DE60218837T2

DE60218837T2 - Verbindungen und verfahren zur hemmung des achselgeruches

Info

Publication number: DE60218837T2
Application number: DE60218837T
Authority: DE
Inventors: Andreas Natsch; Gonzalo Acuna; Marie-Claude Fournie-Zaluski; Hans Gfeller
Original assignee: Givaudan SA
Current assignee: Givaudan SA
Priority date: 2001-05-14
Filing date: 2002-05-14
Publication date: 2007-11-15
Anticipated expiration: 2022-05-15
Also published as: US20040241795A1; WO2002092024A3; EP1387891A2; EP1811034B1; MXPA03010323A; EP1387891B1; US20100278768A1; DE60218837D1; EP1811034A2; WO2002092024A2; EP1258531A1; AU2002308337A1; ATE356876T1; EP1811034A3; US7264956B2; BR0209628A

Description

Die Erfindung betrifft Verfahren, Verbindungen und Zusammensetzungen zur Prävention oder Unterdrückung von unangenehmen menschlichen Gerüchen, insbesondere unangenehmen Achselgerüchen beim Menschen.
Es ist bekannt, dass frischer Schweiß geruchlos ist und dass der Geruch nur beim Kontakt von Schweiß mit Hautbakterien (beispielsweise Bakterien der Gattung Staphylococcus und Corynebacteria) gebildet wird und man nimmt an, dass die geruchlosen Moleküle, die im Schweiß vorhanden sind, durch Bakterien abgebaut werden, die die Achseln kolonisieren. Es ist allgemein anerkannt (Labows et al. Cosmet. Sci. Technol. Ser. (1999), 20: 59–82), dass stark unangenehme Gerüche aus frischem Schweiß hauptsächlich durch die Gattung Corynebacteria freigesetzt werden. Die hauptsächlichen Bestandteile, die für den unangenehmen Geruch verantwortlich sein können, umfassen volatile Steroide, volatile Schwefelverbindungen und kurzkettige, verzweigte Fettsäuren. Der Mechanismus der Freisetzung von volatilen, freien Steroiden aufgrund des Vorkommens von Arylsulfaten und beta-Glucosidase wurde von Froebe et al., J. Soc. Cosmet. Chem, 41, 173–185 (1990) untersucht.
Es wurde vorgeschlagen, den unangenehmen Geruch durch die Vernichtung der Bakterien zu behandeln, die für die Verursachung des unangenehmen Geruchs verantwortlich sind. Tatsächlich enthalten im Handel erhältliche kosmetische Deodorantien oft antibakterielle Verbindungen, die allgemein das Wachstum der Hautmikroflora hemmen. Antibakterielle Verbindungen, die derzeit in Deodoransprodukten verwendet werden, umfassen beispielsweise Triclosan (2,4,4'-Trichlor-2'-hydroxydiphenylether). Jedoch ist ein Nachteil der Verwendung von antibakteriellen Stoffen das Potential zur Zerstörung des Gleichgewichts der natürlichen Mikroflora der Haut.
Es wurde auch vorgeschlagen, Verbindungen in einem Deodorans einzuarbeiten, die spezifisch die biochemischen Reaktionen angehen und unterdrücken, die die geruchlosen Vorläufer, die im Schweiß vorhanden sind, in flüchtige unangenehm riechende Steroide oder Schwefelverbindungen umwandeln. Genauer gesagt gab es mehrere Publikationen, die sich mit der Hemmung von Enzymen beschäftigen, die für die Freisetzung von volatilen Steroiden oder volatilen Schwefelprodukten verantwortlich sein dürften. Siehe diesbezüglich US 5 487 886 A , US 5 213 791 A und US 5 595 728 A , die Aminosäure-β-lyaseinhibitoren zur Verwendung in Deodorantien beschreiben. Diese Mittel dürften die Freisetzung von flüchtigen Schwefelverbindungen aus Cysteinderivaten blockieren. Die US 5 676 937 A und US 5 643 559 A beschreiben Inhibitoren bakterieller Exoenzyme, nämlich Sulfatasen und Glucuronidasen. Diese Verbindungen dürften die Freisetzung von volatilen Steroiden aus den entsprechenden Sulfaten oder Glucuroniden verringern. Die WO 00 01 355 A beschreibt die Hemmung der Steroidreduktasen. Die EP 0 815 833 A beschreibt mehrere Klassen an Verbindungen, die die Bildung von unangenehmen, humanen Gerüchen verhindern. Schließlich ist in den deutschen Patentanmeldungen DE 19858811 A1 und DE 19855956 A1 die Verwendung von Esteraseinhibitoren als Deodoranswirkstoffe beschrieben.
Jedoch spielen Fettsäuren, insbesondere kurzkettige, verzweigte Fettsäuren bekanntermaßen eine Rolle bei unangenehmen Achselgerüchen und insbesondere faulem Geruch. Während die WO 00 01 356 A unangenehmen Achselgeruch dem Katabolismus von langkettigen Fettsäuren zuschreibt und die Verwendung von bestimmen Parfümen zur Hemmung eines solchen Katabolismus lehrt, reflektiert der Stand der Technik nicht eine Verwendung eines enzymatischen Prozesses, der zur Freisetzung von unangenehm riechenden Fettsäuren, insbesondere kurzkettigen, verzweigten Fettsäuren führt und lehrt daher nicht, wie ein unangenehmer Geruch aus diesen Quellen verhindert oder unterdrückt werden kann.
Es wurde nun der Mechanismus der Freisetzung von Fettsäuren im Schweiß ermittelt und es wurde ein Enzym ermittelt, das für die Umwandlung von geruchlosen Vorläuferverbindungen, die im Schweiß gefunden werden, in unangenehm riechende Fettsäuren verantwortlich sein dürfte. Es wurden auch spezifische Inhibitoren des Enzyms und Screeningwerkzeuge zur Identifizierung von potentiellen Inhibitoren und auch Verfahren und Zusammensetzungen zur Prävention oder Unterdrückung von unangenehmem Geruch ermittelt. Diese und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden für den Fachmann aus der folgenden Beschreibung deutlich.
Die Erfindung liefert in einem ersten Aspekt ein Enzym, das einen biochemischen Prozess vermittelt, wobei im wesentlichen geruchlose Vorläuferverbindungen, die im Schweiß gefunden werden, gespalten werden, um unangenehm riechende Verbindungen, insbesondere unangenehm riechende Fettsäuren, vor allem unangenehm riechende kurzkettige, verzweigte Fettsäuren freizusetzen.
Das Enzym der vorliegenden Erfindung wird aus den Bakterien der Gattung Corynebacteria isoliert, die in der Kolonisierung der Achsel gefunden werden, insbesondere bestimmte Corynebacteria sp., insbesondere Corynebacteria striatum Ax 20, das am 26. April 2001 bei der internationalen Hinterlegungsbehörde DSMZ – Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, D-38124 Braunschweig, hinterlegt wurde. Die durch die internationale Hinterlegungsbehörde bereitgestellte Hinterlegungsnummer lautet DSM 14267.
Das Enzym war bisher nicht in isolierter Form verfügbar. Mit "isoliert" ist gemeint, dass das Enzym aus dessen ursprünglicher Umgebung entfernt wird, das heißt aus der Umgebung, in der es natürlicherweise vorkommt. Die vorliegende Erfindung liefert daher das Enzym in isolierter Form, insbesondere in isolierter, gereinigter Form. Mit "gereinigter Form" sind zumindest 80 %, genauer gesagt mehr als 90 %, insbesondere 95 % und vor allem 99 % oder mehr in Bezug auf andere Protein und/oder Nukleinsäurekontaminationen gemeint. Das Enzym kann durch die in SEQ ID Nr.1 gezeigte Aminosäuresequenz charakterisiert werden. Jedoch sind im Umfang der Erfindung Enzyme enthalten, die Aminosäuresequenzen umfassen, welche im wesentlichen zu der Aminosäuresequenz ähnlich sind, die in SEQ ID Nr. 1 gezeigt ist. Der Ausdruck "im wesentlichen ähnlich" meint, wenn er in Bezug auf eine Aminosäuresequenz verwendet wird, eine Sequenz, die einer Referenzaminosäuresequenz entspricht, worin die entsprechende Sequenz für ein Enzym kodiert, das im wesentlichen dieselbe Struktur und dieselbe Funktion wie das Enyzm aufweist, das durch die Referenzaminosäuresequenz kodiert wird, worin die prozentuale Identität der Sequenzen mindestens 80 %, insbesondere mindestens 90 % und vor allem mindestens 95 % der Aminosäurereste über eine definierte Länge des Moleküls beträgt und allelische Variationen umfasst. Die Sequenzvergleiche können mittels eines Smith-Waterman Sequenzvergleichsalgorithmus ausgeführt werden, der in der Technik bekannt ist.
Partielle Aminosäuresequenzen des in SEQ ID Nr. 2, Nr. 3 und Nr. 4 kodierten Enzyms umfassen zusätzliche Aspekte der Erfindung.
Die in SEQ ID Nr. 1 gezeigte Aminosäuresequenz kann aus einem offenen Leserahmen abgeleitet werden, der in SEQ ID Nr. 5 enthalten ist. Demnach liefert die Erfindung in einem weiteren ihrer Aspekte eine isolierte Nukleinsäure, wie sie beispielsweise in SEQ Nr. 5 gezeigt ist, die für ein Enzym mit einer Aminosäuresequenz kodiert, wie sie in SEQ ID Nr. 1 gezeigt ist.
Alle Sequenzdaten können mittels Techniken erhalten werden, die herkömmlich in der Technik bekannt sind.
Ein Enzym der vorliegenden Erfindung kann ein Molekulargewicht von 43 bis 48 kDa aufweisen. Insbesondere kann es ein scheinbares Molekulargewicht auf einer SDS-PAGE von 48 kDa haben und ein tatsächliches Molekulargewicht von 43365 Da, wie dies durch Nano-ESI-MS (Elektronensprayionisationsmassenspektrometrie) Analyse bestimmt wird und auch von der Aminosäuresequenz abgeleitet wird.
Ein erfindungsgemäßes Enzym vermittelt einen biochemischen Prozess, indem im wesentlichen geruchlose Vorläuferverbindungen unter Bildung von unangenehm riechenden Verbindungen gespalten werden, die charakteristischerweise im Schweiß gefunden werden. Die Vorläuferverbindungen sind Substrate, die im allgemeinen als Derivate von L-Glutamin beschrieben werden können, insbesondere L-Glutaminderivate, worin das Nα-Atom des L-Glutaminrests mit einem Rest einer unangenehm riechenden Verbindung acyliert ist, insbesondere einem Fettsäurerest, vor allem einem kurzkettigen, verzweigten Fettsäurerest. Ein Beispiel für eine Vorläuferverbindung, die aus humanem Schweiß isoliert wurde, hat die folgende Struktur:
Die Spaltung des Substrats an der N_α-Position setzt 3-Hydroxy-3-methylhexansäure frei, die selbst einen stechenden Geruch aufweist, welche unter Bildung von 3-Methyl-3-hexensäure dehydratisieren kann, welche eine weitere unangenehm riechende flüchtige Schlüsselverbindung in humanem Schweiß ist. Proteine oder Polypeptide, beispielsweise Enzyme, die so wirken, dass sie Substrate des oben angegebenen Typs unter Freisetzung von unangenehm riechenden Säuren spalten, liegen innerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung. Isolierte Aminoacylasen sind bereits beispielsweise von Pittelkow et al. (Protein Expression and Purification, Band 12, Nr. 2, 269–276) und Bartsch et al. (WO 98 27 201 A) beschrieben.
Ein Enzym der vorliegenden Erfindung kann insbesondere in Bezug auf bestimmte Substrate aktiv sein. Beispielsweise kann es N_α-acylierte L-Glutaminsubstrate erkennen. Jedoch ist es weder fähig, ähnliche acylierte Derivate von verwandten Aminosäuren zu spalten, wie L-Glutamat, L-Aspartat oder L-Asparagin, noch Substrate zu erkennen, worin das N_δ oder die COOH Gruppe des L-Glutaminrests substituiert ist. Ferner ist es stereospezifisch, wobei es beispielsweise Derivate von L-Glutamin erkennt und nicht die von D-Glutamin stammenden Analoga. In Bezug auf die Substratspezifität kann ein Enzym der vorliegenden Erfindung als Aminoacylase beschrieben werden, insbesondere eine N_α-Acylglutaminaminoacylase. Die Acylgruppe am N_α Atom kann breit variieren und das Enzym kann Substrate über einen großen Bereich an unterschiedlichen riechenden und nicht-riechenden Säuren und anderen Verbindungen spalten. Es kann auch zusätzlich zu Amidbindungen Carbamatbindungen an der N_α Position spalten, wobei die Freisetzung eines Alkohols, CO₂ und L-Glutamin vermittelt wird. Es kann auch acylierte Derivate von L-Glutamin spalten, worin das N_α Atom durch ein Sauerstoffatom ersetzt wurde, das heißt Oxoglutaminderivate.
Ferner erfordert das Enzym als Cofaktor ein Zinkion. Unter diesem Aspekt und der Fähigkeit zur Spaltung von Amidbindungen kann es so betrachtet werden, dass es mit der Gruppe an Enzymen verwandt ist, die als Zinkmetallopeptidasen bekannt sind. Genauer gesagt kann es, da es eine Amidbindung benachbart zu einer terminalen Carboxylgruppe spalten kann, zu der Gruppe an Enzymen gerechnet werden, die als Zinkcarboxypeptidasen bekannt sind.
Während ein erfindungsgemäßes Enzym hoch selektiv auf den Glutaminrest eines Substrats ist, wie dies oben erwähnt ist, wurde überraschenderweise festgestellt, dass eine große Vielzahl an Glutaminderivaten fähig ist, in das Enzym zu passen. Beispielsweise wurde festgestellt, dass ungleichartige Substrate, wie Nα-(3-Hydroxy-3-methylhexanoyl)-L-glutamin, Nα-(3-Methyl-2-hexenoyl)-L-glutamin, Nα-Lauroyl-L-glutamin, Nα-(11-Undecenoyl)-L-glutamin, Nα-Tetradecanoyl-L-glutamin, Nα-Decanoyl-L-glutamin, Nα-Phenylacetyl-L-glutamin, Nα-Carbobenzoyloxy-L-glutamin (= Z-Glutamin), Nα-3,7-Dimethyl-6-octenyloxycarbonyl-L-glutamin, Nα-(3-Hexenyl)oxycarbonyl-L-glutamin, Nα-Butyloxycarbonyl-L-glutamin, Nα-(4-tert-Butylcyclohexyloxycarbonyl)-L-glutamin, Nα-2-Phenylethyloxycarbonyl-L-glutamin, Nα-(3-Methyl-5-phenylpentanoxycarbonyl)-L-glutamin, Nα-(2-Adamantan-1-ylethoxycarbonyl)-L-glutamin, Nα-(2-Adamantan-1-ylmethoxycarbonyl)-L-glutamin, Nα-[2-(2,2,3-Trimethylcyclopent-3-enyl)ethoxycarbonyl)-L-glutamin und Nα-(4-Methoxyphenylsulfanylcarbonyl)-L-glutamin alle fähig sind, durch das Enzym gespalten zu werden. Diese Feststellungen legen zusammen mit der Erkenntnis der Art der Metallopeptidasen nahe, dass ein erfindungsgemäßes Enzym eine hohe Spezifität für Glutamin an der sogenannten "S₁'-Stelle" aufweist, aber eine große Vielzahl an Substituenten am Nα-Atom des Substrats akzeptiert, vorausgesetzt diese Substituenten sind ausreichend sperrig und hydrophob, um von der sogenannten "S₁ Stelle" des Enzyms aufgenommen zu werden. Die Ausdrücke "S₁ Stelle" und "S₁' Stelle", wie sie hierin verwendet werden, beziehen sich auf die Stellen auf Metallopeptidaseenzymen, die dem Fachmann bekannt sind.
Ein oben beschriebenes Enzym stellt eine besonders bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dar. Jedoch bilden auch andere Bakterienstämme, beispielsweise andere Stämme von Corynebacteria oder Bakterien der Gattung Staphylococci, die in der Mikroflora der Achsel gefunden werden, ebenfalls verwandte Enzyme, die wiederum biochemische Reaktionen vermitteln, worin L-Glutaminderivate an Nα gespalten werden. Jedoch spalten diese verwandten Enzyme spezifisch Vorläuferverbindungen unter Freisetzung von geradkettigen Fettsäuren, wobei die Säuren nur eine untergeordnete Rolle im typischen Achselgeruch spielen. Diese verwandten Enyzme und Inhibitoren hiervon bilden auch Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst ein Verfahren zur Isolierung eines oben beschriebenen Enzyms. Das Enzym der vorliegenden Erfindung tritt intrazellulär auf und kann aus den Zellen durch eine mechanische Zerstörung der Zellhülle freigesetzt werden. Daher kann ein Enzym aus Zellextrakten isoliert werden, die aus Wildtypbakterienstämmen, speziell von Corynebacterium Stämmen erhalten werden, die von der menschlichen Achsel isoliert werden, insbesondere Corynebacterium striatum Ax 20.
Alternativ dazu kann ein Enzym durch rekombinante Mittel hergestellt werden und die Erfindung liefert in einem weiteren ihrer Aspekte solche Verfahren, rekombinante Vektoren und ihre Verwendung als Reagenzien bei der Herstellung und prokaryontische oder eukaryontische Wirtszellen, die mit diesen Vektoren transformiert sind.
Daher kann ein Enzym durch die Anzucht von Wirtszellen, die durch einen Expressionsvektor transformiert sind, der eine fremde Nukleinsäure umfasst, die für ein Enzym kodiert, unter Bedingungen angezogen werden, so dass es exprimiert wird und anschließende Gewinnung mittels bekannter Techniken hergestellt werden. In einer bestimmten Ausführungsform der Erfindung wird ein Nukleinsäurefragment, das für die SEQ ID Nr. 5 oder eine im wesentlichen ähnliche Nukleinsäuresequenz kodiert, die für ein Enzym mit einer Aminosäuresequenz kodiert, das im wesentlichen dieselbe wie die SEQ ID Nr. 1 ist, in einen Expressionsvektor eingeführt, indem man operativ die Nukleinsäure an die erforderlichen Expressionskontrollregionen bindet, die zur Genexpression erforderlich sind. Der Vektor wird dann in eine geeignete Wirtszelle, beispielsweise eine bakterielle Wirtszelle, insbesondere E. coli eingeführt. Es sind mehrere Expressionsvektoren bekannt und im Handel erhältlich und die Auswahl eines geeigneten Expressionsvektors und geeigneter Wirtszellen, die dieser transformieren kann, unterliegt der Wahl des Fachmanns. Beispiele für Expressionsvektoren und Wirtsstämme sind in T. Maniatis et al. (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982) beschrieben, wobei andere Beispiele für Vektor-Wirtsstammkombinationen der Vektor pPROTet.E133 in Stamm DH5αPR0, der von Clontech (Palo Alto, California, USA) erhalten wird oder der Vektor pBADgIIIA im Stamm TOP 10 sind, der von Invitrogen (Groningen, The Netherlands) erhalten werden kann.
Die rekombinante Produktion eines Enzyms gemäß der Erfindung ist nicht auf die Produktion in bakteriellen Wirten beschränkt. Es können alle anderen Mittel die dem Fachmann zur Herstellung eines Enzyms auf der Basis einer definierten genetischen Sequenz bekannt sind, verwendet werden. Solche Methoden umfassen beispielsweise die Expression in genetisch modifizierten Hefen, in Insektenzellen, die mit einem modifizierten Baculovirus transformiert sind und in eukaryontischen Zelllinien oder die in vitro Transkription und Translation.
Das gemäß den oben beschriebenen Verfahren hergestellte Enzym kann gemäß bekannter Techniken gereinigt werden. Daher können Wirtszellen, die das Enzym enthalten, extrahiert werden, um das Enzym freizusetzen, beispielsweise durch mechanische Zerstörung der Zellen oder durch osmotischen Schock. Danach kann das rohe Enzym vom Wirtszelldebris und dem Wirtszellprotein und den Nukleinsäurekontaminationen abgetrennt werden, wobei bekannte Techniken, wie Fällung und Chromatographie verwendet werden. Es können alle Chromatographietechniken, die in der Technik zur Reinigung von Proteinen bekannt sind, verwendet werden. Beispielsweise können Schritte, wie Ionenaustausch, hydrophobe Interaktion, Umkehrphase und Größenausschlusschromatographie in jeder geeigneten Sequenz verwendet werden. Optional kann das nach jedem Chromatographieschritt eluierte Enzym weiter durch Filtration, beispielsweise mittels Ultrafiltrationstechniken gereinigt und konzentriert werden.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zum Screenen von Verbindungen als Inhibitoren eines wie hierin oben beschriebenen Enzyms bereitgestellt. Insbesondere kann zur Identifizierung der hemmenden Verbindungen das Enzym oder die Zellen oder Zellextrakte, die das Enzym enthalten, das von einer der oben beschriebenen Quellen erhalten wurde, zusammen mit einem geeigneten Substrat , das durch das Enzym gespalten wird und mit potentiell hemmenden Verbindungen inkubiert werden. Ein geeignetes Substrat kann aus einer beliebigen Klasse an Vorläuferverbindungen ausgewählt werden, wie sie oben angegeben sind, insbesondere einem N_α-acylierten L-Glutamin oder einem Carbamat von Glutamin. Besonders brauchbare Substrate sind N_α-3-Methyl-3-hydroxyhexanoylglutamin, N_α-Lauroyl-L-glutamin (im Handel erhältlich von Fluka, Buchs, Schweiz) und N_α-Carbobenzyloxy-L-glutamin (Z-Glutamin, im Handel erhältlich von Aldrich, Buchs, Schweiz). Nach einer bestimmten Inkubationszeit, die gemäß einem Routinexperiment bestimmt werden kann, kann die Analyse durch Messung der freigesetzten Säure oder des Alkohols oder durch Messen der Menge an freiem L-Glutamin ausgeführt werden. Ein besonders brauchbarer Ansatz für ein Screening mit hohem Durchsatz potentieller Inhibitoren kann sein, die Freisetzung von freiem L-Glutamin durch Derivatisierung der freien N_α Gruppe mit einem Amingruppenderivatisierungsmittel zu messen, das durch Umsetzung mit der Amingruppe einen Chromophor oder ein Fluoreszenzmolekül bildet. Insbesondere brauchbar kann unter diesem Gesichtspunkt die Verwendung von Fluoreszamin (im Handel erhältlich von Fluka, Buchs, Schweiz) unter Bildung eines Fluoreszenzmoleküls nach der Umsetzung mit L-Glutamin sein. Schließlich kann die Spaltung des L-Glutaminsubstrats mit den Kontrollreaktionen verglichen werden und das Potential der Testverbindungen, die Reaktion zu hemmen, kann hierdurch quantifiziert werden.
Durch die Kenntnis der Art des Enzyms und des oben angegebene Screeningverfahrens ist der Fachmann fähig, Verbindungen zu entwickeln, die Inhibitoren des Enzyms bei der Vermittlung der biochemischen Reaktion sind, die zu Freisetzung von unangenehm riechenden Verbindungen führt.
In einem alternativen Verfahren zur Prävention oder Unterdrückung von unangenehmen Gerüchen anstelle von oder zusätzlich zu der Verwendung von Inhibitoren, die wirken, um die Aktivität des Enzyms zu verhindern oder zu unterdrücken, kann man Mittel verwenden, die die Expression des Enzyms in Bakterien verringern, die ein Gen enthalten, das für ein solches Enzym kodiert. Solche Mittel können entweder mittels Wildtypstämmen oder genetisch veränderten Bakterienstämmen gescreent werden, die das Enzym exprimieren. Falls Wildtypstämme verwendet werden, kann das Maß an Enzymexpression direkt unter verschiedenen Umweltbedingungen und nach der Zugabe von potentiell hemmenden Verbindungen gemessen werden. Alternativ dazu können genetisch veränderte Corynebacterien verwendet werden, die mit einem Vektor transformiert sind, der ein Reportergen enthält. Diese Vektoren können das Reportergen unter der Kontrolle der regulatorischen Sequenzen für die Enzymexpression enthalten, wobei die regulatorische Sequenz in SEQ ID Nr. 6 enthalten ist. Für diesen Zweck kann die regulatorische Sequenz oder jeder Teil hiervon stromaufwärts des Reportergens in einen Vektor mit breitem Wirtsbereich kloniert werden, der zur Transformation von Corynebakterien fähig ist. Das Reportergen kann hierdurch unter die regulatorische Kontrolle der genetischen Sequenz gestellt werden, die die Expression des Enzyms kontrolliert. Der auf diese Weise erhaltene Vektor kann dann in einen Corynebacteriumstamm transformiert werden. Besonders brauchbare Vektoren für diesen Zweck sind in M.P. Schmitt (Infection and Immunity, 1997, 65(11): 4634–4641) und von N. Bardonnet und C. Blanco (FEMS Microbiol. Lett., 1991, 68 (1): 97–102) beschrieben. Besonders brauchbare Markergene sind IacZ (kodiert für die β-Galacturonidase), gfp (kodiert für das grün fluoreszierende Protein), luxABCD (kodiert für die bakterielle Luciferase) und gusA (kodiert für die Glucuronidase). Der genetisch veränderte Stamm kann dann in Gegenwart einer zu testenden Verbindung angezogen werden und die Expression des Markergens kann durch herkömmliche Verfahren gemessen werden. Verbindungen, die zu einer Verringerung der Expression führen (das heißt Verringerung der Menge an mRNA) können die Bildung von schlechten Gerüchen durch die Verringerung der Enzymmenge in der Achsel verringern.
Es folgt nun eine Reihe an Beispielen, die zur Erläuterung der Erfindung dient.
Beispiel 1
Isolierung einer neuen unangenehm riechenden Säure und Vorläufern hiervon aus Humanschweiß
Frische Achselsekretionen werden von Testpersonen durch Waschen der Achsel mit 10 % Ethanol entnommen. Die Proben werden mit MTBE zur Entfernung der störenden Lipide extrahiert. Die hydrophilen Phasen, die aus den Waschlösungen aus mehreren Individuen erhalten werden, werden vereinigt. Dieses Material ist praktisch geruchlos, aber es bildet nach einer Hydrolyse eines Probenteils mit 1 M NaOH einen typischen unangenehmen Achselgeruch. Um die unangenehm riechenden flüchtigen Anteile zu identifizieren, werden die hydrolysierten Probenteile extrahiert und durch Festphasenextraktion konzentriert und durch GC und Geruch analysiert. Die Peaks, die einen starken Geruch aufweisen und eng mit dem unangenehmen Geruch der Achsel verwandt sind, werden durch GC-MS analysiert. Die Proben enthalten einen bestimmten Peak einer Säure, die für den unangenehmen Achselgeruch sehr typisch ist. Basierend auf den MS Daten ist die wahrscheinlichste Struktur des Peaks 3-Hydroxy-3-methylhexansäure. Diese Annahme wird durch Synthese der letzteren Verbindung und dem Vergleich der Spektren und Retentionszeiten mit den GC-MS Daten des unangenehm riechenden Hauptpeaks in der GC-Geruchsanalyse verglichen. Diese neue unangenehm riechende Verbindung ist strukturell mit der bekannten 3-Methyl-2-hexensäure verwandt und wird durch Dehydratisierung nach verlängerter Inkubation in die letztere Verbindung umgewandelt.
Um den Vorläufer für diese Säure zu identifizieren wird die gepoolte nicht-hydrolysierte Probe auf einer Superdex Gelfiltrationssäule (Pharmacia, Uppsala, Schweden) mittels NH₄CO₃/NaCl als Elutionspuffer abgetrennt. Individuelle Fraktionen dieses Trennschritts werden auf den Gehalt eines unangenehm riechenden Vorläufers durch Hydrolyse mit 1 M NaOH getestet. Eine Fraktion entwickelt einen starken unangenehmen Geruch nach der Hydrolyse und der unangenehme Geruch kann der Freisetzung von 3-Hydroxy-3-methylhexansäure durch GC-MS Analyse zugerechnet werden. Diese Fraktion wird einer LC-MS Analyse unterzogen. Sie enthält einen Hauptmassenpeak mit 274 Da und einen zusätzlichen Peak bei 256 Da. Das Massenspektrum des vorherigen Peaks legt eine Verbindung nahe, worin die 3-Hydroxy-3-methylhexansäure mit einem Molekül L-Glutamin verbunden ist (das heißt N_α-3-Hydroxy-3-methylhexanoyl-L-glutamin), während der zweite Peak basierend auf der Masse dem dehydratisierten Analogon N_α-3-Methyl-2-hexenoyl-L-glutamin entspricht. N_α-3-Hydroxy-3-methylhexanoyl-L-glutamin wird dann synthetisiert und das MS Spektrum und die Retentionszeit in der LC-MS Analyse werden mit der aus der natürlichen Schweiß isolierten Verbindung verglichen und als identisch befunden.
Beispiel 2
Isolierung von Achselbakterien, die die Fähigkeit aufweisen, die unangenehm riechende Vorläuferverbindung spalten zu können
Die Achselflora von 8 Testpersonen wird mit der Detergenz-Wischmethode isoliert: Ein 6 cm² Bereich der Achsel wird mit einem Phosphatpuffer abgewischt, der 1 % Tween 80 enthält. Die Proben werden auf tryptischen Sojaagar ausplattiert, dem 5 g/l Tween 80 und 1 g/l Lecithin zugesetzt sind. Einzelisolate, die nach einer Inkubation für 48 Stunden isoliert werden, werden subkultiviert und charakterisiert. Es werden insgesamt 24 einzelne Stämme basierend auf der Kolonie- und Zellmorphologie, Gram-Reaktion, lipophilem Wachstum, Lipasereaktion und API Identifizierungskits (BioMerieux, Frankreich, Coryneforme mit dem API Coryne-Kit und Kokken mit dem ID Staph 32 Kit) identifiziert. Die Stämme werden über Nacht in einem flüssigen Medium (Mueller-Hinton mit 0,01 % Tween 80 versetzt) angezogen, durch Zentrifugation geerntet und mit einer schließlichen OD₆₀₀ von 1 in einem semisynthetischen Medium resuspendiert (Pro Liter: 3 g KH₂PO₄, 1,9 g K₂HPO₄, 0,2 g Hefeextrakt, 0,2 g MgSO₄, 1,4 g NaCl, 1 g NH₄Cl, 10 mg MnCl₂, 1 mg Fe₃Cl₂, 1 mg CaCl₂). Aliquots dieser stationären Kultur werden dann mit einer Endkonzentration von 500 ppm an Nα-3-Hydroxy-3-methylhexanoyl-L-glutamin (5 % Stammlösung gelöst in Methanol) versetzt. Nach 24 Stunden Inkubation (unter Schütteln bei 300 Upm, 36°C) werden die Proben extrahiert und die Menge an freigesetzter 3-Hydroxy-3-methylhexansäure wird durch Kapillar GC bestimmt. Die Tabelle 1 gibt die Ergebnisse für einen Teil der getesteten Stämme an. Aus diesen Ergebnissen wird deutlich, dass unter den aus der Achsel isolierten Corynebakterien einige aber nicht alle zur Freisetzung von 3-Hydroxy-3-methylhexansäure aus dem synthetischen Vorläufer fähig sind. Die Corynebakterien, die zur Ausführung dieser biochemischen Reaktion fähig sind, können in der Gruppe der lipophilen und in der Gruppe der nichtlipophilen Corynebakterien gefunden werden. Daher scheint ein spezifisches Enzym, das nur in einigen Bakterienstämmen vorkommt, für diese Spaltung verantwortlich zu sein. Da es einen unangenehmen Achselgeruch freisetzt, wird das putative Enzym AMRE genannt, das für "unangenehmen Achselgeruch freisetzendes Enzym" steht. Scheinbar sind die getesteten Staphylokokken nicht zur Katalyse der Reaktion fähig, was mit der Beobachtung übereinstimmt, dass nur Individuen mit einer Achselflora, die durch Corynebakterien dominiert ist, den am meisten typischen unangenehmen Achselgeruch bilden (Labows et al., Cosmet. Sci Technol. Ser. 1999, 20: 59–82). Wenn jedoch das Nα-Lauroyl-L-glutamin als Substrat im selben Experiment verwendet wird, wird festgestellt, dass auch andere Corynebakterien und einige Staphylokokken Laurinsäure aus dem Substrat freisetzen können. Daher scheint es, dass die meisten Achselbakterien ein verwandtes Enzym besitzen, aber dass viele nur gerade Fettsäuren freisetzen können, die einen geringen Beitrag zum typischen unangenehmen Achselgeruch beitragen. Tabelle 1: Spaltung der natürlichen unangenehm riechenden Vorläufer durch Achselbakterien

(*) Corynebacterien, die aus der Achsel vom Menschen isoliert werden, können in zwei Klassen auf der Basis ihrer Erfordernis für eine Fettsäurequelle im Wachstumsmedium eingeteilt werden

Beispiel 3
Reinigung und Analyse des Enzyms aus Stämmen, die unangenehm riechende Vorläuferverbindungen spalten
Corynebacterium striatum Ax20 wird ausgewählt, um das für die Spaltung des Vorläufers Nα-3-Hydroxy-3-methylhexanoyl-L-glutamin verantwortliche Enzym zu isolieren und reinigen. Der Stamm wird über 48 Stunden in Mueller-Hinton Medium angezogen, das mit 0,01 % Tween 80 versetzt ist. Ein Gesamtvolumen aus 2 Liter Kultur wird durch Zentrifugation geerntet. Das Pellet wird in Puffer A (50 mM NaCl, 50 mM NaH₂PO₄/K₂HPO₄ Puffer bei pH 7) gewaschen und dieser Puffer wird während des gesamten Reinigungsverfahrens verwendet. Die Zellen werden mechanisch durch Vortexen mit Glaskügelchen (425–600 μm, Sigma, St. Louis, USA) während 30 Minuten bei maximaler Geschwindigkeit zerstört. Das rohe Zelllysat wird dann durch Fällung mit einer steigenden Konzentration an (NH₄)₂SO₄ fraktioniert. Der zwischen 50 % und 80 % Sättigung an (NH₄)₂SO₄ erhaltene Niederschlag enthält das aktive Enzym. Die angereicherte Probe wird in Puffer A gelöst und dann sequenziell über 4 Chromatographiesäulen gegeben: DEAE Sepharose CL-6B Anionenaustauscherharz (Pharmacia, Uppsala, Schweden, Elution mit einem linearen Gradienten von 0 bis 800 mM KCl), hydrophobes Phenyl-Sepharose Wechselwirkungsharz (Pharmacia, Elution mit einem linearen Gradienten von 1000 mM bis 0 mM an (NH₄)₂SO₄, starke Anionenaustauschersäule Mono Q auf dem FPLC System (Pharmacia, Elution mit einem Gradienten von 0 bis 800 mM KCl) und schließlich schwache Mono P Anionenaustauscherharzsäule auf dem FPLC System (Elution mit einem Gradienten von 0–800 mM KCl in einem 50 mM Bis-Tris Puffer anstelle von Puffer A). Nach jeder Säulentrennung werden die aktiven Fraktionen (bestimmt durch Fluoreszenzaktivitätstest mit Na-Lauroyl-L-glutamin als Substrat, siehe Beispiel 8) vereinigt und dann entsalzt und durch Ultrafiltration konzentriert (Amicon Membran YM10, Millipore, Bedford, US). Die entstehenden aktiven Fraktionen enthalten nach der letzten Säulentrennung eine Hauptproteinbande mit einem scheinbaren Molekulargewicht von etwa 48 kDa, wie dies durch SDS PAGE bestimmt wird. Die effektive Molekularmasse wird durch Nano-ESI-MS Analyse bestimmt und mit 43365 ± 5 Da ermittelt. Dieses Enzym behält die gesamte Aktivität, falls es mit PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid, Roche Biochemicals, Mannheim, Deutschland) und Pefabloc SC (4-(2-Aminoethyl)benzolsulfonylfluorid, Roche Biochemicals) inkubiert wird, die typische Inhibitoren für Serin- und Cysteinproteasen sind. Andererseits wird es vollständig durch 1 mM EDTA und o-Phenantrolin gehemmt. Diese Hemmung kann durch die Zugabe von 1 mM ZnCl₂ aufgehoben werden. Dies zeigt, dass das Enzym zur Klasse der Zink-abhängigen Metallopeptidasen gehört, die ein Zn Atom als Cofaktor erfordern. Schließlich wird das Enzym einer LC-ESI-MS/MS Analyse nach einem tryptischen Verdau und einer Analyse der N-terminalen Aminosäuresequenz unterzogen. Dies führt zur Identifizierung der N-terminalen Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 2) und zur Sequenz von zwei internen Peptiden (SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 4).
Beispiel 4
Substratspezifität des Enzyms
Um im Detail die Strukturerfordernisse von Substraten zu verstehen, wird das aus Corynebacterium striatum Ax20 extrahierte Enzym mit einer großen Vielzahl an Verbindungen inkubiert, die mit dem ursprünglich isolierten Na-3-Methyl-3-hydroxyhexanoyl-L-glutamin verwandt sind, das im Schweiß vorkommt. Jede Verbindung wird in einer Konzentration von 500 ppm in Puffer A verwendet und die Analyse der freigesetzten Säure oder des Alkohols wird durch Kapillar GC nach einer Inkubation von 24 Stunden ausgeführt. Zuerst werden unterschiedliche Modifikationen am N-Terminus getestet. Es wird festgestellt, dass das Enzym so einfache Substrate, wie Nα-Lauroyl-L-glutamin und Nα-Carbobenzyloxy-L-glutamin (= Z-Glutamin) spalten kann. Aus dem Letzteren setzt es Benzylalkohol frei. Andere N-Lauroylaminosäuren und Z-Aminosäuren (alle von Fluka und Aldrich, Buchs, Schweiz erhalten) werden so getestet, aber es wird gefunden, dass unter den 20 in Proteinen vorkommenden Aminsäuren das Enzym nur L-Glutaminsäurederivate und in einem viel geringeren Ausmaß L-Alaninderivate spaltet. Die Ergebnisse einiger der getesteten Substrate sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Ferner kann das Enzym andere Carbamate von L-Glutamin spalten, auch Derivate, worin der Alkohol ein Duftalkohol ist (beispielsweise Citronellol, siehe Tabelle 2, Verbindung 5) und kann daher zur Freisetzung von angenehm riechenden Molekülen aus Vorläufern verwendet werden. Tatsächlich hat es eine breite Spezifität für Substituenten an Nα, wie dies in den Verbindungen 1 bis 5 (unten) widergespiegelt ist und oben diskutiert ist. Schließlich ist es stereospezifisch und kann keine Derivate von D-Glutamin spalten (Tabelle 2, Verbindung 19), es benötigt eine freie COOH Gruppe des L-Glutamins und spaltet keine Derivate, worin die Gruppe an Methanol oder Glycin gebunden ist (Tabelle 2, Verbindungen 20 und 21). Es kann auch kein Derivat spalten, worin das Nδ des Glutamins weiter derivatisiert ist (Tabelle 2, Verbindung 22). Tabelle 2: Substratspezifität des Enzyms

1) – steht für keine Spaltung, + steht für eine Spaltung von < 10 %, ++ Spaltung 10–50 % und +++ Spaltung über 50

Beispiel 5
Isolierung des für das Enzym kodierenden Gens
Basierend auf der partiellen Aminosäuresequenzanalyse (siehe Beispiel 3) werden degenerierte Primer entworfen und zur Amplifizierung eines 350 bp und eines 650 bp Fragments des entsprechenden Gens zwischen dem N-Terminus (SEQ ID Nr. 2) und den zwei internen Peptidsequenzen (SEQ ID Nr. 3 und 4) verwendet. Die chromosomale DNA von Ax20 dient als Matrize. Der Primer mit der Sequenz SEQ ID Nr. 7 aneliert erfolgreich an der für den N-Terminus kodierenden Sequenz und die Primer mit der Sequenz SEQ ID Nr. 8 und SEQ ID Nr. 9 anelieren innerhalb der für die internen Peptide kodierenden Sequenzen. Es werden Standard PCR Bedingungen verwendet und die Anelierungstemperaturen werden auf einem Gradientencycler optimiert (T-Gradient, Biometra, Göttingen, Germany). Die amplifizierte DNA wird in den Vektor pGM-T Easy (Promega, Madison, USA) kloniert und die Nukleotidsequenz wird auf dem ABI-Prism Modell 310 (PE Biosystems, Rotkreuz, Schweiz) mittels Standardverfahren bestimmt. Basierend auf der erhaltenen Sequenz werden spezifisch verschachtelte Oligonukleotide entworfen, um die stromaufwärts (SEQ ID Nr. 10 und 11) und stromabwärts liegende Region (SEQ ID Nr. 12 und SEQ ID Nr. 13) zu klonieren. Die chromosomale DNA von Ax20 wird mit Smal und Pvull verdaut und in den Genome Walker Adaptor (Clontech Laboratoris, Palo Alto, USA) ligiert. Die stromaufwärts und stromabwärts liegenden Regionen werden dann amplifiziert, wie dies in den Beschreibungen des Universal Genome Walker O Kits (Clontech Laboratories, Palo Alto, USA) beschrieben ist, in den Vektor pGEM T-easy kloniert und die Nukleotidsequenz wird bestimmt. Mit den zwei Enzymverdaus erhält man zwei stromaufwärts (450 bp und 1200 bp) liegende Fragmente und zwei stromabwärts liegende Fragmente (1200 bp und 3000 bp). Die volle kodierende Sequenz des Enzyms (SEQ ID Nr. 5) wie auch stromaufwärts (SEQ ID Nr. 6) und stromabwärts liegende Regionen sind in der klonierten Region enthalten. Die abgeleitete Aminosäuresequenz des offenen Leserahmens, der dem Enzym (SEQ ID Nr. 1) entspricht, wird mit öffentlichen Proteinsequenzdatenbanken (Swissprot und GeneBank, bakterielle Sequenzen) verglichen und es wird festgestellt, das sie sehr gut mit bekannten Aminoacylasen, einigen Carboxypeptidasen und verschiedenen putativen Peptidasen aligniert, die in Genomsequenzierprojekten identifiziert wurden. Es werden mehrere dieser Enzyme in der Peptidasefamilie m40 zusammengefasst, die auch als ama/hipo/hyuc Familie der Hydrolasen bekannt sind.
Beispiel 6
Heterologe Expression des für das Enzym kodierenden Gens
Die Vollängensequenz des offenen Leserahmens, der für das Enzym kodiert, wird mit PCR aus chromosomaler DNA von Ax20 mittels spezifischer Primer (SEQ ID Nr. 14 und SEQ ID Nr. 15) amplifiziert. Das amplifizierte DNA Fragment wird dann mit den Restriktionsenzymen NcoI und HindIII verdaut, dann wird es in den Vektor pBADIIIA (Invitrogen, Groningen, Niederlande) ligiert, der mit denselben En zymen vorverdaut ist. Das entstehende Plasmid pBADgIIIAMRE wird in den Wirtsstamm E. coli TOP10 (Invitrogen) transformiert. Der Stamm wird in LB Medium angezogen, bis er eine optische Dichte von etwa 0,5 bei 600 nm erreicht. Die Kultur wird mit Arabinose (0,2 % Endkonzentration) induziert, für 4 Stunden inkubiert, durch Zentrifugation gewonnen und durch Ultrabeschallung zerstört. Enzymtests mit Na-Lauryl-Glutamin als Substrat werden in Puffer A mit einer Inkubationszeit von 1 Stunde und einer Substratkonzentration von 500 ppm ausgeführt. Die Tabelle 3 gibt die Aktivität der aus den Wildtypzellen erhaltenen Extrakte und der Extrakte der induzierten und nicht-induzierten modifizierten Stämme wieder, die das Enyzm exprimieren. Tabelle 3: Heterologe Expression des Enzyms in E.coli
Beispiel 7
Screening mit geringem Durchsatz für Inhibitoren des Enzyms
Extrakte von Ax20 werden durch mechanische Zerstörung hergestellt, wie dies in Beispiel 3 beschrieben ist. Der Extrakt (0,5 ml entspricht 2 ml Zellkultur) wird zu 3,5 ml Puffer A gegeben und mit 40 μl Substrat (Nα-Lauroyl-L-glutamin, 5 % Stammlösung in Methanol) versetzt. Parallelproben werden zusätzlich mit den potentiell hemmenden Verbindungen unter Bildung einer Endkonzentration von 0,5 und 5 mM zugegeben. Die Proben werden für 2 Stunden inkubiert und dann mit MTBE und HCl extrahiert und auf die freigesetzte Laurinsäure mittels Kapillar GC analysiert. Durch den Vergleich der Proben, die potentiell hemmende Verbindungen enthalten, mit Kontrollproben nur mit Enzym und Substrat wird die Hemmung (%) berechnet. Die Tabelle 4 gibt das Ergebnis für ausgewählte Zinkchelatverbindungen wieder. Derselbe Test wird auch entweder mit gereinigtem Enzym aus dem Wildtypstamm (siehe Beispiel 3) oder mit Extrakten von E. coli Top 10/pBADgIII AMRE, der mit Arabinose induziert ist (siehe Beispiel 6) ausgeführt. Ferner wird derselbe Test mittels lebenden Zellen von Ax20 in der stationären Phase anstelle einer isolierten Enzympräparation gemacht. In diesem Fall wird die erfolgreiche Aufnahme der Inhibitoren in die Zellen und die Hemmung simultan gemessen. Tabelle 4: Hemmung des isolierten Enzyms und der enzymatischen Aktivität in intakten Zellen durch Zinkchelatbildner
Beispiel 8
Screnning mit hohem Durchsatz auf Inhibitoren des Enzyms
Potentiell hemmende Verbindungen werden in Puffer A gelöst und Aliquots der Lösungen der unterschiedlichen Inhibitoren (10 μl) werden auf einzelne Vertiefungen einer weißen Mikrotiterplatte verteilt. Gereinigtes Enzym, das aus dem Stamm E. coli Top 10/pBADgIII AMRE erhalten wurde, wird in Puffer A (200 pg/ml Endkonzentration) verdünnt und zu den hemmenden Verbindungen gegeben. Nach 10 Minuten Vorinkubation wird das Substrat (Nα-Lauroyl-L-glutamin) zu den einzelnen Vertiefungen in einer Endkonzentration von 0,05 mM gegeben. Nach 15 Minuten Inkubation wird die Aminogruppe des freigesetzten L-Glutamins durch die Zugabe von 50 μl einer Fluoreszaminstammlösung (2,5 mM in Acetonitril, Fluoreszamin wird von Fluka, Buchs, Schweiz erhalten) zu jeder Vertiefung der Mikrotiterplatte derivatisiert. Nach 5 Minuten wird die Fluoreszenz in den Vertiefungen der Mikrotiterplatten mit einer Anregungswellenlänge von 360 nm und einer Emissionswellenlänge von 460 nm gemessen. Die Fluoreszenz der Kontrollvertiefungen nur mit Enzym, Substrat und DMSO wird dann mit der Fluoreszenz in Vertiefungen verglichen, die potentielle Inhibitoren enthalten. Durch die Variation der Inhibitorkonzentration wird der HK₅₀ Wert für jede Verbindung bestimmt und die Ki Werte werden berechnet. Tabelle 5: Ki Werte für Verbindungen der Formel (I)
Sequenzlistenteil der Erfindung

Claims

Isolierte N_α-Acylglutaminaminoacylase, die eine Aminosäuresequenz umfasst, welche eine Sequenzidentität von mindestens 80 % zur Aminosäuresequenz aufweist, die in SEQ ID Nr. 1 gezeigt ist.
N_α-Acylglutaminaminoacylase nach Anspruch 1, die keine acylierten Derivate von L-Glutamat spaltet, welche eine Aminosäuresequenz umfasst, die eine Sequenzidentität von mindestens 80 % zu der Aminosäuresequenz aufweist, welche in SEQ ID Nr. 1 gezeigt ist und durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die eine in SEQ ID Nr. 5 gezeigte Nukleotidsequenz umfasst.
Isolierte Nukleinsäure, die für eine N_α-Acylglutaminaminoacylase kodiert, die eine Aminosäuresequenz umfasst, die eine Sequenzidentität von mindestens 80 % zur Aminosäure umfasst, die in SEQ ID Nr. 1 gezeigt ist.
Isolierte Nukleinsäure nach Anspruch 3, die aus einer Nukleotidsequenz besteht, welche in SEQ ID Nr. 5 gezeigt ist.
Expressionsvektor, der eine Nukleinsäure umfasst, welche für ein Enzym kodiert, das eine Aminsäuresequenz umfasst, welche eine Sequenzidentität von mindestens 80 % zu der Aminosäuresequenz aufweist, die in SEQ ID Nr. 1 gezeigt ist.
Expressionsvektor nach Anspruch 5, der die in SEQ ID Nr. 5 gezeigte Nukeotidsequenz umfasst.
Wirtszellen, die mit Expressionsvektoren nach Anspruch 5 oder Anspruch 6 transformiert sind.
Verfahren zur Herstellung von N_α-Acylglutaminaminoacylase nach der Definition in einem der Ansprüche 1 bis 2, das die Kultivierung einer Wirtszelle umfasst, die einen für das Enzym kodierenden Expressionsvektor trägt, unter Bedingungen, die zur Expression des Enzyms in dieser Wirtszelle ausreichen, wobei die Bildung eines exprimierten Enzyms veranlasst wird, und Gewinnung des durch die Zelle gebildeten Enzyms.
Verfahren zum Screenen von Verbindungen auf eine Inhibitoraktivität von N_α-Acylglutaminaminoacylase nach der Definition in einem der Ansprüche 1 bis 2, das umfasst die Schritte 1) Inkubation eines Enzyms oder Zellextrakts, der N_α-Acylglutaminaminoacylase enthält, die eine Aminosäuresequenz aufweist, welche eine Sequenzidentität von mindestens 80 % zu einer Aminosäuresequenz aufweist, die in SEQ ID Nr. 1 gezeigt ist, mit einem Derivat von L-Glutamin und einer Verbindung mit potentiellen Inhibitoreigenschaften und II) Messen der Freisetzung von übelriechenden Verbindungen und/oder freiem L-Glutamin.