für Zytokin IL-12 führen, wurden verwendet, um neurale Vorläuferzellen in vitro zu infizieren. 24 Stunden nach der Infektion wurde ein erfolgreicher Gentransfer unter Verwendung eines X-Gal-Anfärbens (X-Gal-Anfärbeassay-Kit, verfügbar bei Gene Therapy Systems, Inc.; San Diego, CA) auf β-Galactosidase-führende, adenoviral infizierte Vorläuferzellen und einem IL-12 "Enzyme Linked Immunosorbent Assay" (Enzymgekoppelte Immunadsorptionsbestimmung) ("ELISA"-Kit, verfügbar bei BD Pharmingen; San Diego, CA) auf IL-12-Gen-führende mit Adenovirus infizierte Vorläuferzellen bestätigt.
Ein erfolgreicher Gentransfer von β-Galactosidase wurde mit Hilfe eines positiven Anfärbens auf das X-Gal- und β-Galactosidase-erzeugte blaue Präzipitat in den β-Galactosidase-führenden, mit Adenovirus infizierten Vorläuferzellen bestätigt (5). Der erfolgreiche Gentransfer von IL-12 wurde mit Hilfe der positiven, photochromen ELISA-Reaktion im Medium bestätigt, das von den IL-12-Genführenden, mit Adenovirus infizierten Vorläuferzellen geerntet wurde (Tabelle 1). TABELLE 1: Detektion der IL-12-Sekretion durch ELISA

IL-12-Detektion durch ELISA

In vitro mit AdIL-12 infizierte Zellen >> 2ng/ml

In vitro mit AdLacZ infizierte Zellen 4 pg/ml

scheininfizierte Zellen nicht detektiert
BEISPIEL 3
GENTRANSFER IN NEURALE VORLÄUFERZELLEN UNTER NUTZUNG VON 2-FACH MUTIERTEM HERPES SIMPLEX VIRUS TYP I
Es wurde ein Herpes simplex-Virus Typ 1 für die Gene deletiert, die den latent aktivierten Transkript (LAT) codieren, sowie Gamma-34,5-Gene (virusgekennzeichnet DM33) genutzt. Das Virus enthielt das Gen für GFP unter der Kontrolle des starken LAT-Promotors und war daher in der Lage, die Expression von GFP in eine beliebige, erfolgreich infizierte Zelle zu übertragen. Dieser Vektor wurde zur Infektion neuraler Vorläuferzellen in vitro verwendet. 72 Stunden nach der Infektion wurde der erfolgreiche Gentransfer unter Betrachtung der GFP-Expression unter einem Fluoreszenslichtmikroskop bestätigt (6).
Die GFP-Expression war in neuralen Vorläuferzellen 72 Stunden nach Infektion mit DM33 sichtbar. Dieses bestätigte die Möglichkeit, Herpes simplex Typ I erfolgreich für den Gentransfer in neurale Vorläuferzellen zu nutzen.
BEISPIEL 4
NEURALE VORLÄUFERZELLEN SIND ZUR DIFFERENZIERUNG IN ASTROZYTEN, NEURONEN UND OLIGODENDROGLIA IN DER LAGE
Es wurden neurale Vorläuferzellen in vitro erneut in Kulturmedium, dem wesentliche Wachstumsfaktoren fehlten und das mit Retinoinsäure ergänzt war (ein bekannter Stimulator zur Differenzierung) erneut auf Platte genommen. Die Kulturoberflächen wurden mit Poly-D-Lysin (verfügbar bei Sigma) zur Förderung der Anhaftung von sich differenzierenden Zellen beschichtet.
Nach drei bis vier Tagen waren neurale Vorläuferzellen an der Kultoroberfläche angehaftet und differenzierten zu Astrozyten, Neuronen und Oligodendroglia. Das Vorhandensein dieser Zellen wurde speziell mit Hilfe von positivem immunozytochemischen Anfärben von Populationen für bekannte Marker aller drei Linien bestätigt. Speziell waren Astrozyten in der Kulturpopulation auf GFAP positiv; Neuronen waren auf β-III-Tubulin positiv und Oligodendroglia waren auf CNPase positiv. Dieses bestätigte die Multipotenz und die wahre Vorläufernatur der neuralen Vorläuferzellen der vorliegenden Erfindung.
BEISPIEL 5
NEURALE VORLÄUFERZELLEN SPÜREN DIE AUSBREITUNG VON GEHIRNTUMORZELLEN IN VIVO AUF
Es wurden neurale Vorläuferzellen mit replikationsdefizientem Adenovirus, welches das Gen für β-Galactosidase entsprechend der vorstehenden Beschreibung im Beispiel 2 führt, infiziert. Diese Zellen wurden sodann intratumoral in C57b1/6-Mäuse, die etablierte GL26-Gehirntumoren in ihrer rechten zerebralen Hemisphäre hatten, entsprechend transplantiert. Nach elf Tagen wurden die Mäuse euthanasiert und deren Gehirne sofort entnommen, tiefgefroren und unter Verwendung eines Kryostaten sektioniert (verfügbar bei Janis Research Company, Inc.; Wilmington, MA). Die tiefgefrorenen Sektionen wurden sodann unter Verwendung einer X-Gal-Anfärbelösung zum Nachweise des Vorhandenseins von β-Galactosidase-exprimierenden neuralen Vorläuferzellen in den Gehirntumoren angefärbt.
Neurale Vorläuferzellen waren im Inneren der Haupttumormasse deutlich sichtbar. Darüber hinaus konnten neurale Vorläuferzellen deutlich erkannt werden, wie sie Taschen von Tumorzellen aufspürten, die von der Haupttumormasse weg wanderten. Dieses demonstriert eindeutig die Fähigkeit neuraler Vorläuferzellen, Taschen von Tumorzellen aktiv zu verfolgen, die sich durch das Gehirn ausbreiten.
BEISPIEL 6
NEURALE VORLÄUFERZELLEN SPÜREN IN VIVO ISCHÄMISCHE GEHIRNVERLETZUNG AUF
Die zerebrale Mittelarterie von Wistar-Ratten wurde mit einem Fadenembolus für zwei Stunden verschlossen. Ein Abfall im Perfusionsdruck bestätigte die Wirksamkeit des Verschlusses. Es wurden neurale Vorläuferzellen mit replikationsdefizienten Adenovirus infiziert, der das Gen für β-Galactosidase entsprechend der vorstehenden Beschreibung im Beispiel 2 führte. Die Zellen wurden intrakranial entweder sofort oder zwei Stunden nach dem Verschluss der zerebralen Mittelarterie infundiert. Nach 48 Stunden wurden die Ratten euthanasiert und deren Gehirne sofort entnommen, tiefgefroren und sektioniert. Die frischen, tiefgefrorenen Sektionen wurden sodann unter Verwendung einer X-Gal-Anfärbelösung angefärbt, um das Vorhandensein von β-Galactosidase-exprimierenden neuralen Vorläuferzellen in dem Gehirn nachzuweisen.
Die neuralen Vorläuferzellen waren in den sektionierten Gehirnen eindeutig identifizierbar, was zeigt, dass diese Zellen die Blut-Hirn-Schranke mühelos durchqueren können. Die transplantierten Zellen waren im gesamten ischämischen Teil des Hirns verteilt und am Meisten als Einzelzellen, die das pathologische Gewebe infiltrierten (8). Ohne an irgendeine Theorie gebunden sein zu wollen, wird davon ausgegangen, dass dieses ein Teil der Reaktion der Zellen auf chemotaktische Stimuli sein könnte, die von dem geschädigten Gewebe ausgehen. Die Zellen konnten auch in normalen Teilen des Gehirns angetroffen werden, wobei einige Zellen in den Meninges lokalisiert waren.
BEISPIEL 7
NEURALE VORLÄUFERZELLEN LASSEN SICH AUS FÖTALEM GEHIRNGEWEBE ERZEUGEN
"Neurokügelchen" wurden aus einer primären fötalen Hirnkultur in ähnlicher Weise erzeugt, wie sie im Zusammenhang mit Knochenmark in Beispiel 1 vorstehend beschrieben wurde (d. h. es wurden Zellen in serumfreiem DMEM/F-12-Medium, angereichert mit B27, 20 ng/ml FGF-2 und 20 ng/ml EGF zusammen mit Penicillin und Streptomycin in Kultur genommen). Neurale Stammzellen wuchsen in kugelförmigen Aggregaten 2 bis 3 Tage nach der Entnahme und Inkulturnahme in Wachstumsfaktorergänzten Medien (7A). Diese "Neurokügelchen" wiesen neurale Vorläuferzellen auf, die Nestin exprimierten (7B).
Die neuralen Stammzellen wurden unter modifizierten Kurturbedingungen erneut auf Platte genommen, nachdem die Zellen zur Differenzierung angeregt wurden. Die Neuronen exprimierten β-III- Tubulin (7C), Astrozyten-exprimierten GFAP (7D) und Oligodendrozyten-exprimierten CNPase (7E). In vitro mit AdLacZ-infizierte neurale Stammzellen exprimierten β-Galactosidase (7F).
BEISPIEL 8
NEURALE VORLÄUFERZELLEN SPÜREN TUMORZELLEN IN VIVO AUF
Tumore von Glioma-führenden Mäusen, die mit neuralen Vorläuferzellen-LacZ beimpft waren, wurden mit X-Gal angefärbt und mit Neutralrot gegengefärbt. Es wurden vier unterscheidbare Muster von Tumorausbreitungen nachgewiesen und neurale Vorläuferzellen ermittelt, die in dem jeweiligen Fall migrierende Glioma aufspürten: (1) ein dünner Auswuchs von Tumorzellen tief in angrenzendes normales Hirn; (2) eine direkte Ausbreitung von Tumormasse in angrenzendes Gewebe; (3) eine Migration von Gliomazellen weg von dem primären Tumorbett entlang des Traktes der Rückenmarksubstanz und (4) von einer Haupttumormasse unabhängiger Tumor-Mikrosatellit (jeweils 9A bis 9D). Eingestreut in den Tumorzellen entsprechend der Darstellung in dem Tumor-Mikrosatellit (9D) waren β-Galactosidasepositive neurale Vorläuferzellen, was sich anhand einer hochauflösenden Mikrophotographie offenbarte (9E).
Kontralateral zu dem bestehenden Tumor wurden neurale Vorläuferzellen in die zerebrale Hemisphäre geimpft. Die Vorläuferzellen wurden in die linke zerebrale Hemisphäre eingeführt (9F, linkes Bild), zeigten jedoch eine spezifische, nicht regellose Migration in die Umgebung des Tumors in der gegenüberliegenden Hemisphäre (9F, rechtes Bild und eingefügtes Kästchen). Neurale Vorläuferzellen erscheinen blau (was auf eine Expression von β-Galactosidase hinweist), während Tumorzellen rot erscheinen (hyperzelluläre Bereiche waren intensiv mit Neutralrot angefärbt). Damit zeigen neurale Vorläuferzellen einen starken Tropismus zur Ausstreuung von Glioma in vivo.
BEISPIEL 9
NEURALE VORLÄUFERZELLEN TRANSFIZIERT MIT ZYTOKINEN INDUZIEREN EINE LOKALISIERTE IMMUNREAKTION IN VIVO
Es wurden neurale Vorläuferzellen mit Genen transfiziert, die sie zum Ausscheiden entweder von IL-12, 3T3-IL-12 oder LacZ brachten, wie vorstehend im Beispiel 2 beschrieben wurde. Diese neuralen Vorläuferzellen wurden in Glioma führende Gehirne von Ratten geimpft.
Eine Analyse der Durchflusszytometrie zeigte eine robuste intratumorale T-Zelleninfiltration in Gehirnen, die mit neuralen Vorläuferzellen geimpft wurden, die IL-12 und 3T3-IL-12 ausschieden (10A, linke bzw. mittlere Bilder). Allerdings war der Gehalt an intratumoralen T-Zellen von Gehirnen, die mit neuralen Vorläuferzellen geimpft wurden, welche LacZ ausschieden, sehr viel geringer (10A, rechtes Bild) und war mit der Infiltration vergleichbar, die sich in scheinbar transfizierten neuralen Vorläuferzellen fand sowie mit Salzlösung geimpften Glioma (Daten nicht gezeigt).
Tumore, die mit neuralen Vorläuferzellen behandelt waren, die IL-12 ausschieden, zeigten eine robuste CD4+- und CD8+-T-Zellinfiltration (10D, linke bzw. rechte Bilder), und zwar mit zahlreichen Aggregaten entlang der Grenze von Tumorgewebe/normalem Gewebe (10D). Mit neuralen Vorläuferzellen behandelte Tumore, die 3T3-IL-12 ausschieden, demonstrierten ebenfalls eine CD4+- und CD8+-T-Zellinfiltration (10B, linke bzw. rechte Bilder) mit positiven Zellen eingestreut in Tumorgewebe. Allerdings zeigten mit neuralen Vorläuferzellen behandelte Tumore, die LacZ ausschieden, eine vernachlässigbare Infiltration von Tumoren durch CD4+- oder CD8+-T-Zelle (10C, linke bzw. rechte Bilder).
In einer Vergleichsanalyse der T-Zellinfiltration in vergleichbaren Auswüchsen von einem primären Tumorbett demonstrierten Tumormikrosatelliten in mit neuralen Vorläuferzellen behandelten Gehirnen, die IL-12 ausschieden, an robuste T-Zellinfiltration, während solche in Gehirnen, die mit neuralen Vorläuferzellen behandelt wurden, die 3T3-IL-12 ausschieden, dieses nicht zeigten (10E, linke bzw. rechte Bilder).
BEISPIEL 10
NEURALE VORLÄUFERZELLEN TRANSFIZIERT MIT B-GALACTOSIDASE SPÜREN IN VIVO TUMORZELLEN AUF
Es wurden RG2-Tumorzellen (100.000 in 5 μl Medium) stereotaktisch in das Striatum von Wistar-Ratten implantiert. Zwei Tage nach der Tumorimplantation wurden 30.000 von Knochenmark derivierte Zellen infiziert mit Adenovirus, welches das β-Galactosidase-Gen führt, in die gleiche Stelle implantiert. Die immunhistoligische Analyse erfolgte 60 Tage nach der Zellimplantation. Wie in 12 gezeigt, lassen sich die auf LacZ angefärbten Zellen in dem Tumorauswuchs erkennen, der aus der Haupttumormasse auswanderte; in 12A mit 10-facher Vergrößerung und in 12B mit 40-facher Vergrößerung. Die Sektionen waren mit Hämatoxylin gegengefärbt.
Die vorstehende Beschreibung bezieht sich auf spezielle Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung. Die gegenwärtig offenbarten Ausführungsformen sind daher in jeder Hinsicht als veranschaulichend und nicht den Geltungsbereich der Erfindung einschränkend zu verstehen, die durch die beigefügten Ansprüche und weniger durch die vorstehende Beschreibung festgelegt ist.

Claims

Verfahren zum Erzeugen eines klinisch signifikanten Volumens von neuralen Vorläuferzellen, welches Verfahren umfasst: Bereitstellen einer Masse von Zellen, die aus Knochenmark eines Säugers erhalten wurden und einschließlich mindestens eine Stammzelle und Kultivieren der Masse von Zellen in einem Medium, welches Fibroblastenwachstumsfaktor-2 (FGF-2) und epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) aufweist, um ein klinisch signifikantes Volumen neuraler Vorläuferzellen zu erzeugen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Masse von Zellen aus Gesamtknochmark von Säugern erhalten wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Masse von Zellen von einem erwachsenen Säuger erhalten wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Masse von Zellen von einem Fötus erhalten wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Medium Dulbecco's modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Medium ferner ein Supplement aufweist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Supplement ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus B27, N2 und Kombinationen davon.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Medium ferner eine zusätzliche Verbindung aufweist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die zusätzliche Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: Interleukin 3 (IL-3), Stammzellenfaktor-1 (SCF-1), sonic hedgehog (Shh), fms-ähnlicher Tyrosinkinase-3 (Flt3)-Ligand, Leukämie-inhibierendem Faktor (LIF) und Kombinationen davon.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Medium ferner ein Antibiotikum aufweist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Antibiotikum ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Penicillin, Streptomycin und Kombinationen davon.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei sich Cluster von neuralen Vorläuferzellen in dem Medium entwickelt und das Verfahren ferner das Abtrennen mindestens eines Clusters von dem Medium umfasst.
Verfahren nach Anspruch 12, ferner einschließend die Subkultivierung des mindestens einen Clusters.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Subkultivieren des mindestens einen Clusters ferner das Kultivieren des mindestens einen Clusters in einem Medium umfasst, das FGF-2 und EGF aufweist.
Verwendung neuraler Vorläuferzellen, deriviert von einer Knochenmarkquelle und mit einer starken Expression des Markers CD90 in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung neuropathischer Erkrankungen.
Verwendung nach Anspruch 15, wobei die Zellen mit Hilfe des Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14 erzeugt werden.
Verwendung nach Anspruch 15, wobei die neuropathischen Erkrankungen ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Gehirntumor, Gehirn-Ischämie, Schlaganfall, Rückenmarksverletzung und neurodegenerativen Erkrankungen.
Verwendung nach Anspruch 15, wobei die Behandlung die Verabreichung eines klinisch signifikanten Volumens neuraler Vorläuferzellen umfasst.
Verwendung nach Anspruch 18, wobei das klinisch signifikante Volumen neuraler Vorläuferzellen ausreichend ist, um die neuropathologische Erkrankung zu behandeln.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, ferner umfassend zu bewirken, dass die neurale Vorläuferzelle ein Gen führt, welches die lokale Erzeugung einer biologischen Verbindung hervorruft.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei die biologische Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Cytokinen, hirnabstammendem neurotrophischem Faktor (BDNF), Nervenwachstumsfaktor (NGF), Neurotrophin-3 (NT-3), Neurotrophin-4 (NT-4) und Neurotrophin-5 (NT-5), basischem Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF), Insulin-ähnlichem Wachstumsfaktor-1 (IGF-1), Glia-deriviertem neurotrophische faktor (GDNF), Amyloid-Vorläuferproteinen, Protease-Nexin-1 und Kombinationen davon.
Verwendung einer neuralen Vorläuferzelle, hergestellt nach dem Verfahren nach Anspruch 20 oder 21 und deriviert von einer Knochenmarkquelle und mit starker Expression des Markers CD90 in der Herstellung eines Medikaments für die Zuführung einer biologischen Verbindung zu einem Zielgewebe.
Verwendung nach Anspruch 22, wobei das Medikament verwendet wird zur Behandlung einer neuropathologischen Erkrankung.