-
Die
Erfindung betrifft Verfahren, Verbindungen und Zusammensetzungen
zur Prävention
oder Unterdrückung
von unangenehmen menschlichen Gerüchen, insbesondere unangenehmen
Achselgerüchen
beim Menschen.
-
Es
ist bekannt, dass frischer Schweiß geruchlos ist und dass der
Geruch nur beim Kontakt von Schweiß mit Hautbakterien (beispielsweise
Bakterien der Gattung Staphylococcus und Corynebacteria) gebildet
wird und man nimmt an, dass die geruchlosen Moleküle, die
im Schweiß vorhanden
sind, durch Bakterien abgebaut werden, die die Achseln kolonisieren.
Es ist allgemein anerkannt (Labows et al. Cosmet. Sci. Technol.
Ser. (1999), 20: 59–82),
dass stark unangenehme Gerüche
aus frischem Schweiß hauptsächlich durch
die Gattung Corynebacteria freigesetzt werden. Die hauptsächlichen
Bestandteile, die für
den unangenehmen Geruch verantwortlich sein können, umfassen volatile Steroide,
volatile Schwefelverbindungen und kurzkettige, verzweigte Fettsäuren. Der
Mechanismus der Freisetzung von volatilen, freien Steroiden aufgrund
des Vorkommens von Arylsulfaten und beta-Glucosidase wurde von Froebe
et al., J. Soc. Cosmet. Chem, 41, 173–185 (1990) untersucht.
-
Es
wurde vorgeschlagen, den unangenehmen Geruch durch die Vernichtung
der Bakterien zu behandeln, die für die Verursachung des unangenehmen
Geruchs verantwortlich sind. Tatsächlich enthalten im Handel
erhältliche
kosmetische Deodorantien oft antibakterielle Verbindungen, die allgemein
das Wachstum der Hautmikroflora hemmen. Antibakterielle Verbindungen,
die derzeit in Deodoransprodukten verwendet werden, umfassen beispielsweise
Triclosan (2,4,4'-Trichlor-2'-hydroxydiphenylether).
Jedoch ist ein Nachteil der Verwendung von antibakteriellen Stoffen
das Potential zur Zerstörung
des Gleichgewichts der natürlichen
Mikroflora der Haut.
-
Es
wurde auch vorgeschlagen, Verbindungen in einem Deodorans einzuarbeiten,
die spezifisch die biochemischen Reaktionen angehen und unterdrücken, die
die geruchlosen Vorläufer,
die im Schweiß vorhanden
sind, in flüchtige
unangenehm riechende Steroide oder Schwefelverbindungen umwandeln.
Genauer gesagt gab es mehrere Publikationen, die sich mit der Hemmung
von Enzymen beschäftigen,
die für
die Freisetzung von volatilen Steroiden oder volatilen Schwefelprodukten
verantwortlich sein dürften.
Siehe diesbezüglich
US 5 487 886 A ,
US 5 213 791 A und
US 5 595 728 A ,
die Aminosäure-β-lyaseinhibitoren
zur Verwendung in Deodorantien beschreiben. Diese Mittel dürften die
Freisetzung von flüchtigen
Schwefelverbindungen aus Cysteinderivaten blockieren. Die
US 5 676 937 A und
US 5 643 559 A beschreiben
Inhibitoren bakterieller Exoenzyme, nämlich Sulfatasen und Glucuronidasen.
Diese Verbindungen dürften
die Freisetzung von volatilen Steroiden aus den entsprechenden Sulfaten
oder Glucuroniden verringern. Die WO 00 01 355 A beschreibt die
Hemmung der Steroidreduktasen. Die
EP 0 815 833 A beschreibt mehrere Klassen
an Verbindungen, die die Bildung von unangenehmen, humanen Gerüchen verhindern.
Schließlich
ist in den deutschen Patentanmeldungen
DE 19858811 A1 und
DE 19855956 A1 die
Verwendung von Esteraseinhibitoren als Deodoranswirkstoffe beschrieben.
-
Jedoch
spielen Fettsäuren,
insbesondere kurzkettige, verzweigte Fettsäuren bekanntermaßen eine Rolle
bei unangenehmen Achselgerüchen
und insbesondere faulem Geruch. Während die WO 00 01 356 A unangenehmen
Achselgeruch dem Katabolismus von langkettigen Fettsäuren zuschreibt
und die Verwendung von bestimmen Parfümen zur Hemmung eines solchen
Katabolismus lehrt, reflektiert der Stand der Technik nicht eine
Verwendung eines enzymatischen Prozesses, der zur Freisetzung von
unangenehm riechenden Fettsäuren,
insbesondere kurzkettigen, verzweigten Fettsäuren führt und lehrt daher nicht,
wie ein unangenehmer Geruch aus diesen Quellen verhindert oder unterdrückt werden
kann.
-
Es
wurde nun der Mechanismus der Freisetzung von Fettsäuren im
Schweiß ermittelt
und es wurde ein Enzym ermittelt, das für die Umwandlung von geruchlosen
Vorläuferverbindungen,
die im Schweiß gefunden
werden, in unangenehm riechende Fettsäuren verantwortlich sein dürfte. Es
wurden auch spezifische Inhibitoren des Enzyms und Screeningwerkzeuge
zur Identifizierung von potentiellen Inhibitoren und auch Verfahren
und Zusammensetzungen zur Prävention
oder Unterdrückung
von unangenehmem Geruch ermittelt. Diese und andere Aspekte der
vorliegenden Erfindung werden für
den Fachmann aus der folgenden Beschreibung deutlich.
-
Die
Erfindung liefert in einem ersten Aspekt ein Enzym, das einen biochemischen
Prozess vermittelt, wobei im wesentlichen geruchlose Vorläuferverbindungen,
die im Schweiß gefunden
werden, gespalten werden, um unangenehm riechende Verbindungen,
insbesondere unangenehm riechende Fettsäuren, vor allem unangenehm
riechende kurzkettige, verzweigte Fettsäuren freizusetzen.
-
Das
Enzym der vorliegenden Erfindung wird aus den Bakterien der Gattung
Corynebacteria isoliert, die in der Kolonisierung der Achsel gefunden
werden, insbesondere bestimmte Corynebacteria sp., insbesondere
Corynebacteria striatum Ax 20, das am 26. April 2001 bei der internationalen
Hinterlegungsbehörde DSMZ – Deutsche
Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, D-38124 Braunschweig,
hinterlegt wurde. Die durch die internationale Hinterlegungsbehörde bereitgestellte
Hinterlegungsnummer lautet DSM 14267.
-
Das
Enzym war bisher nicht in isolierter Form verfügbar. Mit "isoliert" ist gemeint, dass das Enzym aus dessen
ursprünglicher
Umgebung entfernt wird, das heißt
aus der Umgebung, in der es natürlicherweise
vorkommt. Die vorliegende Erfindung liefert daher das Enzym in isolierter
Form, insbesondere in isolierter, gereinigter Form. Mit "gereinigter Form" sind zumindest 80
%, genauer gesagt mehr als 90 %, insbesondere 95 % und vor allem
99 % oder mehr in Bezug auf andere Protein und/oder Nukleinsäurekontaminationen
gemeint. Das Enzym kann durch die in SEQ ID Nr.1 gezeigte Aminosäuresequenz
charakterisiert werden. Jedoch sind im Umfang der Erfindung Enzyme
enthalten, die Aminosäuresequenzen
umfassen, welche im wesentlichen zu der Aminosäuresequenz ähnlich sind, die in SEQ ID
Nr. 1 gezeigt ist. Der Ausdruck "im
wesentlichen ähnlich" meint, wenn er in
Bezug auf eine Aminosäuresequenz
verwendet wird, eine Sequenz, die einer Referenzaminosäuresequenz
entspricht, worin die entsprechende Sequenz für ein Enzym kodiert, das im
wesentlichen dieselbe Struktur und dieselbe Funktion wie das Enyzm
aufweist, das durch die Referenzaminosäuresequenz kodiert wird, worin
die prozentuale Identität
der Sequenzen mindestens 80 %, insbesondere mindestens 90 % und
vor allem mindestens 95 % der Aminosäurereste über eine definierte Länge des
Moleküls
beträgt
und allelische Variationen umfasst. Die Sequenzvergleiche können mittels
eines Smith-Waterman Sequenzvergleichsalgorithmus ausgeführt werden,
der in der Technik bekannt ist.
-
Partielle
Aminosäuresequenzen
des in SEQ ID Nr. 2, Nr. 3 und Nr. 4 kodierten Enzyms umfassen zusätzliche
Aspekte der Erfindung.
-
Die
in SEQ ID Nr. 1 gezeigte Aminosäuresequenz
kann aus einem offenen Leserahmen abgeleitet werden, der in SEQ
ID Nr. 5 enthalten ist. Demnach liefert die Erfindung in einem weiteren
ihrer Aspekte eine isolierte Nukleinsäure, wie sie beispielsweise
in SEQ Nr. 5 gezeigt ist, die für
ein Enzym mit einer Aminosäuresequenz
kodiert, wie sie in SEQ ID Nr. 1 gezeigt ist.
-
Alle
Sequenzdaten können
mittels Techniken erhalten werden, die herkömmlich in der Technik bekannt
sind.
-
Ein
Enzym der vorliegenden Erfindung kann ein Molekulargewicht von 43
bis 48 kDa aufweisen. Insbesondere kann es ein scheinbares Molekulargewicht
auf einer SDS-PAGE von 48 kDa haben und ein tatsächliches Molekulargewicht von
43365 Da, wie dies durch Nano-ESI-MS (Elektronensprayionisationsmassenspektrometrie)
Analyse bestimmt wird und auch von der Aminosäuresequenz abgeleitet wird.
-
Ein
erfindungsgemäßes Enzym
vermittelt einen biochemischen Prozess, indem im wesentlichen geruchlose
Vorläuferverbindungen
unter Bildung von unangenehm riechenden Verbindungen gespalten werden, die
charakteristischerweise im Schweiß gefunden werden. Die Vorläuferverbindungen
sind Substrate, die im allgemeinen als Derivate von L-Glutamin beschrieben
werden können,
insbesondere L-Glutaminderivate,
worin das Nα-Atom
des L-Glutaminrests mit einem Rest einer unangenehm riechenden Verbindung
acyliert ist, insbesondere einem Fettsäurerest, vor allem einem kurzkettigen,
verzweigten Fettsäurerest.
Ein Beispiel für eine
Vorläuferverbindung,
die aus humanem Schweiß isoliert
wurde, hat die folgende Struktur:
Die Spaltung des Substrats
an der N
α-Position
setzt 3-Hydroxy-3-methylhexansäure
frei, die selbst einen stechenden Geruch aufweist, welche unter
Bildung von 3-Methyl-3-hexensäure
dehydratisieren kann, welche eine weitere unangenehm riechende flüchtige Schlüsselverbindung
in humanem Schweiß ist.
Proteine oder Polypeptide, beispielsweise Enzyme, die so wirken,
dass sie Substrate des oben angegebenen Typs unter Freisetzung von
unangenehm riechenden Säuren
spalten, liegen innerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung.
Isolierte Aminoacylasen sind bereits beispielsweise von Pittelkow
et al. (Protein Expression and Purification, Band 12, Nr. 2, 269–276) und
Bartsch et al. (WO 98 27 201 A) beschrieben.
-
Ein
Enzym der vorliegenden Erfindung kann insbesondere in Bezug auf
bestimmte Substrate aktiv sein. Beispielsweise kann es Nα-acylierte
L-Glutaminsubstrate erkennen. Jedoch ist es weder fähig, ähnliche acylierte
Derivate von verwandten Aminosäuren
zu spalten, wie L-Glutamat, L-Aspartat oder L-Asparagin, noch Substrate zu erkennen,
worin das Nδ oder
die COOH Gruppe des L-Glutaminrests substituiert ist. Ferner ist
es stereospezifisch, wobei es beispielsweise Derivate von L-Glutamin
erkennt und nicht die von D-Glutamin stammenden Analoga. In Bezug
auf die Substratspezifität
kann ein Enzym der vorliegenden Erfindung als Aminoacylase beschrieben
werden, insbesondere eine Nα-Acylglutaminaminoacylase. Die Acylgruppe
am Nα Atom
kann breit variieren und das Enzym kann Substrate über einen
großen
Bereich an unterschiedlichen riechenden und nicht-riechenden Säuren und
anderen Verbindungen spalten. Es kann auch zusätzlich zu Amidbindungen Carbamatbindungen
an der Nα Position
spalten, wobei die Freisetzung eines Alkohols, CO2 und L-Glutamin
vermittelt wird. Es kann auch acylierte Derivate von L-Glutamin
spalten, worin das Nα Atom durch ein Sauerstoffatom
ersetzt wurde, das heißt
Oxoglutaminderivate.
-
Ferner
erfordert das Enzym als Cofaktor ein Zinkion. Unter diesem Aspekt
und der Fähigkeit
zur Spaltung von Amidbindungen kann es so betrachtet werden, dass
es mit der Gruppe an Enzymen verwandt ist, die als Zinkmetallopeptidasen
bekannt sind. Genauer gesagt kann es, da es eine Amidbindung benachbart
zu einer terminalen Carboxylgruppe spalten kann, zu der Gruppe an
Enzymen gerechnet werden, die als Zinkcarboxypeptidasen bekannt
sind.
-
Während ein
erfindungsgemäßes Enzym
hoch selektiv auf den Glutaminrest eines Substrats ist, wie dies
oben erwähnt
ist, wurde überraschenderweise
festgestellt, dass eine große
Vielzahl an Glutaminderivaten fähig
ist, in das Enzym zu passen. Beispielsweise wurde festgestellt,
dass ungleichartige Substrate, wie Nα-(3-Hydroxy-3-methylhexanoyl)-L-glutamin,
Nα-(3-Methyl-2-hexenoyl)-L-glutamin,
Nα-Lauroyl-L-glutamin, Nα-(11-Undecenoyl)-L-glutamin,
Nα-Tetradecanoyl-L-glutamin,
Nα-Decanoyl-L-glutamin, Nα-Phenylacetyl-L-glutamin,
Nα-Carbobenzoyloxy-L-glutamin
(= Z-Glutamin), Nα-3,7-Dimethyl-6-octenyloxycarbonyl-L-glutamin,
Nα-(3-Hexenyl)oxycarbonyl-L-glutamin,
Nα-Butyloxycarbonyl-L-glutamin, Nα-(4-tert-Butylcyclohexyloxycarbonyl)-L-glutamin,
Nα-2-Phenylethyloxycarbonyl-L-glutamin,
Nα-(3-Methyl-5-phenylpentanoxycarbonyl)-L-glutamin,
Nα-(2-Adamantan-1-ylethoxycarbonyl)-L-glutamin,
Nα-(2-Adamantan-1-ylmethoxycarbonyl)-L-glutamin,
Nα-[2-(2,2,3-Trimethylcyclopent-3-enyl)ethoxycarbonyl)-L-glutamin
und Nα-(4-Methoxyphenylsulfanylcarbonyl)-L-glutamin
alle fähig
sind, durch das Enzym gespalten zu werden. Diese Feststellungen legen
zusammen mit der Erkenntnis der Art der Metallopeptidasen nahe,
dass ein erfindungsgemäßes Enzym eine
hohe Spezifität
für Glutamin
an der sogenannten "S1'-Stelle" aufweist, aber eine
große
Vielzahl an Substituenten am Nα-Atom
des Substrats akzeptiert, vorausgesetzt diese Substituenten sind
ausreichend sperrig und hydrophob, um von der sogenannten "S1 Stelle" des Enzyms aufgenommen
zu werden. Die Ausdrücke "S1 Stelle" und "S1' Stelle", wie sie hierin
verwendet werden, beziehen sich auf die Stellen auf Metallopeptidaseenzymen,
die dem Fachmann bekannt sind.
-
Ein
oben beschriebenes Enzym stellt eine besonders bevorzugte Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung dar. Jedoch bilden auch andere Bakterienstämme, beispielsweise
andere Stämme
von Corynebacteria oder Bakterien der Gattung Staphylococci, die
in der Mikroflora der Achsel gefunden werden, ebenfalls verwandte
Enzyme, die wiederum biochemische Reaktionen vermitteln, worin L-Glutaminderivate
an Nα gespalten
werden. Jedoch spalten diese verwandten Enzyme spezifisch Vorläuferverbindungen
unter Freisetzung von geradkettigen Fettsäuren, wobei die Säuren nur
eine untergeordnete Rolle im typischen Achselgeruch spielen. Diese
verwandten Enyzme und Inhibitoren hiervon bilden auch Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung.
-
Ein
weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst ein Verfahren
zur Isolierung eines oben beschriebenen Enzyms. Das Enzym der vorliegenden
Erfindung tritt intrazellulär
auf und kann aus den Zellen durch eine mechanische Zerstörung der
Zellhülle
freigesetzt werden. Daher kann ein Enzym aus Zellextrakten isoliert
werden, die aus Wildtypbakterienstämmen, speziell von Corynebacterium
Stämmen
erhalten werden, die von der menschlichen Achsel isoliert werden,
insbesondere Corynebacterium striatum Ax 20.
-
Alternativ
dazu kann ein Enzym durch rekombinante Mittel hergestellt werden
und die Erfindung liefert in einem weiteren ihrer Aspekte solche
Verfahren, rekombinante Vektoren und ihre Verwendung als Reagenzien
bei der Herstellung und prokaryontische oder eukaryontische Wirtszellen,
die mit diesen Vektoren transformiert sind.
-
Daher
kann ein Enzym durch die Anzucht von Wirtszellen, die durch einen
Expressionsvektor transformiert sind, der eine fremde Nukleinsäure umfasst,
die für
ein Enzym kodiert, unter Bedingungen angezogen werden, so dass es
exprimiert wird und anschließende
Gewinnung mittels bekannter Techniken hergestellt werden. In einer
bestimmten Ausführungsform
der Erfindung wird ein Nukleinsäurefragment,
das für
die SEQ ID Nr. 5 oder eine im wesentlichen ähnliche Nukleinsäuresequenz
kodiert, die für
ein Enzym mit einer Aminosäuresequenz
kodiert, das im wesentlichen dieselbe wie die SEQ ID Nr. 1 ist,
in einen Expressionsvektor eingeführt, indem man operativ die
Nukleinsäure
an die erforderlichen Expressionskontrollregionen bindet, die zur Genexpression
erforderlich sind. Der Vektor wird dann in eine geeignete Wirtszelle,
beispielsweise eine bakterielle Wirtszelle, insbesondere E. coli
eingeführt.
Es sind mehrere Expressionsvektoren bekannt und im Handel erhältlich und
die Auswahl eines geeigneten Expressionsvektors und geeigneter Wirtszellen,
die dieser transformieren kann, unterliegt der Wahl des Fachmanns.
Beispiele für
Expressionsvektoren und Wirtsstämme sind
in T. Maniatis et al. (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory,
1982) beschrieben, wobei andere Beispiele für Vektor-Wirtsstammkombinationen der Vektor pPROTet.E133
in Stamm DH5αPR0,
der von Clontech (Palo Alto, California, USA) erhalten wird oder
der Vektor pBADgIIIA im Stamm TOP 10 sind, der von Invitrogen (Groningen,
The Netherlands) erhalten werden kann.
-
Die
rekombinante Produktion eines Enzyms gemäß der Erfindung ist nicht auf
die Produktion in bakteriellen Wirten beschränkt. Es können alle anderen Mittel die
dem Fachmann zur Herstellung eines Enzyms auf der Basis einer definierten
genetischen Sequenz bekannt sind, verwendet werden. Solche Methoden
umfassen beispielsweise die Expression in genetisch modifizierten
Hefen, in Insektenzellen, die mit einem modifizierten Baculovirus
transformiert sind und in eukaryontischen Zelllinien oder die in
vitro Transkription und Translation.
-
Das
gemäß den oben
beschriebenen Verfahren hergestellte Enzym kann gemäß bekannter
Techniken gereinigt werden. Daher können Wirtszellen, die das Enzym
enthalten, extrahiert werden, um das Enzym freizusetzen, beispielsweise
durch mechanische Zerstörung
der Zellen oder durch osmotischen Schock. Danach kann das rohe Enzym
vom Wirtszelldebris und dem Wirtszellprotein und den Nukleinsäurekontaminationen
abgetrennt werden, wobei bekannte Techniken, wie Fällung und
Chromatographie verwendet werden. Es können alle Chromatographietechniken,
die in der Technik zur Reinigung von Proteinen bekannt sind, verwendet
werden. Beispielsweise können
Schritte, wie Ionenaustausch, hydrophobe Interaktion, Umkehrphase
und Größenausschlusschromatographie
in jeder geeigneten Sequenz verwendet werden. Optional kann das
nach jedem Chromatographieschritt eluierte Enzym weiter durch Filtration,
beispielsweise mittels Ultrafiltrationstechniken gereinigt und konzentriert
werden.
-
In
einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zum Screenen
von Verbindungen als Inhibitoren eines wie hierin oben beschriebenen
Enzyms bereitgestellt. Insbesondere kann zur Identifizierung der hemmenden
Verbindungen das Enzym oder die Zellen oder Zellextrakte, die das
Enzym enthalten, das von einer der oben beschriebenen Quellen erhalten
wurde, zusammen mit einem geeigneten Substrat , das durch das Enzym
gespalten wird und mit potentiell hemmenden Verbindungen inkubiert
werden. Ein geeignetes Substrat kann aus einer beliebigen Klasse
an Vorläuferverbindungen
ausgewählt
werden, wie sie oben angegeben sind, insbesondere einem Nα-acylierten
L-Glutamin oder einem Carbamat von Glutamin. Besonders brauchbare
Substrate sind Nα-3-Methyl-3-hydroxyhexanoylglutamin,
Nα-Lauroyl-L-glutamin
(im Handel erhältlich
von Fluka, Buchs, Schweiz) und Nα-Carbobenzyloxy-L-glutamin (Z-Glutamin,
im Handel erhältlich
von Aldrich, Buchs, Schweiz). Nach einer bestimmten Inkubationszeit,
die gemäß einem
Routinexperiment bestimmt werden kann, kann die Analyse durch Messung
der freigesetzten Säure
oder des Alkohols oder durch Messen der Menge an freiem L-Glutamin
ausgeführt
werden. Ein besonders brauchbarer Ansatz für ein Screening mit hohem Durchsatz
potentieller Inhibitoren kann sein, die Freisetzung von freiem L-Glutamin
durch Derivatisierung der freien Nα Gruppe
mit einem Amingruppenderivatisierungsmittel zu messen, das durch
Umsetzung mit der Amingruppe einen Chromophor oder ein Fluoreszenzmolekül bildet.
Insbesondere brauchbar kann unter diesem Gesichtspunkt die Verwendung
von Fluoreszamin (im Handel erhältlich
von Fluka, Buchs, Schweiz) unter Bildung eines Fluoreszenzmoleküls nach
der Umsetzung mit L-Glutamin sein. Schließlich kann die Spaltung des
L-Glutaminsubstrats
mit den Kontrollreaktionen verglichen werden und das Potential der
Testverbindungen, die Reaktion zu hemmen, kann hierdurch quantifiziert
werden.
-
Durch
die Kenntnis der Art des Enzyms und des oben angegebene Screeningverfahrens
ist der Fachmann fähig,
Verbindungen zu entwickeln, die Inhibitoren des Enzyms bei der Vermittlung
der biochemischen Reaktion sind, die zu Freisetzung von unangenehm
riechenden Verbindungen führt.
-
In
einem alternativen Verfahren zur Prävention oder Unterdrückung von
unangenehmen Gerüchen
anstelle von oder zusätzlich
zu der Verwendung von Inhibitoren, die wirken, um die Aktivität des Enzyms
zu verhindern oder zu unterdrücken,
kann man Mittel verwenden, die die Expression des Enzyms in Bakterien
verringern, die ein Gen enthalten, das für ein solches Enzym kodiert.
Solche Mittel können
entweder mittels Wildtypstämmen
oder genetisch veränderten
Bakterienstämmen
gescreent werden, die das Enzym exprimieren. Falls Wildtypstämme verwendet
werden, kann das Maß an
Enzymexpression direkt unter verschiedenen Umweltbedingungen und
nach der Zugabe von potentiell hemmenden Verbindungen gemessen werden.
Alternativ dazu können
genetisch veränderte
Corynebacterien verwendet werden, die mit einem Vektor transformiert sind,
der ein Reportergen enthält.
Diese Vektoren können
das Reportergen unter der Kontrolle der regulatorischen Sequenzen
für die
Enzymexpression enthalten, wobei die regulatorische Sequenz in SEQ
ID Nr. 6 enthalten ist. Für
diesen Zweck kann die regulatorische Sequenz oder jeder Teil hiervon
stromaufwärts
des Reportergens in einen Vektor mit breitem Wirtsbereich kloniert
werden, der zur Transformation von Corynebakterien fähig ist.
Das Reportergen kann hierdurch unter die regulatorische Kontrolle
der genetischen Sequenz gestellt werden, die die Expression des
Enzyms kontrolliert. Der auf diese Weise erhaltene Vektor kann dann
in einen Corynebacteriumstamm transformiert werden. Besonders brauchbare
Vektoren für
diesen Zweck sind in M.P. Schmitt (Infection and Immunity, 1997,
65(11): 4634–4641)
und von N. Bardonnet und C. Blanco (FEMS Microbiol. Lett., 1991,
68 (1): 97–102)
beschrieben. Besonders brauchbare Markergene sind IacZ (kodiert
für die β-Galacturonidase),
gfp (kodiert für
das grün
fluoreszierende Protein), luxABCD (kodiert für die bakterielle Luciferase)
und gusA (kodiert für
die Glucuronidase). Der genetisch veränderte Stamm kann dann in Gegenwart
einer zu testenden Verbindung angezogen werden und die Expression
des Markergens kann durch herkömmliche
Verfahren gemessen werden. Verbindungen, die zu einer Verringerung
der Expression führen
(das heißt
Verringerung der Menge an mRNA) können die Bildung von schlechten
Gerüchen
durch die Verringerung der Enzymmenge in der Achsel verringern.
-
Es
folgt nun eine Reihe an Beispielen, die zur Erläuterung der Erfindung dient.
-
Beispiel 1
-
Isolierung einer neuen
unangenehm riechenden Säure
und Vorläufern
hiervon aus Humanschweiß
-
Frische
Achselsekretionen werden von Testpersonen durch Waschen der Achsel
mit 10 % Ethanol entnommen. Die Proben werden mit MTBE zur Entfernung
der störenden
Lipide extrahiert. Die hydrophilen Phasen, die aus den Waschlösungen aus
mehreren Individuen erhalten werden, werden vereinigt. Dieses Material ist
praktisch geruchlos, aber es bildet nach einer Hydrolyse eines Probenteils
mit 1 M NaOH einen typischen unangenehmen Achselgeruch. Um die unangenehm
riechenden flüchtigen
Anteile zu identifizieren, werden die hydrolysierten Probenteile
extrahiert und durch Festphasenextraktion konzentriert und durch
GC und Geruch analysiert. Die Peaks, die einen starken Geruch aufweisen
und eng mit dem unangenehmen Geruch der Achsel verwandt sind, werden
durch GC-MS analysiert. Die Proben enthalten einen bestimmten Peak
einer Säure, die
für den
unangenehmen Achselgeruch sehr typisch ist. Basierend auf den MS
Daten ist die wahrscheinlichste Struktur des Peaks 3-Hydroxy-3-methylhexansäure. Diese
Annahme wird durch Synthese der letzteren Verbindung und dem Vergleich
der Spektren und Retentionszeiten mit den GC-MS Daten des unangenehm
riechenden Hauptpeaks in der GC-Geruchsanalyse verglichen. Diese
neue unangenehm riechende Verbindung ist strukturell mit der bekannten
3-Methyl-2-hexensäure
verwandt und wird durch Dehydratisierung nach verlängerter
Inkubation in die letztere Verbindung umgewandelt.
-
Um
den Vorläufer
für diese
Säure zu
identifizieren wird die gepoolte nicht-hydrolysierte Probe auf einer Superdex
Gelfiltrationssäule
(Pharmacia, Uppsala, Schweden) mittels NH4CO3/NaCl als Elutionspuffer abgetrennt. Individuelle
Fraktionen dieses Trennschritts werden auf den Gehalt eines unangenehm
riechenden Vorläufers
durch Hydrolyse mit 1 M NaOH getestet. Eine Fraktion entwickelt
einen starken unangenehmen Geruch nach der Hydrolyse und der unangenehme
Geruch kann der Freisetzung von 3-Hydroxy-3-methylhexansäure durch
GC-MS Analyse zugerechnet werden. Diese Fraktion wird einer LC-MS
Analyse unterzogen. Sie enthält einen
Hauptmassenpeak mit 274 Da und einen zusätzlichen Peak bei 256 Da. Das
Massenspektrum des vorherigen Peaks legt eine Verbindung nahe, worin
die 3-Hydroxy-3-methylhexansäure
mit einem Molekül
L-Glutamin verbunden ist (das heißt Nα-3-Hydroxy-3-methylhexanoyl-L-glutamin),
während
der zweite Peak basierend auf der Masse dem dehydratisierten Analogon
Nα-3-Methyl-2-hexenoyl-L-glutamin
entspricht. Nα-3-Hydroxy-3-methylhexanoyl-L-glutamin
wird dann synthetisiert und das MS Spektrum und die Retentionszeit
in der LC-MS Analyse werden mit der aus der natürlichen Schweiß isolierten
Verbindung verglichen und als identisch befunden.
-
Beispiel 2
-
Isolierung von Achselbakterien,
die die Fähigkeit
aufweisen, die unangenehm riechende Vorläuferverbindung spalten zu können
-
Die
Achselflora von 8 Testpersonen wird mit der Detergenz-Wischmethode
isoliert: Ein 6 cm
2 Bereich der Achsel wird
mit einem Phosphatpuffer abgewischt, der 1 % Tween 80 enthält. Die
Proben werden auf tryptischen Sojaagar ausplattiert, dem 5 g/l Tween
80 und 1 g/l Lecithin zugesetzt sind. Einzelisolate, die nach einer
Inkubation für
48 Stunden isoliert werden, werden subkultiviert und charakterisiert.
Es werden insgesamt 24 einzelne Stämme basierend auf der Kolonie-
und Zellmorphologie, Gram-Reaktion,
lipophilem Wachstum, Lipasereaktion und API Identifizierungskits
(BioMerieux, Frankreich, Coryneforme mit dem API Coryne-Kit und Kokken
mit dem ID Staph 32 Kit) identifiziert. Die Stämme werden über Nacht in einem flüssigen Medium
(Mueller-Hinton mit 0,01 % Tween 80 versetzt) angezogen, durch Zentrifugation
geerntet und mit einer schließlichen
OD
600 von 1 in einem semisynthetischen Medium
resuspendiert (Pro Liter: 3 g KH
2PO
4, 1,9 g K
2HPO
4, 0,2 g Hefeextrakt, 0,2 g MgSO
4,
1,4 g NaCl, 1 g NH
4Cl, 10 mg MnCl
2, 1 mg Fe
3Cl
2, 1 mg CaCl
2). Aliquots
dieser stationären
Kultur werden dann mit einer Endkonzentration von 500 ppm an Nα-3-Hydroxy-3-methylhexanoyl-L-glutamin
(5 % Stammlösung
gelöst
in Methanol) versetzt. Nach 24 Stunden Inkubation (unter Schütteln bei
300 Upm, 36°C)
werden die Proben extrahiert und die Menge an freigesetzter 3-Hydroxy-3-methylhexansäure wird
durch Kapillar GC bestimmt. Die Tabelle 1 gibt die Ergebnisse für einen
Teil der getesteten Stämme an.
Aus diesen Ergebnissen wird deutlich, dass unter den aus der Achsel
isolierten Corynebakterien einige aber nicht alle zur Freisetzung
von 3-Hydroxy-3-methylhexansäure
aus dem synthetischen Vorläufer
fähig sind.
Die Corynebakterien, die zur Ausführung dieser biochemischen
Reaktion fähig
sind, können
in der Gruppe der lipophilen und in der Gruppe der nichtlipophilen
Corynebakterien gefunden werden. Daher scheint ein spezifisches
Enzym, das nur in einigen Bakterienstämmen vorkommt, für diese
Spaltung verantwortlich zu sein. Da es einen unangenehmen Achselgeruch
freisetzt, wird das putative Enzym AMRE genannt, das für "unangenehmen Achselgeruch
freisetzendes Enzym" steht.
Scheinbar sind die getesteten Staphylokokken nicht zur Katalyse
der Reaktion fähig,
was mit der Beobachtung übereinstimmt,
dass nur Individuen mit einer Achselflora, die durch Corynebakterien
dominiert ist, den am meisten typischen unangenehmen Achselgeruch
bilden (Labows et al., Cosmet. Sci Technol. Ser. 1999, 20: 59–82). Wenn
jedoch das Nα-Lauroyl-L-glutamin
als Substrat im selben Experiment verwendet wird, wird festgestellt,
dass auch andere Corynebakterien und einige Staphylokokken Laurinsäure aus
dem Substrat freisetzen können.
Daher scheint es, dass die meisten Achselbakterien ein verwandtes
Enzym besitzen, aber dass viele nur gerade Fettsäuren freisetzen können, die
einen geringen Beitrag zum typischen unangenehmen Achselgeruch beitragen. Tabelle
1: Spaltung der natürlichen
unangenehm riechenden Vorläufer
durch Achselbakterien
![Figure 00080001](https://patentimages.storage.googleapis.com/12/9b/ef/c8a8e2cb432949/00080001.png)
- (*) Corynebacterien, die aus der Achsel
vom Menschen isoliert werden, können
in zwei Klassen auf der Basis ihrer Erfordernis für eine Fettsäurequelle
im Wachstumsmedium eingeteilt werden
-
Beispiel 3
-
Reinigung und Analyse
des Enzyms aus Stämmen,
die unangenehm riechende Vorläuferverbindungen
spalten
-
Corynebacterium
striatum Ax20 wird ausgewählt,
um das für
die Spaltung des Vorläufers
Nα-3-Hydroxy-3-methylhexanoyl-L-glutamin
verantwortliche Enzym zu isolieren und reinigen. Der Stamm wird über 48 Stunden
in Mueller-Hinton Medium angezogen, das mit 0,01 % Tween 80 versetzt
ist. Ein Gesamtvolumen aus 2 Liter Kultur wird durch Zentrifugation
geerntet. Das Pellet wird in Puffer A (50 mM NaCl, 50 mM NaH2PO4/K2HPO4 Puffer bei pH 7) gewaschen und dieser Puffer
wird während
des gesamten Reinigungsverfahrens verwendet. Die Zellen werden mechanisch
durch Vortexen mit Glaskügelchen
(425–600 μm, Sigma, St.
Louis, USA) während
30 Minuten bei maximaler Geschwindigkeit zerstört. Das rohe Zelllysat wird
dann durch Fällung
mit einer steigenden Konzentration an (NH4)2SO4 fraktioniert.
Der zwischen 50 % und 80 % Sättigung
an (NH4)2SO4 erhaltene Niederschlag enthält das aktive
Enzym. Die angereicherte Probe wird in Puffer A gelöst und dann
sequenziell über
4 Chromatographiesäulen
gegeben: DEAE Sepharose CL-6B Anionenaustauscherharz (Pharmacia,
Uppsala, Schweden, Elution mit einem linearen Gradienten von 0 bis
800 mM KCl), hydrophobes Phenyl-Sepharose Wechselwirkungsharz (Pharmacia,
Elution mit einem linearen Gradienten von 1000 mM bis 0 mM an (NH4)2SO4,
starke Anionenaustauschersäule
Mono Q auf dem FPLC System (Pharmacia, Elution mit einem Gradienten
von 0 bis 800 mM KCl) und schließlich schwache Mono P Anionenaustauscherharzsäule auf
dem FPLC System (Elution mit einem Gradienten von 0–800 mM
KCl in einem 50 mM Bis-Tris Puffer anstelle von Puffer A). Nach
jeder Säulentrennung
werden die aktiven Fraktionen (bestimmt durch Fluoreszenzaktivitätstest mit
Na-Lauroyl-L-glutamin als Substrat, siehe Beispiel 8) vereinigt
und dann entsalzt und durch Ultrafiltration konzentriert (Amicon
Membran YM10, Millipore, Bedford, US). Die entstehenden aktiven
Fraktionen enthalten nach der letzten Säulentrennung eine Hauptproteinbande
mit einem scheinbaren Molekulargewicht von etwa 48 kDa, wie dies
durch SDS PAGE bestimmt wird. Die effektive Molekularmasse wird
durch Nano-ESI-MS Analyse bestimmt und mit 43365 ± 5 Da
ermittelt. Dieses Enzym behält
die gesamte Aktivität,
falls es mit PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid, Roche Biochemicals,
Mannheim, Deutschland) und Pefabloc SC (4-(2-Aminoethyl)benzolsulfonylfluorid,
Roche Biochemicals) inkubiert wird, die typische Inhibitoren für Serin-
und Cysteinproteasen sind. Andererseits wird es vollständig durch
1 mM EDTA und o-Phenantrolin gehemmt. Diese Hemmung kann durch die
Zugabe von 1 mM ZnCl2 aufgehoben werden.
Dies zeigt, dass das Enzym zur Klasse der Zink-abhängigen Metallopeptidasen
gehört,
die ein Zn Atom als Cofaktor erfordern. Schließlich wird das Enzym einer
LC-ESI-MS/MS Analyse nach einem tryptischen Verdau und einer Analyse
der N-terminalen Aminosäuresequenz
unterzogen. Dies führt
zur Identifizierung der N-terminalen Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 2) und
zur Sequenz von zwei internen Peptiden (SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr.
4).
-
Beispiel 4
-
Substratspezifität des Enzyms
-
Um
im Detail die Strukturerfordernisse von Substraten zu verstehen,
wird das aus Corynebacterium striatum Ax20 extrahierte Enzym mit
einer großen
Vielzahl an Verbindungen inkubiert, die mit dem ursprünglich isolierten
Na-3-Methyl-3-hydroxyhexanoyl-L-glutamin verwandt sind, das im Schweiß vorkommt.
Jede Verbindung wird in einer Konzentration von 500 ppm in Puffer
A verwendet und die Analyse der freigesetzten Säure oder des Alkohols wird
durch Kapillar GC nach einer Inkubation von 24 Stunden ausgeführt. Zuerst
werden unterschiedliche Modifikationen am N-Terminus getestet. Es
wird festgestellt, dass das Enzym so einfache Substrate, wie Nα-Lauroyl-L-glutamin
und Nα-Carbobenzyloxy-L-glutamin
(= Z-Glutamin) spalten kann. Aus dem Letzteren setzt es Benzylalkohol
frei. Andere N-Lauroylaminosäuren
und Z-Aminosäuren
(alle von Fluka und Aldrich, Buchs, Schweiz erhalten) werden so
getestet, aber es wird gefunden, dass unter den 20 in Proteinen
vorkommenden Aminsäuren
das Enzym nur L-Glutaminsäurederivate
und in einem viel geringeren Ausmaß L-Alaninderivate spaltet.
Die Ergebnisse einiger der getesteten Substrate sind in Tabelle
2 zusammengefasst. Ferner kann das Enzym andere Carbamate von L-Glutamin
spalten, auch Derivate, worin der Alkohol ein Duftalkohol ist (beispielsweise
Citronellol, siehe Tabelle 2, Verbindung 5) und kann daher zur Freisetzung
von angenehm riechenden Molekülen
aus Vorläufern
verwendet werden. Tatsächlich
hat es eine breite Spezifität für Substituenten
an Nα, wie
dies in den Verbindungen 1 bis 5 (unten) widergespiegelt ist und
oben diskutiert ist. Schließlich
ist es stereospezifisch und kann keine Derivate von D-Glutamin spalten
(Tabelle 2, Verbindung 19), es benötigt eine freie COOH Gruppe
des L-Glutamins und spaltet keine Derivate, worin die Gruppe an Methanol
oder Glycin gebunden ist (Tabelle 2, Verbindungen 20 und 21). Es
kann auch kein Derivat spalten, worin das Nδ des Glutamins weiter derivatisiert
ist (Tabelle 2, Verbindung 22). Tabelle
2: Substratspezifität
des Enzyms
![Figure 00100001](https://patentimages.storage.googleapis.com/eb/5a/35/5bb9e6d9352cb0/00100001.png)
![Figure 00110001](https://patentimages.storage.googleapis.com/39/17/74/73cfc11f90659d/00110001.png)
- 1) – steht
für keine
Spaltung, + steht für
eine Spaltung von < 10
%, ++ Spaltung 10–50
% und +++ Spaltung über
50
-
Beispiel 5
-
Isolierung des für das Enzym
kodierenden Gens
-
Basierend
auf der partiellen Aminosäuresequenzanalyse
(siehe Beispiel 3) werden degenerierte Primer entworfen und zur
Amplifizierung eines 350 bp und eines 650 bp Fragments des entsprechenden
Gens zwischen dem N-Terminus (SEQ ID Nr. 2) und den zwei internen
Peptidsequenzen (SEQ ID Nr. 3 und 4) verwendet. Die chromosomale
DNA von Ax20 dient als Matrize. Der Primer mit der Sequenz SEQ ID
Nr. 7 aneliert erfolgreich an der für den N-Terminus kodierenden
Sequenz und die Primer mit der Sequenz SEQ ID Nr. 8 und SEQ ID Nr.
9 anelieren innerhalb der für
die internen Peptide kodierenden Sequenzen. Es werden Standard PCR
Bedingungen verwendet und die Anelierungstemperaturen werden auf
einem Gradientencycler optimiert (T-Gradient, Biometra, Göttingen,
Germany). Die amplifizierte DNA wird in den Vektor pGM-T Easy (Promega, Madison,
USA) kloniert und die Nukleotidsequenz wird auf dem ABI-Prism Modell
310 (PE Biosystems, Rotkreuz, Schweiz) mittels Standardverfahren
bestimmt. Basierend auf der erhaltenen Sequenz werden spezifisch
verschachtelte Oligonukleotide entworfen, um die stromaufwärts (SEQ
ID Nr. 10 und 11) und stromabwärts
liegende Region (SEQ ID Nr. 12 und SEQ ID Nr. 13) zu klonieren.
Die chromosomale DNA von Ax20 wird mit Smal und Pvull verdaut und
in den Genome Walker Adaptor (Clontech Laboratoris, Palo Alto, USA)
ligiert. Die stromaufwärts
und stromabwärts
liegenden Regionen werden dann amplifiziert, wie dies in den Beschreibungen
des Universal Genome Walker O Kits (Clontech Laboratories, Palo
Alto, USA) beschrieben ist, in den Vektor pGEM T-easy kloniert und
die Nukleotidsequenz wird bestimmt. Mit den zwei Enzymverdaus erhält man zwei
stromaufwärts
(450 bp und 1200 bp) liegende Fragmente und zwei stromabwärts liegende
Fragmente (1200 bp und 3000 bp). Die volle kodierende Sequenz des
Enzyms (SEQ ID Nr. 5) wie auch stromaufwärts (SEQ ID Nr. 6) und stromabwärts liegende
Regionen sind in der klonierten Region enthalten. Die abgeleitete Aminosäuresequenz
des offenen Leserahmens, der dem Enzym (SEQ ID Nr. 1) entspricht,
wird mit öffentlichen
Proteinsequenzdatenbanken (Swissprot und GeneBank, bakterielle Sequenzen)
verglichen und es wird festgestellt, das sie sehr gut mit bekannten
Aminoacylasen, einigen Carboxypeptidasen und verschiedenen putativen
Peptidasen aligniert, die in Genomsequenzierprojekten identifiziert
wurden. Es werden mehrere dieser Enzyme in der Peptidasefamilie
m40 zusammengefasst, die auch als ama/hipo/hyuc Familie der Hydrolasen
bekannt sind.
-
Beispiel 6
-
Heterologe Expression
des für
das Enzym kodierenden Gens
-
Die
Vollängensequenz
des offenen Leserahmens, der für
das Enzym kodiert, wird mit PCR aus chromosomaler DNA von Ax20 mittels
spezifischer Primer (SEQ ID Nr. 14 und SEQ ID Nr. 15) amplifiziert.
Das amplifizierte DNA Fragment wird dann mit den Restriktionsenzymen
NcoI und HindIII verdaut, dann wird es in den Vektor pBADIIIA (Invitrogen,
Groningen, Niederlande) ligiert, der mit denselben En zymen vorverdaut
ist. Das entstehende Plasmid pBADgIIIAMRE wird in den Wirtsstamm
E. coli TOP10 (Invitrogen) transformiert. Der Stamm wird in LB Medium
angezogen, bis er eine optische Dichte von etwa 0,5 bei 600 nm erreicht.
Die Kultur wird mit Arabinose (0,2 % Endkonzentration) induziert,
für 4 Stunden
inkubiert, durch Zentrifugation gewonnen und durch Ultrabeschallung
zerstört.
Enzymtests mit Na-Lauryl-Glutamin als Substrat werden in Puffer
A mit einer Inkubationszeit von 1 Stunde und einer Substratkonzentration
von 500 ppm ausgeführt.
Die Tabelle 3 gibt die Aktivität
der aus den Wildtypzellen erhaltenen Extrakte und der Extrakte der
induzierten und nicht-induzierten modifizierten Stämme wieder,
die das Enyzm exprimieren. Tabelle
3: Heterologe Expression des Enzyms in E.coli
![Figure 00120001](https://patentimages.storage.googleapis.com/12/6c/8f/5a9ac7132179de/00120001.png)
-
Beispiel 7
-
Screening mit geringem
Durchsatz für
Inhibitoren des Enzyms
-
Extrakte
von Ax20 werden durch mechanische Zerstörung hergestellt, wie dies
in Beispiel 3 beschrieben ist. Der Extrakt (0,5 ml entspricht 2
ml Zellkultur) wird zu 3,5 ml Puffer A gegeben und mit 40 μl Substrat (Nα-Lauroyl-L-glutamin,
5 % Stammlösung
in Methanol) versetzt. Parallelproben werden zusätzlich mit den potentiell hemmenden
Verbindungen unter Bildung einer Endkonzentration von 0,5 und 5
mM zugegeben. Die Proben werden für 2 Stunden inkubiert und dann
mit MTBE und HCl extrahiert und auf die freigesetzte Laurinsäure mittels
Kapillar GC analysiert. Durch den Vergleich der Proben, die potentiell
hemmende Verbindungen enthalten, mit Kontrollproben nur mit Enzym
und Substrat wird die Hemmung (%) berechnet. Die Tabelle 4 gibt das
Ergebnis für
ausgewählte
Zinkchelatverbindungen wieder. Derselbe Test wird auch entweder
mit gereinigtem Enzym aus dem Wildtypstamm (siehe Beispiel 3) oder
mit Extrakten von E. coli Top 10/pBADgIII AMRE, der mit Arabinose
induziert ist (siehe Beispiel 6) ausgeführt. Ferner wird derselbe Test
mittels lebenden Zellen von Ax20 in der stationären Phase anstelle einer isolierten
Enzympräparation
gemacht. In diesem Fall wird die erfolgreiche Aufnahme der Inhibitoren
in die Zellen und die Hemmung simultan gemessen. Tabelle
4: Hemmung des isolierten Enzyms und der enzymatischen Aktivität in intakten
Zellen durch Zinkchelatbildner
![Figure 00130001](https://patentimages.storage.googleapis.com/b7/26/ae/88be7c4beb7ba1/00130001.png)
-
Beispiel 8
-
Screnning mit hohem Durchsatz
auf Inhibitoren des Enzyms
-
Potentiell
hemmende Verbindungen werden in Puffer A gelöst und Aliquots der Lösungen der
unterschiedlichen Inhibitoren (10 μl) werden auf einzelne Vertiefungen
einer weißen
Mikrotiterplatte verteilt. Gereinigtes Enzym, das aus dem Stamm
E. coli Top 10/pBADgIII AMRE erhalten wurde, wird in Puffer A (200
pg/ml Endkonzentration) verdünnt
und zu den hemmenden Verbindungen gegeben. Nach 10 Minuten Vorinkubation wird
das Substrat (Nα-Lauroyl-L-glutamin)
zu den einzelnen Vertiefungen in einer Endkonzentration von 0,05 mM
gegeben. Nach 15 Minuten Inkubation wird die Aminogruppe des freigesetzten
L-Glutamins durch die Zugabe von 50 μl einer Fluoreszaminstammlösung (2,5
mM in Acetonitril, Fluoreszamin wird von Fluka, Buchs, Schweiz erhalten)
zu jeder Vertiefung der Mikrotiterplatte derivatisiert. Nach 5 Minuten
wird die Fluoreszenz in den Vertiefungen der Mikrotiterplatten mit
einer Anregungswellenlänge
von 360 nm und einer Emissionswellenlänge von 460 nm gemessen. Die
Fluoreszenz der Kontrollvertiefungen nur mit Enzym, Substrat und
DMSO wird dann mit der Fluoreszenz in Vertiefungen verglichen, die
potentielle Inhibitoren enthalten. Durch die Variation der Inhibitorkonzentration
wird der HK
50 Wert für jede Verbindung bestimmt
und die Ki Werte werden berechnet. Tabelle
5: Ki Werte für
Verbindungen der Formel (I)
Sequenzlistenteil
der Erfindung