DE19730132C2 - Verfahren zum Nachweis von Prionen sowie eine Vorrichtung hierzu - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Prionen, insbesondere Erregern der spongiformen Enzephalopathie, sowie eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens.

Prionerkrankungen wie die Formen der spongiformen Enzephalopathie können sowohl durch vererbte genetische Defekte entstehen als auch über noch nicht vollständig verstandene Infektionswege erworben werden. Darüber hinaus treten sie auch als spontane Mutationsformen bestimmter Prionproteine auf. Iatrogene Infektionswege entstehen durch Behandlung mit Wachstumshormonen, Gonadotropin, Hornhauttransplantationen. Auch die Verwendung von nicht ausreichend sterilisiertem chirurgischen Material stellt eine mögliche Infektionsquelle dar.

Die 33 bis 35 kD großen Prionproteine (abgekürzt PrP) kommen in einer natürlichen physiologischen Tsoform sowie in einer pathologisch infektiösen Isoform vor, wobei die infektiöse Isoform durch eine Umfaltung der tertiären Raumstruktur aus der nichtinfektiösen physiologischen Form entsteht.

Aus Prusiner et al., Cell 38, 127 (1984) sowie Biochemistry 21, 6942 (1982) ist es bereits bekannt, daß Prionproteine einer partiellen Proteolyse zugänglich sind. Dabei hat es sich gezeigt, daß die natürliche physiolo­ gische Isoform nahezu vollständig einer Proteolyse zu­ gänglich ist, wohingegen die pathologische Form sich lediglich bis zu einer Größe von 27 bis 30 kD abbauen läßt. Diese einer weiteren Proteolyse nicht zugängliche Proteinform wird als ein gegen Protease beständiger Kern bezeichnet. Sie entsteht durch Abbau von 67 Aminosäuren am NH₂-Terminus und besteht selbst aus 141 Aminosäuren.

In der WO 93/23432 wird die Entdeckung eines neuen lös­ lichen Prionenpolypeptids beschrieben, welches in vivo auftritt. Derartige Polypeptide werden mittels Immunoadsorption an monoklonale oder polyklonale Antikörper enthaltende Säulen aufgereinigt. Zum Nachweis von abnormen Formen wird ebenfalls die von Prusiner beschriebene Proteolyse der physiologischen löslichen Form mit Proteinase K beschrieben. Derart isolierte Prionenproteine werden dann mittels eines üblichen Sand­ wichtestes mit einem markierten Antikörper detektiert.

Es sind auch bereits Verfahren zum Nachweis der patholo­ gischen Prion-Isoformen beschrieben worden. So beschreibt beispielsweise Collinge et al. in Lancet, Vol. 349, S. 99 (1997) einen Westernblot-Test unter Verwendung eines monoklonalen Anti-Prionprotein Antikörpers 3F4.

Prusiner et al., Cell 63, 673 bis 686 (1990) beschreiben einen als ELISA bezeichneten Immunoblot, wobei das zu untersuchende Material zuerst auf Nitrocellulose aufge­ tragen und dann mit einem biotinylierten 13A5-monoklonalen Antikörper und Peroxidase-konjugiertem Streptavidin indirekt nachgewiesen wird. Der Anteil an infektiösem pathologischen Protein wird durch Verdauen mit Proteinase K und anschließender Immunreaktion mittels den zuvor beschriebenen Antikörpern bestimmt.

Es sind auch bereits eine Vielzahl von Antikörpern be­ schrieben, die sowohl gegen die physiologische als auch gegen die pathologische Form gerichtet sind. So können beispielsweise Maus-spezifische PrP-Antikörper in sy­ rischen Hamstern gewonnen werden, die wöchentlich mit 5 × 10⁷ MoCHO-Zellen, welche das rekombinante membrangebundene MoPrP^c exprimieren, immunisiert wurden. Das Antiserum kann bereits nach 4 Injektionen gewonnen werden und reagiert mit MoPrP, jedoch nicht mit HaPrP (Prusiner aaO). Weitere Antikörper, die gegen Prionprotein gerichtet sind, werden beispielsweise in Barry und Prusiner J. Infect. Dis. 154, 518-521 (1986); Barry et al., J. Immunol. (1985), 135, 603-613; Bockmann et al., Ann. Neurol. (1987), 21, 589-595; Gabizon et al., (1988), PNAS, USA 85, 6617-6621 sowie in einer Übersicht von Prusiner et al., Cell (1990) 63, 673-686 mit weiteren Verweisen beschrieben.

Die zuvor beschriebenen Methoden mittels Auftrennen durch Elektrophorese bzw. Immobilisierung an Membranen, insbesondere Nitrocellulose-Membranen und anschließender Bestimmung mittels Anti-PrP-Antiserum ist jedoch als Methode für Reihenuntersuchungen aufgrund der notwendigen Arbeits- und Zeitintensität nicht geeignet. Aufgrund der enormen Bedrohung der Bevölkerung durch eine mögliche Übertragbarkeit von spongiformen Enzephalopathien besteht daher ein großer Bedarf an einem schnellen Nachweisver­ fahren für Prionen, beispielsweise in der Human- und Veterinärdiagnostik, wobei in entnommenen Körperflüssig­ keiten und Gewebeproben die pathologische Prion-Isoform qualitativ und quantitativ nachgewiesen werden kann. Ein besonderer Bedarf besteht an einem sog. direkten Nachweis, bei dem das Prion nicht mittels durch Marker erzeugten sekundären Stoffen bestimmt wird.

Dieses Ziel wird durch ein Verfahren gemäß Anspruch 1 gelöst.

Das erfindungsgemäße Verfahren zum qualitativen und/oder quantitativen Nachweis von infektiösen Proteinen (Prionen) aus einem ggfs. infektiöse pathologische und nicht-infek­ tiöse physiologische Isoformen des Prionprotein enthal­ tenden biologischen Material wird derart durchgeführt, daß man mittels einer zumindest limitierten Proteolyse die nicht-infektiöse, physiologische Isoform verdaut und die infektiöse pathologische Isoform durch einen Immunassay nachweist. Das erfindungsgemäße Verfahren ist nun dadurch gekennzeichnet, daß man die Proteolyse mittels einer immobilisierten Protease durchführt, die infektiöse Isoform mit einem Antikörper immobilisiert, der an eine feste Phase gebunden ist und dann detektiert. Die Detektion wird vorzugsweise mit einem weiteren, insbesondere markierten Antikörper, einem optischen Detektor oder mittels einer Immunquarzmikrowaage oder einem Oberflächenwellenelement durchgeführt.

Der Nachweis mittels markierter Antikörper basiert auf dem klassischen Sandwich-ELISA, wie er dem Fachmann bekannt ist. Dabei weist der Antikörper einen entsprechenden Marker auf, der ein nachweisbares Signal erzeugt, wodurch das gesuchte Prionprotein indirekt nachgewiesen wird. Als Marker werden üblicherweise radioaktive, lumineszierende oder fluoreszierende Substanzen und insbesondere Enzyme verwendet, welche ein Signal wie eine pH-Verschiebung oder ein gefärbtes oder lichtaussendendes Produkt bilden. Die gefärbten Produkte lassen sich dann mittels eines op­ tischen Detektors nachweisen. Als besonders geeignet hat sich auch die Verwendung von pH-verschiebenden Marker­ enzymen wie beispielsweise Urease erwiesen. Die hierbei mit der Analytenkonzentration korrelierende pH-Änderung läßt sich dann insbesondere mit ionensensitiven Feldef­ fekt-Transistoren (ISFET) detektieren.

Optische Detektoren zum direkten Nachweis sind integrierte Wellenleiter, Glasfasern, optische Gitterkoppler und Oberflächenplasmonresonatoren, wie sie beispielsweise von F. Aberl und H. Wolf in "Aktuelle Trends in der Immunosensorik, Labor 2000", S. 70-76 (1993) oder J. von Gent et al., "Design and Realization of a Surface Plasmon Resonance-based Chemo-Optical Sensor", Sensors and Actuators, Vol. A 25-27, (1991), S. 449-452, beschrieben sind.

Bei einem integrierten Wellenleiter führen ein oder mehrere Bereiche an der Oberfläche eines planaren Sub­ strates Licht. Dies wird dadurch erreicht, daß der licht­ führende Bereich eine höhere Brechzahl n aufweist als die umgebenden Bereiche. Ein kleiner Anteil des Lichtes dringt jedoch an der Grenze des lichtführenden Bereiches zum umgebenden Material in dieses wie z. B. einem Substrat oder einer darüber befindlichen Flüssigkeit. Dieser Anteil wird das evaneszente Feld genannt. Die Lichtintensität dieses Feldes klingt exponentiell mit dem Abstand vom lichtführenden Bereich ab. Finden an einer derartigen Grenze des Wellenleiters Immunreaktionen statt, so ändert sich dadurch der Brechungsindex der Immunschicht und somit das Ausbreitungsverhalten (Geschwindigkeit oder Absorpti­ on) der Welle.

Bei einer Glasfaser wird das Licht im Kern geführt. Dieser ist im allgemeinen von einer Umhüllung mit kleinerem Brechungsindex umgeben. Wird die Umhüllung an einer Stelle entfernt und dort eine Immunschicht aufgebracht, so können wie beim integrierten Wellenleiter Immunreaktionen zu einer meßbaren Änderung der Welle insgesamt führen.

Auch beim optischen Gitterkoppler wird das evaneszente Feld ausgenützt. Der Unterschied gegenüber einem inte­ grierten Wellenleiter besteht in der Einkoppelung des Lichtes. Beim optischen Gitterkoppler wird ein Laserstrahl über ein eingeprägtes Beugungsgitter in den lichtführenden Film eingekoppelt. Am Ausgang der lichtleitenden Schicht wird die Intensität in Abhängigkeit des Einstrahlwinkels gemessen. Eine Verschiebung des Winkels, bei dem sich ein Intensitätsmaximum am Detektor einstellt, läßt Rück­ schlüsse auf stattfindende Adsorptionsvorgänge im evaneszenten Feld des lichtführenden Films zu. Der umge­ kehrte Lichtweg - Einkopplung direkt in das Substrat und Auskopplung über ein Gitter - ist ebenfalls möglich.

Die Oberflächenplasmonresonanz (englisch surface plasmon resonance genannt) tritt auf, wenn Licht an einem dünnen Metallfilm reflektiert wird. Unter einem bestimmten Einstrahlwinkel (dem Resonanzwinkel) werden vom Licht Schwingungen der Elektronen (dieses Schwingungen nennt man Plasmonen) angeregt. Dies führt zu einem Intensitätsminimum des reflektierten Lichtstrahls. Die üblicherweise verwendete Anordnung besteht aus einem Glasprisma, das mit einem dünnen Gold- oder Silberfilm bedeckt ist. Kommt es innerhalb eines oberflächennahen Bereiches des Metallfilms (Eindringtiefe der evaneszenten Welle der Oberflächenplasmonen) zur Adsorption von Prote­ inen, so führt dies aufgrund der Veränderung des Bre­ chungsindexes oder der Dielektrizitätskonstante zu einer deutlich meßbaren Verschiebung des Resonanzwinkels.

Als ebenfalls besonders geeignet hat sich die direkte Messung mittels piezoelektrischen Schwingquarzen und Oberflächenwellenelementen erwiesen, welche als Mikrowaa­ gen verwendet werden können. Dabei werden auf einem piezoelektrischen Substrat wie einem Quarz mittels Interdigital-Transducern elektro-akustische Wellen erzeugt und detektiert. Kommt nun ein derartiger Quarz mit einem angrenzenden Medium zusammen, so führt dies zu einer Änderung der Ausbreitungsgeschwindigkeit bzw. zu einer Änderung der Amplitude der erzeugten Wellen. Auf diese Weise lassen sich Änderungen von mechanischen Eigen­ schaften des zu messenden Mediums wie Viskosität, Dichte und insbesondere Masse sowie Änderungen von elektrischen Eigenschaften, wie Leitfähigkeit und Dielektrizität, durch eine Änderung der erzeugten Wellen direkt nachweisen. Als ganz besonders geeignet haben sich hierbei Oberflächen­ wellensensoren erwiesen, wie sie beispielsweise von A. Leidl, A. Bruhn, E. Yacoub-George und S. Drost in "Proceedings of the 2nd International Symposium an miniaturized total analysis system µTAS '96, Basel, 19. bis 22. November 1996, S. 231 sowie von A. Leidl et al. in "Special Issue of 'Smart Materials and Structures' on 'SAW Devices and their Application', voraussichtlich August 1997 beschrieben sind.

Quarzkristallmikrowaagen, wie sie von C. Kößlinger et al., Fresenius J. Anal. Chem. (1994), 349, 349-354 be­ schrieben sind, haben sich insbesondere zum Immunnachweis als ganz besonders geeignet erwiesen. Bei beiden obigen Sensoren werden prionenspezifische Antikörper auf der Oberfläche des Quarzkristalles immobilisiert. Beim Auf­ tragen von zu untersuchenden Flüssigkeiten werden, sofern vorhanden, Prion-Antigene dann vom quarzgebundenen Anti­ körper selektiv gebunden. Dies führt zu einer Massenände­ rung der Quarzoberfläche, die mit dem zuvor beschriebenen Signal detektiert werden kann. Da die Massenzunahme direkt der Menge des immobilisierten Prions entspricht, kann auf diese Weise der Nachweis direkt durchgeführt werden, ohne daß dabei die sekundäre Bildung von Markerstoffen bestimmt werden muß. Diese Empfindlichkeit läßt sich durch eine zusätzliche spezifische Massenerhöhung wie beispielsweise die Verwendung eines zweiten Antikörpers, der an eine weitere antigene Determinante des Prion-Antigens bindet, noch weiter steigern.

Das im erfindungsgemäßen Verfahren einzusetzende biolo­ gische Material kann sowohl lebenden als auch taten Individuen entnommen werden. Bevorzugte Organe sind hierbei Hirn und zentrales Nervengewebe, lymphatisches Gewebe, insbesondere lymphatischer Rachenring wie Tonsil­ len, Thymusgewebe, sowie Milz. Die limitierte Proteolyse kann mit sämtlichen proteinspaltenden Mitteln, insbeson­ dere Enzymen durchgeführt werden, welche die physiolo­ gische Isoform der Prionen abbauen, die pathologische Isoform jedoch im wesentlichen nicht angreifen. Ein Protein wird erfindungsgemäß dann im wesentlichen nicht angegriffen oder abgebaut, wenn nach der Proteolyse ein immunologisch wirksamer, beständiger Rest der Aminosäure­ kette verbleibt. Auch eine milde Proteolyse mittels Alkali wie KOH hat sich als zweckmäßig erwiesen. Bevorzugt ist es jedoch, die Proteolyse mit Proteinase K durchzuführen.

Nach Durchführung des Testes kann der Detektor, also der festphasengebundene Antikörper bzw. die Immunquarz­ kristallmikrowaage oder das Oberflächenwellenelement mittels einer geeigneten Regenerationslösung gespült werden, wobei die beim Test immobilisierten Prionen und Reagenzien wieder abgelöst bzw. mobilisiert und entfernt werden. Geeignete Reagenzlösungen sind beispielsweise Salzlösungen mit einer geeigneten Ionenstärke und/oder einem geeigneten pH-Wert.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren zu verwendenden Anti­ körper sind entweder gemäß den eingangs geschilderten Verfahren nach dem Stand der Technik erhältlich oder durch Immunisierung von priondefekten Tieren zu gewinnen. Auf diese Weise ist es sogar möglich, Antikörper zu erhalten, welche selektiv gegen das Aminoende des proteolyse­ resistenten Kernes der pathologischen Isoform gerichtet sind. Besonders bevorzugt ist es, monoklonale Antikörper zu verwenden.

Die Erfindung betrifft auch eine Vorrichtung zur Durch­ führung des erfindungsgemäßen Verfahrens gemäß Anspruch 9. Die Vorrichtung umfaßt einen Detektor, sowie ein Reak­ torelement zur Vorbereitung der Probe. Die erfindungs­ gemäße Vorrichtung zeichnet sich dadurch aus, daß das Reaktorelement eine immobilisierte Protease enthält, welche die physiologische Isoform zumindest teilweise proteolysiert und einen festphasengebundenen Antikörper aufweist, der die pathologische Isoform der Prionen bindet. Eine bevorzugte Protease ist immobilisierte Proteinase K. Das Reaktorelement enthält zumindest zum Teil die notwendigen Reagenzien.

Zweckmäßige Detektoren sind insbesondere ein ionensensitiver Feldeffekt-Transistor (ISFET), Schwingquarz, Oberflächenwellenelement (SAW-Sensoren), Elektroden oder die zuvor beschriebenen optischen Detek­ toren. In einer zweckmäßigen Ausgestaltung enthält die Vorrichtung auch Lipasen, insbesondere immobilisierten Lipasen. In einer besonderen Ausführungsform sind die Reagenzien, insbeson­ dere die Enzyme, kovalent an einen Träger, insbesondere Kieselgel sowie Siliziumverbindungen wie Borosilikatgläser (Pyrex®), SiO₂, Si₃N₄, SiC oder Metallschichten wie Au oder Pt oder Kunststoffen wie Polymethacrylate gebunden. Als eine geeignete Immobilisierungstechnik hat sich die kovalente Bindung mittels Aminoorganoalkyloxysilan und Glutardialdehyd, insbesondere auch die Bindung mittels kovalent an das Enzym gebundene Biotin an Streptavidin, das an einer oben genannten Festphase immobilisiert ist, erwiesen, wie es beispielsweise in H. Weetal et al. in Methods in Enzymology, 34 (1974), 59 beschrieben ist.

Es ist auch möglich, das Reaktorelement derart auszuge­ stalten, daß es immobilisierte Anti-Prion-Antikörper aufweist. Auch hier ist wieder ein bevorzugter Träger Kieselgel. Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird dann die zu untersuchende Probe vor oder nach der Verdauung mit Proteinase K auf die immobilisierten Antikörper aufgetra­ gen und dann vorzugsweise von ungebundenen Bestandteilen befreit. Nach der Immobilisierung wird dann gegebenfalls nach Proteolyse der gebundenen physiologischen nicht-in­ fektiösen Prionen die verbleibenden immobilisierten pathologischen Prionproteine mittels eines weiteren einen Marker tragenden Antikörpers markiert und mit einer Reaktionslösung versehen. Das durch den Marker, insbeson­ dere Enzymmarker gebildete Reaktionsprodukt läßt sich dann mittels optischen oder ISFET-Detektoren wie beschrieben nachweisen.

Claims (14)

1. Verfahren zum Nachweis von Erregern der spongiformen Enzephalopathie aus einem gegebenfalls pathologische und physio­ logische Prion-Isoformen enthaltenden biologischen Mate­ rial, wobei mittels einer zumindest limitierten Proteolyse die physiologische Isoform verdaut und die pathologische Isoform mittels eines Immunassays nachgewiesen wird, dadurch gekennzeichnet, daß man die Proteolyse mittels einer immobilisierten Protease durchführt und die pathologische Isoform an einem festphasengebundenen Antikörper immobilisiert und dann detektiert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man mit einem weiteren markierten Antikörper, einem optischen Detektor, einer Immunquarzkristallmikrowaage und/oder einem Oberflächenwellenelement detektiert.

3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die spongiforme Enzephalopathie BSE, Scrapie, Creutzfeldt-Jakob, Kuru- Kuru, Gerstmann-Sträussler-Syndrom und/oder Alzheimer ist.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das biologische Material aus lymphatischem Gewebe, Thymus-Gewebe, Milz, Medulla oblongata und/oder Hirn stammt.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das lymphatische Gewebe der lymphatische Rachenring, insbesondere die Tonsillen sind.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die limitierte Proteolyse mittels Proteinase K durchgeführt wird.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Antikörper verwen­ det, der gegen den Kern der proteasebeständigen Isoform gerichtet ist.

8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Antikörper verwendet, der gegen das NH₂-terminale Ende des Kerns gerichtet ist.

9. Vorrichtung zum Nachweis von Erregern der spongiformen Enzephalopathie, umfassend ein Reaktorelement zur Vorbe­ reitung der zu untersuchenden Probe, sowie einen Detektor, wobei das Reaktorelement zumindest einen Teil der notwen­ digen Reagenzien enthält, dadurch gekennzeichnet, daß das Reaktorelement eine immobilisierte Protease enthält, die die physiologische Prion-Isoformen zumindest einer limi­ tierten Proteolyse unterwirft und daß die Vorrichtung einen festphasengebundenen Antikörper aufweist, der die pathologische Isoform bindet.

10. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Detektor ausgewählt ist aus einem markierten Antikörper, einer Immunquarzkristallmikrowaage, einem Oberflächenwellenelement und/oder einem optischen Detek­ tor.

11. Vorrichtung nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die immobilisierte Protease Proteinase K ist.

12. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9-11, dadurch gekennzeichnet, daß die Protease an einem Trägermaterial immobilisiert ist, das Silizium und/oder eine Silizium­ verbindung umfaßt.

13. Vorrichtung nach Ansprüche 9-12, dadurch gekennzeich­ net, daß der festphasengebundene Anti-Prion-Antikörper als erster Antikörper in einem zweiten Reaktorelement angeordnet ist, wobei die Bindung eines Prions an diesen ersten Antikörper mit einem weiteren markierten Antikörper nachweisbar ist.

14. Vorrichtung nach Anspruch 9-13, dadurch gekennzeich­ net, daß der festphasengebundene Antiprion-Antikörper gegen das aminoterminale Ende des Kerns der gegen Protease beständigen Isoform gerichtet ist.