DE602004004571T2 - Abhängigkeit des symptomfreien Überlebens 5-FU behandelter Darmkrebspatienten vom Verhältnis der mRNA-Expressionshöhe aus Thymidinphosphorylase und Dihydropyrimidindehydrogenase - Google Patents

Abhängigkeit des symptomfreien Überlebens 5-FU behandelter Darmkrebspatienten vom Verhältnis der mRNA-Expressionshöhe aus Thymidinphosphorylase und Dihydropyrimidindehydrogenase Download PDF

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Description

  • Technisches Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Vorhersage des Ansprechens auf eine medikamentöse Krebsbehandlung unter Verwendung von Biomarkeranalytik. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung das Gebiet der Vorhersage des Ansprechens von Patienten, die an Darmkrebs leiden, auf 5-FU- und/oder 5-FU-Analoga.
  • Stand der Technik
  • Darmkrebs (CRC), noch immer eine der bedeutendsten zum Tode führenden Krebsarten in der westlichen Welt, kann bei etwa einem Drittel der Patienten allein durch chirurgische Resektion des Primärtumors geheilt werden. Die übrigen Patienten haben jedoch zum Zeitpunkt der klinischen Manifestation des Primärtumors bereits verborgene oder ferne Metastasen entwickelt, und erhalten eine adjuvantive (post-chirurgische) Chemo- und/oder Radiotherapie. Zusammen mit den klinischen Daten des Patienten bestimmen die histopathologische Klassifizierung des Tumors und die Einstufung nach TNM-Kategorien die Kriterien für eine adjuvantive Therapie.
  • Nach gegenwärtiger Standard werden nodal-negative Tumore (T1-4, N0, M0) nur durch vollständige Resektion des Primärtumors behandelt, wohingegen Fälle mit histopathologischen Anzeichen für eine Beteiligung der Lymphknoten (T1-4, N1-2, M0) nach der chirurgischen Entfernung des Primärtumors Chemo- und/oder Radiotherapie erhalten. Trotz einer ständigen Verbesserung der diagnostischen Werkzeuge und der relevanten Marker sowie der Behandlungsstrategien [Ragnhammar, P., et al., Acta Oncol. 40 (2001) 282–308], ist die genaue Prognose und/oder Vorhersage der Antwort auf eine adjuvantive Therapie noch immer ein ungelöstes Problem [Iqbal, S., und Lenz, H. J., Curr. Oncol. Rep. 3 (2001) 102–108; Kumar, S. K., und Goldberg, R. M., Curr. Oncol. Rep. 3 (2001) 94–101].
  • Die Enzyme Thymidin-Phosphorylase (TP), Dihydropyrimidin-Dehydrogenase (DPD) und Thymidylat-Synthese (TS) sind am Metabolismus von Pyrimidinen beteiligt und daher letztendlich an der Proliferation von normalen sowie pathologisch veränderten Zellen beteiligt. TS ist das zentrale und limitierende Enzym für die Pyrimidin-De-Novo-Synthese und daher auch für die RNA/DNA-Synthese, DPD ist am Abbau von Uracil und Thymidin, zu inaktiven Abfallprodukten beteiligt und TP kontrolliert intrazelluläre Thymidinwerte [Diasio, R. B., und Johnson, M. R., Pharmacology 61 (2000) 199–203]. Außerdem wurde gezeigt, dass TP zu dem von Thrombozyten gebildeten endothelialen Zellwachstumsfaktor (platelet-derived endothelial cell growth factor (PD-ECGF)) Molekül identisch ist [Furukawa, T., et al., Nature 356 (1992) 668; Sumizawa, T., et al., J. Biochem. 114 (1993) 9–14] und in mehreren soliden Tumoren angiogene Eigenschaften besitzt [Takebayashi, Y., et al., J. Natl. Cancer Inst. 88 (1996) 1110–1117; Griffiths, L, und Stratford, I. J., Br. J. Cancer 76 (1997) 689–693]. Diese Eigenschaften können die TP-, DPD- und/oder TS-Expression zu wertvollen prognostischen und chemoprädiktiven Markern bei CRC machen.
  • Außerdem sind alle drei Enzyme aufgrund ihrer Beteiligung am Pyrimidin-Metabolismus auch für die Effizienz von 5-FU und 5-FU-verwandten chemotherapeutischen Mitteln von Bedeutung [Diasio, R. B. und Johnson, M. R., Pharmacology 61 (2000) 199–203; WO 02/44423]. Während TS das Hauptziel solcher Chemotherapeutika ist, wirken die Enzyme TP und DPD bei der Aktivierung und dem Abbau dieser Mittel bzw. ihrer Intermediate. Daher wurden die drei Enzyme einzeln oder die TS/DPD- und TP/DPD-Verhältnisse als Marker für die Prognose und/oder Vorhersage der Antwort auf eine adjuvantive Chemotherapie bei CRC und anderen Krebsarten einbezogen. [Metzger, R., et al., Clin. Cancer Res. 4 (1998) 2371–2376; Salonga, D., et al., Clin. Cancer Res. 6 (2000) 1322–1327; Takenoue, T., et al., Ann. Surg. Oncol. 7 (2000) 193–198; Araki, Y., et al., Kurume Med. J. 48 (2001) 93–98; Edler, D., et al., J. Clin. Oncol. 20 (2002) 1721–1728; Kornmann, M., et al., J. Gastrointest. Surg. 6 (2002) 331–337, Terashima, M. et al., Europ. J. of Cancer (2002) 2375–2381; Fujwaki, R. et al., J. of Clinical Oncology (2000) 3946–3951]. Tatsächlich wurden hohe TS-Werte mit der Resistenz von Tumoren gegen 5-FU-Chemotherapie in Verbindung gebracht [Copur, S., et al., Biochem. Pharmacol. 49 (1995) 1419–1426; Wang, W., et al., Cancer Res. 61 (2001) 5505–5510; Johnston, P. G., et al., Cancer Res. 55 (1995) 1407–1412; Bathe, O. F., et al., Cancer J. Sci. Am. 5 (1999) 34–40] und eine niedrige DPD-Expression wurde mit starker Toxizität von 5-FU-Chemotherapiemitteln korreliert [Wei, X., et al., J. Clin. Invest. 98 (1996) 610–615, Johnson, M. R., et al., Clin. Cancer Res. 5 (1999) 2006–2011]. Der große Bereich der TS- und DPD-Expression und die damit verbundenen Wirkungen auf das Ergebnis einer Chemotherapie scheinen zumindest teilweise auf einen Polymorphismus in der TS-Promotor-Enhancer-Region [Marsh, S., et al., Int. J. Oncol. 19 (2001) 383–386; lacopetta, B., et al., Br. J. Cancer 85 (2001) 827–830] bzw. auf eine häufige Punktmutation innerhalb von Intron 14 des DPD-Gens [van Kuilenburg, A. B., et al., Clin. Cancer Res. 6 (2000) 4705–4712; Raida, M., et al., Clin. Cancer Res. 7 (2001) 2832–2839] zurückzuführen zu sein. Obwohl in mehreren Studien die TP-, DPD- und TS-Expression bei CRC untersucht wurde, ist die Rolle der Enzyme noch immer widersprüchlich. Dies ist hauptsächlich darauf zurückzuführen, dass sich die Untersuchungsprotokolle, nach denen die TP-, DPD- und TS-Expression untersucht wird, unterscheiden im Hinblick auf 1) mRNA, Protein oder Enzymaktivität, 2) in Primärtumoren oder fernen Metastasen und 3) Patienten werden mit unterschiedlichen der neo- oder adjuvantiven Radio-/Chemotherapie-Protokollen behandelt.
  • Angesichts des dargestellten Standes der Technik bestand die zu lösende Aufgabe darin, diejenigen Parameter zu identifizieren, die von allen potentiellen, im Stand der Technik vorgeschlagenen Parametern tatsächlich das Ansprechen auf 5-FU- und/oder 5-FU-Analoga anzeigen, und zu bestimmen, unter welchen Bedingungen diese Parameter die größtmögliche Spezifität bieten.
  • Kurze Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung ist daher auf ein Verfahren zur Bestimmung, ob ein Patient, der an Darmkrebs leidet, auf eine Behandlung mit 5-Fluor-Uracil oder einem 5-Fluor-Uracil-Analogon anspricht gerichtet, welches umfasst
    • a) Bestimmung der Thymidin-Phosphorylase-mRNA-Expression in einer klinischen Probe
    • b) Bestimmung der Dihydropyrimidin-Dehydrogenase-mRNA-Expression in der klinischen Probe
    • c) Bestimmung des Verhältnisses des in Schritt a) erhaltenen Wertes und des in Schritt b) erhaltenen Wertes
    • d) Bestimmung, ob das in Schritt c erhaltene Verhältnis einen vorbestimmten Grenzwert übersteigt.
  • Um zu viele falsch positive Ergebnisse zu verhindern, hat es sich als vorteilhaft erwiesen, wenn der Grenzwert für das TP/DPD-Verhältnis wenigstens 3 und vorzugsweise 3,7 beträgt.
  • Andererseits hat es sich als vorteilhaft erwiesen, um zu viele falsch negative Ergebnisse zu verhindern, wenn der Grenzwert für das TP/DPD-Verhältnis nicht größer als 10 und vorzugsweise nicht größer als 8,2 ist.
  • In einer bestimmten Ausführungsform erfolgt eine zusätzliche Bestimmung der absoluten oder relativen Expressionshöhe an Dihydropyrimidin-Dehydrogenase und eine Expressionshöhe unterhalb eines bestimmten Grenzwertes ist ein zusätzliches Anzeichen für das Ansprechen auf 5-Fluor-Uracil oder ein entsprechendes Analogon.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Bei der Untersuchung, die der Erfindung zugrunde liegt, wurde die TP-, DPD- und TS-mRNA-Expression in einer einheitlichen Gruppe von 102 Patienten mit CRC untersucht, wobei mikrodissezierte, in Formalin fixierte und in Paraffin eingebettete Primärtumorproben für eine quantitative RT-PCR (QRT-PCR) in dem LightCycler®-System verwendet wurden. Wir befassten uns speziell mit der Korrelation der TP-, DPD- und TS-mRNA-Expression und der TS/DPD- und TP/DPD-Verhältnissen mit der Tumorhistologie sowie der Patientenprognose und der Vorhersage der Antwort auf eine adjuvantive 5-FU-Chemotherapie.
  • Die Erfinder untersuchten ausführlich die Thymidin-Phosphorylase (TP), Dihydropyrimidin-Dehydrogenase (DPD) und Thymidylat-Synthase (TS) mRNA-Expression bei CRC, wobei der Schwerpunkt auf ihrem Nutzen als prognostische Marker im Allgemeinen und als prädiktive Marker für eine 5-FU-Chemotherapie lag. Zu diesem Zweck wurde eine neue Methode der Quantifizierung von TP-, DPD- und TS-mRNA, RT-PCR unter Verwendung des LightCycler®-Systems (Roche Applied Science), entwickelt und an mikrodissezierten, in Formalin fixierten, in Paraffin eingebetteten Tumorgeweben aus 102 Fällen mit CRC angewendet. Im Gegensatz zu anderen Untersuchungen [Johnston, P. G., et al., Cancer Res. 55 (1995) 1407–1412] [Metzger, R., et al., Clin. Cancer Res. 4 (1998) 2371–2376; Salonga, D., et al., Clin. Cancer Res. 6 (2000) 1322–1327] untersuchten die Erfinder nachträglich die TP-, DPD- und TS-mRNA-Expression in Primärtumoren und bewerteten die prognostische Bedeutung und die klinische Antwort der Patienten auf 5-FU-Chemotherapie, durch Korrelation der Enzymmengen mit dem Follow-up der Patienten. Obwohl die TP-, DPD- und/oder TS-Expression in primären CRC-Tumoren im Hinblick auf eine Prognose analysiert wurde [Takebayashi, Y., et al., J. Natl. Cancer Inst. 88 (1996) 1110–1117; Araki, Y., et al., Kurume Med. J. 48 (2001) 93–98; Edler, D., et al., J. Clin. Oncol. 20 (2002) 1721–1728; Sanguedolce, R., et al., Anticancer Res. 18 (1998) 1515–1520; Paradiso, A., et al., Br. J. Cancer 82 (2000) 560–567; Findlay, M. P., et al., Br. J. Cancer 75 (1997) 903–909; Allegra, C. J., et al., J. Clin. Oncol. 20 (2002) 1735–1743], ist unsere Studie die erste, in der die prognostische und prädiktive Bedeutung der TP-, DPD- und TS-mRNA-Expression an einer Gruppe von CRC-Fällen mit einheitlicher Probengröße, Behandlungsuntergruppen, Follow-up-Daten und standardisierter Gewebeentnahme und Konservierung untersucht wurden.
  • Die ausführliche Analyse der TP-, DPD- und TS-mRNA-Expression in 102 Fällen von CRC ergab eine große Breite von Expressionshöhen für alle drei Enzyme. Dies wurde bereits zuvor berichtet [Igbal, S., und Lenz, H. J., Curr. Oncol. Rep. 3 (2001) 102–108; Metzger, R., et al., Clin. Cancer Res. 4 (1998) 2371–2376; Mori, K., et al., Int. J. Oncol. 17 (2000) 33–38] und zusammen unterstreichen diese Ergebnisse das Konzept der intertumoralen Heterogenität.
  • Schließlich wurde der Zusammenhang der TP- und TS-mRNA-Mengen mit einer bestimmten Tumorhistopathologie auch durch die TP/DPD- und TS/DPD-Verhältnisse wiedergespiegelt. Eine Erklärung für diese Befunde kann die biologischen Funktionen dieser Enzyme betreffen: Während TP, auch als von Thrombozyten gebildeter endothelialer Zellwachstumsfaktor bekannt [Furukawa, T., et al., Nature 356 (1992) 668; Sumizawa, T., et al., J. Biochem. 114 (1993) 9–14], mit Angiogenese in mehreren soliden Tumoren im Zusammenhang steht [Takebayashi, Y., et al., J. Natl. Cancer Inst. 88 (1996) 1110–1117; Griffiths, L, und Stratford, I. J., Br. J. Cancer 76 (1997) 689–693], kann TS als ein Marker der metabolischen Aktivität und der Zellproliferation angesehen werden [Pestalozzi, B. C., et al., Br. J. Cancer 71 (1995) 1151–1157; Backus, H. H., et al., J. Clin. Pathol. 55 (2002) 206–211; Pestalozzi, B. C., et al., Br. J. Cancer 71 (1995) 1151–1157]. Daher kann eine höhere TP- und TS-mRNA-Expression in „frühen" Tumoren ihre Wirkung zur Förderung der vaskulären Unterstützung und der Tumorzellproliferation widerspiegeln, die beim Fortschreiten zugunsten von beispielsweise Tumorzellinvasion und Metastasierung verringert ist. Tatsächlich wurden niedrige TP-, DPD- und TS-mRNA-Expressionshöhen mit einer günstigen Antwort auf 5-FU-Chemotherapie in Verbindung gebracht [Metzger, R., et al., Clin. Cancer Res. 4 (1998) 2371–2376; Salonga, D., et al., Clin. Cancer Res. 6 (2000) 1322–1327]. Tatsächlich geht auch aus unseren Daten hervor, dass genau diese Gruppe von Tumoren mit fortgeschrittenen UICC-Stadien, d.h. solche Patienten, die eine adjuvantive Chemotherapie erhalten, geringere Mengen an TP- und TS-mRNA exprimieren.
  • In früheren Berichten wurde die TP-, DPD- und TS-mRNA-Expression, allein oder in Kombination, als mögliche Marker für die Prognose [Takenoue, T., et al., Ann. Surg. Oncol. 7 (2000) 193–198; Edler, D., et al., J. Clin. Oncol. 20 (2002) 1721–1728; Sanguedo!ce, R., et al., Anticancer Res. 18 (1998) 1515–1520; Paradiso, A., et al., Br. J. Cancer 82 (2000) 560–567; Allegra, C. J., et al., J. Clin. Oncol. 20 (2002) 1735–1743] und/oder für die Vorhersage der Antwort auf eine 5-FU-Chemotherapie [Metzger, R., et al., Clin. Cancer Res. 4 (1998) 2371–2376; Salonga, D., et al., Clin. Cancer Res. 6 (2000) 1322–1327; Araki, Y., et al., Kurume Med. J. 48 (2001) 93–98; Johnston, P. G., et al., Cancer Res. 55 (1995) 1407–1412] bei CRC diskutiert. Außerdem wurden die TP/DPD- und/oder TS/DPD-Verhältnisse vor kurzem als prognostische und/oder prädiktive Marker einbezogen [Kornmann, M., et al., J. Gastrointest. Surg. 6 (2002) 331–337; Ishikawa, T., et al., Cancer Res. 58 (1998) 685–690, Terashima, M. et al., Europ. J. of Cancer (2002), 2375–2381; Fujiwaki, R. et al., J. of Clinical Oncology (2000) 3946–3951]. In der vorliegenden Untersuchung konnten die Erfinder das TS/DPD-Verhältnis als potentiellen prognostischen Marker identifizieren, wobei höhere TS/DPD-Verhältnisse mit einem geringeren Gesamtüberleben von CRC-Patienten, die nur eine Resektion erhalten, korrelieren.
  • Noch bedeutender ist, dass die vorliegende Untersuchung eine signifikante Korrelation der DPD-mRNA-Mengen und des TP/DPD-Verhältnisses mit symptomfreiem Überleben nach 5-FU-Chemotherapie ergab, wobei geringe DPD-mRNA-Mengen und ein großes TP/DPD-Verhältnis ein längeres symptomfreies Überleben vorhersagen. Dies kann mit der Tatsache, dass geringe DPD-Mengen alleine oder geringe DPD-Mengen und große TP-Mengen (großes TP/DPD-Verhältnis) die aktive Menge an 5-FU stabilisieren, in Verbindung stehen. Im Gegensatz dazu hatten weder TP-, DPD- oder TS-mRNA-Mengen noch das TP/DPD- oder TS/DPD-Verhältnis irgendeine Vorhersagekraft bezüglich des Gesamtüberlebens.
  • Während vorhergehende Untersuchungen sich auf die TP-, DPD- oder TS-Proteinexpression in primären CRC-Tumoren durch Immunhistochemie [Takebayashi, Y., et al., J. Natl. Cancer Inst. 88 (1996) 1110–1117; Edler, D., et al., J. Clin. Oncol. 20 (2002) 1721–1728; Paradiso, A., et al., Br. J. Cancer 82 (2000) 560–567; Findlay, M. P., et al., Br. J. Cancer 75 (1997) 903–909; Allegra, C. J., et al., J. Clin. Oncol. 20 (2002) 1735–1743], Proteingehalt [Sanguedolce, R., et al., Anticancer Res. 18 (1998) 1515–1520] oder Enzymaktivität [Araki, Y., et al., Kurume Med. J. 48 (2001) 93–98] gerichtet haben entschieden die Erfinder sich für eine TP-, DPD- und TS-mRNA-Analyse mittels quantitativer RT-PCR, da dieses Verfahren schnell, verlässlich, leicht zu standardisieren ist und für große Serien von in Formalin fixierten, in Paraffin eingebetteten, mikrodissezierten Gewebeproben gut funktioniert. Beim Nachweis einer prognostischen und/oder prädiktiven Bedeutung dieser Enzyme für die mRNA-Menge wären aufgrund von post-transkriptorischen, Fixierungs-bedingten (und damit zusammenhängenden funktionellen) Veränderungen Probleme zu erwarten gewesen [Kawakami, K., et al., Clin. Cancer Res. 7 (2001) 4096–4101].
  • Verschiedene Forscher haben jedoch eine gute Korrelation von beispielsweise DPD- und TS-Gen- und Proteinexpression gezeigt [Johnston, P. G., et al., Cancer Res. 55 (1995) 1407–1412; Uetake, H., et al., Clin. Cancer Res. 5 (1999) 2836–2839; Tanaka-Nozaki, M., et al., Clin. Cancer Res. 7 (2001) 2783–2787]. Um unsere Methode zu bestätigen, durchmusterten die Erfinder zu Beginn mikrodissezierte Zellen aus Kontrollgeweben. Die Ergebnisse spiegelten zuvor veröffentlichte Daten wider, beispielsweise große TP-Mengen in inflammatorischen Zellen [Fox, S. B., et al., J. Pathol. 176 (1995) 183–190] und große DPD-Mengen in der Leber [Guimbaud, R., et al., Cancer Chemother. Pharmacol. 45 (2000) 477–482; Johnston, S. J., et al., Clin. Cancer Res. 5 (1999) 2566–2570]. Außerdem wurde berichtet, dass Tumore geringere DPD- [Johnston, S. J., et al., Clin. Cancer Res. 5 (1999) 2566–2570; Miyamoto, S., et al., Int. J. Oncol. 18 (2001) 705–713] und größere TP-[Takebayashi, Y., et al., Eur. J. Cancer 32 (1996) 1227–1232; Miwa, M., et al., Eur. J. Cancer 34 (1998) 1274–1281] Mengen als „normale" Gewebe aufweisen, ein Konzept, das der Tumorspezifität von 5-FU-Pro-Pharmaka zugrundeliegt.
  • Während die Erfinder außerdem in den „Tumor"-Zellisolaten geringere DPD-Mengen als in „normalen Epithel"-Zellisolaten nachwiesen, ergaben die Ergebnisse keine Unterschiede zwischen TP- und TS-mRNA-Mengen in Tumorzellen und „normalen" Zellen. Dies spiegelt höchstwahrscheinlich die Tatsache wider, wie genau eine „normale" Zellpopulation bestimmt wird. Für die Interpretation der TP-, DPD- und TS-Expression ist eine morphologisch kontrollierte Gewebebeschaffung wichtig, da Nicht-Epithelzellen die Ergebnisse signifikant beeinflussen können. Wenn die Erfinder daher „normale glatte Muskelzellen des Kolon" (im Gegensatz zu den „normalen Epithelzell"-Proben) mit „Tumor"-Zellen verglichen, so zeigten die letzteren eine stärkere TP- und TS-mRNA-Expression, wie bereits berichtet [Takebayashi, Y., et al., Eur. J. Cancer 32 (1996) 1227–1232; Miwa, M., et al., Eur. J. Cancer 34 (1998) 1274–1281].
  • Zusammenfassend ist die vorliegende Erfindung auf eine neue, quantitativen RT-PCR-Methode zur Bestimmung des Ansprechens von Darmkrebspatienten auf 5-FU und/oder 5-FU-Analoga gerichtet. Das neue Verfahren zeichnet sich durch diese Bestimmung des TP/DPD-Verhältnisses und ggf. der DPD-mRNA-Expression in FFPE-Biopsien von Patienten aus. Das TP/DPD-Verhältnis ist ein Vorhersagewert für das symptomfreie Überleben von Darmkrebspatienten, die unterstützend mit 5-FU behandelt werden.
  • Die folgenden Beispiele, Referenzen und Figuren werden bereitgestellt, um das Verständnis der vorliegenden Erfindung zu erleichtern, deren tatsächlicher Rahmen in den beigefügten Ansprüchen dargelegt ist.
  • Beschreibung der Figuren
  • 1: TP-, DPD- und TS-mRNA-Expression in mikrodissezierten Geweben. Normale Kolonmucosa (n = 8) und Muscularis propria (n = 3), chronische Colitis (n = 3), Darmkrebs (CRC; n = 102) und normale Leber (n = 1, doppelt). mRNA-Mengen sind als relatives Verhältnis ausgedrückt (Mittel +/– Standardabweichung).
  • 2: TP-, DPD- und TS-mRNA-Expression in 102 CRC-Patienten. Jedes Symbol gibt einen Fall wider, wobei Balken und Zahlen mRNA Median-Mengen angeben (relatives Verhältnis) für: alle Fälle (Quadrate, n = 102), „kein CTX" (Dreiecke, n = 40) und „CTX" (Kreise, n = 52).
  • 3: Zusammenhang der TP-, DPD- und TS-mRNA-Expression mit Tumorhistologie. Graphische Übersicht der statistisch signifikanten Korrelationen, wobei die Säulen die Medianmenge innerhalb jeder Untergruppe darstellen. Die Y-Achse gibt die relativen mRNA-Mengen oder Enzymverhältnisse an. p-Werte siehe Tabelle 2.
  • 4: Korrelation des TP/DPD-Verhältnisses mit Gesamtüberleben und symptomfreiem Überleben. Kaplan-Meier-Analyse in Bezug auf das Gesamtüberleben für die „kein CTX"-(n = 40) und „CTX"-(n = 52) Gruppen (A). Weder TP-, DPD- noch TS-mRNA-Mengen waren ein Vorhersagewert für das Gesamtüberleben in mit 5-FU-behandelten („CTX") Patienten (B, mit Grenzwert = mediane mRNA-Expression). Geringe DPD-mRNA-Mengenverhältnisse waren jedoch signifikant korreliert mit dem symptomfreien Überleben von mit 5-FU-behandelten Patienten (C, Grenzwerte wie angegeben).
  • 5: Korrelation von TP/DPD-Verhältnis mRNA-Mengen mit Gesamtüberleben und symptomfreiem Überleben. Kaplan-Meier-Analyse in Bezug auf symptomfreies Überleben und Korrelation mit dem TP/DPD-Verhältnis. Große TP/DPD-Verhältnisse waren signifikant korreliert mit symptomfreiem Überleben in mit 5-FU behandelten Patienten (Grenzwerte: A = 0,39, B = 3,7, C = 5,0, D = 6,2, E = 8,1).
  • Beispiele
  • Beispiel 1
  • Patienten und Gewebe.
  • Darmkrebsproben wurden aus dem Archiv des Pathologischen Instituts, Klinikum Rechts der Isar, München, Deutschland, erhalten. Resektierte Primärtumorproben aus insgesamt 102 Patienten (Tabelle 1; medianes klinisches Follow-up = 63,5 Monate, Bereich 8-125 Monate) wurden nach Mikrodissektion der Tumorzellen analysiert.
  • Figure 00100001
  • Figure 00110001
    Tabelle 1: Zusammenfassung der Patientenmerkmale.
    • 1 = 10 Fälle aus der statistischen Analyse ausgenommen aufgrund von Kombinationstherapien;
    • 2 = Zahlen bedeuten den statistischen Median (Bereich) des Überlebens in Monaten.
  • 40 Patienten erhielten nur eine Resektion („Kein CTX"-Gruppe), 52 Patienten hatten nach Resektion adjuvantive Chemotherapie erhalten („CTX"-Gruppe) und 10 Patienten hatten eine kombinierte adjuvantive Chemo-/Radiotherapie erhalten. Die adjuvantiven Therapien in der „CTX"-Gruppe waren wie folgt: 25/52 Patienten Mayo-Protokoll (6 Monate mit 425 mg/m2 5-FU und 20 mg/m2 Leukovorin) [O'Connell, M. J., et al., J. Clin. Oncol. 15 (1997) 246–250], 7/52 „Mörtel"-Therapie [450 mg/m2 5-FU und 50 mg/m2 Levamisol) [Moertel, C. G., et al., N. Engl. J. Med. 322 (1990) 352–358], 5/52 Patienten Ardalan-Protokoll (24 Stunden mit 2.600 mg/m2 5-FU und 500 mg/m2 Leucovorin) [Ardalan, B., et al., J. Clin. Oncol. 9 (1991) 625–630], 14/52 Patienten modifiziertes Ardalan-Protokoll und 1/52 Patienten SAKK-Protokoll (500 mg/m2 5-FU und 10 mg/m2 Mitomycin C) [SAKK, Lancet 345 (1995) 349–353]. Für Kontrollzwecke wurden Gewebeproben von normalem Kolon, chronischer Colitis (siehe unten) und normaler Leber erhalten. Alle Gewebe waren gemäß üblicher Vorgaben in Formalin fixiert (10 % gepuffertes Formalin, 24 Stunden) und in Paraffin eingebettet worden (FFPE). Vor der Analyse wurde die Histopathologie jeder Probe an mit Hämatoxylin angefärbten seriellen Schnitten bestätigt.
  • Beispiel 2
  • Mikrodissektion.
  • Vor der RNA-Expression aus FFPE-Geweben wurden Mikrotomschnitte (5 μm) mit Xylol und abgestuften Alkoholen unter RNAse-freien Bedingungen behandelt. Für die anschließende Mikrodissektion wurden die Schnitte einzeln mit Instant-Hämatoxylin (Shandon, Frankfurt, Deutschland) angefärbt und Tumorzellen wurden unter mikroskopischer Beobachtung unter Verwendung von feinen Nadeln (Eichmaß 18) disseziert. Die Reinheit der dissezierten Tumorzellpopulation betrug 80–90 %.
  • Kontrollgewebe wurden unter den gleichen Bedingungen seziert und beinhalteten normale Kolonmucosa (n = 8; Epithelzellen) und Kolon-Muscularis propria (n = 4; Muskelzellen), reaktive Läsionen chronischer Colitis (n = 3; Crohn-Erkrankung, Coltis ulcerosa und Divertikulitis des Sigma) und normaler Leber (n = 1; Gesamtzellpopulationen). Für die letzteren beiden Kontrollgruppen wurde eine doppelte Analyse durchgeführt, indem zwei aufeinander folgende Schnitte jeder Gewebeprobe separat verarbeitet wurden.
  • Beispiel 3
  • RNA-Isolierung.
  • In 52 CRC-Fällen wurden mikrodissezierte Gewebeproben einer RNA-Isolierung wie zuvor beschrieben unterzogen [Lassmann, S., et al., J. Pathol. 198 (2002) 198–206]. Kurz, mikrodissezierte Tumorzellen wurden unmittelbar in Eppendorf-Röhrchen, die Verdauungspuffer enthielten, gegeben (10 mM TrisHCl, 0,1 mM EDTA, 2 % SDS und 0,5 mg Proteinase K, jeweils von Sigma, Taufkirchen, Deutschland). Inkubation erfolgte über Nacht (60 °C, 350–400 rpm), gefolgt von Extraktion mit Phenol:Chloroform und Präzipitation von Nukleinsäuren in Isopropanol. Das resultierende RNA-Pellet wurde weiter aufgereinigt durch Inkubation (45 Min, 37 °C) mit 10 U DNase I (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland), 20 μl DNase-Puffer (0.4 M TrisHCl, 60 mM MgCl2, 0,1 M NaCl) und H2O bis auf 200 μl. Anschließend wurde RNA erneut extrahiert durch Extraktion mit Phenol:Chloroform, Präzipitation und Wiederauflösen in H2O. In 50 CRC-Fällen und den Kontrollproben wurden mikrodissezierte Tumor- oder Kontrollzellen mit dem „HighPure RNA Paraffin Kit" (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland) gemäß dem mitgelieferten Protokoll isoliert. Dieses Verfahren umfasst auch einen Proteinase K-Verdauungsschritt, Reinigung von Nukleinsäuren, einen DNase-Verdauungsschritt und erneute Reinigung der RNA. In vorhergehenden Experimenten wurden aus 3 aufeinander folgenden Gewebeschnitten von jeweils einer normalen Mucosa und einer Tumorprobe, die durch die beiden Verfahren isoliert wurden ähnliche Ergebnisse erhalten (Daten nicht gezeigt). Die RNA wurde bis zur weiteren Verwendung bei –70 °C gelagert.
  • Beispiel 4
  • Reverse Transkription und quantitative Polymerasekettenreaktion (QRT-PCR).
  • Reverse Transkription und quantitative PCR in dem LightCycler®-System wurde mit Reagenzien und Kits von Roche Applied Science gemäß Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Kurz, RNA-Proben wurden auf vier gleiche Aliquote verteilt, die jeweils dasselbe Gemisch von cDNA-Reagenzien und entweder TP-, DPD-, TS- oder Referenzgen-spezifischen Primern (Katalog Nr. 3 302 946, 3 302 938, 3 302 954) erhielten. Eine Positiv-Kontroll-RNA (Kalibrator, aus den „LC-mRNA quantification Kits for TP, DPD and TS") war in diesem Schritt enthalten. Jeweils eine Kalibrator-RNA wurde zusammen mit 4 unbekannten Proben als ein getrennter „Satz" behandelt, um Qualität und Reproduzierbarkeit zu kontrollieren. Jeweils 3 cDNA-"Sätze" wurden dann zusammen in einem quantitativen PCR-Durchgang unter Verwendung des „LC-mRNA quantification kits for TP, DPD and TS" analysiert. Für die Datenanalyse wurde die „Relative Quantification Software" (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland) eingesetzt. Dadurch wird das relative Verhältnis von Cp(Enzym:Referenzgen)Probe zu Cp(Enzym:Referenzgen)Kalibrator berechnet, wobei sowohl Probenbeladung (RNA-Eingabe) als auch PCR-Effizienz über den festen Referenzpunkt (Kalibrator) kontrolliert wurden. Um eine genaue Quantifizierung zu gewährleisten, wurden nur Daten von RNA-Präparationen mit Kreuzungspunkten von 20 bis max. 33 (linearer Amplifikationsbereich) einbezogen. Die Varianz der TP-, DPD-, TS- und Referenzgen-mRNA-Expression (Mittel +/– Standardabweichung vom Kreuzungspunkt) war minimal, mit 26,62 +/– 0,36, 28 +/– 0,51, 22 +/–0,23 bzw. 23,19 +/–0,7 für 29 Kalibratoren (macht 29 × 4 = 116 Gewebeproben).
  • Beispiel 5
  • Statistik.
  • Die quantitativen Parameter wurden unter Verwendung von Mittel oder Median mit Standardabweichungen bzw. Bereichen beschrieben. Die qualitativen Parameter wurden über Häufigkeitstabellen untersucht. Nichtparametrische Tests wurden durchgeführt (SAS®-Software; Version 8.02), da alle Marker eine Abweichung von der normalen Verteilung für beobachtet wurde.
  • In der Gruppe aller 102 Fälle wurde die TP-, DPD- und TS-mRNA-Expression sowie das TS/DPD- und TP/DPD-Verhältnis korreliert mit 1) Patientenalter und Geschlecht und 2) Lokalisierung des Primärtumors, TNM-Klassifizierung, UICC-Stadium und Differenzierungsgrad. Dies wurde mittels des Spearman-Korrelationskoeffizienten und des Tests auf Null-Korrelation durchgeführt. Für einen Vergleich von einzelnen Untergruppen wurde der Wilcoxon-Test für ungepaarte Proben und der Kruskal-Wallis-Test angewendet. Um die prognostische Bedeutung und/oder den Antwortvorhersagewert der drei Enzyme zu bewerten, wurden die 102 Fälle in die „kein CTX"-(n = 40) und die „CTX"-(n = 52) Gruppe unterteilt. Patienten, die eine kombinierte Radio-/Chemotherapie erhalten hatten (n = 10) wurden ausgenommen. Innerhalb der beiden Untergruppen wurde eine getrennte statistische Analyse durchgeführt für die Korrelation der TP-, DPD- und TS-mRNA- und des TS/DPD- und TP/DPD-Verhältnisses mit: Inzidenz einer Rezidiverkrankung, Inzidenz des Todes sowie symptomfreies Überleben und Gesamtüberleben. Die Überlebensanalyse wurde durch sowohl eine Cox-Regression als auch einen Log-Rank-Test erhalten, wobei der Signifikanzwert auf 5 % eingestellt wurde.
  • Beispiel 6
  • Ergebnisse
  • TP-, DPD- und TS-mRNA-Expression in normalem Kolon, chronischer Colitis und CRC
  • Zu Beginn wurden TP-, DPD- und TS-mRNA-Mengen in einer Reihe von mikrodissezierten FFPE-Kontrollproben durch quantitative RT-PCR unter Verwendung des LightCycler®-Systems untersucht. Wie in 1 gezeigt ist, wurde mRNA-Expression für TP, DPD und TS in allen Proben nachgewiesen, die mRNA-Expressionshöhen unterschieden sich aber zwischen den Geweben: hohe TP-mRNA-Expression wurde in reaktiven Läsionen chronischer Cholitis beobachtet, gefolgt von moderaten Mengen in normaler Kolonmucosa (Epithelzellen) und normaler Leber (gemischte Zellpopulation) und einer noch geringeren Expression in normaler Kolon-Muscularis propria (Muskelzellen). Die DPD-mRNA-Expression war in normaler Leber am stärksten, gefolgt von normaler Muscularis propria > reaktive Läsionen chronischer Cholitis >/= normale Mucosa. TS war stark exprimiert in normaler Mucosa > reaktive Läsionen chronischer Colitis > normale Leber und Muscularis propria.
  • Im Vergleich ergaben die mittleren TP-, DPD- und TS-mRNA-Expressionshöhen von Kolontumorproben (n = 102, siehe unten) eine geringere DPD-mRNA-Expression in Tumorproben im Vergleich zu Epithelzellen normaler Mucosa. Im Gegensatz dazu wurde kein signifikanter Unterschied von TP- und TS-mRNA-Mengen zwischen normaler Mucosa und Tumorgeweben detektiert.
  • Durchmustern von TP-, DPD- und TS-mRNA-Expression in 102 Patienten mit Darmkrebs
  • Die Gruppe der untersuchten Patienten umfasste 102 Fälle von CRC in verschiedenen Stadien (Tabelle 1, Materialien und Methoden), entweder mit Resektion allein (40 Fälle; „kein CTX"-Gruppe), mit Resektion und anschließender 5-FU-Chemotherapie (52 Fälle; „CTX"-Gruppe) oder mit Resektion und einer Kombination aus Radio- und Chemotherapie (10 Fälle) behandelt.
  • Die Analyse der mRNA-Expression von TP, DPD und TS zeigte in allen 102 CRC-Fällen eine große Breite von Enzymexpressionsmustern (2). Ausgedrückt als relatives Verhältnis waren die Bereiche für TP, DPD und TS 1,52–166,29, 0–24,39 bzw. 0,21–3,71. Bei der Unterteilung der Fälle in die Gruppen „Kein CTX" und „CTX" war die TP-, DPD- und TS-mRNA-Expression in beiden Gruppen ähnlich, abgesehen von einer Tendenz zu einer geringeren TP-mRNA-Expression in der „CTX"-Gruppe. Dies spiegelt sich in dem statistischen Median der TP-, DPD- und TS-mRNA-Expressionhöhen wider (2).
  • Korrelation der TP-, DPD- und TS-mRNA-Expression mit Patientendaten und Histologie
  • Wie in Tabelle 2A zusammengefasst ist, zeigte sich keine statistisch signifikante Korrelation zwischen TP-, DPD- oder TS-mRNA-Mengen oder den TS/DPD- und TP/DPD-Verhältnissen mit dem Alter oder Geschlecht der Patienten und mit der Lokalisierung des Primärtumors (Kolon oder Rectum).
  • Figure 00160001
    Tabelle 2: Die Zahlen bedeuten p-Werte des Kruskal-Wallis-Tests für Patienten und Tumorparameter.
  • Signifikante Unterschiede waren jedoch erkennbar im Hinblick auf 1) TP-mRNA-Expression mit Tumor T-(p = 0,03) und N-(p = 0,04) Kategorie und UICC-Stadium (p = 0,009); 2) TS-mRNA-Expression mit Differenzierungsgrad (p = 0,001), 3) TS/DPD-Verhältnis mit Tumor T-Kategorie (p = 0,014) und Differenzierungsgrad (p = 0,033) und 4) TP/DPD-Verhältnis mit Tumor T-(p = 0,007) und N-(p = 0,001) Kategorie und UICC-Stadium (p = 0,001). Wie in 3 gezeigt ist, verringerte sich die TP-mRNA-Expression und das TP/DPD-Verhältnis signifikant bei höheren Tumor T- und N-Kategorien sowie bei höheren UICC-Stadien. Die TS-mRNA-Expression war bei Differenzierungsgrad 3 signifikant geringer als bei Grad 2-Tumoren. Schließlich war das TS/DPD-Verhältnis geringer in Tumoren mit höherer T-Kategorie sowie bei Differenzierungsgrad 3 im Vergleich zu Grad 2-Tumoren.
  • TP-, DPD- und TS-mRNA-Expression in CRC – Korrelation mit Prognose
  • Um die TP-, DPD- und TS-mRNA-Expression mit der Prognose zu korrelieren wurden Patienten, die adjuvantive Chemo- und Radiotherapie (n = 10) erhalten hatten, von der statistischen Analyse ausgenommen. Außerdem wurden die verbleibenden 92 Patienten in solche ohne begleitende Therapie (n = 40; „kein CTX") und solche mit begleitender Chemotherapie (n = 52; „CTX") eingeteilt, wie in 4A gezeigt ist, da Patienten mit Lymphknotenbeteiligung („N+") im Allgemeinen eine schlechtere Prognose aufweisen als solche, die als „N0" [1] eingestuft werden. Die statistische Analyse wurde dann in den beiden Gruppen getrennt durchgeführt im Hinblick auf Inzidenz einer Rezidiverkrankung und Tod sowie symptomfreies und Gesamtüberleben. Zunächst zeigte sich keine signifikante Korrelation zwischen entweder TP-, DPD- oder TS-mRNA-Expression oder den TS/DPD- und TP/DPD-Verhältnissen und der Inzidenz einer Rezidiverkrankung oder Tod (Tabelle 2B).
  • Figure 00170001
    Tabelle 2: Zahlen bedeuten p-Werte der Cox-Regression für Follow-up Parameter
  • Zweitens hatte keines der Enzyme oder das TP/DPD-Verhältnis einen signifikanten Einfluss auf das Gesamtüberleben (Kaplan-Meier-Analyse). Drittens ergab eine multivariierte Analyse der TP-, DPD- und TS-mRNA-Expression und des Gesamtüberlebens keine signifikante Korrelation, obwohl TP- und DPD-mRNA-Expression in der „CTX"-Gruppe signifikant korreliert waren (p<0,0001). Diese Ergebnisse trafen sowohl für die „kein CTX"-Gruppe als auch für die „CTX"-Gruppe zu (Tabelle 2).
  • Im Gegensatz dazu war das Gesamtüberleben innerhalb der „kein CTX"-Gruppe signifikant mit dem TS/DPD-Verhältnis (p = 0,032) korreliert, wobei das Todesfallrisiko mit größeren TS/DPD-Verhältnissen zunimmt.
  • TP-, DPD- und TS-mRNA-Expression – Marker für die Antwortvorhersage
  • Um zu beurteilen, ob TP-, DPD- und/oder TS-mRNA-Mengen oder das Verhältnis von TP/DPD oder TS/DPD die klinische Antwort auf eine 5-FU-Chemotherapie vorhersagen können, wurde eine ausführliche statistische Analyse für Patienten innerhalb der „CTX"-Gruppe durchgeführt. Bei einer Unterteilung der „CTX"-Patienten in solche mit „geringen" und „hohen" TP-, DPD- und TS-mRNA-Mengen (Grenzwert = Median, wie in 2 angegeben) und anschließende Kaplan Meier-Analyse wurde keine Korrelation im Hinblick auf das Gesamtüberleben gefunden (4B). Ähnlich sagten auch weder nierige noch hohe TP/DPD- oder TS/DPD-Verhältnisse ein Gesamtüberleben in den beiden „CTX"-Untergruppen vorher (nicht gezeigt).
  • Signifikante Korrelationen wurden jedoch für DPD-mRNA-Mengen und für das TP/DPD-Verhältnis im Hinblick auf symptomfreies Überleben beobachtet (4C). So war bei Verwendung eines Grenzwertes der mRNA-Menge von 8,2 eine geringe DPD-mRNA-Expression mit symptomfreiem Überleben mit p = 0,05 korreliert.
  • Außerdem wurde eine positive Korrelation zwischen symptomfreiem Überleben und dem TP/DPD-Verhältnis nachgewiesen. Wie in 5 gezeigt ist, war bei Verwendung von Grenzwerten von 3,7 (5b), 5,0 (5c), 6,2 (5d) und 8,1 (5e) ein großes TP/DPD-Verhältnis signifikant korreliert mit symptomfreiem Überleben mit p = 0,002.
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    • WO 02/44423

Claims (6)

  1. Verfahren zur Bestimmung, ob ein Patient, der an Darmkrebs leidet, auf eine Behandlung mit 5-Fluor-Uracil und/oder einem 5-FU Analogon anspricht, umfassend: a) Bestimmung der Thymidin-Phosphorylase mRNA-Expression in einer klinischen Probe b) Bestimmung der Dihydropyrimidin-Dehydrogenase mRNA-Expression in der klinischen Probe c) Bestimmung des Verhältnisses des in Schritt a) erhaltenen Wertes und des in Schritt b) erhaltenen Wertes d) Bestimmung, ob das in Schritt c) erhaltene Verhältnis einen vorbestimmten Grenzwert übersteigt.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Grenzwert mindestens 3 und bevorzugt mindestens 3,7 beträgt.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, worin der Grenzwert nicht höher als 10 und bevorzugt nicht höher als 8,2 ist.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1–3, weiter dadurch gekennzeichnet, dass ein absoluter oder relativer mRNA-Expressionswert der Dihydropyrimidin-Dehydrogenase bestimmt wird, und dass ein Expressionswert unterhalb eines bestimmten Grenzwerts ein zusätzliches Anzeichen für eine Empfindlichkeit gegenüber 5-Fluor-Uracil und/oder einem 5-FU Analogon ist.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1–4, dadurch gekennzeichnet dass die mRNA-Expression von Thymidin-Phosphorylase und/oder Dihydropyrimidin-Dehydrogenase mittels Reverse-Transkriptase PCR bestimmt wird.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass -ein sequenzspezifischer Thymidin-Phosphorylase Primer und/oder ein sequenzspezifischer Dihydropyrimidin-Dehydrogenase Primer während des cDNA Syntheseschritts verlängert wird.
DE602004004571T 2003-08-28 2004-08-25 Abhängigkeit des symptomfreien Überlebens 5-FU behandelter Darmkrebspatienten vom Verhältnis der mRNA-Expressionshöhe aus Thymidinphosphorylase und Dihydropyrimidindehydrogenase Active DE602004004571T2 (de)

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