DE602004007455T2

DE602004007455T2 - NMR-Spektroskopie an Proteinen mit selektiver Anregung mittels ESR

Info

Publication number: DE602004007455T2
Application number: DE602004007455T
Authority: DE
Inventors: Isao Kitagawa
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 2003-11-26
Filing date: 2004-11-22
Publication date: 2008-03-13
Anticipated expiration: 2024-11-23
Also published as: EP1536245A1; DE602004007455D1; US20050110495A1; US7202664B2; EP1536245B1; JP4192078B2; JP2005156345A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Beurteilung der Funktion und der Bindungsstärke von Molekülen. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Beurteilen der Wechselwirkung eines Protein-Ligand-Komplexes und eines Protein-Protein-Komplexes.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Bei vielen Anwendungen ist es erwünscht, die Wechselwirkung zwischen Substanzen in einer Probe zu erfassen. Beispielsweise ist die Erfassung der Wechselwirkung zwischen einem Protein und einem Liganden, einem Protein und einem Glykoprotein oder Proteinen sehr nützlich für die Diagnose von Krankheiten, für biotechnologische Untersuchungen und für die Entwicklung in der Landwirtschaft und von Pharmazeutika.
Es wurden viele Verfahren zum Erfassen der Wechselwirkung zwischen Molekülen entwickelt. Bei der Erfassung der Wechselwirkung zwischen Proteinen werden SAR-durch-NMR und Affinitäts-NMR verwendet. Das SAR-durch-NMR-Verfahren ist ein Verfahren, bei dem die Wechselwirkung zwischen einem Zielprotein, das einer ¹⁵N-Isotopenmarkierung unterzogen wurde, und einem Liganden anhand der Änderung der chemischen Verschiebung erfasst wird, um die Molekülentwicklung von Liganden mit einer stärkeren Wechselwirkung voranzutreiben (beispielsweise Patentdokument 1: WO 97/18469 , Nicht-Patentdokument 1: Yoshiki Yamaguchi und Kazuo Shimada, "A new approach to a study an novel drug discovery using nuclear magnetic resonance", Protein, Nucleic acid, Enzyme, 45 (2000) 895). Das Affinitäts-NMR-Verfahren ist ein Erfassungsverfahren, bei dem die Änderung der Relaxationszeit eines von der Änderung der Translationsbewegung erzeugten Signals, wenn ein Ligand mit einem geringen Molekulargewicht mit einem Zielprotein verbunden wird, verwendet wird.
Die Wechselwirkungsmessung durch die Kernspinresonanz allein hat einige Nachteile. Erstens gibt es eine Obergrenze (40 KD oder weniger) des analysierbaren Molekulargewichts, weil das SAR-durch-NMR-Verfahren die Struktur eines markierten Proteins analysieren muss. Weil eine große Menge des mit einem Isotop markierten Proteins erforderlich ist, ist die Löslichkeit des Zielproteins begrenzt, so dass die Arten der messbaren Proteine beschränkt werden. Große Anzahlen isotopenmarkierter Proben sind sehr kostspielig.
Weil das Affinitäts-NMR-Verfahren keine große Menge eines isotopenmarkierten Proteins benötigt, ist die Messung zweitens verhältnismäßig kostengünstig. Es kann nur die Bindungsstärke zwischen einem Protein und einem Liganden erfassen. Die Position eines aktiven Bereichs oder eines Bindungsbereichs und die Struktur des Zielproteins können nicht herausgefunden werden. Es ist schwierig, strukturelle Informationen als Anleitung zum Entwickeln besserer Liganden zu erhalten.
Ein Protein-Protein-(Glykoprotein)-Komplex und ein Riesenprotein werden gemessen, indem eine selektive Isotopenmarkierung zur Proteinsynthese unter Verwendung eines Mediums, bei dem eine spezifizierte Aminosäure einer Isotopenmarkierung unterzogen wurde, mit der Kernspinresonanz kombiniert wird (siehe Nicht-Patentdokument 2: J. Wigelt, M. Wikstrom, J. Schultz, M.J.P. van Dongen, Combinational Chemistry & High Throughput Screening, 5 (2002) 623). Nur ein Resonanzsignal von dem Atom an dem spezifizierten Aminosäurerest einer Probe, die der selektiven Isotopenmarkierung unterzogen wurde, wird beobachtet, um es zu ermöglichen, den Rest des Proteins mit einem hohen Molekulargewicht zu relegieren.
Zur Ausführung der selektiven Isotopenmarkierung wird ein Medium, in dem eine spezifizierte Aminosäure einer Isotopenmarkierung unterzogen wurde, unter Verwendung einer hoch entwickelten Technik präpariert, um eine Proteinsynthese auszuführen. Die Unterschiede in den Erfahrungen und Geschicklichkeiten verschiedener Probenpräparierer erhöhen stark die Probenpräparationskosten.
Die meisten Verfahren aus dem Stand der Technik zum Erfassen der Bindung zwischen Molekülen unter Verwendung der Kernspinresonanz vergleichen die Messergebnisse vor und nach der Bindung von Zielmolekülen. Die Messung des Wechselwirkungsprozesses ist sehr schwierig.
Als ein experimentelles Mittel zur Änderung des Zustands des Elektronenspins zur Erfassung eines Resonanzsignals wird weit verbreitet die ESR verwendet. Bei der ESR wird ein breites Frequenzband von einigen hundert MHz bis einigen zehn GHz verwendet. Die Energie, die einem ungepaarten Elektron durch die ESR in der Frequenzbandbreite verliehen wird, ist erheblich kleiner als die chemische Bindung, die Wasserstoffbindung und die van-der-Waals-Kraft. Ihre Eigenschaften werden nicht geändert, indem einer Probe während eines langen Zeitraums Pulse zugeführt werden. In dieser Hinsicht kann die ESR ein zerstörungsfreies Messverfahren sein.
Bei der Ultraviolett-Raman-Spektroskopie, bei der die Reaktion einer Probe unter Verwendung eines Pulslasers hoher Energie beobachtet wird, kann eine Denaturierung eines Probenproteins herbeigeführt werden, wenn die Ausgangsleistung des Pulslasers zu stark ist. Die Anwendung eines Lasers mit einer Frequenz, die höher ist als jene eines Infrarotstrahls, kann die Strukturänderung des Proteins herbeiführen. Weil die angewendete Energie in der Nähe der Bindungsenergie von das Protein bildenden Atomen und der Rotationsenergie einer Atomgruppe ist, kann die Energie dem spezifizierten Abschnitt nicht selektiv zugeführt werden. Beim experimentellen Verfahren zum Analysieren der Reaktion der gesamten Probe auf einfallendes Licht der Raman-Spektroskopie ist die selektive Beobachtung des spezifizierten Abschnitts schwierig.
Bei der Funktions- und Strukturanalyse von Proteinen nimmt der Bedarf für das Abzielen auf Protein mit einem höheren Molekulargewicht und für das Analysieren eines Ligand-Protein-Komplexes zu. Es wurde keine Technik für das Ändern und Beobachten des spezifizierten Abschnitts des Proteins vorgestellt.

[Patentdokument 1] WO 97/18469
[Nicht-Patentdokument 1] Yoshiki Yamaguchi und Kazuo Shimada, "A new approach to a study an novel drug discovery using nuclear magnetic resonance", Protein, Nucleic acid, Enzyme, 45 (2000) 895
[Nicht-Patentdokument 2] J. Wigelt, M. Wikstrom, J. Schultz, M.J.P. van Dongen, Combinational Chemistry & High Throughput Screening, 5 (2002) 623

In "Mapping of Ligand Binding Sites an Macromolecules by Means of Spin-Labeled Ligands and 2D Difference Spectroscopy", Journal of Magnetic Resonance, Band 80, 1988, S. 197 bis 213, De Jong u.a. werden zwei Prozeduren zum Verarbeiten von 2D-NMR-Daten verglichen. Die anliegenden Ansprüche 1 und 8 wurden angesichts dieses Dokuments in zweiteiliger Form formuliert.
In "NMR Spectroscopy Techniques for Screening and Identifying Ligand Binding to Protein Receptors", Angewandte Chemie International Edition, Band 42, Nr. 8, S. 864 bis 890, Meyer u.a. sind NMR-Spektroskopietechniken zum Analysieren von Bindungsereignissen von Liganden an Rezeptoren beschrieben.
In "Spin Labels as a Tool to Identify and Characterize Protein-Ligand Interactions by NMR Spectroscopy", ChemBio-Chem, Band 3, 2002, S. 167 bis 173, Jahnke ist dargestellt, dass Spinmarkierungen verwendet werden können, um die Empfindlichkeit spektroskopischer NMR-Durchmusterungen in der Arzneimittelforschung zu erhöhen.
In "Probing Protein structure by solvent perturbation of NMR spectra", European Journal of Biochemistry, Band 227, 1995, S. 78 bis 86, Improta u.a. werden zwei Techniken zum Prüfen der Proteinstruktur, nämlich photochemisch induzierte dynamische Kernpolarisationstechniken und Techniken auf der Grundlage der Lösungsmittelstörung von NMR-Spektren, verglichen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Zur Erfassung der Bindung eines Zielproteins und eines Liganden und der Wechselwirkung zwischen Proteinen sind eine Technik zum selektiven Zuführen von Energie zu dem spezifizierten Rest, der zur Bindung des Zielproteins beiträgt, in einer Mischprobe zur Steuerung des Zustands für die Änderung des Bindungsabschnitts des Proteins und eine Technik zum Messen des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins der Bindung und des Wechselwirkungsprozesses wichtig.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren und eine Vorrichtung bereitzustellen, wodurch die Wechselwirkung eines Proteins in einer Mischprobe gesteuert und erfasst werden kann und der Wechselwirkungsprozess gemessen werden kann. Die Aufgabe wird durch den in den vorliegenden Ansprüchen definierten Erfindungsgegenstand gelöst. Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind eine Einheit, welche für eine Probe ein gleichförmiges statisches Magnetfeld bereitstellt, ein Oszillator, der auf die Probe eine elektromagnetische Welle im THz-Bereich anwendet, sowie eine Sonde und eine Beobachtungseinheit, welche ein Kernspinresonanzsignal erfassen können, angeordnet.
Die 1, 2 und 3 zeigen schematisch die Anordnung der Komponenten einer Kernspinresonanz (nachstehend als NMR bezeichnet), welche für das Verwirklichen der vorliegenden Erfindung bevorzugt sind. Die 1 und 2 sind Beispiele, in denen Magnete für ein statisches Magnetfeld 6 zweigeteilt sind und eine Probe 4 und eine Sondenspule für die Kernspinresonanz 5 zwischen den Magneten für statische Magnetfelder 6 angeordnet sind. 3 ist ein Beispiel, in dem die Probe 4 in einer Bohrung 7 des Magneten 6 angeordnet ist. In den jeweiligen Darstellungen bezeichnen die Bezugszahl 1 einen Oszillator für elektromagnetische THz-Wellen, die Bezugszahl 2 einen Detektor für elektromagnetische THz-Wellen, die Bezugszahl 3 ein Probenröhrchen, die Bezugszahl 4 eine Probe, die Bezugszahl 7 eine Bohrung des Magneten 6, die Bezugszahl 8 eine Verlängerungslinie der Sondenspule für die Kernspinresonanz 5 und die Bezugszahl 9 eine Führung zum Einführen des Probenröhrchens 3. Der Oszillator 1 für elektromagnetische THz-Wellen und der Detektor 2 für elektromagnetische THz-Wellen haben Verlängerungslinien, welche in der Zeichnung fortgelassen sind. Die Sondenspule für die Kernspinresonanz 5 ist in den 1 und 2 eine Solenoidspule und in 3 eine Sattelspule. In den 1 und 3 sind der Oszillator 1 für elektromagnetische THz-Wellen und der Detektor 2 für elektromagnetische THz-Wellen bereitgestellt. In 2 ist nur der Oszillator 1 für elektromagnetische THz-Wellen bereitgestellt.
In der Kernspinresonanzvorrichtung wird ein elektrisches Signal zum THz-Oszillator 1 gesendet, um eine elektromagnetische Welle auf die Probe 4 anzuwenden, ein Kernspinresonanzsignal der Probe durch die Sondenspule für die Kernspinresonanz 5 erfasst und wird die Bindungsenergie in dem Zielprotein beobachtet. Die Sondenspule für die Kernspinresonanz 5 kann eine Sendespule einer elektromagnetischen Welle für die Kernspinresonanz sein. Die vom THz-Oszillator 1 angewendete elektromagnetische Welle wird durch die Sondenspule für die Kernspinresonanz 5 und das Probenröhrchen 3 gesendet, damit sie die Probe 4 erreicht.
Zum Beobachten der Änderung des Kernspinresonanzsignals, die durch die elektromagnetische THz-Welle in der Probe hervorgerufen wird, sind der Bereich maximaler Empfindlichkeit der Sondenspule 5 für die Kernspinresonanz und der Bereich, den die elektromagnetische THz-Welle erreicht, fast gleich. Wenngleich dies in den 1 bis 3 nicht dargestellt ist, ist der periphere Abschnitt der Sondenspule für die Kernspinresonanz 5 des Mechanismusteils für das Halten der Sondenspule für die Kernspinresonanz 5, des Probenröhrchens 3 und der Führung 9 mit einer Schutzkonstruktion versehen. Der Abschnitt, der dem Bereich der Schutzkonstruktion entspricht, ist mit Fenstern zum Durchlassen der elektromagnetischen THz-Welle versehen.
Die 4A und 4B sind Diagramme, welche ein Beispiel der Schutzkonstruktion zeigen, wobei 4A eine Schnittansicht ist und 4B eine perspektivische Ansicht. ist. Die 4A und 4B sind Beispiele, bei denen die Sondenspule 5 bei Zimmertemperatur verwendet wird. Die Bezugszahl 10 bezeichnet einen Abschirmungsteil der Schutzkonstruktion. Die Bezugszahlen 13 und 13' bezeichnen Eintritts- und Austrittsfenster für eine elektromagnetische THz-Welle. Die Bezugszahl 5 bezeichnet eine Sondenspule. Die Bezugszahlen 12 und 12' bezeichnen Verbindungslöcher der Führung 9 für das Einführen des Probenröhrchens 3. Die Sondenspulen 5 sind in Reihe, parallel oder in Reihe parallel geschaltet, und sie erstrecken sich durch die Verlängerungsleitungen 8 (1 bis 3), welche in der Zeichnung fortgelassen sind, nach außen. Die Sondenspule 5 kann von einem Solenoidtyp sein, wie in der Zeichnung dargestellt ist, oder sie kann von einem Satteltyp sein, wie in 3 dargestellt ist. Die Führung 9 für das Einführen des Probenröhrchens 3 ist mit den Verbindungslöchern 12 und 12' verbunden. Das Probenröhrchen 3 wird über die Führung 9 und das Verbindungsloch 12 in die Sondenspule 5 eingeführt. Der Abschirmungsteil 10 ist mit dem Eintrittsfenster 13 und dem Austrittsfenster 13' für die elektromagnetische THz-Welle versehen. Wie in den 1 und 3 dargestellt ist, werden das Eintrittsfenster 13 und das Austrittsfenster 13' bereitgestellt, wenn der Oszillator 1 für elektromagnetische THz-Wellen und der Detektor 2 für elektromagnetische THz-Wellen bereitgestellt werden. Wie in 2 dargestellt ist, kann nur das Eintrittsfenster 13 bereitgestellt werden, wenn nur der Oszillator 1 für elektromagnetische THz-Wellen bereitgestellt wird.
Wenn die Sondenspule 5 bei Zimmertemperatur verwendet wird, braucht die Sonde nicht zur Isolation gedichtet zu werden. Wie in den 4A und 4B dargestellt ist, können die Fenster 13 und 13' zum Durchlassen elektromagnetischer THz-Wellen in einem Teil des Abschirmungsteils 10 geöffnet werden. In den in den 4A und 4B dargestellten Beispielen ist das Fenster 13', das die durchgelassene elektromagnetische THz-Welle beobachten kann, auf der entgegengesetzten Seite des Eintrittsfensters 13 für elektromagnetische THz-Wellen bereitgestellt, so dass die NMR-Messung und die THz-Spektroskopie gleichzeitig ausgeführt werden. Wenn es keine spezielle Bedingung gibt, ist es wünschenswert, dass die Eintrittsfenster 13 und 13' nur unter Vakuum oder Luft stehen.
Wenn die Sondenspule 5 bei einer sehr niedrigen Temperatur betrieben wird, liegt das Innere des Abschirmungsteils 10 bei einer sehr niedrigen Temperatur, wenngleich dies nicht dargestellt ist. Die Fenster 13 und 13' für das Durchlassen elektromagnetischer THz-Wellen müssen zur Isolation geschlossen werden. Die elektromagnetischen THz-Wellen müssen durchgelassen werden. In diesem Fall können die in den 4A und 4B dargestellten Fenster 13 und 13' durch eine dünne Siliciumkristallplatte geschlossen werden. Beispielsweise ist es, wie anhand der Daten verständlich ist, die in dem Dokument vom American Institute of Physics Handbook, 3. Ausgabe, Herausgeber D.E. Grat' (McGraw-Hill, 1972) beschrieben sind, optimal, wenn der Siliciumkristall (die dünne Siliciumplatte) die elektromagnetischen Wellen im THz-Bereich durchlässt.
Der THz-Bereich ist ein begrenzter Bereich zwischen einer elektromagnetischen Welle und Licht, und er hat eine Frequenzbandbreite, in der große Beträge von Resonanz und Absorption von Phononen einer Probe existieren. Wenn eine Probe in ein gleichförmiges statisches Magnetfeld eingebracht wird und einen ungepaarten Spin hat, hat sie ein Energieniveau, das der Orientierung des ungepaarten Spins durch den Zeeman-Effekt entspricht. Wenn eine elektromagnetische Welle mit einer Resonanzfrequenz, die der Differenz zwischen Energieniveaus entspricht, einfällt, geschieht ein Übergang zwischen den Niveaus des ungepaarten Spins. In einem hohen Magnetfeld, in dem die Frequenz den THz-Bereich erreicht, dissipiert die Energie zum Phononenmodus, der in der Nähe der Resonanzfrequenz existiert. Die dissipierende Energie durchläuft den Prozess des Gittersystems, so dass sie zu Wärmeenergie in dem Rest in der Nähe des ungepaarten Spins wird. Die Energie wird nur dem spezifizierten Abschnitt der Probe zugeführt.
Wenn die zugeführte Energie ausreicht, tritt eine Strukturänderung in dem spezifizierten Restabschnitt auf. Die Änderung unterscheidet sich von der Änderung im isolierenden Elektronensystem, und wenn die Zufuhr der festen Energie fortgesetzt wird, wird sie zu einer quasistationären Strukturänderung. Es wird eine Daueranwendung von elektromagnetischen THz-Wellen ausgeführt, um es zu ermöglichen, die von der Strukturänderung abgeleitete Änderung der chemischen Verschiebung durch NMR-Messung zu beobachten.
Der elektronische Zustand in dem spezifizierten Rest wird durch die Bindung an den Liganden oder die Dissoziation von dem Liganden geändert. Wenn der ungepaarte Spin beseitigt oder erzeugt wird, wird die Energiezufuhr zum spezifizierten Rest beseitigt (oder sie tritt auf). Durch die Dissipation (oder das Auftreten) der Signaländerung der chemischen Verschiebung durch NMR-Messung kann die Wechselwirkung erfasst und beobachtet werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden die Wechselwirkung und die Bindung des spezifizierten Aminorests, der eine Gruppe mit einer hohen Bindungsaktivität, wie Carbonyl, in der Seitenkette aufweist, selektiv geändert, um es zu ermöglichen, die Bindung des Proteins mit einem hohen Molekulargewicht mit einem Liganden und die Wechselwirkung zwischen Proteinen durch ein Kernspinresonanzsignal zu beobachten. Weil ein wellenlängenveränderlicher THz- Oszillator verwendet wird, werden eine Resonanzoszillation des gesamten Proteins und eine Resonanz der spezifizierten Struktur bereitgestellt, um es zu ermöglichen, seine Molekularstruktur und chemische Änderung durch Kernspinresonanz zu beobachten. Die Energie einer angewendeten elektromagnetischen THz-Welle ist gering und beträgt 0,4 kJ/mol, wenn die Frequenz 1 THz beträgt. Das Problem der Denaturierung von Protein, das bei einem Experiment in der Art der Raman-Spektroskopie, bei der Licht oberhalb von Infrarotstrahlen verwendet wird, berücksichtigt werden muss, kann reduziert werden.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG
1 ist ein Diagramm, das schematisch die Anordnung der Komponenten einer Kernspinresonanzvorrichtung zeigt, die zur Verwirklichung der vorliegenden Erfindung bevorzugt ist,
2 ist ein Diagramm, das schematisch die Anordnung der Komponenten einer anderen Kernspinresonanzvorrichtung zeigt, die für das Verwirklichen der vorliegenden Erfindung bevorzugt ist,
3 ist ein Diagramm, das schematisch die Anordnung der Komponenten einer weiteren Kernspinresonanzvorrichtung zeigt, die zur Verwirklichung der vorliegenden Erfindung bevorzugt ist,
4A ist eine Schnittansicht eines Beispiels einer Schutzkonstruktion, die im peripheren Abschnitt einer Sondenspule für die Kernspinresonanz bereitgestellt ist,
4B ist eine perspektivische Ansicht, die 4A entspricht,
5 ist ein Diagramm, das die Strukturformel von Carbonyl in einer Lösung zeigt, in der ein Proton ionisiert ist,
6 ist ein schematisches Diagramm, das eine Zielproteinprobe zeigt, die erhalten wird, indem ein Protein, das Asparaginsäure oder Glutaminsäure im aktiven Zentrum aufweist, einer Isotopenmarkierung von Asparaginsäure oder Glutaminsäure unterzogen wird,
7 ist ein Diagramm, das die Prozedur zum Beobachten der Strukturänderung in dem Protein durch Anwendung einer elektromagnetischen THz-Welle zeigt,
8 ist ein schematisches Diagramm, in dem die Strukturänderung (Änderungsbetrag des Abstands zwischen Wasserstoffatomen) in dem Probenprotein anhand des Messergebnisses durch die in 7 beschriebene Anwendung der elektromagnetischen THz-Welle geschätzt ist,
9 ist ein schematisches Diagramm, in dem eine Zielproteinprobe dargestellt ist, die durch Binden eines Probenproteins, das erhalten wurde, indem das Protein mit Asparaginsäure oder Glutaminsäure im aktiven Zentrum der Isotopenmarkierung von Asparaginsäure oder Glutaminsäure unterzogen wurde, an den Liganden erhalten wurde,
10 ist ein Diagramm, in dem die Prozedur zum Beobachten der Protein-Ligand-Wechselwirkung dargestellt ist,
11 ist ein schematisches Diagramm, in dem die Bindungsstärke zwischen dem Probenprotein und dem Liganden anhand des Messergebnisses durch die in 10 beschriebene Anwendung der elektromagnetischen THz-Welle geschätzt wird,
12A ist ein Diagramm, in dem eine Energiekurve eines Protein-Ligand-Komplexes dargestellt ist, um das Verhalten einer Kurve zwischen der Anwendung einer elektromagnetischen THz-Welle und dem Änderungsbetrag der chemischen Verschiebung in 12B zu erklären, und
12B ist ein Diagramm, in dem die Kurve zwischen der Anwendung einer elektromagnetischen THz-Welle und dem Änderungsbetrag der chemischen Verschiebung durch Auftragen des unter verschiedenen Anwendungen gemessenen Änderungsbetrags der chemischen Verschiebung dargestellt ist.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORM
Gemäß den bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, die in den 1 bis 4A und 4B beschrieben sind, wird zum Erfassen der Bindung eines Zielproteins mit einem Liganden und der Wechselwirkung zwischen Proteinen ein spezifisches Verfahren verwendet, bei dem dem spezifischen Rest, der zur Bindung des Zielproteins in einer gemischten Probe beiträgt, selektiv Energie zugeführt wird, um den Zustand des bindenden Abschnitts des Proteins zu steuern und diesen zu ändern, um das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein einer Bindung und den Wechselwirkungsprozess zu messen.
Eine Proteinanalyse durch eine Mehrfachmessung durch Anwenden einer elektromagnetischen THz-Welle und eine NMR-Messung wird detailliert beschrieben.
Das Protein, das in der Probe 4 enthalten ist, weist etwa 20 Arten von Aminosäureresten auf, die durch eine Peptidbindung gebunden sind. Einige der Reste weisen Carbonyl in dem als Seitenkette bezeichneten Abschnitt auf, der nicht zur Peptidbindung beiträgt. Abhängig von einer Bedingung der wässrigen Lösung weist das Seitenkettencarbonyl einen Dublettzustand auf, in dem ein Proton ionisiert ist und ein ungepaarter Spin in der Nähe eines Sauerstoffatoms bereitgestellt ist. 5 zeigt die Strukturformel des Carbonyls, in dem ein Proton ionisiert ist. Wie durch die Pfeile angegeben ist, wird, wenn die gesamte Probe einem starken gleichmäßigen statischen Magnetfeld ausgesetzt wird, der ungepaarte Elektronensein des Seitenkettencarbonyls parallel zum Magnetfeld ausgerichtet.
Wenn der in dem Carbonyl erzeugte ungepaarte Spin einem starken statischen Magnetfeld ausgesetzt wird, ist die Energie in dem Zustand, in dem es parallel zum Magnetfeld gerichtet ist, und dem Zustand, in dem es nicht parallel zum Magnetfeld gerichtet ist, verschieden, und der Spinzustand wird aufgespalten, wodurch die Entartung aufgehoben wird. Wenn Energie, die gleich der Energiedifferenz zwischen den Zuständen ist, dem ungepaarten Spin zugeführt wird, tritt ein Übergang zwischen den beiden Zuständen auf, und es tritt ein Umklappen des Seins auf. Die Energie in dem Zustand des Spin- Umklappens ist hoch. Der Spin-Umklappzustand wird nicht unverändert gehalten. Die Energie relaxiert durch die Wechselwirkung zwischen dem Elektronensystem und dem Gittersystem, so dass in den ursprünglichen parallelen Spinzustand zurückgekehrt wird. Die Moleküloszillation und Molekülstrukturänderungen beeinflussen den Elektronenspinzustand erheblich. Die Zustandsrelaxation wird durch die Temperatur der Probe beeinflusst.
Eine Energiebewegung von dem spezifizierten Bereich des Proteins wird durch Beobachtung der Anti-Stokes-Raman-Linie unter Verwendung eines Pikosekunden-Pulslaserstrahls über die Zeit verifiziert. Wenn Kohlenmonoxid von Myoglobin photodissoziiert wird, wird nach Y. Mizutani und T. Kitagawa, Science 278 (1997) 443 Häm für einen Moment heiß und kühlt bei einer Zeitkonstanten von 1,9 Pikosekunden. Es scheint, dass zusammen damit die Strukturänderung des Proteins in bis zu 100 Pikosekunden auftritt.
Die dem spezifizierten Abschnitt des Proteins zugeführte Energie wird auf das nahe gelegene Atom überführt, so dass damit eine Strukturänderung auftritt. In dem Fall, in dem die dem spezifizierten Elektronensein zugeführte Energie oberhalb der Aktivierungsenergie der Bindung liegt, kann die Ligand-Protein-Bindung oder die Protein-Protein-Bindung geändert werden.
Bei der Protein-Ligand-Bindung oder der Protein-Protein-Bindung ist der Bereich, der sich auf die Bindung bezieht, häufig ein Rest, in dem die Seitenkette oxidativ oder basisch ist. Ein spezifisches Beispiel wird anhand Protease des HIV-1-Virus gegeben. Das Protein hat eine Funktion, Protease selbst, reverse Transcriptase und Integrarze von Vorläufer-Körperprotein des HIV-1-Virus zu erzeugen. Der Abschnitt, der eine Proteaserevitalisierung aufweist, ist als Asparaginsäure an der 25. Position des Proteins bekannt. Es ist bekannt, dass die Asparaginsäure Carbonyl in der Seitenkette aufweist und dass das Carbonyl einen. ungepaarten Spin hat und durch eine Wasserstoffbindung an ein Molekül eines Obstruktionsmedikaments gebunden ist.
Das statische Magnetfeld der Kernspinresonanz wurde in den letzten Jahren erhöht, um die Auflösung zu verbessern. Ein Magnetfeld, das einer Resonanzfrequenz von etwa 1 GHz eines Protons entspricht, beträgt etwa 21 T (Tesla). Die Resonanzfrequenz einer gepulsten elektromagnetischen Welle, die für das Umklappen eines ungepaarten Elektronenspins erforderlich ist, wird durch Gleichung (1) bestimmt, welche. das Energieniveau der Zeman-Aufspaltung zeigt.
wobei g der g-Wert eines Elektrons ist, β das Bohrsche Magneton ist (9,274 × 10^–24 JT^–1) und H die externe Magnetfeldstärke ist. Beispielsweise beträgt die Resonanzfrequenz des ungepaarten Seins, die einer externen Magnetfeldstärke von 21 T entspricht, etwa 500 GHz, welche nahe dem THz-Bereich liegt.
500 GHz entsprechen 1,09 cal/mol. Wenn die elektromagnetische Welle auf den in dem Carbonyl erzeugten ungepaarten Spin angewendet wird, geht der ungepaarte Spin in Resonanz. Die Energie der elektromagnetischen Welle wird in der Nähe des ungepaarten Seins relaxiert. Eine Energie von etwa 20 K wird dem Restabschnitt zugeführt, welche etwa 1/100 der van-der-Waals-Kraft in der wässrigen Lösung entspricht. Die durch eine Anwendung bereitgestellte Energie ist schwach und beträgt etwa 1/100 der van-der-Waals-Kraft. Die Wahrscheinlichkeit ist sehr niedrig, dass das Problem der Proteindenaturierung auftritt, das bei der Spektroskopietechnik durch die Verwendung elektromagnetischer Wellen mit einer Wellenlänge unterhalb Infrarotstrahlen, beispielsweise bei der Raman-Spektroskopie, die weit verbreitet für die Struktur- und Funktionsanalyse verwendet wurde, auftritt.
Wenn eine elektromagnetische Welle im THz-Bereich, entsprechend der Resonanzfrequenz des ungepaarten Elektronen spins beim statischen Magnetfeld durch eine Kombination verschiedener Pulse auf ein Zielprotein angewendet wird, geschieht eine eindeutige Absorption durch magnetische Resonanz des ungepaarten Elektronenspinabschnitts, so dass eine Energiezufuhr zu dem spezifizierten Rest mit dem ungepaarten Elektronensein ermöglicht wird. Die Energie relaxiert in mehreren Pikosekunden, so dass es möglich wird, die Bindungs- und Dissoziationsreaktion in dem spezifizierten Restabschnitt zu fördern, ohne das Protein zu denaturieren.
(Ausführungsform 1)
Das Anwenden einer elektromagnetischen Welle wird mit der Kernspinresonanzmessung kombiniert, um es zu ermöglichen, die Zustandsänderung verschiedener Proben zu beobachten. Die Zustandsänderung umfasst nicht nur eine Änderung, die in dem Gesamtprotein hervorgerufen wird, sondern auch eine selektive Änderung, die sich auf den spezifizierten Rest konzentriert. Die Beobachtung der Änderung in einer Proteinstruktur, die durch Anwenden einer elektromagnetischen Welle hervorgerufen wird, wird nachstehend detailliert beschrieben.
6 zeigt eine Zielproteinprobe 103, die erhalten wurde, indem das Protein 101, das Asparaginsäure oder Glutaminsäure im aktiven Zentrum aufweist, einer Isotopenmarkierung 102 von Asparaginsäure oder Glutaminsäure unterzogen wurde.
Es wird die Bindung zu beobachtender Kernspins bestimmt. Wenn die Änderung der chemischen Verschiebung eines HN-Atoms und eines N-Atoms verglichen wird, wird das ¹H-¹⁵N-HMQC-Spektrum verwendet. Wenn die Stärke der Wechselwirkung zwischen Wasserstoffatomen untersucht wird (d.h. der Abstand zwischen Atomen), wird das NOESY-Spektrum verwendet.
7 zeigt die Prozedur zum Beobachten der Strukturänderung in dem Protein durch Anwendung einer elektromagnetischen THz-Welle.

(1) Zuerst wird die Probe 4, welche die Proteinprobe 103 enthält, präpariert.
(2) Als nächstes wird eine NMR-Messung in dem Zustand ausgeführt, in dem keine elektromagnetische THz-Welle auf die Probe 4 angewendet wird, um ein NMR-Spektrum zu erhalten (Messung 1). Bei der Messung 1 wird das die Probe 4, die die Proteinprobe 103 enthält, aufnehmende Probenröhrchen 3 in die Sondenspule für die Kernspinresonanz 5 eingeführt, um die NMR-Messung entsprechend der normalen NMR-Messprozedur auszuführen. Das Messergebnis wird verarbeitet (Datenverarbeitung 1), um ein Messergebnis 124-1 zu erhalten, bei dem die horizontale Achse die chemische Verschiebung (F1) angibt und die vertikale Achse die chemische Verschiebung (F2) angibt. Das Messergebnis 124-1 ist ein Spektrum, das auf der Struktur der Proteinprobe beruht, wenn die in 6 dargestellte Probe nicht einer elektromagnetischen THz-Welle ausgesetzt ist. Hier ist ein Peak 120 der Peak des aktiven Zentrums der Asparaginsäure oder der Glutaminsäure.
(3) Während die elektromagnetische THz-Welle auf die Probe 4 angewendet wird, wird die NMR-Messung ausgeführt, um ein NMR-Spektrum zu erhalten (Messung 2). Wie anhand des Vergleichs mit der in der oberen Stufe dargestellten Messung 1 verständlich ist, fällt eine elektromagnetische THz-Welle 110, zusätzlich zur normalen NMR-Messprozedur zur Ausführung der NMR-Messung, auf das in die Sondenspule für die Kernspinresonanz 5 eingeführte Probenröhrchen 3. Wenn die elektromagnetische THz-Welle 110 einfällt, geschieht die Strukturänderung der Probe in einigen hundert Pikosekunden. Die Zeit vom Einfall der elektromagnetischen THz-Welle bis zum Wechsel der Probe ist ausreichend kürzer als die Zeit einer Messung der Kernspinresonanz. Eine Kombination des Anwendens einer elektromagnetischen THz-Welle und des Zulassens einer Relaxationszeit von einigen hundert Pikosekunden erfolgt einmal oder mehrere Male, um währenddessen oder danach einen NMR-Puls anzuwenden. Eine Reihe solcher Messungen wird mehrere Male summiert, um ein ausreichendes Kernspinresonanzsignal zu beobachten.

Das Messergebnis wird verarbeitet (Datenverarbeitung 2), um ein Messergebnis 124-2 zu erhalten, bei dem die horizontale Achse die chemische Verschiebung (F1) angibt und die vertikale Achse die chemische Verschiebung (F2) angibt. Das Messergebnis 124-2 ist ein Spektrum auf der Grundlage der Struktur der Proteinprobe, wenn auf die in 6 dargestellte Probe eine elektromagnetische THz-Welle angewendet wird. Hier ist ein Peak 121 ein Peak des aktiven Zentrums von Asparaginsäure oder Glutaminsäure beim Anwenden einer elektromagnetischen THz-Welle. Das Spektrum von dem Atom in der Nähe einer Gruppenresonanz, welche die elektromagnetische THz-Welle absorbiert, wird entsprechend dem Betrag der Absorption der elektromagnetischen THz-Welle geändert.
Wenn die Atomspezies für das Beobachten der Änderung der Proteinprobe und der Bindungsbeziehung von Kernspins verschieden sind, ist der verwendete NMR-Puls verschieden. Es wird die mit dem NMR-Puls kombinierte elektromagnetische THz-Welle verwendet. Entsprechend dem verwendeten NMR-Puls gibt es (i) den Fall, in dem eine elektromagnetische THz-Welle angewendet wird, um eine NMR-Pulssequenz zu bewirken, (ii) den Fall, in dem die elektromagnetische THz-Welle zwischen den NMR-Pulsen eingefügt wird, (iii) den Fall, in dem die elektromagnetische THz-Welle mit dem NMR-Puls angewendet wird, (iv) den Fall, in dem die elektromagnetische THz-Welle angewendet wird, während das FID (freie induzierte Abfallssignal) nach dem Einfallen des NMR-Pulses erfasst wird, (v) den Fall, in dem die elektromagnetische THz-Welle kontinuierlich angewendet wird, während die NMR-Pulssequenz ausgeführt wird, und (vi) den Fall, in dem die vorstehend erwähnten (i) bis (v) kombiniert werden.

(4) Die Spektren 124-1 und 124-2, wie NOESY, die bei den Datenverarbeitungen 1 und 2 erhalten wurden, werden verglichen, um die Änderung zwischen den Peaks 120 und 121 zu bestimmen, die vor und nach dem Anwenden der elektromagnetischen THz-Welle erhalten werden. Die Änderung erscheint nicht nur in der Änderung des Betrags ΔC der chemischen Verschiebung, sondern auch in der Änderung ΔS des Betrags der Peak-Stärke (der Anzahl der Konturlinien am Peak). Anhand dieser Änderung wird der Betrag der Änderung des Abstands zwischen Wasserstoffatomen geschätzt.

8 ist ein schematisches Diagramm, worin die Strukturänderung (der Betrag der Änderung des Abstands zwischen Wasserstoffatomen) des Probenproteins gegenüber dem Messergebnis, das durch Anwenden der elektromagnetischen THz-Welle erhalten wurde, wie in 7 beschrieben wurde, geschätzt ist. Es wird geschätzt, dass sich der Abstand zwischen Wasserstoffatomen der Isotopenmarkierung 102 des Probenproteins so ändert, wie durch den Pfeil des in der oberen Stufe dargestellten Messergebnisses angegeben ist. Der Betrag entspricht ΔC und ΔS. Es wurde herausgefunden, dass Informationen über die Strukturänderung in der Nähe des aktiven Zentrums der Proteinprobe, die durch das Anwenden von THz-Strahlen hervorgerufen wird, durch das Verfahren zur mehrfachen Spektroskopieanalyse gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten werden können. Die Informationen werden mit Informationen über Wasserstoff kombiniert, von dem bekannt ist, dass seine Relegation es ermöglicht, die Strukturänderung und die Änderung der chemischen Eigenschaften in der Art des elektrostatischen Potentials zu analysieren.
(Ausführungsform 2)
Nachstehend wird ein Beobachtungsbeispiel der Protein-Ligand-Wechselwirkung unter Verwendung einer angewendeten elektromagnetischen THz-Welle detailliert beschrieben.
9 zeigt eine Zielproteinprobe 105, die durch Binden eines Probenproteins, das erhalten wurde, indem das Protein 101 mit Asparaginsäure oder Glutaminsäure im aktiven Zentrum der Isotopenmarkierung 102 von Asparaginsäure oder Glutaminsäure unterzogen wurde, an den Liganden 104 erhalten wurde. Auf diese Weise wird eine Probenpräparation ausgeführt, um eine selektive Isotopenmarkierung für das Probenprotein auszuführen und den Liganden 104 daran zu binden.
10 zeigt die Prozedur zum Beobachten der Protein-Ligand-Wechselwirkung.

(1) Eine NMR-Messung wird an der Probe 103 des Zielproteins ausgeführt, um das Spektrum 124-1 in der Art des ¹H-¹⁵N-HMQC zu erhalten. Die Messung gleicht der in Ausführungsform 2 beschriebenen Messung 1. Das Spektrum ist ein Spektrum in dem Zustand, in dem das Zielprotein 103 nicht bindet, und es dient als Referenz für die folgende Analyse. Insbesondere ist der Peak 120 der Asparaginsäure oder der Glutaminsäure des aktiven Zentrums ein wichtiger Wert.
(2) Wie anhand 9 beschrieben wurde, wird eine NMR-Messung (Messung 3) der die Zielproteinprobe 105, die durch Binden des Zielproteins 101 an den Liganden 104 erhalten wurde, enthaltenden Probe 4 ausgeführt. Die Messprozedur gleicht jener von Messung 1. Das Messergebnis wird verarbeitet (Datenverarbeitung 3), um ein Messergebnis 124-3 zu erhalten, bei dem die horizontale Achse die chemische Verschiebung (F1) angibt und die vertikale Achse die chemische Verschiebung (F2) angibt. Ein Peak 124 des aktiven Zentrums von Asparaginsäure oder Glutaminsäure wird in dem Spektrum 124-3, wie ¹H-¹⁵N-HMQC, beobachtet. Der Peak ist gegenüber dem Peak 120 von Messung 1 geändert. Die Änderung des Peakwerts tritt auf, weil der Ligand 104 und das Zielprotein 101 einen Bindungszustand eingehen.
(3) Es wird eine NMR-Messung (Messung 4) der durch Binden des Zielproteins 101 an den Liganden 104 erhaltenen Probe 4 ausgeführt. Bei der Messung 4 erfolgt das Anwenden der elektromagnetischen THz-Welle 110 auf den ungepaarten Elektronensein des Carbonyls der Asparaginsäure oder Glutaminsäure mehrere Male, um Energie zuzuführen, die sich auf die Asparaginsäure oder die Glutaminsäure des Bindungsbereichs konzentriert. Die Strukturänderung infolge der elektromagnetischen THz-Welle 110 geschieht in einigen hundert Pikosekunden. Die Zeit vom Einfall der elektromagnetischen THz-Welle bis zum Wechsel der Probe ist ausreichend kürzer als die Zeit einer Messung der Kernspinresonanz. Eine Kombination des Anwendens einer elektromagnetischen THz-Welle und des Zulassens einer Relaxationszeit von einigen hundert Pikosekunden erfolgt einmal oder mehrere Male, um währenddessen oder danach einen NMR-Puls anzuwenden. Eine Reihe solcher Messungen wird mehrere Male summiert, um ein ausreichendes NMR-Signal zu beobachten. Das Messergebnis wird verarbeitet (Datenverarbeitung 4), um ein Messergebnis 124-4 zu erhalten, bei dem die horizontale Achse die chemische Verschiebung (F1) angibt und die vertikale Achse die chemische Verschiebung (F2) angibt. Das Messergebnis 124-4 ist ein Spektrum, das auf der Struktur der Proteinprobe beruht, wenn die in 9 dargestellte Probe einer elektromagnetischen THz-Welle ausgesetzt ist. Hier ist der Peak 125 der Peak des aktiven Zentrums der Asparaginsäure oder Glutaminsäure, worauf die elektromagnetische THz-Welle angewendet wurde.

Entsprechend dem für die Messung verwendeten NMR-Puls wurde vorstehend eine Kombination einer angewendeten elektromagnetischen THz-Welle und eines NMR-Pulses beschrieben.
Die durch die elektromagnetische THz-Welle 110 bereitgestellte Energie wird von dem ungepaarten Spin dem Asparaginsäurerest oder Glutaminsäurerest zugeführt. Die Energie kann gesteuert werden, indem die Pulsbreite der elektromagnetischen THz-Welle und die Anzahl der Pulse geändert werden. Wenn die angewendete Energie klein ist, ist die dem Bindungsabschnitt mit dem Liganden zugeführte Energie kleiner als die Aktivierungsenergie. Die Bindung mit dem Liganden wird nicht dissoziiert, und es geschieht keine Änderung des NMR-Spektrums. Die Anzahl der Pulse und die Pulsbreite werden gesteuert, um die der Probe zugeführte Energie zu erhöhen. In dem Zustand, in dem die der Aktivierungsenergie der Bindung entsprechende Energie dem Bindungsbereich zugeführt werden kann, beginnt die Änderung in dem NMR-Spektrum an dem Peak 125 zu erscheinen.
Der Peak 120 im Bindungsbereich in der Probe 103 des Zielproteins als eine bei der Messung 1 erhaltene Referenz wird mit dem Peak 125 verglichen, der erhalten wird, indem zugelassen wird, dass die elektromagnetische THz-Welle 110 auf die Probe 105 fällt, die den Liganden an derselben Koordinate aufweist. Es wird der durch Anwenden der elektromagnetischen THz-Welle bei der in 9 dargestellten Probe hervorgerufene Änderungsbetrag ΔC der chemischen Verschiebung erhalten.
11 ist ein schematisches Diagramm, in dem die Bindungsstärke zwischen dem Probenprotein und dem Liganden anhand des Messergebnisses durch die in 10 beschriebene Anwendung der elektromagnetischen THz-Welle geschätzt wird. Zum Schätzen der Bindungsstärke wird die Anwendung der elektromagnetischen THz-Welle, die notwendig ist, um das Probenprotein und den Liganden vom Bindungszustand zu dem Zustand, der für das Auftrennen der Bindung (Dissoziation). ausreicht, zu ändern, bestimmt. In dem Zustand, in dem die Anwendung nicht ausreicht und die Bindung nicht aufgetrennt werden kann, gleicht der Peak 125 in 10 fast dem Peak 124. In dem Zustand, in dem die Anwendung erhöht wird, um die Bindung aufzutrennen, liegt der Peak 125 in der Nähe des Peaks 120. Der Änderungsbetrag ΔC der chemischen Verschiebung steht in engem Zusammenhang mit der Bindungsstärke zwischen dem Bindungsbereich und dem Liganden.
Wenn insbesondere der unter verschiedenen Anwendungen gemessene Änderungsbetrag ΔC der chemischen Verschiebung aufgetragen wird, wird eine in 12B dargestellte Kurve 133 für die Anwendung einer elektromagnetischen THz-Welle und den Änderungsbetrag der chemischen Verschiebung erhalten. 12A zeigt eine Energiekurve 131 des Protein-Ligand-Komplexes zum Erklären des Verhaltens der Kurve 133. Wenn die Anwendung der elektromagnetischen THz-Welle kleiner als die Dissoziationsenergie (Ed) 132 des Liganden ist, kann der Ligand nicht von dem Protein dissoziiert werden. Der Änderungsbetrag der chemischen Verschiebung ist klein oder unverändert. Wenn die Anwendung der elektromagnetischen THz-Welle erhöht wird, um eine ausreichende Energie bereitzustellen, die größer als die Dissoziationsenergie 132 ist, wird der Ligand 104 von dem Zielprotein 101 entfernt, wodurch der Änderungsbetrag der chemischen Verschiebung vergrößert wird. Die Anwendung der elektromagnetischen THz-Welle, wenn die chemische Verschiebung vergrößert wird, entspricht der Dissoziationsenergie 132 des Liganden.
Die Messung des Änderungsbetrags der chemischen Verschiebung wird für verschiedene Liganden ausgeführt. Es kann der Betrag der Dissoziationsenergie in Bezug auf die Liganden beurteilt werden.
Unter Berücksichtigung des Rests des aktiven Zentrums wird die Energie dem Rest des aktiven Zentrums durch Anwenden einer elektromagnetischen Welle unter einem Magnetfeld zur Änderung der Wechselwirkung, der Bindung im aktiven Zentrum der Molekülstruktur zur Messung durch Kernspinresonanz selektiv zugeführt. Die Bindungsstärke und die Strukturänderung im aktiven Zentrum können beobachtet werden.
Vor der Messung der Proteinprobe durch Mehrfachspektroskopiemessung muss eine Vorverarbeitung ausgeführt werden, welche die Frequenz der angewendeten elektromagnetischen THz-Welle spezifiziert. Die Frequenz der elektromagnetischen THz-Welle ist veränderlich. Der Detektor 2 für elektromagnetische THz-Wellen wird verwendet, um die angewendete Frequenz zu bestimmen, während der Betrag der Transmission der elektromagnetischen THz-Welle gemessen wird. Die Frequenz der in einem Magnetfeld absorbierten elektromagnetischen Welle kann für ein unbekanntes Probenprotein festgelegt werden. Die Vorverarbeitung wird folgendermaßen fortgesetzt:

(1) In dem Zustand, in dem kein Magnetfeld existiert, wird ein Absorptionsspektrum der Proteinprobe für eine elektromagnetische THz-Welle gemessen. Es ist wünschenswert, dass eine Probe verwendet wird, die einer Probe gleichwertig ist, welche bei der Mehrfachspektroskopie verwendet wird, oder dass dasselbe Probenröhrchen verwendet wird.
(2) Die Vorrichtung zur Mehrfachspektroskopieanalyse gemäß der vorliegenden Erfindung wird verwendet, um ein Absorptionsspektrum im Zustand des Anlegens eines Magnetfelds zu messen. Zu dieser Zeit wird keine NMR-Messung ausgeführt.
(3) Die Absorptionsspektren von (1) und (2) werden verglichen. Die Frequenz des Spektrums, die bei der Messung von (2) auftritt, ist eine festzulegende Frequenz.

Wie vorstehend beschrieben wurde, ist die NMR-Messvorrichtung mit einem offenen Raum und einer Sondenkonstruktion, welche das Einfallen der elektromagnetischen THz-Welle ermöglichen kann, versehen. Es wurde herausgefunden, dass die selektive Beobachtung des spezifizierten Bereichs durch Mehrfachspektroskopiemessung unter Verwendung der elektromagnetischen THz-Welle wirksam ist, um die Protein-Ligand-Bindung und die Protein-Protein-Wechselwirkung zu beobachten.
Hier werden folgende Bezugszahlen verwendet:
1...Oszillator für elektromagnetische THz-Wellen, 2...Detektor für elektromagnetische THz-Wellen, 3...Probenröhrchen, 4...Probe, 5...Sondenspule für die Kernspinresonanz, 6...Magnet für das statische Magnetfeld, 7...Bohrung des Magneten, 8...Verlängerungslinie der Sondenspule für die Kernspinresonanz, 9...Führung zum Einführen des Probenröhrchens, 10...Abschirmungsteil, 12, 12'...Verbindungsloch der Führung für das Einführen des Probenröhrchens, 13, 13'...Eintrittsfenster für die elektromagnetische THz-Welle, 14...in dem Rest erzeugter ungepaarter Spin, 101...Zielprotein, 102...Asparaginsäure und Glutaminsäure, welche einer Isotopenmarkierung unterzogen wurden, 103...Probe des Zielproteins, 104...Ligand, 105...Probe mit dem Zielprotein und dem Liganden, 110...elektromagnetische THz-Welle, 120...für die Probe des Zielproteins beobachtetes Peak-Signal des Bindungsbereichs, 121...durch Einfallenlassen der elektromagnetischen THz-Welle auf die Probe des Zielproteins beobachtetes Peak-Signal des Bindungsbereichs, 124...für die durch Kombinieren des Zielproteins mit einem Liganden erhaltene Probe beobachtetes Peak-Signal des Bindungsbereichs, 125...für die durch Kombinieren des Zielproteins mit dem Liganden erhaltene Probe durch Einfallenlassen der elektromagnetischen THz-Welle beobachtetes Peak-Signal des Bindungsbereichs, 131...Energiekurve des Protein-Ligand-Komplexes, 132... Dissoziationsenergie zwischen Ligand und Protein und 133...Kurve für die Beziehung zwischen dem Anwenden der elektromagnetischen THz-Welle und dem Änderungsbetrag der chemischen Verschiebung.

Claims

NMR-Spektroskopieverfahren, in dem: ein gleichförmiges statisches Magnetfeld an eine Probe (4) angelegt wird, die ein Protein (101) mit einer Seitenketten-Carbonylgruppe mit nicht paarweisem Elektronenspin (14) aufweist; eine elektromagnetische Welle (110) in Pulsform oder in kontinuierlicher Wellenform an die Probe angelegt wird; und eine NMR-Spektroskopie an der Probe durchgeführt wird, wobei eine strukturelle Änderung des Proteins oder eine Änderung aufgrund der Bindung zwischen dem Protein und einem Liganden in einem spezifizierten Abschnitt der Probe aufgrund der Anwendung der elektromagnetischen Welle durch eine chemische Verschiebung in dem NMR-Spektrum der Probe beobachtet wird, dadurch gekennzeichnet, dass die elektromagnetische Welle (110) eine Frequenz im THz-Bereich entsprechend der Resonanzfrequenz der nicht paarweisen Elektronenspins in dem statischen Magnetfeld aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Anlegen der elektromagnetischen Welle durchgeführt wird, bevor, während oder nachdem eine Kernspinanregung durchgeführt wird, die zum Durchführen der NMR-Spektroskopie der Probe gehört.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die elektromagnetische Welle (110) einmal oder mehrmals in vorbestimmten Zeitabständen nach einer vorbestimmten Zeit durch einen Benutzer angelegt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei ein Protein-Ligand-Komplex oder ein Protein-Protein-Komplex die Messobjekt-Probe (4) darstellt, so dass die spezifizierte strukturelle Änderung des Proteins in den Proben aufgrund des Anlegen der elektromagnetischen Welle beobachtet wird, indem Spektren miteinander verglichen werden, die durch die Kernmagnetresonanzerfassung bei unterschiedlichen Anwendungsbedingungen der elektromagnetischen Welle erhalten werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei beim Beobachten der strukturellen Änderung in dem spezifizierten Abschnitt in der Probe (4) der Benutzer eine Anwendungsbedingung der elektromagnetischen Welle (110) auf Grundlage einer Änderung der chemischen Verschiebung der Peaks in einem NMR-Spektrum der Probe steuert.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei ein Asparaginsäurerest, ein Glutaminsäurerest, oder ein natürlicher Aminosäurerest, die nicht in dem in der Probe (4) existierenden Protein (101) enthalten sind, oder ein Aminosäurerest einer beliebigen Kombination von diesen, einer Isotop-Markierung (102) mit Wasserstoff, Kohlenstoff oder Stickstoff, oder einer beliebigen Kombination davon, unterzogen wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei beim Anlegen der elektromagnetischen Welle eine Frequenz der elektromagnetischen Welle (110) kontinuierlich oder intermittierend bei einer bestimmten Frequenz oder über einen bestimmten Frequenzbereich moduliert wird.
NMR-Spektroskopiegerät mit: einer Einrichtung (6) zum Anlegen eines gleichförmigen statischen Magnetfelds an eine Probe (4), die ein Protein (101) mit einer Seitenketten-Carbonylgruppe mit nicht paarweisem Elektronensein (14) aufweist; einer Einrichtung (1) zum Anlegen einer elektromagnetischen Welle (110) in Pulsform oder in kontinuierlicher Wellenform an die Probe; und einer Einrichtung zum Beobachten und Vergleichen, die dazu ausgelegt ist, eine NMR-Spektroskopie an der Probe durchzuführen, wobei eine strukturelle Änderung des Proteins aufgrund der Anwendung der elektromagnetischen Welle oder eine Änderung aufgrund der Bindung zwischen dem Protein und einem Liganden in einem spezifizierten Abschnitt der Probe durch eine chemische Verschiebung in dem NMR-Spektrum der Probe beobachtet wird, dadurch gekennzeichnet, dass die elektromagnetische Welle (110) eine Frequenz im THz-Bereich entsprechend der Resonanzfrequenz der nicht paarweisen Elektronenspins in dem statischen Magnetfeld aufweist.
Gerät nach Anspruch 8, wobei die Magnetfeldanlegeeinrichtung (1) betrieben wird, bevor, während oder nachdem die NMR-Spektroskopie durchgeführt wird.
Gerät nach Anspruch 8, wobei eine Einheit zum Beobachten der strukturellen Änderung in dem spezifizierten Abschnitt der Probe (4) dazu ausgelegt ist, mehrere NMR-Spektren mit unterschiedlichen Anwendungsbedingungen der elektromagnetischen Welle (110) aufzuzeichnen und eine Datenverarbeitung, wie zum Beispiel eine Addition oder Subtraktion der beobachteten NMR-Spektren, durchzuführen.
Gerät nach Anspruch 8, wobei die Magnetfeldanlegeeinrichtung (1) einen Aufbau mit einem offenen Raum aufweist, der einen elektromagnetischen Wellenleiter zwischen einem Oszillator für elektromagnetische Wellen und der Probe (4) bereitstellen kann.