DE60203599T2

DE60203599T2 - Methode zur Inaktivierung von TSE

Info

Publication number: DE60203599T2
Application number: DE60203599T
Authority: DE
Inventors: Neil D.H. Health Protection Agency RAVEN
Original assignee: Health Protection Agency
Current assignee: Health Protection Agency
Priority date: 2001-01-08
Filing date: 2002-01-08
Publication date: 2006-01-19
Anticipated expiration: 2022-01-09
Also published as: AU2002219336B2; EP1577382A2; JP4427587B2; ATE292679T1; WO2002053723A2; JP2008174568A; WO2002053723B1; EP1360282A2; EP1360282B1; ES2237675T3; EP1577382A3; HK1057062A1; PT1360282E; JP2004516845A; WO2002053723A3; JP4427252B2; CA2434129A1; DE60203599D1; AU2002219336C1

Description

Die Erfindung liegt auf dem Gebiet der Verfahren und Zusammensetzungen für die Sterilisierung von Materialien und Geräten, die mit infektiösen Keimen kontaminiert worden sein könnten, und für die Detektion jener Keime. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf Verfahren für die Inaktivierung und Detektion von Mitteln der übertragbaren spongiformen Enzephalopathie (TSE) und stellt Zusammensetzungen zum Abbauen und Detektieren von TSE, die auf oder innerhalb infizierter Materialien lokalisiert ist, bereit.
Übertragbare spongiforme Enzephalopathien (TSEs) sind eine Gruppe tödlicher neurologischer Erkrankungen, die Creutzfeld-Jacob-Erkrankung (CJD) und Kuru beim Menschen, bovine spongiforme Enzephalopathie (BSE) beim Rind und Scrapie beim Schaf einschließen. TSEs sind durch Umwandlungen eines normalen Wirtsproteins in ein pathogenes Protein innerhalb des Gehirngewebes eines infizierten Tieres gekennzeichnet. Auf die pathogene Form des Proteins wird oftmals Bezug genommen als ein Prion und es ist hochresistent gegen physikalischen und chemischen Abbau. Von dem Prion wird angenommen, dass es das übertragende Mittel ist, durch welches die TSE-Erkrankung zwischen Tieren weitergegeben wird.
Es gab in den vergangenen Jahren eine merkliche öffentliche Beunruhigung über die mit dem Verzehr von Fleischprodukten und insbesondere Rindfleisch, das möglicherweise mit BSE, der Rinderform von TSE, infiziert worden ist, in Verbindung stehenden Risiken. Viele dieser Befürchtungen stehen in Verbindung mit der Annahme, dass das BSE-Prion, wenn es von einem Menschen gegessen wird, in einigen Fällen die unheilbare menschliche Form der Erkrankung verursacht, auf die als variante CJD (vCJD) Bezug genommen wird. Es wurden rigorose Praktiken in den landwirtschaftlichen und Fleisch verarbeitenden Industrien angenommen, um das Risiko der Kreuzkontamination zwischen BSE-infizierten Kadavern und Fleisch, das für den menschlichen Verzehr bestimmt ist, oder andere vom Tier abgeleitete Produkte, wie Talg, zu reduzieren. Mit BSE infizierte Tiere können jedoch immer noch unbeabsichtigt in Schlachthäusern verarbeitet werden, insbesondere, falls sich das Tier im frühen Krankheitsstadium befindet und deshalb als ein infizierter TSE-Wirt undetektiert ist. Es gibt ebenfalls ein merkliches Risiko bei der Entsorgung von bekanntem, mit BSE infiziertem Material, besonders, falls die bei der Entsorgungsoperation verwendete Ausrüstung dann bei den normalen verarbeitenden Tätigkeiten ohne geeignete Sterilisation wieder verwendet wird.
Die Sterilisation von Instrumenten und Ausrüstungsgegenständen nach einem möglichen Aussetzen an mit TSE infiziertes Gewebe ist von einer hauptsächlichen Wichtigkeit. Besonders chirurgische Ausrüstungsgegenstände, wie Skalpelle, Scheren und Endoskope, sollten gründlich sterilisiert werden vor der Verwendung an Patienten, um eine Krankheitsübertragung zu vermeiden.
Es wurde berichtet, dass der infektiöse CJD-Keim zufällig auf chirurgischen Elektroden, die in das Gehirn eines Patienten mit CJD eingeführt worden waren, auf zwei andere zuvor nicht infizierte Patienten übertragen worden ist (Bernouli et al. (1977), The Lancet i: S. 478–479). Die betroffenen Elektroden wurden mit Ethanol und Formaldehyddampf zwischen jedem Vorgang sterilisiert; Bedingungen, von denen zuvor gedacht wurde, dass sie ausreichend sind, um im Grunde sämtliche infektiösen Keime zu eliminieren, und doch war der infektiöse CJD-Keim in der Lage, solch rauen Bedingungen zu widerstehen und das Gehirngewebe des Empfängerpatienten zu infizieren.
Die TSE-Übertragung wird typischerweise in den Fällen beobachtet, bei denen infiziertes Material zwischen Tieren übertragen wird oder in ein Tier implantiert wird. Wie zuvor beschrieben, kann die unvollständige oder unzureichende Sterilisation chirurgischer Instrumente zu solch einer Übertragung von infiziertem Material zwischen Patienten führen. Sogar die härtesten chemischen Reinigungs- und Dampfsterilisationsvorgänge können es nicht vermögen, Blut und Gewebe von chirurgischen Instrumenten zu entfernen, insbesondere in den Klauen oder Gelenken von Scheren und Klammern (Laurenson (1999), The Lancet, 20. November). Folglich kann das Risiko unbeabsichtigter TSE-Übertragung unnötig hoch sein.
Von TSE-Keimen oder Prionen ist bekannt, dass sie hoch resistent gegen Denaturierung und Abbau sind, mehr als man normalerweise für ein Protein annehmen würde. Taylor (J. Hosp. Infect. (1999), 43 Supplement, S. 569–76) gibt einen Überblick über eine Anzahl von Verfahren für die Inaktivierung von Prionproteinen.
Chemische Verfahren zum Inaktivieren von TSE-Prionproteinen schließen die Behandlung infizierten Materials mit Natriumhydroxid- oder Natriumhypochloritlösungen ein (Taylor et al. (1994), Arch. Virol., 139, S. 313–326), obwohl von der Infektiosität des Prions gezeigt wird, dass sie das Aussetzen an 2 M Natriumhydroxid für bis zu zwei Stunden überlebt.
Alternative Verfahren für das Inaktivieren von TSE-Prionen schließen Autoklavieren ein, doch wiederum von dem BSE- und Scrapie-Keim gezeigt, dass es eine Behandlung bei 134 bis 138°C für 18 Minuten überlebt (Taylor et al., ebenda). Folglich wurde ein kombinierter chemischer/Erhitzungsansatz vorgeschlagen, bei welchem infizierte Materialien an 1 M Natriumhydroxid, gefolgt von Autoklavieren bei 121°C für zwischen 30 und 60 Minuten ausgesetzt werden (Taylor, J. Hosp. Infect. (1999), 43 Supplement, S. S69–76). Von diesem kombinierten Verfahren wurde gezeigt, dass die Inaktivierung von infektiösen TSE-Mitteln erreicht werden kann, obwohl unter sehr rauen Bedingungen.
Viele Materialien, wie Plastik, Polymere und Nicht-Protein-Tierderivate, können nicht solch extremen Bedingungen ausgesetzt werden, ohne dass sie selber zerstört werden. Die oben beschriebenen chemischen und physikalischen Vorgänge sind nur tatsächlich geeignet für die Sterilisierung von Metallinstrumenten und chirurgischen Werkzeugen, die nicht zu groß sind und die in einen Standardautoklaven passen. Empfindlichere Instrumente wie Endoskope können extremen Bedingungen der hohen Temperatur nicht ausgesetzt werden, ohne das Risiko der dauerhaften Schädigung ihrer inneren Bestandteile.
Weiterhin schließen chemische Vorgänge typischerweise die Verwendung von ätzenden und/oder chaotropen Mitteln ein, die bei der Handhabung und bei der Entsorgung gefährlich sind. Es würde deshalb wünschenswert sein, ein Verfahren zum Inaktivieren von TSE-Prionen bereitzustellen, ohne den Bedarf, große Mengen gefährlicher Substanzen zu verwenden, und welches Verfahren für die Verwendung bei größeren Objekten und Flächen ebenso wie an kleineren Objekten angepasst werden kann.
Taylor (Vet. J. (2000), 159, S. 10–17) beschreibt Tests, die proteolytische Enzyme verwenden, um Prionproteine zu deaktivieren. Proteasen, wie Trypsin, haben eine geringe Wirkung unter nicht-denaturierenden Bedingungen (Taylor (2000), S. 14), andere Proteasen, wie Proteinase K, können jedoch eine Wirkung auf die TSE-Infektiosität nach verlängerten Verdauungszeiten haben. Die Mehrheit der gegenwärtigen TSE-Inaktivierungsverfahren ist jedoch auf chemische und physikalische Abbauvorgänge gerichtet.
Das US-Patent Nr. 5,234,832 beschreibt die Verwendung eines proteolytischen Enzyms für die Reinigung und Desinfektion medizinischer Instrumente.
Das US-Patent Nr. 4,614,549 beschreibt die Verwendung eines proteolytischen Enzyms für die Reinigung und Desinfektion von Kontaktlinsen.
Es ist deshalb ein Ziel der Erfindung, Verfahren und Mittel bereitzustellen, um wirksam infektiöse TSE-Keime unter Bedingungen zu inaktiveren, die leicht auf eine Vielzahl an Örtlichkeiten und Situationen angewendet werden können. Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, den Bedarf für Extrembedingungen der sehr hohen Temperatur und rauen chemischen Denaturierungsmitteln zu reduzieren, um TSE-Keime zu inaktivieren, die an oder innerhalb von mit TSE infizierten Materialien lokalisiert sind.
Ein erster Aspekt der Erfindung stellt ein Verfahren zur Inaktivierung eines TSE-Keims bereit, umfassend das Aussetzen des TSE-Keims an ein thermostabiles proteolytisches Enzym bei einer Temperatur im Bereich von 50 bis 120°C, worin das Enzym thermisch stabil ist und biologisch aktiv bei einer Temperatur indem Bereich von 50 bis 120°C.
Die Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung sind geeignet für die Inaktivierung des TSE-Keims in Apparaten und Materialien, die infiziert sind oder die verdächtigt werden, dass sie mit dem TSE-Keim infiziert sind. Zusätzlich werden die Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung in einer prophylaktischen oder vorsorgenden Weise geeignet verwendet, wo das sichere Wissen einer Infektion ungewiss ist. Zum Beispiel kann das Verfahren der Erfindung leicht in die Standardsterilisationsprotokolle eingeschlossen werden, die für die Vorbereitung chirurgischer Geräte vor ihrer Verwendung in Operationsvorgängen verwendet werden.
Die Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung werden ebenfalls geeigneterweise für die Inaktivierung des TSE-Keims in möglicherweise kontaminiertem Klinikabfall und aussortiertem Tiermaterial verwendet. Gegenwärtig wird dieses Abfallmaterial bei 1000°C verglüht, was spezialisierte Einrichtungen erfordert und teuer ist. Es ist ein Vorteil der vorliegenden Erfindung, dass ein TSE-Inaktivierungsvorgehen bei Temperaturen und unter Bedingungen geschehen kann, die keine hochspezialisierten Einrichtungen erfordern, und dass die Aussichten der vollständigen Inaktivierung des TSE-Keims vergleichbar sind mit den energieintensiveren und teureren Verbrennungsvorgängen.
Von dem Begriff übertragbare spongiformen Enzephalopathie-(TSE-)Keim wird beabsichtigt, dass er sämtliche neurologischen Erkrankungen umfasst, die anscheinend über ein pathogenes Prionprotein-Zwischenprodukt übermittelt werden. Solche TSE schließen typischerweise die menschlichen Erkrankungen Creutzfeld-Jacob-Erkrankung (CJD), variante Creutzfeld-Jacob-Erkrankung (vCJD), Kuru, fatale familiäre Insomnie und das Gerstmaen-Sträussler-Scheinker-Syndrom ein. Nicht menschliche TSEs schließen die bovine spongiforme Enzephalopathie (BSE), Scrapie, spongiforme Katzenenzephalopathie, Chronic Wasting Disease (chronisch auszehrende Krankheit) und die übertragbare Nerzenzephalopathie ein. Unter der Annahme, dass vCJD gegenwärtig als eine menschliche Form von BSE verstanden wird, ist es offensichtlich, dass gewisse TSE-Keime in der Lage sind, die Speziesbarriere zu überschreiten, und dass neue TSEs aus Nicht-Rind-Quellen in der Zukunft zu Tage treten werden könnten.
Das proteolytische Enzym der Erfindung ist typischerweise eine Protease, kann jedoch geeigneterweise jedes biologische polymere Molekül sein, das in der Lage ist, eine Spaltung einer Polypeptidkette zu katalysieren.
Es ist eine Eigenschaft der Erfindung, dass das proteolytische Enzym ein thermostabiles Enzym ist, das heißt, dass es eine optimale biologische Aktivität bei Temperaturen zeigt, die höher sind als die normale Körpertemperatur von 37°C. In Ausführungsbeispielen der Erfindung ist das Enzym thermisch stabil und biologisch aktiv und Inaktivierung wird bei Temperaturen im Bereich von 50°C bis 120°C durchgeführt, und bevorzugter in einem Bereich, wo die Temperatur zwischen 55°C und 85°C liegt. In einem besonderen Ausführungsbeispiel der Erfindung beträgt die Temperatur ungefähr 60°C. In einem weiteren besonderen Ausführungsbeispiel der Erfindung beträgt die Temperatur ungefähr 80°C.
Thermostabile proteolytische Enzyme, die für die Verwendung in den Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung geeignet sind, sind von einer Anzahl an Quellen erhältlich, wie thermophile Bakterien und Archaebakterien. In einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung wird das thermostabile proteolytische Enzym aus thermophilen Bakterien, hyperthermophilen Bakterien und Archaebakterien isoliert. Geeignete Organismen für die Extraktion proteolytischer Enzyme für die Verwendung bei der Erfindung schließen die folgenden ein: Thermotoga maritima; Thermotoga neopolitana; Thermotoga termarum; Fervidobacterium islandicum; Fervidobacterium nodosum; Fervidobacterium pennivorans; Thermosipho africanus; Aeropyrum pernix; Thermus flavus; Pyrococcus spp.; Sulfolobus solfataricus; Desulfurococcus; Bacillus thermoproteolyticus; Bacillus stearothermophilus; Bacillus sp. 11231; Bacillus sp. 11276; Bacillus sp. 11652; Bacillus sp. 12031; Thermus aquaticus; Thermus caldophilus; Thermus sp. 16132; Thermus sp. 15673 und Thermus sp. Rt41A.
Es sind nicht nur die zuvor genannten Organismen die Quellen für thermostabile Proteasen. In der Tat können gewisse Organismen, die nicht als echt thermophil angesehen werden, ebenfalls thermostabile proteolytische Enzyme exprimieren. Solche Organismen werden gewöhnlich als thermisch ausdauernd bezeichnet, dahingehend, dass, obwohl sie nicht wählen, unter Bedingungen einer hohen Temperatur zu leben, sie hohen Temperaturen für begrenzte Zeiträume widerstehen können. Eine Anzahl von Bacillus- Arten fällt in die Kategorie der Thermoresistenz und es ist bekannt, dass sie thermostabile Proteasen vom Subtilisintyp produzieren.
Der pH-Wert, bei welchem die Inaktivierung durchgeführt wird, kann sich von sauer zu alkalisch erstrecken, typischerweise liegt er jedoch in dem Bereich von pH 8 bis 13, vorzugsweise bei einem pH-Wert von mehr als 9 und bevorzugter bei einem pH-Wert von um 12. Ähnlich ist die thermostabile Protease in einem pH-Bereich von sauer bis alkalisch aktiv, typischerweise ist sie jedoch optimal aktiv in dem Bereich von pH 8 bis 13 und bevorzugt bei einem pH-Wert von mehr als 9 und bevorzugter bei einem pH-Wert von um 12.
In einem Beispiel der Erfindung in Verwendung wird das proteolytische Enzym aus einer Kultur der thermophilen Bakterien oder Archaebakterien extrahiert. Die Kultur wird geeigneterweise unter den für den Organismus optimalen Bedingungen typischerweise in einem Bioreaktor aufrecht erhalten. Folglich kann eine kontinuierliche Quelle des Organismus gehalten werden, was es erlaubt, das proteolytische Enzym zu gewinnen, wann immer es benötigt wird.
Alternativ wird in einem Beispiel der Erfindung in Verwendung, wie unten detaillierter beschrieben, das Gen, das ein thermostabiles proteolytisches Enzym kodiert, aus dem Quellorganismus Bacillus thermoproteolyticus isoliert. Das Gen wird verwendet, um ein rekombinantes Expressionskonstrukt, typischerweise ein Plasmid, zu erzeugen, das in einen Wirtsorganismus, Escherichia coli, transformiert wird. Die transformierten E. coli werden in einem Bioreaktor wachsen gelassen und es wird, wenn sie sich in einer geeigneten Zelldichte befinden, die Expression des Plasmidkonstruktes gestartet und das proteolytische Enzym wird unter Verwendung von Standardverfahren geerntet. Der rekombinante Expressionsweg sorgt für die Produktion des proteolytischen Enzymproduktes unter weniger extremen Temperaturbedingungen als sie für den Ausgangsquellorganismus erforderlich wären.
Der rekombinante Weg ist weiterhin vorteilhaft dahingehend, dass er die genetische Manipulation rekombinanter thermostabiler Proteasegene erlaubt, um die thermische Stabilität oder biologische Aktivität zu erhöhen oder für einen gewissen anderen Zweck. Folglich kann die Aktivität eines thermostabilen proteolytischen Enzyms leicht für die Verwendung in den Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung optimiert werden.
Ein zweiter Aspekt der Erfindung verwendet das Verfahren für das Sterilisieren eines Apparates, umfassend den Schritt des Aussetzens des Apparates an eine Lösung, die ein thermostabiles proteolytisches Enzym umfasst.
Unter dem Begriff "Sterilisieren" wird gewöhnlich verstanden, dass er das Vorgehen bedeutet, durch welches lebende Organismen von einem Substrat, wie einem Ausrüstungsteil oder einer Lösung, entfernt werden oder darin abgetötet werden. In dem vorliegenden Fall wird der TSE-Keim oder das Prion technisch nicht als lebender Organismus erachtet, in dem Sinn, dass er ein Bakterium oder Virus ist, da er anscheinend nicht irgendwelches genetische Material enthält. Die Übertragung des pathogenen TSE-Keims zwischen Tieren resultiert jedoch in Krankheit. Folglich wird der Begriff "Sterilisieren", wie er hierin verwendet wird, auf das Vorgehen angewandt, durch welches sowohl pathogene Keime (wie TSE-Keime) als auch lebende Organismen nicht-infektiös gemacht werden oder aus einem Substrat entfernt werden oder darin abgetötet werden.
In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel umfasst das Verfahren der Erfindung das Halten der Sterilisierungslösung bei einer Temperatur von unter 100°C, vorzugsweise von wenigstens 45°C und bevorzugter zwischen 45°C und 85°C. Der pH-Wert der Sterilisierungslösung kann sich von sauer bis alkalisch erstrecken, liegt jedoch typischerweise in dem Bereich von pH 8 bis 13, wenigstens pH 9 und bevorzugter um pH 12. Ähnlich ist die thermostabile Protease in einem pH-Bereich von sauer bis alkalisch aktiv, ist jedoch typischerweise optimal aktiv in dem Bereich von pH 8 bis 13, wenigstens pH 9 und bevorzugter um pH 12 herum.
In besonderen Ausführungsbeispielen der Erfindung wird die Sterilisierungslösung auf den Apparat als ein Spray aufgetragen. Der Vorteil dieser Applikationsweise liegt darin, dass größere Oberflächen von Apparaten, Operationstischen oder sogar Raumwänden (z. B. in Schlachthöfen) mit der Sterilisierungslösung der Erfindung behandelt werden können. Typischerweise wird die Lösung auf eine optimale Temperatur, z. B. zwischen 60°C bis 80°C, erhitzt, bevor sie auf die Oberfläche, die sterilisiert werden soll, gesprüht wird, wobei jene Oberfläche wahlweise im Voraus erhitzt wird.
Alternativ wird der Apparat in die Sterilisierungslösung für eine vorbestimmte Zeitdauer eingetaucht. Wiederum wird die Temperatur der Lösung typischerweise vor dem Eintauchen des kontaminierten Apparates optimiert. Wahlweise können Ultraschallmittel in das Tauchbad eingeschlossen werden, um es zu ermöglichen, dass das Ultraschallreinigen zur selben Zeit wie die Behandlung mit der Sterilisierungslösung der Erfindung geschehen kann.
In einem dritten Aspekt sorgt die Erfindung für ein Verfahren zur Sterilisierung von Material, umfassend das Aussetzen dieses Materials an eine erste Lösung, die ein thermostabiles proteolytisches Enzym umfasst, und dann Aussetzen des Apparates an wenigstens eine zweite Lösung, die ein zweites thermostabiles proteolytisches Enzym umfasst. In Verwendung ist das Material typischerweise ein Apparat, chirurgische Ausrüstung oder Ausrüstung zum Fleischverarbeiten oder mit TSE infizierte biologische Abfälle.
Indem das Sterilisationsverfahren in wenigstens zwei und wahlweise mehr aufeinander folgende Schritte aufgeteilt wird, können die Bedingungen in jedem Schritt optimiert werden, um eine maximale Inaktivierung jedes anwesenden TSE-Keims sicherzustellen. Folglich können die Temperaturen und/oder pH-Werte aufeinander folgender Schritte unterschiedlich sein. In spezifischen Ausführungsbeispielen der Erfindung sind die proteolytischen Enzyme in der ersten und zweiten (und wahlweise mehr) Lösung dieselben oder sie sind verschieden.
In einem vierten Aspekt verwendet die Erfindung eine Zusammensetzung für die Inaktivierung eines TSE-Keims, umfassend ein thermostabiles proteolytisches Enzym.
Typischerweise umfasst die Zusammensetzung der Erfindung weiter ein Puffermittel. In einem besonderen Ausführungsbeispiel der Erfindung hat das Puffermittel einen pK_a-Wert von zwischen 8 und 13. Alkalische Puffer, die für die Verwendung in den Verfahren der Erfindung geeignet sind, schließen hier Cyclohexylamino-1-butansulfonsäure (CABS) ein, welches einen pK_a-Wert von 10,7 bei 25°C hat, und 3-Cyclohexylamino-1-propansulfonsäure (CAPS), welches einen pK_a-Wert von 10,4 bei 25°C hat.
Alternativ umfasst die Zusammensetzung ausreichend Natriumhydroxid oder ein anderes alkalisches Mittel, um den pH-Wert der Zusammensetzung zum Alkalischen anzupassen, vorzugsweise auf einem pH-Wert von wenigstens 9 und bevorzugter auf einem pH-Wert von um 12. Die Zugabe von 1 M Natriumhydroxid zu der Zusammensetzung der Erfindung unter Verwendung einer pH-Sonde, die unter Verwendung von universalem Standard kalibriert worden ist, ist allgemein ausreichend, um den pH-Wert der Zusammensetzung auf um 12 einzustellen.
Weitere Aspekte der Erfindung sorgen für Verwendungen der oben genannten Zusammensetzungen für die Inaktivierung von TSE-Keimen.
Ein Vorteil der. Erfindung ist seine Verwendung beim Abbauen von TSE und ähnlichen Keimen und es wurde bei der Durchführung besonderer Ausführungsbeispiele der Erfindung gefunden, dass mit TSE kontaminiertes Material erfolgreich unter Verwendung einer Kombination von erhöhter Temperatur von ungefähr 50°C bis 70°C und einem alkalischen pH-Wert von ungefähr 9 bis 12 mit einem thermostabilen, alkophilen, proteolytischen Enzym dekontaminiert worden ist. Während es gelegentlich möglich ist, eine gewisse Dekontaminierung durch eine extrem hohe Temperatur alleine zu erzielen, ist es von einem signifikanten Nutzen, in der Lage zu sein, TSE zu inaktivieren, während Extrembedingungen, wie Temperaturextreme, vermieden werden, welche zur Schädigung der Ausrüstung führen, die dekontaminiert werden.
Die Erfindung sorgt ebenfalls für die Dimer-Entfernung, unter Verwendung von Proteaseabbau, der wahlweise durch Umgebungsbedingungen – hohe Temperatur, extreme pH-Werte und/oder die Verwendung von Detergenzien (z. B. SDS) verstärkt wird. Ebenso wie die Verwendung von einzelnen Enzymbehandlungen können Kombinationen von Proteasen und/oder anderen Enzymen verwendet werden. Zum Beispiel mag ein besserer Abbau des infektiösen Keims durch die Zugabe von Lipasen, Peptidasen, Glykosylasen, Nucleasen und anderen Enzymen erreicht werden.
Um die Dimer-Entfernung zu bestätigen, kann ein kreuzreaktiver Dimer-Antikörper in Verbindung mit einem geeigneten Detektionssystem verwendet werden, wovon ein Beispiel ein empfindliches in-vitro-Detektionssystem ist, das gegenwärtig von Invitrogen erhältlich ist, auf das als Western Breeze Bezug genommen wird, um die Entfernung vor weiteren Mausbiotests zu bestätigen.
Unter Verwendung des Western-Blot-Nachweissystems in einem Beispiel unten wird das Monomer anscheinend vollständig durch Proteaseverdauung entfernt. Unter diesen Bedingungen verhindern jedoch Proben, die nachfolgend in vivo verwendet werden, die Infektion nicht und sie können sogar ihr Einsetzen verstärkt haben. Es muss deshalb eine andere Infektionsquelle als das Monomer geben. Da das Monomer entfernt werden kann (oder im schlechtesten Fall dramatisch in der Konzentration reduziert sein kann), zeigt dies eine Hauptrolle des Dimers bei der Infektiosität an – entweder alleine oder in Kombination mit dem Monomer.
Die Verfahren und Zusammensetzungen spezifischer Ausführungsbeispiele der Erfindung werden detaillierter unten beschrieben und werden durch die begleitenden Zeichnungen erläutert, in welchen:
1 die Wirkung von Temperatur auf eine Protease-M-Verdauung von Mausgehirnhomogenat (mbh (mouse brain homogenate)) zeigt;
2 die Wirkung des pH-Werts auf eine Protease-M-Verdauung von mbh zeigt;
3 eine Bacillus-thermoproteolyticus-Rokko-Verdauung von mbh zeigt;
4 die Wirkung von Natriumdodecylsulfat (SDS) auf eine Rokko-Verdauung von mbh zeigt;
5 eine SDS-PAGE von mbh zeigt;
6 einen Immunoblot von mbh zeigt;
7 eine Protease-G-, -R- und -C-Verdauung von mbh zeigt;
8 einen Immunoblot der Verdauung in 7 zeigt; und
9 bis 12 Blots von mit BSE (301V) infiziertem Mausgehirnhomogenat zeigen, um die Korrelation der Infektiosität mit dem Priondimer zu erläutern, und wie weiter in den Beispielen unten erklärt.
BEISPIELE
VM-Mauskolonie und Inkubation mit dem BSE(301V)-Keim
Studien über die Inaktivierung des BSE-Keims, den BSE-Stamm (310V), erforderten des Etablieren einer Mausbrutkolonie für die Schaffung von sowohl nicht infektiösem als auch infektiösem Gehirnhomogenat (mbh) und dessen anschließende Titration und Biotest. Der für die Verwendung in der Studie ausgewählte VM-Mausstamm wurde von Dr. David Taylor (Institute of Animal Health, Edinburgh) erhalten. Sechs Paare wurden in einen reservierten Raum in einer Tiereinrichtung eingeführt. Die Mäuse wurden hinsichtlich ihres Gesundheitszustands gescreent und es wurde ein Brutprogramm gestartet.
Infektiöses BSE(301V)-Mausgehirn (IAH, Edinburgh) wurde für die Inokulierung durch Rohhomogenisation zubereitet, gefolgt von dem Passieren der Gehirne durch Nadeln von Lüerschen Injektionsspritzen hindurch, die eine zunehmend feinere Nadelstärke haben (von 21G–27G), in und von einer darin enthaltenen Sicherheitsspritze in ein verschlossenes, mit einem Septum abgedeckten Fläschchen. Dieses Vorgehen wurde in einer validierten Sicherheitskabine in einem Sicherheitslabor der Stufe 3 (Containment Level 3; CL3) unmittelbar vor der intrazerebralen Inokulation der VM-Mäuse durchgeführt. Die narkotisierten (Alphadolon/Alphaxalon)-Mäuse wurden intrazerebral mit Nadeln der Nadelgröße Nr. 26 mit 20 μl der Mausgehirnhomogenatzubereitung inokuliert. 49 von 50 Mäusen überlebten diese Prozedur. Diese wurden behalten, um die Inkubation des Keims und die Bildung der erforderlichen Menge an infektiösem Material mit hohem Titer zu ermöglichen.
Biomasseproduktion
Eine große Anzahl an Organismen wurde für die Produktion von Biomasse gewählt, um eine so breit gefächerte Auswahl an thermostabilen proteolytischen Enzymen wie möglich bereitzustellen. Die ausgewählten Organismen erstreckten sich von jenen, die optimalerweise bei mäßig thermophilen Temperaturen (50°C) wachsen, bis zu solchen, die bei extrem thermophilen Temperaturen (100°C) wachsen, und schlossen Mitglieder sowohl der Archaebakterien als auch der Bakterien ein. Thermophile wurden ebenfalls ausgewählt, um einen breiten Bereich an Wachstums-pH-Werten zu überdecken, wobei pH-Optimawerte von pH 2,5 bis pH 11,5 umfasst wurden. Die Mehrheit der Organismen wurde in Batchkultur wachsen gelassen; dort, wo die Wachstumsanforderungen der Organismen jedoch besonders anspruchsvoll waren, wurde eine kontinuierliche Kultur verwendet (Raven und Sharp (1997), Applied Microbial Physilogy: A Practical Approach, Ch. 2, Hrsg. Stanbury and Rhodes, OUP, S. 23–52). In Abhängigkeit von der Biomasseausbeute des wachsen gelassenen Organismen wurden Batchkulturvolumina von zwischen 20 1 und 120 1 genutzt, um die gewünschte Menge an Zellpaste zu erzielen. Das System der kontinuierlichen Kultur nutzte einen Gasheberbioreaktor mit einem Arbeitsvolumen von entweder 2 oder 5 1, der vollständig aus Glas und PTFE konstruiert war. Sich stärker vermehrende Organismen, wie Bacillus spp. und Thermus spp., wurden vorgescreent, um jene mit hohen Spiegeln an Proteaseaktivität vor ihrer Kultur in einem größeren Maßstab auszuwählen. Es wurde ein schneller und empfindlicher fluorometrischer Proteasetest unter Nutzung von Mikrotiterplatten für diesen Zweck gewählt, um ein Hochdurchsatzscreening zu erlauben (EnzChek^TM, Molecular Probes, Leiden, Niederlande).
Kulturbiomasse wurde durch kontinuierliche Zentrifugation (Contifuge Stratos^TM, Kendro Laboratory Products, Bishop Stortford, UK) geerntet und bei –80°C gelagert. Kulturüberstände wurden mit einem Tangentialströmungsfilter mit einem Rückhaltevermögen von 10 kDa (Pall-Filtration, Porthsmouth, UK) aufkonzentriert. Proteine wurden mit Ammoniumsulfat (90% Sättigung) gefällt und bei –80°C gelagert.
Proteinaufreinigung
Es war eine schnelle Proteasescreening- und Aufreinigungstechnik erforderlich, um sämtliche der Rohproteinzubereitungen nach dem Biomasseproduktionsschritt zu verarbeiten. Es wurde für diesen Zweck ein Farbstoff-Liganden-Affinitätschromatographiesystem verwendet (PIKSI M^TM, Affinity Chromatography Ltd., Isle of Man, UK). Anfänglich wurde jedes rohe Ammoniumsulfatpräzipität in Puffer gelöst und durch eine Entsalzungssäule geführt. Jede Probe wurde dann auf den PIKSI-M-Testkit geladen, der zehn unterschiedliche Affinitätsliganden enthielt. Fraktionen wurden dann hinsichtlich ihrer Proteaseaktivität untersucht, um die am besten geeignete Matrix für die Aufreinigung der Protease zu bestimmen, entweder durch positives Binden des Zielmoleküls und dann Eluieren oder durch negatives Binden der Verunreinigungen. Die Aufreinigung wurde dann in einen größeren Maßstab unter Verwendung derselben Affinitätsmatrix in Verbindung mit einem FPLC-System (Amersham-Pharmacia Biotech, Amersham, UK) umgesetzt. Indem diese Technik mit dem fluorometrischen Proteasetest kombiniert wurde, konnte das schnelle Screening vieler Fraktionen unternommen werden.
Der fluorometrische Proteasetest nutzt Kaseinderivate, die mit dem grünen Fluoreszenzmittel BODIPY FL stark markiert worden sind, bei welchem die Fluoreszenz der Konjugate annähernd vollständig ausgelöscht wird. Proteasenkatalysierte Hydrolyse setzt die hochfluoreszierende Markierung frei und die resultierende Fluoreszenz kann auf einem fluorometrischen Mikroplattenlesegerät (Labsystems Fluoroscan II^TM) gemessen werden. Die Zunahme in der Fluoreszenz ist proportional zu der Proteaseaktivität und wurde mit jener einer Standardprotease (Protease X, Sigma-Aldrich, Poole, UK) verglichen.
Proteasecharakterisierung
Es wurde eine Reihe an thermostabilen Proteasen analysiert (siehe Tabelle 1). Die direkte Charakterisierung der Aktivität wurde unter Verwendung des als ein Substrat zugänglichen, nächstliegendsten, nicht infektiösen Analogons zu infektiösem BSE(301V)-Mausgehirnhomogenat durchgeführt, das heißt mit normalem VM-Mausgehirnhomogenat. Anfängliche Verdauungen von vollständig uninfiziertem Mausgehirnhomogenat (mbh) wurden über 30 Minuten bei 60°C und bei einem pH-Wert von 7,0 durchgeführt. Die Proben wurden dann unter reduzierenden Bedingungen gekocht und durch SDS-PAGE auf vorgegossenen 4–12% Bis-Tris-NuPage-Gelen (Novex^TM, San Diego, USA) analysiert. Gele wurden unter Verwendung von Standardvorgängen fixiert und die Proteine wurden unter Verwendung des Colloidal-Blue-Färbungskits von Novex sichtbar gemacht. Die Ergebnisse zeigten sowohl die Spiegel an Aktivität der Proteasen gegenüber dem mbh-Substrat unter diesen Bedingungen als auch ebenfalls den Spiegel an Reinheit der einzelnen Proteasen. In dem Test verwendete Proteasekonzentrationen wurden auf der Gesamtproteinkonzentration basiert, deshalb wurde ein weiter Aktivitätenbereich beobachtet, von begrenzter bis zu vollständiger Verdauung.
Aktivitätsprofile, die den vollständigen Effekt von pH-Wert und Temperatur auf die mbh-Verdauung zeigen, wurden dann für jedes Enzym erzeugt. Etliche Enzyme zeigten eine übermäßige Aktivität über den gesamten Bereich an Bedingungen (pH 2–12 und 50–100°C). Im Allgemeinen jedoch wurde die vollständige Verdauung von mbh nur über einen engen Bereich erreicht, was die pH-Wert- und Temperaturoptima der Enzyme anzeigen. Die 1 und 2 zeigen die Aktivitätsprofile für eine Probenprotease, die Bacillus-Protease M. Wie gesehen werden kann, ist das Enzym mäßig thermophil und ergibt eine vollständige Verdauung bei Temperaturen von bis zu 70°C. Ähnlich zeigt das pH-Profil eine Präferenz für neutrale oder alkalische Bedingungen.
Testen der Protease
Etliche Enzyme ergaben keine vollständige Verdauung von mbh, sogar dann nicht, wenn die Inkubationszeiten auf bis zu 24 Stunden verlängert worden sind. Dies könnte einfach an der niedrigen Proteaseaktivität gelegen haben, es zeigten jedoch etliche hochaufgereinigte und konzentrierte Enzyme immer noch nur teilweise Verdauungen. Bei diesen Reaktionen schien nur eine geringe Enzym-Substrat-Wechselwirkung zu geschehen. Es wurde überlegt, dass dies an dem Nicht-Protein-Material, z. B. Lipide, liegen könnte, die das Substrat umgeben und die Wechselwirkung verhindern; eine Vorbehandlung mit Lipasen und anderen Enzymen hatte jedoch keine beobachtbare Wirkung (Daten nicht gezeigt). Eine zweite Möglichkeit, die in Betracht gezogen wurde, war die Wirkung von abstoßenden Oberflächenladungen zwischen Proteasen und dem Substrat. Ein bestimmtes Protein, aufgereinigt aus Bacillus-thermoproteolyticus-Rokko, erzeugte sogar bei hohen Konzentrationen fortwährend eine schlechte Verdauung von mbh. Dieses Enzym war dafür bekannt, dass es in der Anwesenheit von hohen Detergenzienspiegeln aktiv bleibt, deshalb wurden Verdauungen mit der Zugabe von SDS in einem Ansatz, diese Wirkung zu überwinden, durchgeführt. Die 3 und 4 zeigen B.-thermoproteolyticus-Rokko-Verdauungen von mbh in der Abwesenheit und Anwesenheit von SDS. 3 zeigt deutlich, dass es unter Standardbedingungen einen geringen Unterschied in der Verdauung gibt, sogar wenn die Proteasekonzentration auf 20 mg·ml^–1 erhöht wird. Nach der Zugabe von SDS (Spuren 2 bis 5) sind keine Proteinbanden, mit der Ausnahme der Protease selber, sichtbar, was eine vollständige Verdauung anzeigt. Die untersuchten Proteasen könnten deshalb einfach in drei Kategorien eingeteilt werden: (i) jene, die in der Lage sind, eine vollständige mbh-Verdauung in der Abwesenheit von Detergenz zu ergeben, (ii) jene, die in der Lage sind, eine vollständige mbh-Verdauung in der Anwesenheit von SDS zu ergeben, und (iii) jene, die nicht in der Lage sind, das Substrat vollständig zu verdauen. Die Proteasen in den Kategorien (i) und (ii) wurden für die unmittelbare weitere Studie ausgewählt, während jene in Kategorie (iii) entweder ausgeschieden wurden oder von ihnen angenommen wurde, dass sie in einer größeren Menge und/oder höheren Reinheit erforderlich sind.
Western-Blotting von Mausgehirnhomogenat
Mbh-Proteine wurde auf Nitrocellulose übertragen und über Nacht in PBS-Tween (PBST) + 3% Magermilchpulver geblockt. Die Membran wurde gewaschen (3× in PBST) und für eine Stunde mit dem rekombinanten monoklonalen Anti-Mensch-6H4-PrP-Antikörper (Prionics, Zürich, Schweiz) inkubiert. Nach einem zweiten Waschschritt wurde das Anti-Maus-HRP-Konjugat hinzugefügt und die Membran wurde für 1 Stunde inkubiert. Das Waschen wurde wiederholt und die Antikörperreaktion wurde durch die Zugabe von TMB sichtbar gemacht (Harlow und Lane (1988); Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press).
Die 5 und 6 zeigen eine SDS-PAGE bzw. einen Immunoblot von unverdautem mbh. Obwohl es einen gewissen unspezifischen Hintergrund gibt, können dunkle Banden, die die Anwesenheit von Mausprionen zeigen, deutlich bei dem erwarteten Molekulargewicht (~33–35 kDa) gesehen werden. Unterscheidbare Banden sind ebenfalls sichtbar bei ungefähr 66–70 kDa, welche den kürzlich berichteten Priondimeren entsprechen mögen (Safar et al. (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 56373–6377).
Westerntransfer und -immunoblotting wurden verwendet, um zu bestätigen, dass kein immunreaktives Fragment von Maus-PrP^c nach der Verdauung verblieb. 7 zeigt mbh, das bis zur Vollständigkeit mit drei eng verwandten thermostabilen proteolytischen Enzymen (Proteasen G, R und C) verdaut worden ist, wie beurteilt durch SDS-PAGE. In dem entsprechenden Immunoblot (8) sind nur zwei Banden sichtbar, beide mit einem anscheinenden Molekulargewicht von ~23 kDa. Die starke Bande in Spur 9 entspricht dem rekombinanten Maus-PrP (Positivkontrolle), während die schwache Band in Spur 4 auf Grund einer leichten Reaktion mit der stark beladenen Enzymzubereitung anwesend zu sein scheint. In diesem Fall ist der vollständige Verlust an PrP^c-Immunoreaktivität immer noch ersichtlich, da keine Bande in Spur 3 beobachtbar ist.
Zubereitung und Titrierung von infektiösem Mausgehirnhomogenat
Vom achten Tag nach der Herausforderung an wurden Mäuse der täglichen klinischen Beurteilung unterzogen, um klinisch angegriffene Mäuse so früh als möglich zu detektieren. Eine einzelne Maus starb an einer unbekannten Ursache vor diesen Zeitraum. Der Rest zeigte das erwartete Krankheitsfortschreiten und die Tiere wurden zwischen 110 und 130 Tagen nach der Herausforderung geschlachtet. Die Gehirne wurden aseptisch entfernt und solange gefroren gelagert, bis sie benötigt wurden. 48 infektiöse BSE(301V)-VM-Mausgehirne wurden in vier Volumina PBS in einem geschlossenen Homogenisator homogenisiert und wurden nacheinander durch Nadeln mit zunehmender Nadelgröße (21G bis 26G) bis zum freien Fließen hindurchgeführt. Eine Probe mit einer weiteren doppelten Verdünnung (1:9 Mausgehirn:PBS) wurde für die Titration der Infektiosität zubereitet. Es wurden über 800 × 0,1 ml Aliquoten an infektiösem BSE(301V)-Mausgehirnhomogenat zubereitet. Diese Vorgänge wurden wiederum durchgeführt unter strengem Klasse-III-Verschluss, einschließlich des Tragens von Beatmungsgeräten mit positivem Druck.
Gruppen mit 25 acht Wochen alten VM-Mäusen erhielten Titrationsdosen der infektiösen Mausgehirnhomogenatzubereitung bei 10-fachen Verdünnungen von 10^–1 bis 10^–8. Eine weitere Gruppe aus 25 Mäusen wurde mit nicht infektiösem Mausgehirnhomogenat als eine Kontrolle geimpft. Sämtliche Mäuse wurden unter Anästhesie unter Verwendung von Nadeln der Größe 26G × 3/8'' (0,95 cm) mit Plastikschutzhüllen, die 2 mm unterhalb der Schrägfläche abgeschnitten wurden, in einer Kabine der Klasse 2 unter Verwendung eines Injektionsschutzes inokuliert. Die Mäuse wurden dann belassen, um dem BSE(301V)-Keim für verlängerte Zeiträume, einige mehr als ein Jahr, zu inkubieren. Der Anfangstiter der infektiösen Mausgehirnhomogenatzubereitung wurde retrospektiv etabliert, wenn erst einmal sämtliche Inkubationen abgeschlossen waren (klinische Überwachung vom 80. Tag an).
Dimerdetektion in verdautem Mausgehirn
Mit BSE (301V) infiziertes Mausgehirnhomogenat wurde mit einem neutralen pH-Wert und 60°C für 30 Minuten mit Proteasen verdaut. Gesamtproteinverdauungen wurden auf SDS-PAGE-Gel laufen gelassen und durch Western-Blotting auf Nitrocellulosemembranen übertragen. Diese wurden in Streifen geschnitten und mit CAMR-Antiprion-Antikörpern (hergestellt in Ratten) sondiert. Ein zweiter generischer Antikörper (Ziegen-Anti-Kaninchen) wurde an Meerrettichperoxidase konjugiert und bei der Detektion durch ein kollorimetrisches TMB-Substrat verwendet.
Zu dieser Zeit war das erwartete Ergebnis, dass die Ergebnisse dieselben waren wie der Kontrollblot (Nr. 7) – unter Verwendung des Antiprion-Antikörpers mAb 6H4 (von Prionics, Schweiz). Bei diesem Kontrollblot sieht man das typische Drei-Banden-Muster (Glykosylierungsstadien) für mit Protease verdautes, die Infektion bestätigendes Prionprotein (PrP^Sc).
Die Blots in diesem Beispiel zeigten jedoch dieses Muster nicht. Blot 1 nutzt einen polyklonalen Antikörper, der gegen ein PPD-konjugiertes Peptid, entsprechend einer N-terminalen Region des Prionmoleküls, hervorgerufen wurde. In den Spuren ist nichts zu sehen. Dieser Abschnitt des Proteins ist empfänglich für Proteolyse, so ist es nicht überraschend, nichts in den Spuren (2 & 3) zu sehen – siehe 9, Blot 1 auf der linken Seite. Spur 1 ist ein Molekulargewichtsmarker.
Blot 2 hat einen zweiten Antikörper, der gegen eine Peptidsequenz weiter im Inneren des Prionmoleküls hervorgerufen worden ist. Dieser zeigt wenigstens 9 Banden variierenden Intensität, mit gleichem Abstand und mit einem Molekulargewicht, das einem Priondimer mit einer Reihe von Glykosylierungszuständen entspricht – siehe Blot 2 in 9.
Blot-3-Antikörper zeigt ein ähnliches Profil; Blot 4 ist ebenfalls gezeigt, seine Ergebnisse sind jedoch von zu schlechter Qualität, um irgendwelche Schlüsse zu ziehen – siehe Blot 3 und 4 in 9.
Die Blots 5 und 6, gezeigt in 10 mit dem Kontrollblot 7, zeigen wiederum das vielbandige Muster.
Dimerdetektion in verdautem Mausgehirn
Das obige Beispiel wurde wiederholt und die Ergebnisse sind in den 11 und 12 gezeigt.
Blot 1 zeigt Molekulargewichtmarker in den Spuren 1 und 5. Spur 2 ist rekombinantes Maus-PrP, das die rekombinanten PrP-Oligomere zeigt. Spur 3 zeigt das Fehlen einer Antikörperantwort auf mit Protease verdautes infektiöses Mausgehirnhomogenat. Spur 4 ist die Antikörperantwort in der unverdauten Kontrolle.
Blot 2 ist wie oben, zeigt jedoch das frühere Bandenmuster in der mit Protease verdauten Probe.
Blot 3 zeigt die Antikörper-3-Antwort. Hier gibt es eine gewisse Antwort auf rekombinantes Maus-PrP (Spur 2). Spur 3 zeigt nicht nur das vielfache (dimäre PrP) Bandenmuster, sondern auch eine gewisse monomere PrP-Antwort.
Blot 7 ist die 6H4-mAb-Antikörperkontrolle. Hier gibt es einen guten Nachweis rekombinanter Maus-PrP-Oligomere (Spur 2). Spur 3 zeigt die schwer diglykosylierte Form von mit begrenzt Protease behandelten PrP^Sc und zeigt zusätzlich die schwächer monoglykosylierten und nicht glykosylierten Formen, die typisch für den BSE(301V)-Stamm sind. Es ist kein "Dimer"-Nachweis ersichtlich.
Zubereitung von Antikörpern, die den dimer-bevorzugenden Antikörper einschließen
In den Beispielen nutzten wir 6 polyklonale Antikörper. Von diesen detektieren drei das Dimer alleine und binden das Monomer nicht, wohingegen einer mit sowohl dem Monomer als auch dem Dimer kreuzreagiert.
Die polyklonalen Seren wurden durch Immunisieren von Ratten mit synthetisierten Prionmimetikapeptiden produziert. Diese Peptide wurden basierend auf Regionen mit einer hohen Homologie zwischen Mensch-, Maus- und Rinderprionprotein-Aminosäuresequenzen gestaltet.
Die Sequenzen, die die dimer-reaktiven Antikörper produzieren, waren wie folgt:
CGGWGQPHGGC (Peptid 2)
CGGYMLGSAMSRPIIHFGNDYEC (Peptid 3)
CVNITIKQHTVTTTTKGENFTETDC (Peptid 5)
CITQYQRESQAYYQRGASC (Peptid 6)
Die Peptide wurden mit einem Cystein an beiden Enden (siehe oben) synthetisiert und mit einem Cystein an nur einem Ende. Dieses Verfahren wurde verwendet, um sowohl die lineare Form als auch eine Schleifenstruktur des Antigens auf der Oberfläche des Trägerproteins zu präsentieren.
Die Peptide wurden kommerziell synthetisiert und an das Trägerprotein PPD (aufgereinigtes Proteinderivat; Purified Protein Derivative) gekoppelt, gewonnen von einem abgeschwächten Stamm des Bakteriums Mycobacterium bovis, welches lyophilisiert und verwendet worden ist, um das Peptid über einen Linker zu konjugieren.
Anti-prion-polyklonale Antikörper wurden wie folgt erzeugt:
Eine Probe aus Prä-Immun-Seren (ungefähr 1 ml) wurde aus jedem einer Gruppe an Holländer-Kaninchen gesammelt.
Die Kaninchen wurden mit rekonstituiertem, gefriergetrocknetem Bacillus-Calmette-Guerin-(BCG-)Vakzin für die intradermale Verwendung injiziert. Eine Dosis mit 0,1 ml rekonstituiertem BCG-Vakzin wurde in zwei Stellen am Genick des Kaninchens gegeben.
Nach 4 Wochen wurden 0,6 mg jedes Peptid-PPD-Konjugates gemessen (0,3 mg von jedem der 1-Cystein- und 2-Cystein-Versionen) und in 1 ml steriler 0,9%iger Salzlösung gelöst.
Ein gleiches Volumen Freunds inkomplettes Adjuvans wurde hinzugefügt und 0,75 ml Aliquoten der resultierenden Emulsion wurden intramuskulär in jeden Hinterfuß und 0,25 ml Aliquoten in zwei Stellen am Genick pro Kaninchen injiziert.
Nach 4 Wochen wurde eine Booster-Injektion gegeben, umfassend die wie in Schritt 3 und 4 zubereiteten Peptid-PPD-Konjugate. Die Booster-Injektionen bestanden aus vier 0,25 ml-Injektionen in das Genick jedes Kaninchens.
7–14 Tage nach den ersten Booster-Injektionen wurden 4 ml Testblutproben entnommen und die Seren wurden durch ELISA hinsichtlich des Antikörpertiters beurteilt.
Eine zweite Booster-Injektion wurde 4–6 Wochen nach der ersten gegeben.
Eine dritte Booster-Injektion wurde 4–6 Wochen später gegeben.
Eine 4 ml-Testblutprobe wurde 6–8 Wochen nach der dritten Booster-Injektion entnommen und Antikörpertiter wurden durch ELISA bestimmt.
Eine vierte Booster-Injektion wurde gegeben.
Eine 4 ml-Testblutprobe wurde 7–14 Tage nach der vierten Booster-Injektion entnommen und es wurde der Antikörpertiter durch ELISA bestimmt.
Es wurde eine Endausblutung durchgeführt und das Blut wurde gesammelt. Das Serum wurde durch Zentrifugation abgetrennt und bei –20°C gelagert.
Die Analyse des Antikörpertiters wurde unter Verwendung von ELISA erreicht. Die Immuntestplatte wurde mit denselben Peptiden, die mit einem anderen Trägerprotein (KLH) konjugiert worden sind, überzogen, um die Antwort auf das Peptid von der Antwort auf das Trägerprotein zu unterscheiden.
Drei der durch Immunisierung mit den beschriebenen synthetischen Peptidsequenzen erzeugten Antikörper binden bevorzugt an die Dimerform des Moleküls.
Analoge Schritte können ebenfalls verwendet werden, um einen monoklonalen Antikörper zuzubereiten. Dies könnte erreicht werden unter Verwendung eines Verfahrens, wie z. B. jenes, das beschrieben ist in Antibodies – A Laboratory Manual, Ed Harlow und David Lane, 1988 (Cold Spring Harbor Laboratory).
Die Erfindung stellt folglich die Detektion und den Abbau von TSE-Infektiosität bereit.
Tabelle 1
Sequenzprotokoll

Claims

Verfahren zur Inaktivierung eines Mittels/Agens' der übertragbaren spongiformen Enzephalopathie (TSE), umfassend das Exponieren des TSE-Agens' an ein thermostabiles proteolytisches Enzym bei einer Temperatur im Bereich von 50–120°C, worin das Enzym thermisch stabil ist und bei einer Temperatur im Bereich von 50–120°C biologisch aktiv ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Enzym thermisch stabil und bei einer Temperatur zwischen 55°C und 85°C biologisch aktiv ist.
Verfahren nach Anspruch 2, worin das Enzym thermisch stabil und bei einer Temperatur von etwa 60°C biologisch aktiv ist.
Verfahren nach Anspruch 2, worin das Enzym thermisch stabil und bei einer Temperatur von etwa 80°C biologisch aktiv ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–4, umfassend das Exponieren des TSE-Agens' an das Enzym bei einer Temperatur von zwischen 55 und 85°C.
Verfahren nach Anspruch 5, umfassend das Exponieren des TSE-Agens' an das Enzym bei einer Temperatur von etwa 60°C.
Verfahren nach Anspruch 5, umfassend das Exponieren des TSE-Agens' an das Enzym bei einer Temperatur von etwa 80°C.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–7, umfassend das Exponieren des TSE-Agens' an das Enzym bei alkalischem pH-Wert.
Verfahren nach Anspruch 8, worin der pH-Wert zwischen 8 und 13 liegt.
Verfahren nach Anspruch 8, worin der pH-Wert größer als 9 ist.
Verfahren nach Anspruch 8, worin der pH-Wert etwa 12 beträgt.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin das TSE-Agens ein Prion ist.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin die TSE ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus der Creutzfeld-Jacob-Erkrankung, der abgewandelten Creutzfeld-Jacob-Erkrankung, Kuru, der tödlichen familiären Insomnie, dem Gerstmann-Straussler-Scheinker-Syndrom, der spongiformen Enzephalopathie des Rindes (Rinderwahn), Scrapie, der spongiformen Enzephalopathie der Katze; chronischer Auszehrung und der übertragbaren Nerzenzephalopathie.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin das proteolytische Enzym von einem thermophilen Organismus gehalten wird.
Verfahren nach Anspruch 14, worin der thermophile Organismus ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Archaeen, hyperthermophilen Bakterien und thermophilen Bakterien.
Verfahren nach Anspruch 14, worin der thermophile Organismus ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Thermotoga maritima; Thermotoga neopolitana; Thermotoga thermarum; Fervidobacterium islandicum; Fervidobacterium nodosum; Fervidobacterium pennivorans; Thermosipho africanus; Aeropyrum pernix; Thermus flavus; pyrococcus spp.; Sulfolobus solfataricus; Desulfurococcus; Bacillus thermoproteolyticus; Bacillus stearo-thermophilus; Bacillus sp. 11231; Bacillus sp. 11276; Bacillus sp. 11652; Bacillus sp. 12031; Thermus aquaticus; Thermus caldophilus; Thermus sp. 16132; Thermus sp. 15673; und Thermus sp. Rt41A.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche zur Inaktivierung von TSE-Agenzien in klinischen Abfällen.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche zur Inaktivierung von TSE-Agenzien in aussortiertem tierischen Material.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, umfassend das Exponieren des TSE-Agens' an das Enzym bei einer Temperatur im Bereich von 50–120°C, worin der pH-Wert größer als 9 ist.
Verfahren zum Sterilisieren von Vorrichtungen, umfassend ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–20, worin sich das thermostabile proteolytische Enzym in Lösung befindet.
Verfahren nach Anspruch 21, worin die Temperatur der Lösung unterhalb von 100°C gehalten wird.
Verfahren nach Anspruch 21 oder 22, worin die Lösung als ein Spray aufgebracht wird.
Verfahren nach Anspruch 21 oder 22, worin die kontaminierte Vorrichtung in die Lösung eingetaucht wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–24, worin das TSE-Agens an eine erste Lösung, umfassend ein proteolytisches Enzym, das thermisch stabil und im Bereich von 50–120°C biologisch aktiv ist, exponiert wird und anschließend an eine zweite Lösung exponiert wird, umfassend ein proteolytisches Enzym, das thermischer stabil und in dem Bereich von 50–120°C biologisch aktiv ist.
Verfahren nach Anspruch 25, worin das erste und das zweite proteolytische Enzym gleich sind.
Verfahren nach Anspruch 25, worin sich das erste proteolytische Enzym von dem zweiten proteolytischen Enzym unterscheidet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 25–27, worin der pH-Wert der ersten Lösung sich von dem pH-Wert der zweiten Lösung unterscheidet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 25–28, worin die Temperatur der ersten Lösung sich von der Temperatur der zweiten Lösung unterscheidet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–29, zusätzlich umfassend das Bestätigen der Inaktivierung von TSE durch Bestätigen der Entfernung des Prionen-Dimeren.
Verfahren nach Anspruch 30, umfassend das Sondieren mit einem für Prionen-Dimere spezifischen Antikörper.
Verwendung einer Zusammensetzung, umfassend ein thermostabiles proteolytisches Enzym, das thermisch stabil und bei einer Temperatur im Bereich von 50–120°C biologisch aktiv ist, zum Sterilisieren von mit einem TSE-Agens kontaminierten Material.
Verwendung eines thermisch stabilen proteolytischen Enzyms, das thermisch stabil und bei einer Temperatur im Bereich von 50–120°C biologisch aktiv ist, bei der Herstellung einer Zusammensetzung zum Inaktivieren eines TSE-Agens'.