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Diese
Anmeldung beansprucht die Priorität unter 35 U.S.C. § 119(e)
der U.S. Provisional-Patentanmeldung Nr. 60/317,643, die am 06.
September 2001 eingereicht wurde.
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Gebiet der
Erfindung
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Diese
Erfindung betrifft Wundheilungsprozesse. Insbesondere betrifft die
Erfindung die Unterstützung der
Heilung oder des Verschlusses von perforierten Trommelfellmembranen
oder Wunden, wie auch das Minimieren einer Narbenbildung und die
Entfernung von nekrotischem Gewebe.
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Hintergrund
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Eine
langsame oder ungenügende
Wundheilung kompromittiert die Qualität des Lebens für eine große Anzahl
von Menschen. Eine besondere Art der Wundheilung, bei der Probleme
auftreten können,
ist die Verheilung der Trommelfellmembran (Ohrtrommel)-Perforationen.
Obwohl die Majorität
von Perforationen spontan abheilen werden und durch eine proliferierendes
keratinisierendes squamöses
Epithel geschlossen werden, das sich vor dem wachsenden Bindegewebe
bildet, heilen einige Perforationen nicht, was häufig zu einem Hörverlust
oder anderen Komplikationen führt.
Es ist immer noch eine offene Frage, warum einige Perforationen
heilen, während
andere offen bleiben. Zusätzlich
leiden jedes Jahr in den Vereinigten Staaten mehr als 1,25 Millionen
Personen an Verbrennungen und 6,5 Millionen weisen chronische Hautgeschwüre auf,
die durch Druck, Venen-Stase oder Diabetes mellitus ausgelöst werden.
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Die
Wundheilung ist ein dynamischer Gewebe-remodellierender Prozess,
der die Bildung einer Matrix involviert, die im Wundfeld reich an
Fibrin und Fibronectin ist, die Infiltration von Neutrophilen und
Makrophagen, die Proliferation von epidermalen Keratinozyten an
den Wundkanten und ihre Migration durch die vorläufige Matrix, die Bildung von
granulierendem Gewebe, enthaltend sich neu entwickelnde Gefäße und die
Migration von Entzündungszellen
und Fibroblasten, und eine Wundkontraktion. Wundheilungsstudien
der Haut legen nahe, dass Proteasen eine wichtige Rolle bei etlichen
Schritten spielen. Es ist gut dokumentiert, dass der Abbau der extrazellulären Matrix
(ECM), der während
der Wundheilung stattfindet und andere ECM-Remodellierungsprozesse
von der Wirkung einer Vielzahl proteolytischer Enzyme abhängen, die
von entzündlichen
Zellen sezerniert werden, wie auch von den zellulären Stromagewebe-Elementen.
Es wird angenommen, dass viele unterschiedliche Proteinasen an der
Matrix-Remodellierung
während
der Wundheilung teilhaben (Saksela und Rifkin, Annu. Rev. Cell Biol.
4, 93–126
(1988)). Die für
dieses Verfahren verantwortlichen präzisen Mechanismen jedoch und
wie sie reguliert werden, werden kaum verstanden.
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Das Plasminogen-Aktivierungssystem
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Das
Plasminogen-Aktivierungssystem ist ein vielfältiges, temporär kontrolliertes
enzymatisches System, worin Plasminogen durch das proteolytische
Enzym Plasmin von einem der beiden physiologischen Plasminogenaktivatoren
(PAs), Gewebstyp-Plasminogenaktivator (tPA) und Urokinase-Typ-Plasminogenaktivator (uPA)
aktiviert wird. Die Aktivierung dieses Systems wird durch die Freisetzung
von tPA oder uPA durch spezifische Zellen als Reaktion auf externe
Signale initiiert und führt
zu einer lokal exprimierten extrazellulären proteolytischen Aktivität (Vassalli
et al., J. Exp. Med. 159, 1653–1668
(1984); Saksela & Rifkin,
1988, supra). Das PA-System wird ebenfalls durch spezifische Inhibitoren,
die gegen PAs und Plasmin gerichtet sind, reguliert, einschließlich dem
PA-Inhibitor-Typ
1 (PAI-1), PA-Inhibitor-Typ 2 (PAI-2), Proteasenexin 1 (PN-1) und α2-Anti-Plasmin
(Saksela & Rifkin,
1988, supra; Ny et al., Thromb Res. 71(1):1-45 (1993)). Alle diese
Inhibitoren, die zu der Serpinfamilie gehören, sind Selbstmordinhibitoren,
die von der entsprechenden Protease gespalten werden (Wilczynska
et al., J. Biol. Chem. 270(50):29652–5 (1995); Wilczynska et al.,
Nat. Struct. Biol. 4(5):354–7
(1997)). Das besonders wichtige Merkmal des PA-Systems ist die Amplifikation,
die durch eine Konversion von Plasminogen erreicht wird, was zur
Bildung von Plasmin führt.
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Es
hat sich gezeigt, dass PAs an Wundkanten vorliegen, zusammen mit
etlichen Typen von Matrixmetalloproteinasen (MMPs), einschließlich der
interstitiellen Collagenase (MMP-1), Stromelysin-1 (MMP-3) und den
latenten Formen der Gelatinase A (MMP-2) und Gelatinase-B (MMP-9).
Die Expression von sowohl den PAs als auch den MMPs wird durch Entzündungsmediatoren
und Zytokine induziert, was anzeigt, dass die beiden Enzymsysteme
zusammenwirken können.
von den MMPs ist bekannt, dass sie als latente Vorläuferenzyme
synthetisiert werden, die durch eine begrenzte Proteolyse aktiviert
werden können,
jedoch ist der exakte Mechanismus, durch den diese Aktivierung in
vivo stattfindet, im Wesentlichen unbekannt. Plasmin ist einer der
Faktoren, von denen vorgeschlagen wird, dass er an der Aktivierung
einiger Subklassen von Metalloproteinasen beteiligt ist (Lijnen,
Thromb. Haemost 86(1):324–33
(2001)).
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Eine
Anzahl von Berichten haben gezeigt, dass die Expression oder Aktivierung
von MMPs, Gewebeinhibitoren von Metalloproteinasen (TIMPs), PAs
und PA-Inhibitoren in den Wundheilungsprozessen verändert werden,
und es hat ebenfalls Hinweise gegeben, dass Plasmin eine Rolle bei
der Hautwundheilung spielt (Romer et al., Nat. Med. 2:287–292 (1996)).
Weiterhin beschreiben die US-Patente Nrn. 5,925,350 und 6,033,664
an Verheijen die Verwendung von uPA oder tPA, um die Wundheilung
von langsam oder nicht-heilenden Wunden zu verbessern. In diesen
Studien wurde festgestellt, dass der Verbesserungsmechanismus nicht
mit einer fibrinolytischen Aktivität oder einer Entfernung von
nekrotischem Gewebe assoziiert war. Spezifische Strategien zur Verbesserung
der Trommelfellmembranheilung wurden ebenfalls vorgeschlagen, wobei eine
topische Anwendung hoher Konzentrationen von Hyaluronan (Laurent
et al., Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 114:j1435–1441 (1988))
oder von basischem Fibroblastwachstumsfaktor (bFGF; Fina et al.,
Laryngoscope 103(7):804–809
(1993)) verwendet wurde.
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Während das
Verständnis
der Wundheilung und der verschiedenen Mechanismen, die diese regulieren,
sich verbessert und vielversprechende Behandlungsstrategien vorgeschlagen
wurden, bleiben die Heilung von langsam oder nicht-heilenden Trommelfellmembranperforationen
oder anderen Wunden ein medizinisches wie auch soziales Problem.
Es besteht daher ein Bedarf auf dem Gebiet an neuen und verbesserten Verfahren
zur Beschleunigung von Wundheilungsprozessen, wie z.B. einer Heilung
von Trommelfellmembranperforationen, Verbrennungen und Hautgeschwüren, wobei
alles nekrotische Gewebe entfernt und die Narbenbildung minimiert
wird. Es besteht auch ein Bedarf an neuen Screening-Verfahren, durch
die Arzneimittel identifiziert und bewertet werden können, die
in solchen Behandlungsverfahren verwendet werden können. Die Erfindung
richtet sich an diese und andere Bedürfnisse auf dem Gebiet.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein neues Mittel zur Verbesserung der
Heilung von Trommelfellmembranperforationen oder eine Minimierung
der Narbenbildung während
der Heilung durch Verabreichung von Plasminogen bereit.
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Dementsprechend
stellt die Erfindung Anspruch 1 bereit. Vorzugsweise ist das Subjekt
ein Mensch, und das Plasminogen ist menschliches Plasminogen. Die
Zusammensetzung kann weiterhin einen pharmazeutisch annehmbaren
Träger
umfassen und kann sich in Form einer wässrigen Lösung, eines Gels, einer Lotion,
eines Balsams, eines Pulvers, einer Paste, einer Bandage, eines
Wundverbandes oder eines anderen geeigneten Zufuhrvehikels befinden.
Das Plasminogen soll topisch verabreicht werden. Im Fall der topischen
Verabreichung kann die verabreichte Zusammensetzung ungefähr 0,05
bis ungefähr
10 mg Plasminogen, vorzugsweise ungefähr 0,5 bis ungefähr 5 mg
Plasminogen umfassen. Die Zusammensetzung kann die Heilung unterstützen, indem
die Heilung der Perforation beschleunigt wird, das nekrotische Gewebe
reduziert wird und die Bildung von Narbengewebe im Wundbereich reduziert
wird. In einer Ausführungsform
soll die Plasminogenverabreichung mindestens einmal, vorzugsweise
mindestens einmal jeden Tag wiederholt werden.
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Die
obigen Merkmale und viele andere Vorteile der Erfindung werden durch
Bezugnahme auf die folgende detaillierte Beschreibung besser verstanden
werden, wenn diese zusammen mit den begleitenden Zeichnungen betrachtet
wird.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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1A und
1B:
Zeitverlauf von (A) entzündlicher
Reaktion in der Mittelohrhöhle
und (B) Schrumpfen der Perforation nach einer Trommelfellmembranperforation
bei Wildtyp-Ratten. 50 μl
Plasminogen- (50 μg
(1 mg/ml) -∎-; oder 0,5 mg (10 mg/ml) -
-)
oder Kontrolle (PBS, -
-)
Lösung
wurde nach der Perforation und danach alle 24 Stunden verabreicht.
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Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Heilung von perforierten Trommelfellmembranen.
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Die
Erfindung basiert teilweise auf der Entdeckung, dass der Wundheilungsprozess
in Abwesenheit von Plasminogenen nicht ordentlich fortschreitet,
was zeigt, dass Plasminogen eine Schlüsselrolle bei der Heilung von
Wunden, insbesondere von Trommelfellmembranperforationen, spielt
(siehe Beispiele und Tabelle 1). Wie in den Beispielen dargestellt,
wurde die Heilung von Trommelfellmembranperforationen dramatisch
verändert und war abnormal bei Mäusen, denen Plasminogen fehlte
im Vergleich zu Wildtyp-Kontrollen und anderen transgenen Modellen
(siehe Tabelle 1). Bei Plasminogen-defizienten Mäusen heilten die Trommelfellmembranperforationen während der
144-tägigen
Testperiode, während
derer die Heilung überwacht
wurde, nicht ordentlich, was zu einer abnormalen Trommelfellmembran
führte.
Es wurde auch festgestellt, dass Plasminogen-defiziente Mäuse zu einem
normalen Heilprozess zurückkehrten,
folgend auf eine Injektion von menschlichem Plasminogen (siehe Beispiele
2 und 5) und dass Wildtyp-Ratten eine verbesserte Trommelfellmembranheilung
nach Verabreichung von Plasminogen zeigten (Beispiel 6). Zusätzlich zeigten
Experimente, dass uPA, jedoch nicht tPA, auch eine Rolle bei der
normalen Wundheilung spielen kann, nämlich darin, dass uPA anscheinend
für die
Entfernung von Fibrinablagerungen benötigt wurde (Beispiel 3 und
4). Bei keinem Tiermodell war das Fehlen einer normalen Heilung
jedoch deutlicher als bei den Plasminogen-defizienten Mäusen, was
anzeigte, dass Plasminogen eine essentiellere und vermutlich unterschiedliche
Rolle während
der Wundheilung spielt als uPA. Ohne an eine spezifische Theorie
gebunden zu sein, unterstützten
die gegenwärtigen
Feststellungen, dass die Unfähigkeit
zu einer ordentlichen Heilung durch einen Defekt in der Entzündungsreaktion,
Keratinozyten-Migration oder Matrixremodellierungsereignissen während des
Heilprozesses ausgelöst
werden könnte.
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Wie
durch die Ergebnisse in Tabelle 1 dargestellt, spielen uPA, tPA
und Plasminogen distinkte Rollen in dem Wundheilungsprozess, wobei
Plasminogen eine Schlüsselrolle
spielt. Zusätzlich
sind, wie in den Beispielen dargestellt, die Entfernung von nekrotischem
Gewebe und Fibrin kritisch abhängig
von der Gegenwart oder Verabreichung von Plasminogen/Plasmin anstelle
von tPA oder uPA.
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Tabelle
1 Vergleich
der Zeit für
die Heilung und das Auftreten von geheiltem Trommelfellmembrangewebe
bei Wildtyp-, uPA-defizienten, tPA-defizienten und Plasminogen-defizienten
Mäusen
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Dementsprechend
könnte
Plasminogen bei der Behandlung von Wundheilungserkrankungen wie auch
für eine
Beschleunigungsstrategie für
Trommelfellmembran- und Wundheilung, die Behandlung von Zuständen oder
Erkrankungen, die die Heilung von gestörten epidermalen Geweben betreffen;
Verfahren zur Reduktion der Narbenbildung oder einer nekrotischen
Gewebeanhäufung
oder Bildung, wie auch Screeningverfahren für Arzneimittel, die bei solchen
Behandlungen verwendet werden sollen, verwendet werden. Die Verabreichung
von Plasminogen kann auch die Narbenbildung oder die Nekrosegewebeanhäufung in
Trommelfellmembranen oder anderen epidermalen Geweben während der
Wundheilung minimieren. Beispielsweise kann Plasminogen zusammen
mit einer plastischen Chirurgie angewandt werden, um das Auftreten
der Bildung von Restnarben, Fibrinablagerungen oder nekrotischem
Gewebe zu reduzieren oder zu verhindern. Außerdem kann Plasminogen auf
Geschwüre
oder Verbrennungen aufgebracht werden, um die Heilung zu verbessern.
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Zusätzlich könnte die
Erfindung zur Verbesserung der Wundheilung bei Zuständen bei
einer lokalen oder systemischen Defizienz an Plasminogen verwendet
werden, oder um die Heilung von nicht oder langsam heilenden Wunden
zu verbessern. Tatsächlich
kann, wie in Beispiel 5 dargestellt, die Wiederherstellung von Plasminogen
Wochen nach der Verletzung die angehäufte extrazelluläre Matrix
vermindern und die normale Heilung wieder beginnen lassen, was zeigt,
dass Plasminogen für
eine Behandlung chronischer Wunden, wie z.B. Geschwüren und
wundgelegenen Stellen angewandt werden kann.
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Alternativ
könnte
Plasmin selbst bei der Behandlung von Wundheilungserkrankungen verwendet
werden, wie auch für
eine Beschleunigungsstrategie für
eine Trommelfellmembran- und Wundheilung, eine Behandlung von Zuständen oder
Erkrankungen, die die Heilung von unterbrochenen epidermalen Geweben
betreffen oder für
Verfahren zur Reduktion der Nabenbildung oder eine nekrotische Gewebeanhäufung oder
Bildung. Die Verabreichung von Plasmin kann auch die Narbenbildung
oder die Anhäufung
von nekrotischem Gewebe in Trommelfellmembranen oder anderen epidermalen
Geweben während
der Wundheilung minimieren. Beispielsweise kann Plasmin zusammen
mit einer plastischen Chirurgie verwendet werden, um das Auftreten einer
Bildung von restlichen Narben, Fibrinablagerungen oder nekrotischem
Gewebe zu reduzieren oder zu verhindern. Plasmin kann auch auf Geschwüre, wundgelegenen
Stellen oder Verbrennungen zur Verbesserung der Heilung angewandt
werden.
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Die
hier erwähnten
Zusammensetzungen können
topisch, durch Injektion oder durch intravenöse Infusion verabreicht werden.
Vorzugsweise, wenn auch nicht notwendigerweise, geschieht die Verabreichung
lokal, d.h. in einer gewissen Nachbarschaft zur Wunde. Wenn das
Plasminogen oder Plasmin durch Injektion verabreicht wird (z.B.
intravenös,
subkutan, intramuskulär)
wird es vorteilhafterweise als Lösung
des Materials in einer pharmazeutisch annehmbaren Flüssigkeit
hergestellt, wie z.B. isotonischer Salzlösung. Plasminogen oder Plasmin
können
lokal verabreicht werden, um eine hohe Konzentration zu erhalten,
beispielsweise mindestens 200 μg/ml
Plasminogen oder mindestens 20 μg/ml
Plasmin, bei der Perforation oder dem Wundbereich. Für die topische
Verabreichung kann die Plasminogen- oder die Plasminzusammensetzung
beispielsweise ein Teil eines Gels, einer Lotion, eines Balsams,
einer Paste, eines Sprays, eines Pulvers, einer Bandage oder eines
Wundverbandes sein. Zur Beschleunigung der Heilung einer Trommelfellmembranperforation wird
die Zusammensetzung vorzugsweise über den äußeren Ohrkanal verabreicht,
durch beispielsweise ein Spray, das in den Bereich der Perforation
eingeführt
wird, oder durch Zugabe von Plasminogen oder Plasminogenlösung tröpfenweise.
Vorrichtungen für
die Zufuhr von Zusammensetzungen durch Sprays sind auf dem Gebiet
bekannt und werden beispielsweise im US-Patent Nr. 6,027,712 beschrieben.
Strategien, wie z.B. eine Verabreichung von Plasminogen/Plasmin
durch ein Spray, wie auch durch ein Gel oder eine Paste oder eine topisch
verabreichte Lösung,
können
auch zur Behandlung von Wunden in der Oralhöhle verwendet werden. Für eine Beschleunigung
der Wundheilung können
Plasminogen oder Plasmin in einem Wundverband vorliegen, der auf
die Wunde aufgebracht wird, wovon sie auf den Wundbereich übertragen
werden.
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Definitionen
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Die
in dieser Beschreibung verwendeten Bezeichnungen haben allgemein
ihre üblichen
Bedeutungen auf dem Gebiet, im Kontext der Erfindung und in dem
spezifischen Kontext, in dem jede Bezeichnung verwendet wird. Bestimmte
Bezeichnungen werden unten diskutiert oder auch anderswo in der
Beschreibung, um eine zusätzliche
Anleitung an den Praktiker, bei der Beschreibung der Zusammensetzungen
und Verfahren der Erfindung und wie sie herzustellen und zu verwenden
sind, bereitzustellen.
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"Trommelfellmembran" und "Ohrtrommel" werden hier austauschbar
verwendet.
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Eine "Trommelfellmembranperforation" ist eine Öffnung in
der Trommelfellmembran, die üblicherweise durch
ein Trauma ausgelöst
wird. Es gibt mindestens vier generelle Kategorien: Kompressionsverletzungen (die
häufigsten
und üblicherweise
das Ergebnis eines Schlags auf das Ohr); Verletzungen durch Instrumente (die
zweithäufigste
Ursache, in der Regel nicht absichtlich ausgelöst, häufig durch Baumwollstäbchen oder Haarklammern);
Verbrennungs-Schlacke-Verletzungen (häufig in der Industrie beobachtet,
von heißem
Metall aus Maschinen oder beim Schweißen) und Druckverletzungen
(üblicherweise
während
des Krieges oder während
Bombardierungen beobachtet). Eine Infektion kann zu einer verzögerten Heilung
der Trommelfellmembran führen,
und eine persistente Perforation ist in der Regel eine Manifestation
einer Tubotympanitis, einer Entzündung
der Eustachischen Röhre
und der Trommelfellhöhe
(Mittelohr).
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Eine "Wunde" ist ein Bruch oder
eine Diskontinuität
in der Struktur eines Organs oder des Gewebes, einschließlich des
Epithels, Bindegewebes und Muskelgewebes, die durch ein externes
Mittel ausgelöst
wird. Beispiele für
Wunden beinhalten Hautwunden, blaue Flecke, Geschwüre, wundgelegene
Stellen, Kratzer, Risse, Schnitte, Punktierungen, Psoriasiswunden, Trommelfellmembranperforationen
und Verbrennungen, sind jedoch nicht hierauf begrenzt. Eine besondere
Art von Wunden sind diejenigen, die eine Konsequenz von plastischen
Chirurgieverfahren sind.
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"Topisch" und "topische Anwendung" betrifft die nicht-systemische,
lokale Verabreichung eines Wirkstoffs. So kann die topische Anwendung
die Anwendung eines Wirkstoffs auf die externe Oberfläche einer Wunde
bezeichnen.
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"Plasminogen" beinhaltet hier
endogen auftretendes Säugerplasminogen,
Allelplasminogen, funktional konservative Derivate von Plasminogen,
funktional aktive Plasminogenfragmente und Säugerplasminogenhomologe. Optional
kann eine Plasminogenzusammensetzung mehr als einen Typ, Derivat
oder Homolog von Plasminogen enthalten. Vorzugsweise ist die Plasminogenart,
die in einer an ein Subjekt zu verabreichenden Zusammensetzung verwendet
wird, für
die Species des Subjekts endogen. Eine bevorzugte Verbindung ist
Plasminogen, gereinigt aus einer biologischen Quelle, z.B. rekombinant
erzeugtes menschliches Plaminogen oder gereinigtes menschliches
Plasminogen, das beispielsweise von Biopool AB (Umeȧ, Schweden)
erhältlich
ist. Ein bevorzugtes menschliches Plasminogen hat die Aminosäuresequenz
der GenBank Accession Nr. PLHU (GI:62534 (SEQ ID NO: 1)).
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"Plasmin" beinhaltet hier
endogen auftretendes Säugerplasmin,
Allelplasmin, funktional konservative Derivate von Plasmin, funktional
aktive Plasminfragmente und Säugerplasminhomologe.
Optional kann eine Plasminzusammensetzung mehr als einen Typ, Derivat
oder Homolog von Plasmin enthalten. Vorzugsweise ist die Plasminart,
die in einer an ein Subjekt zu verabreichenden Zusammensetzung verwendet
wird, für
die Species des Subjekts endogen. Eine bevorzugte Verbindung ist
Plasmin, das von einer biologischen Quelle gereinigt wurde, z.B.
rekombinant erzeugtes menschliches Plasmin oder gereinigtes menschliches
Plasmin.
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"Funktional konservative
Varianten" sind
Proteine, bei denen ein gegebener Aminosäurerest ohne Veränderung
der Gesamtkonformation und Funktion des Proteins verändert wurde,
einschließlich,
jedoch nicht begrenzt auf den Ersatz einer Aminosäure durch
eine mit ähnlichen
Eigenschaften (wie beispielsweise sauer, basisch, hydrophob und ähnliche).
Aminosäuren
mit ähnlichen
Eigenschaften sind auf dem Gebiet wohl bekannt. Beispielsweise sind
Arginin, Histidin und Lysin hydrophil-basische Aminosäuren und
können
austauschbar sein. Ähnlich
kann Isoleucin, eine hydrophobe Aminosäure, durch Leucin, Methionin
oder Valin ersetzt werden. Andere Aminosäuren als die hier als konserviert
angegebenen, können
sich in einem Protein oder Enzym unterscheiden, so dass der Prozentsatz
der Protein- oder Aminosäuresequenzähnlichkeit
zwischen zwei Proteinen von ähnlicher
Funktion variieren kann, und kann beispielsweise bei 70 bis 99 %
liegen, bestimmt gemäß einem
Ausrichtungsschema, z.B. das Clusterverfahren, wobei die Ähnlichkeit
auf dem MEGALIGN-Algorithmus basiert. Eine "funktional konservative Variante" beinhaltet auch
ein Polypeptid oder Enzym, das eine mindestens 60%ige Aminosäureidentität, bestimmt
durch BLAST- oder FASTA-Algorithmen, vorzugsweise mindestens 75
%, noch bevorzugter mindestens 85 %, besonders bevorzugt mindestens
90 % und noch mehr bevorzugt 95 % aufweist, und das die gleichen
oder im Wesentlichen ähnlichen
Eigenschaften oder Funktionen wie das native oder Elternprotein
oder Enzym aufweist, mit dem es verglichen wird.
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Ein "Subjekt" beinhaltet hier
sowohl menschliche als auch nicht-menschliche Tiere. Nicht-menschliche Tiere
beinhalten ohne Begrenzung Säuger,
Labortiere, wie z.B. Mäuse,
Ratten, Kaninchen, Hamster, Meerschweinchen usw., Haustiere, wie
Hunde und Katzen und Hoftiere, wie Schafe, Ziegen, Schweine, Pferde
und Kühe.
Ein nicht-menschliches Tier der vorliegenden Erfindung kann ein
Säuger
oder ein Nicht-Säugertier
sein; ein Wirbeltier oder ein Invertebrat.
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Die "Behandlung" eines Subjekts oder "Behandeln" eines Subjekts im
Hinblick auf eine Erkrankung oder einen Zustand, bedeutet die Reduktion
oder Abschwächung
von klinischen Symptomen der Erkrankung oder des Zustandes, wie
z.B. einer beeinträchtigten
oder langsamen Wundheilung. "Unterstützen", "Verstärken" oder "Verbessern" der Trommelfellmembran-
oder Wundheilung allgemein bedeutet die Erhöhung der Geschwindigkeit, mit
der die Wunde oder Perforation heilt oder die Reduktion des Ausmaßes von
restlichen Narben oder nekrotischem Gewebe während oder nach der Heilung
der Wunde oder Perforation.
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Eine "Kontrolle", "Kontrollwert" oder "Referenzwert" in einem Assay ist
ein Wert, der verwendet wird, um eine Veränderung nachzuweisen, in beispielsweise
der Heilung der perforierten Trommelfellmembran oder einer Hautwunde
oder irgendwelchen anderen Assays, die hier beschrieben werden.
Wenn beispielsweise die Heilung einer Trommelfellmembranperforation
untersucht wird, kann die inhibitorische/stimulatorische Wirkung eines
Mittels durch Vergleich der Heilung einer Wunde oder einer Perforation
mit derjenigen einer Kontrolle bewertet werden. Die Kontrolle oder
Referenz kann beispielsweise ein vorherbestimmter Referenzwert sein oder
kann experimentell bestimmt werden. Beispielsweise kann in einem
solchen Assay eine Kontrolle oder Referenz die Heilung einer ähnlichen
Wunde oder Perforation bei einem Tier sein, das dem Arzneimittel
oder dem Wirkstoff nicht ausgesetzt wurde oder einem Tier, das mit
demselben Arzneimittel oder Wirkstoff behandelt wurde, das nicht
eine beeinträchtigte
Wundheilungsfähigkeit
aufweist.
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Eine "effektive Menge" oder eine "therapeutisch effektive
Menge" bedeutet
eine Menge, die die lokale und/oder systemische Konzentration von
Plasminogen erhöht
und/oder die Wundheilung verstärkt.
Beispielsweise kann eine effektive Menge eines Wirkstoffs eine Menge
sein, die zu einem lokalen (in der Perforation, Wunde oder dem Narbenbereich)
oder einem systemischen Niveau an Plasminogen führt, das 200 μg/ml überschreitet.
Alternativ ist eine effektive Menge eines Mittels eine Menge, die
zu einer schnelleren Heilung einer Perforation oder Wunde als in
Abwesenheit des Mittels führt
oder zu einer reduzierten Narben- oder nekrotischen Gewebebildung
als in Abwesenheit des Mittels. Eine effektive Menge könnte auch
eine Menge oder Dosis bedeuten, die ausreicht, um die lokalen oder
systemischen Niveaus von Plasminogen zu erhöhen, z.B. auf ungefähr 10 %,
vorzugsweise auf ungefähr
50 % und noch bevorzugter auf ungefähr 100 % des Niveaus, das vor
der Verabreichung des Wirkstoffs oder Arzneimittels angetroffen
wird. Alternativ ist eine effektive Plasminogenmenge eine Menge,
die zu ungefähr
5 μg bis
ungefähr
50 mg, vorzugsweise ungefähr
0,05 mg bis ungefähr
10 mg und noch bevorzugter ungefähr
0,5 mg bis ungefähr
5 mg Plasminogen pro Quadratzentimeter im Wundbereich führt. Eine
therapeutisch effektive Menge kann eine klinisch signifikante Reaktion
bei einem Subjekt verbessern oder präsentieren, nämlich darin,
dass z.B. eine Trommelfellmembranperforation oder Wundheilung unterstützt oder
eine Narbenbildung reduziert wird. Alternativ genügt eine
therapeutisch effektive Menge, um eine klinisch signifikante Wundheilung
oder einen Narbenbildungszustand im Wirt zu verbessern.
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Wie
hier verwendet, soll "ungefähr" oder "ca." innerhalb von 50
%, vorzugsweise innerhalb von 20 %, noch bevorzugter innerhalb von
5 %, eines gegebenen Wertes oder Bereichs bedeuten.
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Ein
Wert, der sich von anderen Werten "substantiell unterscheidet", kann bedeuten,
dass es einen statistisch signifikanten Unterschied zwischen den
beiden Werten gibt. Jedes geeignete statistische Verfahren, das
auf dem Gebiet bekannt ist, kann verwendet werden, um zu überprüfen, ob
die Unterschiede signifikant sind oder nicht. Ein "statistisch signifikanter" Unterschied bedeutet,
dass eine Signifikanz in einem Konfidenzintervall von mindestens
90 %, noch bevorzugter in einem 95 % Konfidenzintervall bestimmt
wird.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung können
konventionelle molekularbiologische, mikrobiologische und rekombinante
DNA-Techniken im Wissen des Fachmanns auf dem Gebiet verwendet werden.
Solche Techniken werden ausführlich
in der Literatur erklärt.
Siehe beispielsweise Sambrook et al. (Molecular Cloning – A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989); Glover (DNA
Cloning: A Practical Approach, Band I und II, 1985); Hames und Higgins
(Nucleic Acid Hybridization, 1985); Hames und Higgins (Transcription
And Translation, 1984); Freshney (Animal Cell Culture, 1986); Perbal
(A Practical Guide To Molecular Cloning, 1984); und Ausubel et al.
(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., 1994).
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Die
in der gegenwärtigen
Offenbarung verwendeten Abkürzungen
beinhalten die folgenden:
- uPA
- = Urokinase-Typ-Plasminogenaktivator;
- PA
- = Plasminogenaktivator;
- MMP
- = Matrixmetalloproteinase;
- TIMP
- = Gewebeinhibitor
der Metalloproteinase;
- tPA
- = Gewebe-Typ-Plasminogenaktivator;
- Plg
- = Plasminogen
- ECM
- = Extrazelluläre Matrix
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Verbesserung der Wundheilung
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Gemäß der Erfindung
wird die Wundheilung durch Bereitstellung oder Erhöhung der
Plasminogenniveaus verbessert.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird eine im Wesentlichen reine Präparation von menschlichem Plasminogen
verwendet. Das Plasminogen kann in gereinigter Form erworben werden
oder durch Reinigung der Komponente aus Menschen oder anderen Tieren
erzeugt werden oder durch eine rekombinante Produktion in Wirtszellen,
einschließlich
prokaryotischen Wirtszellen, wie S. cerevisiae oder E. coli, und
besonders bevorzugt Säugerwirtszellen,
wie CHO-Zellen. Das Plasminogen kann ein Wildtyp-menschliches, Säuger-homolog
oder modifiziert/mutiert sein. Insbesondere können Fragmente der Komponente,
die sich mindestens einen Teil der gewünschten Aktivität der Volllängenkomponente
erhalten, verwendet werden.
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Anwendungen
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Die
Erfindung kann verwendet werden, um die Heilung einer Trommelfellmembran
oder einer anderen Wunde in Tieren zu beschleunigen, einschließlich jedoch
nicht begrenzt auf Wirbeltiere, wie Menschen und Haustiere, einschließlich Hunde,
Katzen und Pferde. Zusätzlich
kann Plasminogen in dieser klinischen Anwendung verwendet werden,
um die Narbengewebebildung und die Bildung von nekrotischem Gewebe
in einem Wundbereich zu reduzieren und die Entfernung von Gewebeabfall
zu verstärken.
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In
einer Ausführungsform
wird die Erfindung auf die Verstärkung
der Heilung einer perforierten Trommelfellmembran bei einem Menschen
angewandt. Das menschliche oder nicht-menschliche Subjekt kann an einem
Zustand leiden oder auch nicht, der die Heilung der Trommelfellmembranperforation
beeinträchtigt
oder verlangsamt.
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Da
die Erfindung nicht nur die Wundheilungsrate erhöht, sondern auch die Qualität der Wunden
verbessert, d.h. das Auftreten von Narben und von nekrotischem Gewebe
reduziert, kann Plasminogen jedem Patienten verabreicht werden,
um die Narbenbildung zu reduzieren. Das Subjekt kann ein Mensch
sein, der Pläne hat,
sich einer plastischen Chirurgie oder der Anwendung eines Hautersatzes
zu unterziehen, diesem unterzogen wird oder unterzogen wurde. In
einem solchen Fall kann eine Zusammensetzung, umfassend Plasminogen,
angewandt werden oder sowohl vor als auch nach der Chirurgie verabreicht
werden.
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Weiterhin
kann die Verabreichung von Plasminogen ein normales Wundheilungsmuster
in Situationen einer beeinträchtigten
Wundheilung wieder beginnen. Ohne an eine bestimmte Theorie gebunden
zu sein, können
neben einer Fibrinolyse erhöhte
Plasminogenniveaus zu erhöhtem
Plasmin führen,
was einen Wundheilungsprozess durch Aktivierung der Zytokinwege
initiieren kann.
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Zusammensetzungen
und Behandlungen
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Hier
werden Plasminogenzusammensetzungen beschrieben, die, wenn sie in
einer effektiven Menge verabreicht werden, zu einem erhöhten Plasminogenniveau
im Wundbereich eines Subjekts führen
und dadurch zu einer verbesserten Heilung einer Trommelfellmembranperforation
oder einer anderen Wunde.
-
Beispielsweise
kann zur Beschleunigung einer Trommelfellmembranheilung eine Zusammensetzung, umfassend
ungefähr
5 μg bis
ungefähr
50 mg, vorzugsweise ungefähr
0,05 mg bis ungefähr
10 mg und noch bevorzugter ungefähr
0,5 mg bis ungefähr
5 mg Plasminogen, einschließlich
eines Plasminogenhomologs oder -derivats auf den Bereich, der die
Trommelfellmembranperforation umgibt, angewandt werden. Alternativ können ungefähr 10 bis
50 μl einer
1 mg/ml Plasminogenlösung
oder die korrespondierende Menge, die in anderer geeigneter Formulierung
zugeführt
wird, angewandt werden. Zur Beschleunigung der Heilung von Wunden
im Allgemeinen kann eine Plasminogenzusammensetzung so angewandt
werden, dass die Plasminogenmenge pro Quadratzentimeter (cm2) des Wundbereichs ungefähr 5 μg bis ungefähr 50 mg, vorzugsweise ungefähr 0,05
mg bis ungefähr
10 mg umfasst und noch bevorzugter ungefähr 0,5 mg bis ungefähr 5 mg
Plasminogen, einschließlich
eines Plasminogenhomologs oder Derivats.
-
Alternativ
wird das Plasminogen so verabreicht, dass eine lokal hohe Plasminogenkonzentration
in der Trommelfellmembranperforation oder dem Wundbereich eines
Subjekts, z.B. eines menschlichen Patienten, erreicht wird. Bei
einer bevorzugten Ausführung
führt die
Verabreichung einer effektiven Menge des Wirkstoffs zu einer Plasminogenkonzentration
von mindestens ungefähr
200 μg/ml
in der Perforation oder dem Wundbereich. In noch einer anderen bevorzugten
Ausführungsform
führt die
Verabreichung einer effektiven Menge des Wirkstoffs zu einer Plasminogenkonzentration
von mindestens ungefähr
200 μg/ml
in der Perforation oder dem Wundbereich. In noch einer bevorzugten
Ausführungsform
liegt die Konzentration an Plasminogens, die sich aus der Verabreichung
einer effektiven Menge eines Wirkstoffs ergibt, bei ungefähr 2 μg/ml bis
zu ungefähr
2 mg/ml, noch bevorzugter mindestens 200 μg/ml. Die Plasminogenkonzentration
im menschlichen Plasma liegt bei ungefähr 200 μg pro ml.
-
Plasminogen
kann in pharmazeutischen Zusammensetzungen für die Verabreichung an Subjekte
in einer biologisch kompatiblen Form, die für eine in vivo-Verabreichung
geeignet ist, formuliert werden, z.B. durch topische Verabreichung,
Injektion oder Infusion. Unter biologisch kompatibler Form, die
für eine
in vivo-Verabreichung geeignet ist, wird eine Form der zu verabreichenden
Substanz verstanden, wobei irgendwelche toxischen Wirkungen durch
die therapeutischen Wirkungen übertroffen
werden. Die Verabreichung einer therapeutisch aktiven Menge der
pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung ist
als eine effektive Menge in Dosierungen und für Zeitspannen, die notwendig
sind, um das gewünschte
Ergebnis zu erreichen, definiert. Beispielsweise kann eine therapeutisch
aktive Menge der Substanz gemäß Faktoren, wie
dem Zustand der Erkrankung, dem Alter, dem Geschlecht und dem Gewicht
des Individuums, variieren.
-
Behandlungsvorschriften
können
so eingestellt werden, um die optimale therapeutische Reaktion bereitzustellen.
Beispielsweise kann mehr als eine unterteilte Dosis täglich verabreicht
werden oder die Dosis kann proportional reduziert werden, wie angezeigt
durch die Anforderungen der therapeutischen Situation.
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Falls
gewünscht,
können
auch andere Wirkstoffe zusammen mit Plasminogen- oder einer Plasminbehandlung
einer Perforation oder Wunde verwandt werden. Solche Wirkstoffe
beinhalten Säuger-PAs,
wie z.B. menschliches tPA oder menschliches uPA, oder bakterielle
PAs, wie z.B. Streptokinase, sind jedoch nicht hierauf begrenzt.
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Die
aktive Substanz kann auf geeignete Weise verabreicht werden, wie
z.B. durch Injektion (subkutan, intravenös etc.), Inhalation, ein Spray,
durch topische oder transdermale Anwendung oder durch rektale Verabreichung.
Abhängig
von dem Verabreichungsweg kann die aktive Substanz mit einem Material
beschichtet sein, um die Verbindung vor der Wirkung von Enzymen
zu schützen,
vor Säuren
und anderen natürlichen
Zuständen,
die die Verbindung inaktivieren könnten. So beinhalten geeignete
Verabreichungswege die topische, intravenöse, intramuskuläre, intradermale,
rektale und intravaginale Verabreichung. Ein bevorzugter Verabreichungsweg
ist die topische Verabreichung. Im Fall von Trommelfellmembranperforationen
kann der Wirkstoff über
den äußeren Ohrkanal
verabreicht werden. Die Gefäße, die
die Trommelfellmembran stützen,
enden an der Grenze der Membran. Dementsprechend erreichen Blut
und Blutkomponenten, wie Sauerstoff, Nährstoffe und Plasminogen die
Trommelfellmembran nur durch Diffusion.
-
Die
hier beschriebenen Zusammensetzungen können durch per se bekannte
Verfahren für
die Herstellung von pharmazeutisch annehmbaren Zusammensetzungen
hergestellt werden, die an Subjekte verabreicht werden können, so
dass eine effektive Menge der aktiven Substanz in einer Mischung
mit einem pharmazeutisch annehmbaren Vehikel kombiniert wird. Geeignete
Vehikel werden beispielsweise in Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing
Company, Easton, Pa., USA 1985) beschrieben. Auf dieser Basis beinhalten
die Zusammensetzungen, wenn auch nicht exklusiv, Lösungen der
Substanzen oder Verbindungen in Assoziation mit ein oder mehr pharmazeutisch
annehmbaren Vehikeln oder Verdünnungsmitteln
und sind Pufferlösungen
mit einem geeigneten pH und iso-osmotisch mit den physiologischen
Flüssigkeiten
enthalten.
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Beispiele
für Vehikel,
die bei der Zufuhr von Plasminogen oder anderen Zusammensetzungen
gemäß der Erfindung
verwendet werden können, beinhalten
injizierbare Dosierungsformen, Infusionen, Gels, Pasten, Balsame,
Wachse, Lotionen, Hautcremes und verschiedene andere Formate für die topische
Verabreichung, die auf dem Gebiet bekannt sind, sind jedoch nicht
hierauf begrenzt. Die Zusammensetzungen können auch lokal in Form eines
Pulvers oder einer Lösung
verabreicht werden, die auf den Wundbereich gesprüht werden. Alternativ
können
die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
in Wundverbänden,
Pflastern, Verbänden, Gaze
oder anderen Mitteln vorliegen, die auf eine Wunde aufgebracht werden,
von wo aus sie in den Wundbereich transferiert werden. Solche Vorrichtungen
beinhalten auch Vorrichtungen mit einer langsamen Freisetzung, die
kontinuierlich Plasminogen oder andere Komponenten über eine
längere
Zeitspanne freisetzen. Im Hinblick auf eine Heilung von Trommelfellmembranen
ist die Verabreichung der Zusammensetzung unter Verwendung eines
Gels, Sprays oder einer tröpfchenweise
Anwendung über
den äußeren Ohrkanal
eine bevorzugte Ausführungsform.
Injizierbare Dosierungsformen oder Infusionen umfassen eine Lösung von
Plasminogen und Plasmin in einer pharmazeutisch annehmbaren Flüssigkeit,
wie beispielsweise isotonischer Salzlösung, sterilem Wasser oder
wässrigen
Puffersystemen.
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Nachdem
die pharmazeutischen Zusammensetzungen hergestellt wurden, können sie
in einen geeigneten Behälter
platziert und für
die Behandlung eines indizierten Zustandes markiert werden. Für die Verabreichung
einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung
würde eine
solche Markierung die Menge, die Frequenz und das Verabreichungsverfahren
beinhalten.
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Die
Verabreichung von Plasminogen kann mindestens einmal wiederholt
werden. Beispielsweise könnte
Plasminogen in regelmäßigen Intervallen,
z.B. mindestens ungefähr
1 × jeden
2. Tag, ungefähr
1 × am Tag
oder ungefähr
2 × am
Tag verabreicht werden oder könnte
zu Wundverbänden
oder Vorrichtungen mit langsamer Freisetzung zugefügt werden,
die je nach Bedarf getauscht werden.
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Beispiele
-
Die
Erfindung wird weiter durch die folgenden Beispiele beschrieben.
Diese Beispiele sind für
die Erfindung nur illustrativ und sollen den Umfang und die Bedeutung
derselben auf keine Weise begrenzen. Tatsächlich werden viele Modifikationen
und Variationen der Erfindung dem Fachmann auf dem Gebiet beim Lesen
dieser Beschreibung deutlich werden und können ohne vom Umfang abzuweichen
durchgeführt
werden.
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Beispiel 1: Heilung von
unterbrochenen Trommelfellmembranen bei Wildtyp- und Plasminogen-defizienten Mäusen
-
Dieses
Beispiel zeigt, dass Plasminogen-defiziente Mäuse eine verzögerte und
abnormale Wundheilung im Vergleich mit den Wildtyp-Kontrollgeschwistern
aufweisen. Kurzzeitstudien zwischen Plasminogendefizienten und den
Wildtyp-Kontrollmäusen
zeigten von so früh
an wie 6 Stunden nach der durchgeführten Performation, dass die
Plasminogendefizienten Mäuse
eine sehr viel stärkere
entzündliche
Reaktion aufwiesen, was anzeigte, dass Plasminogen bereits so früh wie in
dem Entzündungszustand
der Wundheilung wirkt.
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Verfahren
-
Mäuse: Erwachsene
männliche
Plasminogen-defiziente und Wildtyp-Geschwistermäuse (C57BL/6J, 8–12 Wochen
alt) wurden durch einen chromogenen Aktivitätsassay genotypisiert, der
das Plasminogenniveau in Mausplasma bestimmt (Ny et al., Endocrinology,
140(11):5030–5
(1999)) und durch PCR bestätigt.
Die Mäuse
wurden anästhesiert
und unter einem Otomikroskop wurden ihre Trommelfellmembranen mit
einer Myringotomie-Lanzette perforiert. Die Perforation besetzte
den oberen hinteren Quadranten der Trommelfellmembran.
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Genotypisierung
der Tiere mit PCR. Genomische DNA wurde aus Mausschwanzspitzen isoliert
und durch PCR genotypisiert. Die Sequenzen der in der PCR-Reaktion
verwendeten Primerpaare waren die folgenden:
Neo: 5' ATG ATT GAA CAA
GAT GGA TTG CAC G 3' (SEQ
ID NO:2)
5' TTC
GTC CAG ATC ATC CTG ATC GAC 3' (SEQ
ID NO:3)
Plg: 5' TCA
GCA GGG CAA TGT CAC GG 3' (SEQ
ID NO:4)
5' CTC
TCT GTC TGC CTT CCA TGG 3' (SEQ
ID NO:5)
-
"Neo" bedeutet Neomycin,
wobei es sich um einen Resistenzmarker handelt, der für die Entwicklung von
Gen-defizienten Mäusen
verwendet wird. Das neo-Gen wird dem Genom als "Bullet" zugefügt, um das Gen zu inaktivieren.
Einer Gen-defizienten Zelle fehlt daher das intakte Gen, jedoch
weist sie stattdessen das neo-Gen inseriert auf.
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Eine
PCR wurde durch das Standardverfahren durchgeführt. Kurz gefasst, handelt
es sich um eine anfängliche
Denaturierung bei 94°C
für 3 Minuten,
gefolgt von 30 Zyklen einer Denaturierung bei 92°C für 30 Sekunden, einem Annealing
bei 55°C
für 30
Sekunden und einer Elongation bei 72°C für 45 Sekunden und schließlich gefolgt
von einer 5-minütigen
Elongation bei 72°C.
-
Genotypisierung
der Tiere mit einem chromogenen Assay. Um das Plasminogenniveau
in Mäuseplasma
zu überprüfen, wurde
eine Urokinase (Ukidan) zugefügt
und die Plasminmenge, die gebildet wurde, wurde bestimmt.
-
Durch
Vergleich der Menge an erzeugtem Plasmin zwischen den unterschiedlichen
Plasmaproben konnte der Genotyp einer Maus bestimmt werden. Kurz
gefasst wurde Blut aus der Mäuseschwanzspitze
in Gegenwart von 0,04 M Citronensäure gesammelt. Das Plasma wurde
durch Zentrifugation für
10 Minuten bei 3000 U/min hergestellt und bei –20°C gehalten, bis das Experiment
durchgeführt
wurde. Mausplasma, das 1000-fach verdünnt war, wurde mit 65 nM Urokinase,
10 mM Lysin und 80 μM
chromogenem Substrat S-2251 in
PBS bei 37°C
in einer Platte (96 Vertiefungen) mit einem Gesamtvolumen von 200 μl/Vertiefung
inkubiert. S-2251 färbte
sich, wenn es von einer Proteinase gespalten wurde. Individuelle
Leerproben zur Kompensation unterschiedlicher Farben der Plasmaproben
waren identisch zu der Probe, mit der Ausnahme, dass keine Urokinase
enthalten war. Die Absorption wurde bei 405 nm alle 30 min für 2 Stunden
mit einem Mikrotitertek Plate Reader gemessen. Der durchschnittliche
Anstieg der Absorption über
die Zeit wurde für
jede Maus berechnet. Die drei unterschiedlichen Genotypen konnten
als drei unterschiedliche Niveaus eines durchschnittlichen Anstiegs
der Absorption über
die Zeit, als hoch (plg+/+), mittel (plg+/–) und niedrig (plg–/–) unterschieden
werden.
-
Klinische
Bewertung der Wundheilung und histologische Präparationen. Das Wundheilungserscheinungsbild
wurde unter dem Otomikroskop jeweils 4, 8, 36, 72 und 144 Tage nach
der Perforation bewertet. An jedem Zeitpunkt wurden die Mäuse dekapitiert,
ihre Bulloetympanica wurden von weichem Gewebe gereinigt, geöffnet und
in 2 % Glutaraldehyd in Cacodylatpuffer über Nacht platziert. Die Trommelfellmembran,
einschließlich
der Pars tensa und Pars flaccida wurde seziert, gespült und in
Osmiumtetroxid post-fixiert. Nach einer Dehydratisierung in Aceton
wurden die Proben in einem Epoxyharz eingebettet. Die Kunststoff-eingebetteten
Trommelfellmembranen wurden parallel zum Griff des Malleus durch
den perforierten Quadranten sektioniert. Die Toluidin-blaugefärbten 0,5 μm-Sektionen
wurden dann unter dem Lichtmikroskop überprüft. Ultradünne Sektionen mit einer Dicke
von 700 nm wurden ebenfalls geschnitten und mit Uranylacetat und
Bleicitrat kontrastiert und dann im Elektronenmikroskop untersucht.
-
Ergebnisse
-
Die
Heilung der Trommelfellmembran war bei den Plasminogendefizienten
Mäusen
beeinträchtigt,
wie sich durch eine histologische und morphologische Überprüfung ergab
(siehe Tabelle 2). Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse der Bewertung
des otomikroskopischen Erscheinungsbildes der Trommelfellmembran
als Funktion der Zeit nach der Perforation. Die Anzahl von eindeutig
geschlossenen Trommelfellmembranen wird im Hinblick auf die Gesamtzahl,
die überprüft wurde,
angegeben. Eine morphologische Analyse ergab, dass die Wildtyp-Mäuse perfekt
heilten, dass jedoch alle Perforationen bei Plasminogen-defizienten
Mäusen
ein vollständig unterbrochenes
Heilmuster im Vergleich zum Wildtyp aufwiesen.
-
Tabelle 2
-
Heilung der Trommelfellmembran
wird permanent bei den Plasminogendefizienten Mäusen beeinträchtigt
-
Die
Tabelle zeigt die Fraktion von eindeutig bedeckten Trommelfellmembranen
jeder Gruppe zu jedem Zeitpunkt.
-
Außerdem wurden
Daten der Heilung von Mäusen,
die für
die Plasminogen-Gendaten heterozygot sind, bewertet. Diese Mäuse hatten
50 % der Plasminogenkonzentration in ihren Körperflüssigkeiten, und es zeigte sich,
dass sie im Vergleich zu den Wildtyp-Mäusen eine verzögerte Heilung
hatten. Dies zeigt, dass der Heilungsprozess dosisabhängig ist
und dass so die Verabreichung von Plasminogen an Wildtyp-Mäuse und Menschen
den Heilungsprozess beschleunigen könnte.
-
Beispiel 2: Trommelfellmembranheilung
bei Plasminogen-defizienten Mäusen,
rekonstituiert mit Plasminogen
-
Dieses
Beispiel demonstriert, dass durch Rekonstitution von Plasminogen
bei Plasminogen-defizienten Mäusen
durch systemische Verabreichung der Phänotyp vollständig zurück zu einer
normalen Wundheilung konvertiert werden kann.
-
Verfahren
-
Dieses
Experiment wurde auf ähnliche
Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt,
mit der Ausnahme einer Verabreichung von Plasminogen an eine Gruppe
von Tieren.
-
Rekonstitution
von Plasminogen bei Plasminogen-defizienten Mäusen. Menschliches Plasminogen wurde
in Plasminogen-defizienten Mäusen
durch wiederholte intravenöse
Injektionen von 1,5 mg Plasminogen in 100 μl Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS)
rekonstituiert. Die erste Dosis wurde 12 Stunden vor der Perforation
der Trommelfellmembran verabreicht. Danach wurde Plasminogen alle
24 Stunden während
der Dauer des Experiments verabreicht.
-
Ergebnisse
-
Die
Rekonstitution von Plasminogen bei Plasminogen-defizienten Mäusen durch
i.v.-Injektion stellte die normale Wundheilung bei Plasminogendefizienten
Mäusen
wieder her. Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse der Bewertung des otomikroskopischen
Erscheinungsbilds der Trommelfellmembran nach der Heilung. Die Anzahl von
geheilten Trommelfellmembranen wird in Beziehung auf die Gesamtzahl,
die überprüft wurde,
angegeben.
-
Tabelle 3
-
Trommelfellmembranheilung
bei Plg-defizienten Mäusen
nach der Plg-Verabreichung
-
Die
Tabelle zeigt die Fraktion von geheilten Trommelfellmembranen jeder
Gruppe zu jedem Zeitpunkt
-
So
ist die Wundheilung bei den Plasminogen-defizienten Mäusen in
der Trommelfellmembran abnormal, während die Heilung der Trommelfellmembran
bei Plasminogen-defizienten Mäusen
nach Verabreichung von Plasminogen wieder hergestellt wird. Zusätzlich hatte
keine der Plasminogen-defizienten Mäuse nach 144 Tagen normal verheilte
Trommelfellmembranen, das Heilungsmuster wich vollständig ab,
nämlich
darin, dass die Trommelfellmembrane dick und nicht-transparent wurden,
mit weißlichem
pflastersteinähnlichem
Gewebe, das den Wundbereich bedeckt. Eine morphologische Analyse
ergab, dass die Gewebeauffüllung
des Wundbereichs eine Fibrin-ähnliche
Struktur hatte, was anzeigte, dass die Zellmigration behindert worden
war. Eine Nekrose wurde von Tag 16 an deutlich.
-
Beispiel 3: Heilung von
Trommelfellmembranperforationen bei tPA-defizienten Mäusen
-
Trommelfellmembranen
(TM) von tPA-defizienten (TPA–/–) und Wildtyp-Mäusen wurden am Tag 0 perforiert
und das Heilungsmuster unter dem Otomikroskop, wie oben beschrieben,
verfolgt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 beschrieben. tPA-defiziente
Mäuse waren
6 × mit
dem C57B1/6-Hintergrund
zurückgekreuzt
und waren einmal mit DBAl/J-Hintergrund gekreuzt. Die heterozygoten
Nachkommen wurden für
die Züchtung
verwendet. Die Wildtyp (tPA+/+)- und die homozygoten (tPA–/–)-Nachkommen
dieser Züchtungen
wurden bei den Wundheilungsexperimenten verwendet.
-
Tabelle 4
-
Heilung von Trommelfellmembranen
bei tPA-defizienten Mäusen
-
Die
Tabelle zeigt die Fraktion der geheilten Trommelfellmembranen in
jeder Gruppe zu jedem Zeitpunkt
-
Das
Heilungsmuster der TM-Perforation bei tPA–/–-Mäusen war
identisch zu demjenigen der Wildtyp-Kontrollmäuse, und die Qualität von geheiltem
TM-Gewebe bei tPA–/–-Mäusen und Wildtyp-Kontrollen
erschien identisch zu sein, darin dass kein "pflastersteinähnliches" Gewebe oder Fibrinablagerungen im Wundbereich
beobachtet werden konnten. Dementsprechend wurde kein signifikanter
quantitativer oder qualitativer Unterschied der Trommelfellmembranheilung
bei tPA-defizienten Mäusen
im Vergleich mit dem Wildtyp beobachtet, was anzeigt, dass tPA eine
geringere, wenn überhaupt
eine Rolle in der Trommelfellmembranheilung spielt.
-
Beispiel 4: Heilung von
Trommelfellmembranperforationen bei uPA-defizienten Mäusen
-
Trommelfellmembranen
in Wildtyp- und uPA-defizienten (uPA–/–)-Mäusen wurden
am Tag 0 perforiert, und das Heilungsmuster durch ein Otomikroskop,
wie oben beschrieben, überwacht.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 dargestellt. uPA-defiziente Mäuse waren
6 × mit
dem C57B1/6-Hintergrund rückgekreuzt,
und waren 1 × mit
dem DBAl/J-Hintergrund gekreuzt. Die heterozygoten Nachkommen wurden
für die
Züchtung
verwendet. Die Wildtyp (uPA+/+)- und homozygoten
(uPA–/–)-Nachkommen
aus diesen Züchtungen
wurden in den Wundheilungsexperimenten verwendet.
-
Tabelle 5
-
Heilung von Trommelfellmembranen
bei uPA-defizienten Mäusen
-
Die
Tabelle zeigt die Fraktion von geheilten Trommelfellmembranen in
jeder Gruppe zu jedem Zeitpunkt
-
Dieses
Experiment zeigte, dass die Heilung von einer Trommelfellmembranperforation
bei uPA-defizienten Mäusen
im Vergleich zu den Wildtypkontrollen etwas verzögert war, und dass weißliches
und pflastersteinähnliches
Gewebe mit Fibrinablagerungen im perforierten Bereich nach der Heilung
beobachtet werden konnte. Diese Daten legen nahe, dass uPA eine
Rolle beim Trommelfellmembran- oder Wundheilungsprozess spielen
könnte
und potentiell die Clearance von Fibrinablagerungen beeinflusst,
wenn auch in einem geringeren Grad als Plasminogen.
-
Beispiel 5: "Späte" Verabreichung von
Plasminogen
-
Dieses
Beispiel zeigt, dass ein beeinträchtigter
Heilungsprozess durch Verabreichung von Plasminogen etliche Wochen
nach Durchführung
der Trommelfellmembranperforation wieder hergestellt werden kann.
-
Verfahren:
Plasminogen-defiziente (plg–/–)-Mäuse wurden,
wie oben beschrieben, hergestellt. Die Trommelfellmembranen wurden
am Tag 0 perforiert. Am Tag 36 und danach für 7 Tage wurde an eine Gruppe der
plg–/- Mäuse täglich 1,5
mg menschliches Plasminogen in 150 μl Lösung injiziert.
-
Ergebnisse:
Eine Reduktion der abnormal akkumulierten extrazellulären Matrix
aufgrund der Verabreichung von Plasminogen konnte durch Otomikroskopie
nachgewiesen werden. Spezifisch begann bei den Plasminogendefizienten
Mäusen,
die tägliche
Verabreichungen des Plasminogens erhielten, eine entzündliche
Reaktion, die zu einer Exsudation von akkumuliertem Material aus
dem Trommelfellmembranbereich innerhalb von 2 Tagen nach der ersten
Verabreichung führte.
Während
der 7-tägigen
Injektionsperiode zeigten diese Mäuse eine deutlich verminderte
Dicke der abnormal angehäuften
extazellulären
Matrix (im Wesentlichen bestehend aus Fibrin und nekrotischem Gewebe).
Nach dieser anfänglichen
7-tägigen
Periode ähnelte
das Heilungsmuster einiger Trommelfellmembranen demjenigen einer
normalen Heilung. Diese Ergebnisse zeigen, dass Plasminogen für die Fibrin-Clearance und die
Entfernung von nekrotischem Gewebe essentiell ist.
-
In
einem ähnlichen
Plasminogen-Wiederherstellungsexperiment erhielten Plasminogen-defiziente Mäuse Plasminogen
während
entweder den Tagen 0–3, den
Tagen 4–7
oder den Tagen 8–11
nach der Perforation. Dieses Experiment zeigte, dass Plasminogen
während
allen 3 Stufen der Wundheilung wichtig war: der entzündlichen
Stufe, der Gewebebildungsstufe und der Gewebe-Remodellierungsstufe.
-
Beispiel 6: Topische Anwendung
von Plasminogen an perforierte Trommelfellmembranen bei Wildtyp-Ratten
-
Dieses
Beispiel zeigt, dass die Heilung der Trommelfellmembranperforationen
bei Wildtyp-Ratten durch eine lokale Anwendung von Plasminogen verbessert
ist.
-
Verfahren:
Zehn Trommelfellmembranen pro Tierstudiengruppe wurden punktiert.
50 μl PBS
(Kontrolle) oder menschliches Plasminogen in einer Konzentration
von 1 mg/ml oder 10 mg/ml wurden direkt auf die Trommelfellmembranperforation
aufgebracht. Die Zugabe von Plasminogen oder Kontrolle wurde alle
24 Stunden wiederholt und die Entzündungsreaktion und das Heilungsmuster
wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten überwacht. Spezifisch wurde
die Anhäufung
von entzündlicher
Flüssigkeit
in der Mittelohrhöhle
des Vorhöhlen(attic-)bereiches
verfolgt, und das Schrumpfen der TM-Perforationen wurde während der
ersten 108 Stunden nach den Perforationen verfolgt.
-
Ergebnisse.
Die mittlere Heilungszeit in jeder Gruppe wurde verfolgt und ist
in Tabelle 6 unten dargestellt. Die Tabelle zeigt die durchschnittliche
Zeitspanne für
die Heilung einer Trommelfellmembranperforation für jede Gruppe.
-
Tabelle
6 Verbesserung
der Heilung von Trommelfellmembranperforationen bei Wildtyp-Ratten durch Verabreichung von
Plasminogen
-
Die
Ratten, die 10 mg/ml Plasminogen erhielten, hatten die stärkste Entzündungsreaktion
im Vorhöhlenbereich
des Mittelohrs, während
die Ratten, die 1 mg/ml Plasminogen erhielten, eine fast gleiche
Entzündungsreaktion
wie die Kontrollen zeigten. Die schnellste Heilung von Trommelfellmembranen
wurde in der 10 mg/ml-Gruppe beobachtet, obwohl beide Gruppen, die
Plasminogen erhielten, eine verbesserte Schrumpfung der Perforation
während
der ersten 108 Stunden im Vergleich zu den Kontrollen zeigten.
-
Beispiel 7: Charakterisierung
der Gewebe-Remodellierung und Zellmigrationsereignisse bei Plasminogen-defizienten
Mäusen
-
Um
die abnormale Geweberemodellierung und Zellmigrationsereignisse
bei Plasminogen-defizienten (plg–/–)-Mäusen zu
charakterisieren, wurden serielle Immunfärbungen von Keratin, Fibrin
und Neutrophilen an heilenden/geheilten Trommelfellmembranen von
Wildtyp- und plg–/– Mäusen an
den Tagen 4, 8, 16, 36, 72 und 144 nach Perforationen durchgeführt. Der
neutrophil-reaktive Antikörper
stammte von Cedarlane (Kanada), der anti-Keratin-Antikörper von ICN Pharmaceuticals,
Inc. und der Fibrinogen/Fibrinreaktive Antikörper von Nordic Immunlogy.
-
Ergebnisse.
Am Tag 36 und danach nach der Perforation hatten Plasminogen-defiziente
Mäuse eine abnormale
extrazelluläre
Matrixzusammensetzung im Vergleich zu Wildtypmäusen. Bei den Plasminogendefizienten
Mäusen
enthielten die Perforationen erhöhte
Mengen an Fibrin anstelle von Keratin, während das Keratin an der Perforationsgrenze "gehalten" wurde. Unter dem
Otomikroskop werden diese Fibrinablagerungen als weißliche, "pflastersteinähnliche" Krustengewebe gesehen.
Große
Mengen an Neutrophilen hatten ebenfalls den Wundbereich infiltriert.
Weiterhin war nekrotisches Gewebe bei allen Plasminogen-defizienten
Mäusen
am Tag 16 nach der Perforation und danach deutlich. Die Wildtyp-Mäuse zeigten
einen geheilten Wundbereich, der identisch war wie normale Wildtyp-Kontrollen.
-
Diese
Daten legen nahe, dass Plasminogen entweder direkt oder über die
Bildung von Plasmin für
die Verhinderung oder Reduktion von Fibrinablagerungen, die Unterstützung der
Keratinschichtbildung wie auch die Entfernung von nekrotischem Gewebe
wichtig ist.
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Die
vorliegende Erfindung soll nicht durch den Umfang der hier beschriebenen
spezifischen Ausführungsformen
begrenzt sein. Tatsachlich werden verschiedene Modifikationen der
Erfindung zusätzlich
zu den hier beschriebenen dem Fachmann auf dem Gebiet aus der vorstehenden
Beschreibung und den begleitenden Figuren deutlich werden. Solche
Modifikationen sollen in den Umfang der beigefügten Ansprüche fallen.
-
Es
sollte weiter verstanden werden, dass Werte ungefähr sind
und für
die Beschreibung bereitgestellt werden.
-
-
-
-
-
-) Lösung wurde nach der Perforation und danach alle 24 Stunden verabreicht.
