ES2279266T3 - Correlacion del cociente de los niveles de expresion del mrna de la timidina fosforilasa y la dihidropirimidina dehidrogenasa en el cancer colorrectal con supervivencia libre de enfermedad en pacientes tratados con 5-fu. - Google Patents
Correlacion del cociente de los niveles de expresion del mrna de la timidina fosforilasa y la dihidropirimidina dehidrogenasa en el cancer colorrectal con supervivencia libre de enfermedad en pacientes tratados con 5-fu. Download PDFInfo
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Abstract
Un método para determinar si el paciente que padece un cáncer colorrectal es susceptible al tratamiento con 5-Fluorouracilo y/o análogos del 5-Fluorouracilo que consta de los siguientes pasos: a) determinación de la expresión del mRNA de la timidina fosforilasa en una muestra clínica b) determinación de la expresión del mRNA de la dihidripirimidina deshidrogenasa en dicha muestra clínica c) determinación del cociente del valor obtenido en el paso a) y el valor obtenido en el paso b) d) determinación de si el cociente obtenido en el paso c) excede un determinado valor de corte
Description
Correlación del cociente de los niveles de
expresión del mRNA de la timidina fosforilasa y la dihidropirimidina
dehidrogenasa en el cáncer colorrectal con supervivencia libre de
enfermedad en pacientes tratados con 5-FU.
Esta invención se relaciona con el campo de la
predicción de susceptibilidad al tratamiento farmacológico del
cáncer utilizando análisis de biomarcador. En particular, la
presente invención se relaciona con el campo de la predicción de
susceptibilidad al 5-FU o análogos del
5-FU en pacientes que padecen cáncer
colorrectal.
El cáncer colorrectal (CCR), que continúa siendo
uno de los cánceres con mayor índice de mortalidad en el mundo
occidental, puede curarse aproximadamente en un tercio de los
pacientes mediante una resección quirúrgica únicamente del tumor
primario. Sin embargo, el resto de los pacientes ya habrán
desarrollado una metástasis oculta o distante cuando se produzca la
manifestación clínica del tumor primario y en este caso recibirán
un tratamiento adyuvante (después de la intervención quirúrgica) de
quimioterapia y/o radioterapia. Lo que determina los criterios a
seguir sobre el tratamiento adyuvante es la clasificación
histopatológica del tumor y la estadificación de acuerdo con la
clasificación TNM junto con los datos clínicos del paciente.
Según los criterios actuales, los tumores con
ganglios negativos (T1-4. N0, M0) se tratan mediante
una resección completa únicamente del tumor primario, mientras que
en los casos donde se observa en los datos histopatológicos una
implicación de los ganglios linfáticos (T1-4,
N1-2, M0) recibirán quimioterapia y/o radioterapia
después de la extracción quirúrgica del tumor primario. A pesar de
un perfeccionamiento constante de las herramientas de diagnóstico y
de los marcadores principales, así como de las diferentes
estrategias de tratamiento [Ragnhammar, P., et al., Acta
Oncol. 40 (2001) 282-308], aún existen cuestiones
sin resolver respecto al pronóstico exacto y/o la predicción de
respuesta ante un tratamiento adyuvante [Iqbal, S., y Lenz, H.J.,
Curr. Oncol. Rep. 3 (2001) 102-108; Kumar, S.K., y
Goldberg, R.M., Curr. Oncol. Rep. 3 (2001)
94-101].
Las enzimas timidina fosforilasa (TF),
dihidropirimidina deshidrogenasa (DPD) y timidilato sintasa (TS),
están implicadas en el metabolismo de las pirimidinas, y por lo
tanto se ven involucradas finalmente en la proliferación normal de
las células así como en la transformación patológica de las mismas.
La TS es la enzima central y limitante para la síntesis de novo de
piridiminas y por lo tanto también para la síntesis de novo del
RNA/DNA; la DPD está implicada en la degradación del uracilo y la
timidina para desactivar los productos de deshecho; y la TF
controla los niveles intracelulares de timidina [Diaso, R.B., y
Jonson, M.R., Pharmacology 61 (2000) 199-203].
Además, se demostró que la TF es idéntica al factor de crecimiento
celular endotelial derivado de las plaquetas
(PD-ECGF) [Furukawa, T., et al., Nature 356
(1992) 668; Sumizawa, T., et al., J. Biochem. 114 (1993)
9-14] y manifiesta propiedades angiogénicas en un
gran número de tumores sólidos [Takebayashi, Y., et al., J.
Natl. Cancer Inst. 88 (1996) 1110-1117; Griffiths,
L, y Stratford, I.J., Br. J. Cancer 76 (1997)
689-693]. Dichas propiedades pueden convertir la
expresión de la TF, la DPD y/o la TS en marcadores pronóstico y
quimiopredictivos valiosos en el CCR.
Además, debido a su implicación en el
metabolismo de la pirimidina, estas tres enzimas también son
importantes para la eficacia del 5-FU y agentes
quimioterapéuticos 5-FU [Diasio, R.B., y Johnson,
M.R., Pharmacology 61 (2000) 199-203; WO 02/44423].
Mientras la TS es el primer objetivo de dichos quimioterapéuticos,
las enzimas TF y DPD actúan en la activación y degradación de estos
fármacos y sus intermediarios respectivamente. De tal manera que
las tres enzimas de forma individual o los cocientes TS/DPD y
TF/DPD, están implicadas como marcadores para los pronósticos y/o
predicción de respuestas al tratamiento adyuvante de quimioterapia
en el CCR y otros tipos de cáncer. [Metzger, R., et al.,
Clin. Cancer Res. 4 (1998) 2371-2376; Salonga, D.,
et al., Clin. Cancer Res. 6 (2000) 1322-1327;
Takenoue, T., et al., Ann. Surg. Oncol. 7 (2000)
193-198; Araki, Y., et al., Kurume Med. J.
48 (2001) 93-98; Edler, D., et al., J. Clin.
Oncol. 20 (2002) 1721-1728; Kornmann, M., et
al., J. Gastrointest. Surg. 6 (2002) 331-337;
Terashima M. et al., Europ. J. of Cancer (2002)
2375-2381; Fujwaki R. et al., J. of Clinical
Oncology (2000) 3946-3951]. De hecho, la resistencia
de los tumores expuestos a quimioterapia con 5-FU
está vincula a altos niveles de TS [Copur, S., et al.,
Biochem. Pharmacol. 49 (1995) 1419-1426; Wang, W.,
et al., Cancer Res. 61 (2001) 5505-5510;
Johnston, P.G., et al., Cancer Res. 55 (1995)
1407-1412; Bathe, O.F., et al., Cancer J.
Sci. Am. 5 (1999) 34-40] y la intensa toxicidad a
los agentes quimioterapéuticos 5-FU está
correlacionada con una baja expresión de DPD [Wei, X., et
al., J. Clin. Invest. 98 (1996) 610-615,
Johnson, M.R., et al., Clin. Cancer Res. 5 (1999)
2006-2011]. El amplio rango en los niveles de
expresión de TS y de DPD y los efectos asociados a la respuesta a
la quimioterapia parecen ser debidos, por lo menos en cierta manera,
a un polimorfismo en la región estimuladora del promotor de TS
[Marsh, S., et al., Int. J. Oncol. 19 (2001)
383-386; Iacopetta, B., et al., Br. J.
Cancer 85 (2001) 827-830] y a una mutación puntual y
habitual dentro del intrón 14 del gen de la DPD respectivamente
[van Kuilenburg, A.B., et al., Clin. Cancer Res. 6 (2000)
4705-4712; Raida, M., et al., Clin. Cancer
Res. 7 (2001) 2832-2839]. A pesar de que un gran
número de estudios investigan la expresión de la TF, la DPD y la TS
en el CCR, el papel que desempeñan las enzimas aún es conflictivo.
Esto se debe principalmente a los diversos protocolos de estudio
que analizan la expresión de la TF, la DPD y la TS con respecto a
cualquier 1) actividad del mRNA, proteína o enzima, 2) en los
tumores primarios o en metástasis distantes, y 3) en pacientes que
son tratados con varios protocolos de neo o radio/quimioterapia
adyuvante.
\newpage
En vista de los conocimientos previos señalados,
debía resolverse el problema de la identificación de aquellos
factores, de entre todos aquellos factores potenciales sugeridos
anteriormente en los conocimientos previos, que finalmente son
indicativos de susceptibilidad al 5-FU y/o a los
análogos del 5-FU y que determinan bajo qué
condiciones estos factores proporcionan la mayor especificidad
posible.
De esta manera, la presente invención se refiere
a un método para determinar si un paciente que padece cáncer
colorrectal es susceptible a un tratamiento con
5-fluorouracilo o con análogos del
5-fluorouracilo que consta de los siguientes
pasos:
- a)
- determinación en una muestra clínica de la expresión del mRNA de la timidina fosforilasa
- b)
- determinación en dicha muestra clínica de la expresión del mRNA de la dihidropirimidina deshidrogenasa
- c)
- determinación del cociente del valor obtenido en el paso a) y del valor obtenido en el paso b)
- d)
- determinación de si el cociente obtenido en el paso c) sobrepasa un valor de corte predeterminado.
Con el fin de evitar demasiados resultados
falsos positivos, se ha probado que es muy útil que el valor de
corte sea al menos 3 o preferiblemente 3,7 para las proporciones de
TF y DPD.
Por otro lado, para evitar demasiados resultados
falsos negativos, se ha probado que es muy útil que el valor de
corte no sea mayor que 10 y que preferiblemente no sea mayor que 8,2
para las proporciones de TF y DPD.
En una realización particular, existe una
determinación adicional del nivel de expresión absoluto o relativo
de la dihidropirimidina deshidrogenasa y del valor de expresión por
debajo de un cierto valor de corte, es un indicativo adicional para
comprobar la susceptibilidad al 5-fluorouracilo o a
sus respectivos análogos.
En el estudio que subyace a la invención, la
expresión del mRNA de la TF, la DPD y la TS se examinó en un único
grupo de 102 pacientes con CCR, donde se utilizaron muestras de
tumores primarios microdiseccionadas, fijadas en formalina e
incluidas en parafina para la RT-PCR cuantitativa
(QRT-PCR) en el sistema LightCycler®. Nos dirigimos
específicamente a la correlación de la expresión del mRNA de la TF,
la DPD y la TS y las proporciones de la TS/DPD y la TF/DPD de la
histología del tumor así como del pronóstico y la predicción a la
respuesta del paciente al tratamiento adyuvante de quimioterapia
con 5-FU.
Los inventores investigaron en detalle la
expresión del mRNA de la timidina fosforilasa (TF), la
dihidropirimidina deshidrogenasa (DPD) y la timidilato sintasa (TS)
en el CCR, haciendo mayor énfasis en su valor como marcadores de
pronóstico en general y como marcadores predictivos para la
quimioterapia con 5-FU. Para esto, se desarrolló y
aplicó un novedoso enfoque de la cuantificación
RT-PCR del mRNA de la TF, la DPD y la TS que utiliza
el sistema LightCycler® (Roche Applied Science) para los tejidos
tumorales microdiseccionados, fijados en formalina e incluidos en
parafina en 102 pacientes con CCR. En comparación con otros estudios
[Johnston, P.G., et al., Cancer Res. 55 (1995)
1407-1412] [Metzger, R., et al., Clin. Cancer
Res. 4 (1998) 2371-2376; Salonga, D., et
al., Clin. Cancer Res. 6 (2000) 1322-1327] y
considerando su desarrollo anterior, los inventores examinaron la
expresión del mRNA de la TF, la DPD y la TS en tumores primarios y
evaluaron el impacto del pronóstico y la respuesta clínica de los
pacientes a la quimioterapia con 5-FU mediante la
correlación de los niveles de enzimas para el seguimiento de los
pacientes. Aunque se haya analizado la expresión de la TF, la DPD y
la TS en los tumores primarios del CCR en lo que a pronósticos se
refiere [Takebayashi, Y., et al., J. Natl. Cancer Inst. 88
(1996) 1110-1117; Araki, Y., et al., Kurume
Med. J. 48 (2001) 93-98; Edler, D., et al.,
J. Clin. Oncol. 20 (2002) 1721-1728; Sanguedolce,
R., et al., Anticancer Res. 18 (1998)
1515-1520; Paradiso, A., et al., Br. J.
Cancer 82 (2000) 560-567; Findlay, M.P., et
al., Br. J. Cancer 75 (1997) 903-909; Allegra,
C.J., et al., J. Clin. Oncol. 20 (2002)
1735-1743], nuestro estudio es el primero en
examinar el valor predictivo y de pronóstico de la expresión del
mRNA de la TF, la DPD y la TS dentro de un grupo de casos de CCR
con un tamaño de muestra único, subgrupos de tratamiento, datos de
seguimiento y la utilización de un método normalizado para el
muestreo de tejidos y la conservación de los mismos.
El análisis detallado de la expresión del mRNA
de la TF, la DPD y la TS en 102 casos de CCR, nos mostró una amplia
variedad de niveles de expresión para las tres enzimas. Esto ya se
había observado anteriormente [Iqbal, S., y Lenz, H.J., Curr.
Oncol. Rep. 3 (2001) 102-108; Metzger, R., et
al., Clin. Cancer Res. 4 (1998) 2371-2376;
Mori, K., et al., Int. J. Oncol. 17 (2000)
33-38], y junto con estos resultados se subraya el
concepto de heterogeneidad intertumoral.
Por último cabe destacar que mediante el
cociente de la TF/DPD y la TS/DPD, también se ha expresado la
asociación de los niveles del mRNA de la TF y la TS con la
histopatología de un tumor determinado. La explicación para
entender estos datos podría estar relacionada con las funciones
biológicas de dichas enzimas: Mientras la TF, también conocida como
factor de crecimiento celular endotelial derivado de las plaquetas
[Furukawa, T., et al., Nature 356 (1992) 668; Sumizawa, T.,
et al., J. Biochem. 114 (1993) 9-14], se
asocia con la angiogénesis en un gran número de tumores sólidos
[Takebayashi, Y., et al., J. Natl. Cancer Inst. 88 (1996)
1110-1117; Griffiths, L, y Stratford, I.J., Br. J.
Cancer 76 (1997) 689-693], la TS puede ser
considerada como un marcador de actividad metabólica y de
proliferación celular [Pestalozzi, B.C., et al., Br. J.
Cancer 71 (1995) 1151-1157; Backus, H.H., et
al., J. Clin. Pathol. 55 (2002) 206-211;
Pestalozzi, B.C., et al., Br. J. Cancer 71 (1995)
1151-1157]. Por tanto, una mayor expresión del mRNA
de la TF y la TS en los tumores "tempranos" puede reflejar su
actividad para facilitar el mantenimiento vascular y la
proliferación de las células tumorales, la cual se produce a medida
que progresa para favorecer por ejemplo, la invasión celular tumoral
y la metástasis. De hecho, se han asociado bajos niveles de
expresión del mRNA de la TF, la DPD y la TS a la respuesta favorable
a la quimioterapia con 5-FU [Metzger, R., et
al., Clin. Cancer Res. 4 (1998) 2371-2376;
Salonga, D., et al., Clin. Cancer Res. 6 (2000)
1322-1327]. Además, también partiendo de nuestros
datos, es exactamente este grupo de tumores con estadios avanzados
según la UICC, como por ejemplo aquellos pacientes que reciben un
tratamiento adyuvante de quimioterapia, el que produce bajos niveles
del mRNA de la TF y la TS.
Los datos previos han tratado de manera aislada
o combinada la expresión del mRNA de la TF, la DPD y la TS, como
marcadores potenciales para pronósticos [Takenoue, T., et
al., Ann. Surg. Oncol. 7 (2000) 193-198; Edler,
D., et al., J. Clin. Oncol. 20 (2002)
1721-1728; Sanguedolce, R., et al.,
Anticancer Res. 18 (1998) 1515-1520; Paradiso, A.,
et al., Br. J. Cancer 82 (2000) 560-567;
Allegra, C.J., et al., J. Clin. Oncol. 20 (2002)
1735-1743] y/o como predicción de respuesta ante la
quimioterapia con 5-FU en el CCR [Metzger, R.,
et al., Clin. Cancer Res. 4 (1998) 2371-2376;
Salonga, D., et al., Clin. Cancer Res. 6 (2000)
1322-1327; Araki, Y., et al., Kurume Med. J.
48 (2001) 93-98; Johnston, P.G., et al.,
Cancer Res. 55 (1995) 1407-1412]. Además,
últimamente los cocientes de la TF/DPD y/o la TS/DPD se han mostrado
como marcadores de pronóstico y/o predictivos [Kornmann, M., et
al., J. Gastrointest. Surg. 6 (2002) 331-337;
Ishikawa, T., et al., Cancer Res. 58 (1998)
685-690. Terashima M. et al., Europ. J. of
Cancer (2002), 2375-2381; Fujiwaki R. et
al., J. of Clinical Oncology (2000) 3946-3951].
En el presente estudio, los inventores podrían identificar al
cociente de la TS/DPD como un marcador de pronóstico, con cocientes
más altos de la TS/DPD correlacionados con un total de
supervivencia bajo en pacientes con CCR a los que sólo se les ha
practicado una resección.
Lo más importante es que el presente estudio
revela una correlación muy significativa entre los niveles del mRNA
de la DPD y el cociente de la TF/DPD con una supervivencia libre de
enfermedad después de seguir quimioterapia con
5-FU, a través de la cual se desvelan bajos niveles
del mRNA de la DPD y un alto cociente de la TF/DPD que predice una
mayor supervivencia libre de enfermedad. Esto puede estar
relacionado con el hecho de que sólo los bajos niveles de la DPD o
de que los bajos niveles de la DPD y los altos niveles de la TF
(alto cociente de la TF/DPD) estabilizarán el nivel activo del
5-FU. Por el contrario, ni los niveles del mRNA de
la TF, la DPD o la TS, ni los cocientes de la TF/DPD o la TS/DPD
tenían ningún valor predictivo en cuanto a la supervivencia
total.
Mientras los estudios previos han dirigido la
expresión de la proteína de la TF, la DPD y la TS en los tumores de
los CCR mediante inmunohistoquímica [Takebayashi, Y., et al.,
J. Natl. Cancer Inst. 88 (1996) 1110-1117; Edler,
D., et al., J. Clin. Oncol. 20 (2002)
1721-1728; Paradiso, A., et al., Br. J.
Cancer 82 (2000) 560-567; Findlay, M.P., et
al., Br. J. Cancer 75 (1997) 903-909; Allegra,
C.J., et al., J. Clin. Oncol. 20 (2002)
1735-1743], el contenido de proteína [Sanguedolce,
R., et al., Anticancer Res. 18 (1998)
1515-1520] o la actividad de la enzima [Araki, Y.,
et al., Kurume Med. J. 48 (2001) 93-98], los
inventores se decidieron por el análisis del mRNA de la TF, la DPD
y la TS mediante la RT-PCR cuantitativa, porque este
método es rápido, fiable, fácil de normalizar y funciona
correctamente si se utiliza para largas series de muestras de
tejidos microdiseccionados, incluidos en parafina y fijados con
formalina. Debido a las modificaciones postranscripcionales y a las
relacionadas con la fijación (y funcionalmente asociadas), se podría
haber supuesto alguna dificultad para detectar cualquier valor de
pronóstico y/o predictivo de estas enzimas en los niveles del RNA
[Kawakami, K., et al., Clin. Cancer Res. 7 (2001)
4096-4101].
No obstante, muchos investigadores han
demostrado una buena correlación entre por ejemplo, el gen de la DPD
y la TS y la expresión de la proteína [Johnston, P.G., et
al., Cancer Res. 55 (1995) 1407-1412; Uetake,
H., et al., Clin. Cancer Res. 5 (1999)
2836-2839; Tanaka-Nozaki, M., et
al., Clin. Cancer Res. 7 (2001) 2783-2787]. A
fin de validar nuestro método, los inventores someten a las células
microdiseccionadas procedentes de tejidos control a una revisión.
Los resultados reflejaron los datos publicados anteriormente con por
ejemplo, altos niveles de la TF en células inflamatorias [Fox,
S.B., et al., J. Pathol. 176 (1995) 183-190]
y altos niveles de la DPD en el hígado [Guimbaud, R., et
al., Cancer Chemother. Pharmacol. 45 (2000)
477-482; Johnston, S.J., et al., Clin.
Cancer Res. 5 (1999) 2566-2570]. Además, los tumores
presentaron tener niveles más bajos de la DPD [Johnston, S.J.,
et al., Clin. Cancer Res. 5 (1999) 2566-2570;
Miyamoto, S., et al., Int. J. Oncol. 18 (2001)
705-713] y más altos de la TF [Takebayashi, Y.,
et al., Eur. J. Cancer 32 (1996) 1227-1232;
Miwa, M., et al., Eur. J. Cancer 34 (1998)
1274-1281] que los tejidos sanos, un concepto que
subyace a la especificidad de los tumores para los profármacos de
5-FU.
Mientras los inventores también detectaron
niveles más bajos de la DPD en las células "tumorales" que en
las células "epiteliales normales" aisladas, los resultados no
revelaron diferencias entre los niveles del mRNA de la TS y la TF
en células tumorales y "normales". Posiblemente lo que más
determine esto sea el hecho de cómo defina cada uno a una población
de células "normales" con la mayor precisión posible. Para
interpretar la expresión de la TF, la DPD y la TS, será importante
la adquisición de tejido controlado morfológicamente, ya que las
células no epiteliales pueden poseer una importancia relevante en
los resultados. Por lo tanto, como anteriormente se ha comentado,
cuando los inventores compararon las células normales de músculo
liso del colon (en lugar de las muestras de células epiteliales
normales) con células tumorales, estas últimas manifestaron una
expresión del mRNA de la TF y la TS más elevada [Takebayashi, Y.,
et al., Eur. J. Cancer 32 (1996) 1227-1232;
Miwa, M., et al., Eur. J. Cancer 34 (1998)
1274-1281].
En resumen, la presente invención está dirigida
a un novedoso método de RT-PCR cuantitativa para
determinar la susceptibilidad al 5-FU y/o a
análogos del 5-FU en pacientes con cáncer
colorrectal. Este nuevo método se caracteriza por la determinación
del cociente de la TF/DPD y opcionalmente de la expresión del mRNA
de la DPD en biopsias de FFPE de pacientes. El cociente de la
TF/DPD tiene un valor predictivo para la supervivencia libre de
enfermedad en pacientes con cáncer colorrectal a los que se les
asigna un tratamiento adyuvante con 5-FU.
Los siguientes ejemplos, figuras y referencias
se proporcionan para facilitar la comprensión del invento, cuyo
verdadero alcance se establece en las reivindicaciones anexadas.
Figura 1 Expresión del mRNA de la TF, la
DPD y la TS en los tejidos microdiseccionados. Mucosa normal
del colon (n=8) y muscularis propia (n=3), colitis crónica (n=3),
cáncer colorrectal (CCR; n=102) e hígado sano (n=1, duplicado). Los
niveles del mRNA se expresan mediante el cociente relativo (media
\pm desviación estándar).
Figura 2 Expresión del mRNA de la TF, la
DPD y la TS en los 102 pacientes con CCR. Cada símbolo refleja
un caso, con barras y números que indican la mediana de los niveles
del mRNA (cociente relativo) para: todos los casos (cuadrados,
n=12), los No-CTX (triángulos, n=4) y los CTX
(círculos, n=52).
Figura 3 Expresión del mRNA asociado a
la histología del tumor. Visión general en el gráfico de las
correlaciones importantes estadísticamente, con columnas que
representan la mediana del nivel dentro de cada subgrupo. El eje Y
indica niveles del mRNA relativos o cocientes de enzimas. Para
visualizar los valores de p dirigirse a la Tabla 2.
Figura 4 Correlación del cociente de la
TF/DPD con la supervivencia total e indemne. Análisis de
Kaplan-Meier respecto a la supervivencia total para
los grupos (A) de pacientes No-CTX (n=40) y los CTX
(n=52). Ni los niveles del mRNA de la TF y la DPD, ni los de la TS
tenían un valor predictivo para la supervivencia total en pacientes
tratados con 5-FU (CTX) (B, con un valor de corte
equivalente a la mediana de la expresión del mRNA). Sin embargo, el
cociente de los niveles bajos del mRNA de la DPD estaban
correlacionados de una forma muy significativa con la supervivencia
libre de enfemedad en pacientes tratados con 5-FU
(C, con valores de corte como los indicados).
Figura 5 Correlación de los niveles del
mRNA del cociente de la TF/DPD con la supervivencia total e
indemne. Análisis de Kaplan-Meier respecto a la
supervivencia indemne y su correlación con el cociente de la TF/DPD.
Los cocientes elevados de la TF/DPD estaban correlacionados de una
forma considerable con la supervivencia libre de enfermedad en
pacientes tratados con 5-FU (Valores de corte:
A=0,39; B=3,7; C=5,0; D=6,2; E=8,1).
Las muestras de cáncer colorrectal se han
obtenido del archivo del Instituto de Anatomía Patológica
Klinikum rechts der Isar en Munich, Alemania. Se analizaron
muestras de los tumores primarios extraídos de un total de 102
pacientes mediante la microdisección de células tumorales (Tabla 1;
la mediana del seguimiento clínico equivale a 63,5 meses en un
intervalo de 8 a 125 meses).
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(Tabla pasa a página
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| ^{1} = 10 casos excluidos del análisis estadístico para terapias combinadas; ^{2} = Números que representan la | |
| \hskip0,4cm mediana estadística (intervalo) de supervivencia en meses. |
Tenemos 40 pacientes que sólo se sometieron a
una resección del tumor (grupo No-CTX), 52 pacientes
que recibieron un tratamiento adyuvante con quimioterapia después
de una resección (grupo CTX) y 10 pacientes que recibieron un
tratamiento adyuvante de quimioterapia y radioterapia combinada. El
tratamiento adyuvante en el grupo CTX fue el siguiente: Se trataron
25/52 pacientes bajo el protocolo de Mayo (6 meses con 425
mg/m^{2} de 5-FU y 20 mg/m^{2} de leucovorina)
[O'Connell, M.J., et al., J. Clin. Oncol. 15 (1997)
246-250], 7/52 pacientes bajo el tratamiento
"Mörtel" (450 mg/m^{2} de 5-FU y 50
mg/m^{2} de levamisol) [Moertel, C.G., et al., N. Engl. J.
Med. 322 (1990) 352-358], 5/52 pacientes bajo el
protocolo de tratamiento Ardalan (24 h. de 2.600 mg/m^{2} de
5-FU y 500 mg/m^{2} de leucovorin) [Ardalan, B.,
et al., J. Clin. Oncol. 9 (1991) 625-630],
14/52 pacientes bajo un protocolo de tratamiento Ardalan modificado
y 1/52 pacientes bajo el protocolo de tratamiento SAKK (500
mg/m^{2} de 5-FU y 10 mg/m^{2} de mitomicina C)
[SAKK, Lancet 345 (1995) 349-353]. Se utilizaron
muestras de tejidos de colon sano, colitis crónica (ver arriba) e
hígado sano como control. Todos los tejidos se han fijado con
formalina (una solución amortiguadora con formalina al 10%) e
incluido en parafina (FFPE) de acuerdo con las directrices
habituales. Antes de realizar el análisis se confirmó la
histopatología de cada muestra mediante secciones seriadas teñidas
de hematoxilina.
Antes de la extracción del RNA de los tejidos
FFPE, las secciones de micrótomo (5 \mum) se trataron con xileno
y alcoholes graduados bajo condiciones libres de ribonucleasa. Para
la microdisección posterior, las secciones se tiñeron de forma
individual con hematoxilina instantánea (Shandon, Frankfurt,
Alemania) y las células tumorales se diseccionaron bajo observación
microscópica utilizando agujas finas (calibre 18). La pureza de la
población de células tumorales diseccionadas fue de un
80-90%.
Los tejidos control se diseccionaron bajo las
mismas condiciones e incluyen mucosa normal del colon (n=8; células
epiteliales) y muscularis propia del colon (n=4; células
musculares), lesiones reactivas de colotis crónica (n=3; Enfermedad
de Crohn, colitis ulcerosa y diverticulitis del colon sigmoideo) e
hígado sano (n=1; todas las poblaciones de células). Para los
últimos dos grupos de control se realizó una duplicación de los
análisis mediante la elaboración de dos secciones de series de cada
muestra de tejido de forma separada.
Como ya se ha descrito anteriormente, las
muestras de tejido microdiseccionado estuvieron sujetas a un
aislamiento del RNA en 52 casos de CCR [Lassmann, S., et
al., J. Pathol. 198 (2002) 198-206]. En resumen,
las células tumorales microdiseccionadas se colocaron
inmediatamente dentro de tubos Eppendorf con tampón de digestión
(TrisHCl 10 mM; EDTA 0,1 mM; SDS al 2% y 0,5 mg de proteinasa K,
todas de Sigma, Taufkirchen, Alemania). La incubación se hizo
durante la noche (60ºC, 350-400 rpm) seguida de una
extracción con fenol-cloroformo y una precipitación
de ácidos nucleicos en isopropanol. Posteriormente, el botón de RNA
resultante se purificó mediante una incubación (45 min., 37ºC) con
10 U de desoxiribonucleasa I (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim,
Alemania), 20 µl de tampón de desoxiribonucleasa (TrisHCl 0,4 M;
MgCl_{2} 60 mM; NaCl 0,1 M) y H_{2}O hasta 200 \mul. Más
tarde se obtuvo de nuevo RNA mediante una extracción de
fenol-cloroformo, una precipitación y una
resuspensión en H_{2}O. En 50 casos de CCR y en las muestras
control, se aislaron las células control o tumorales
microdiseccionadas con un equipo "HighPure RNA Paraffin Kit"
(Roche Diagnostics GmgH, Mannheim, Alemania) de acuerdo con el
protocolo establecido. Este método también consiste en una fase de
digestión de proteinasa K, una purificación de los ácidos
nucleicos, una fase de digestión de desoxiribonucleasa y una nueva
purificación del RNA. En experimientos preliminares se obtuvieron
resultados similares mediante los dos métodos a partir de tres
secciones seriadas de tejido de una mucosa normal y de una muestra
de tumor aislada (no se muestran los datos). El RNA se almacenó a
-70ºC hasta que se vuelta a utilizar.
La PCR cuantitativa con trascripción inversa en
el sistema LightCycler® se realizó mediante reactivos y equipos de
la Roche Applied Science de acuerdo con las instrucciones del
proveedor. En resumen, las muestras del RNA se distribuyeron en 4
alícuotas iguales, y todas recibieron la misma mezcla de reactivos
del cDNA y también de la TF, la DPD, la TS o cebadores de
referencia específicos de gen (Números de catálogo 3 302 946, 3 302
938, 3 302 954). En esta fase se incluyó un control positivo del RNA
(calibrador, de los equipos de cuantificación del mRNA con el
sistema LC para la TF, la DPD y la TS). Un calibrador del RNA junto
con 4 muestras desconocidas siempre se ha tomado como un conjunto
individual para controlar la calidad y la capacidad de reproducción.
En un mismo ensayo de la PCR cuantitativa siempre se han analizado
simultáneamente los conjuntos de 3 cDNA utilizando el equipo de
cuantificación del mRNA con el sistema LC para la TF, la DPD y la
TS. Para el análisis de datos se empleó el programa informático
Relative Quantification Software (Roche Diagnostics GmbH,
Mannheim, Alemania). Dicho programa calcula el cociente relativo de
los Cp(enzima : gen de referencia)_{muestra} entre
los Cp(enzima : gen de referencia)_{calibrador}, de
ese modo se controlan ambos para la carga de la muestra (datos del
RNA) y el rendimiento de la PCR respecto al punto constante de
referencia (calibrador). Para asegurar una cuantificación exacta,
únicamente se incluyeron los datos sobre las preparaciones del RNA
que incluían de 20 a un máximo de 33 puntos de cruce de la curva
(intervalo de amplificación lineal). La varianza de la expresión
del mRNA de la TF, la DPD, la TS y del gen de referencia (media
\pm desviación estándar) fue mínima, con 26,62 \pm 0,36, 28
\pm 0,51, 22 \pm 0,23 y 23,19 \pm 0,7 para 29 calibradores
respectivamente (contando con 29 x 4 = 116 muestras de tejido).
Los parámetros cuantitativos se describieron
empleando la media o la mediana con la desviación estándar y los
intervalos respectivamente. Los parámetros cualitativos se
examinaron mediante tablas de frecuencia. Se llevaron a cabo
pruebas no paramétricas (con la aplicación informática SAS®; versión
8.02) dado que se observó una desviación de la distribución normal
para todos los marcadores.
En el grupo de los 102 casos, tanto la expresión
de la TF, la DPD y la TS, como el cociente de la TS/DPD y la TF/DPD
estaban correlacionadas con 1) la edad y el sexo de los pacientes, y
2) la localización del tumor primario, la clasificación TNM, el
estadio según la UICC y el grado de diferenciación. Esto se realizó
mediante el coeficiente de correlación de Spearman y la prueba de
correlación nula. Para comparar subgrupos individuales, se empleó
el test de Wilcoxon para las muestras independientes y la prueba de
Kruskal-Wallis. Se dividieron los 102 casos en los
grupos No-CTX (n=40) y CTX (n=52) para evaluar el
impacto del pronóstico y/o el valor de predicción de respuesta de
las tres enzimas. Se excluyeron los pacientes que recibieron una
terapia combinada de radioterapia y quimioterapia (n=10). Dentro de
los dos subgrupos se llevó a cabo un análisis estadístico por
separado para observar la correlación de la expresión del mRNA de la
TF, la DPD y la TS y el cociente de la TS/DPD y la TF/DPD con: la
incidencia de la enfermedad recurrente, la incidencia de mortalidad,
así como la supervivencia libre de enfermedad o total. Los análisis
de supervivencia se obtuvieron mediante una regresión de Cox y una
prueba de log-rank (prueba de rango logarítmico),
estableciendo el nivel de significación al 5%.
Inicialmente, los niveles de expresión del mRNA
de la TF, la DPD y la TS se examinaron a través de series de
muestras control microdiseccionadas y FEPP mediante una
RT-PCR cuantitativa y utilizando el sistema
LightCycler®. Como se observa en la figura 1, en todas las muestras
se detectó la expresión del mRNA para la TF, la DPD y la TS, pero
los niveles de expresión del mRNA eran diferentes entre los tejidos:
Se pudo apreciar una expresión elevada del mRNA de la TF en las
lesiones reactivas de colitis crónica, acompañada de unos niveles
moderados en la mucosa del colon sano (células epiteliales) y en un
hígado sano (población de células mixtas) e incluso una baja
expresión en la muscularis propia de un colon sano (células
musculares). La expresión del mRNA de la DPD es mayor en un hígado
sano, acompañada de una muscularis propia normal mayor que las
lesiones reactivas de la colitis crónica y mayor o igual que la
mucosa normal. La TS se expresó de una manera muy pronunciada en la
mucosa normal más que en las lesiones reactivas de colitis crónica y
más que en la muscularis propia y el hígado sano.
En comparación, la media de los niveles de
expresión de la TF, la DPD y la TS de las muestras de tumor de
colon (n=102, véase más arriba) reveló una baja expresión del mRNA
de la DPD en las muestras de tumores cuando se comparaban con las
células epiteliales de la mucosa normal. Por el contrario, no se
detectó una diferencia importante en los niveles del mRNA de la TF
y la TS entre la mucosa normal y los tejidos tumorales.
El grupo de pacientes examinado incluye 102
casos de CCR en distintas fases (Tabla 1, Materiales y Métodos), a
los que solamente se les ha practicado una resección (40 casos en el
grupo No-CTX), o una resección y la posterior
quimioterapia con 5-FU (52 casos en el grupo CTX) o
con una resección y una combinación de radioterapia y quimioterapia
(10 casos).
Los análisis de la expresión del mRNA de la TF,
la DPD y la TS en todos los 102 casos de CCR mostraron una amplia
variedad en los niveles de expresión de las enzimas (Figura 2).
Expresados como cociente relativo, los intervalos para la TF, la
DPD y la TS eran 1,52-166,29,
0-24,39 y 0,21-3,71,
respectivamente. Tras la división de los casos en grupos de
No-CTX y CTX, la expresión del mRNA de la TF, la DPD
y la TS era similar en ambos grupos, excepto en el caso en que se
presenta una disminución en la expresión del mRNA de la TF en el
grupo CTX. Esto se ve reflejado mediante una mediana estadística de
los niveles de expresión del mRNA de la TF, la DPD y la TS
(Figura 2).
(Figura 2).
Como se recoge en la Tabla 2A, no se reveló una
correlación importante estadísticamente entre los niveles del mRNA
de la TF, la DPD y la TS o los cocientes de la TS/DPD y la TF/DPD
con la edad o el sexo del paciente y la situación del tumor
primario (colon o recto).
No obstante, sí se apreciaron diferencias
significativas respecto a 1) la expresión del mRNA de la TF con la
clasificación T (p=0,03) y N (p=0,04) del tumor y el estadio según
la UICC (p=0,009); 2) la expresión del mRNA de la TS con el grado
de diferenciación (p=0,001); 3) el cociente de la TS/DPD con la
clasificación T del tumor (p=0,014) y el grado de diferenciación
(p=0,033); y 4) el cociente de la TF/DPD con la clasificación T
(p=0,007) y N (p=0,001) del tumor y el estadio de la UICC (p=0,001).
Como se muestra en la figura 3, la expresión del mRNA de la TF y el
cociente de la TF/DPD descienden de forma considerable en las
clasificaciones del tumor T y N avanzadas así como también lo hace
en los estadios avanzados según la UICC. La expresión del mRNA de
la TS era notablemente más baja en el grado 3 de diferenciación de
los tumores que en el grado 2. Finalmente, el cociente de la TS/DPD
era más bajo en los tumores con una clasificación T avanzada, así
como también en el grado 3 de diferenciación de los tumores más que
en el grado 2.
Para correlacionar la expresión del mRNA de la
TF, la DPD y la TS con pronósticos, se excluyeron los pacientes que
recibieron un tratamiento adyuvante de quimioterapia y radioterapia
(n=10) de los análisis estadísticos. Además, como los pacientes que
tienen afectados los nódulos linfáticos (N+) en general tienen peor
pronóstico que aquellos a los que clasificamos como N0 [1], los 92
pacientes restantes se dividieron en aquellos que no han recibido
una terapia adyuvante (n=40; No CTX) y aquellos que recibieron un
tratamiento adyuvante de quimioterapia (n=52; CTX), como se muestra
en la figura 4A. Por lo tanto, el análisis estadístico se realizó
de forma independiente dentro de los dos grupos respecto a la
incidencia de una enfermedad recurrente y la muerte, así como de la
supervivencia total o libre de enfermedad. En primer lugar, no se ha
revelado ninguna correlación importante entre la expresión del mRNA
de la TF, o la DPD, o la TS o los cocientes de la TS/DPD y la
TF/DPD, y la incidencia de una enfermedad recurrente o la muerte
(Tabla 2B).
En segundo lugar, ninguna de las enzimas o el
cociente de la TF/DPD tuvieron gran influencia en el total de
supervivientes (Análisis de Kaplan-Meier). En tercer
lugar, el análisis multivariante de la expresión del mRNA de la TF,
la DPD y la TS y la supervivencia total no revelaron ninguna
correlación importante, aunque en el grupo CTX sí que se
correlacionaron considerablemente la expresión del mRNA de la TF y
la DPD (p<0,0001). Estos datos fueron reales tanto en el grupo
No-CTX como en el CTX (Tabla 2).
Por el contrario, dentro del grupo
No-CTX la supervivencia total sí que se relaciona de
una manera significativa con el cociente de la TS/DPD, a través del
cual el riesgo de muerte aumenta cuanto más grande son los cocientes
de la TS/DPD.
Para evaluar si los niveles del mRNA de la TF,
la DPD y la TS o el cociente de la TF/DPD o la TS/DPD pueden
predecir la respuesta clínica a la quimioterapia con
5-FU, se realizó un análisis estadístico detallado
para los pacientes que pertenecen al grupo CTX. Tras la subdivisión
de los pacientes del grupo CTX en aquellos con bajos y altos
niveles del mRNA de la TF, la DPD y la TS (valor de corte=mediana,
como se indica en la figura 2) y los análisis de Kaplan Meier
posteriores, no se encontró ninguna correlación respecto a la
supervivencia total (Figura 4B). Asimismo, ni los bajos ni los
altos cocientes de la TF/DPD o la TS/DPD predijeron la supervivencia
total en ninguno de los 2 subgrupos de CTX (no se muestra).
No obstante, sí que se observaron significantes
correlaciones en los niveles de mRNA de la DPD y en el cociente de
la TF/DPD respecto a la supervivencia libre de enfermedad (figura
4C). Por lo tanto, utilizando un valor de corte de 8,2 para el
mRNA, se correlacionó una baja expresión del mRNA de la DPD con la
supervivencia libre de enfermedad con p=0,05.
Además, también se registró una correlación
positiva entre la supervivencia indemne y el cociente de la TF/DPD.
Como se muestra en la figura 5, utilizando unos valores de corte de
3,7 (figura 5b); 5,0 (figura 5c); 6,2 (figura 5d); y 8,1 (figura
5d), un cociente elevado de la TF/DPD se correlacionaba
considerablemente con la supervivencia libre de enfermedad con
p=0,002.
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Claims (6)
1. Un método para determinar si el
paciente que padece un cáncer colorrectal es susceptible al
tratamiento con 5-Fluorouracilo y/o análogos del
5-Fluorouracilo que consta de los siguientes
pasos:
a) determinación de la
expresión del mRNA de la timidina fosforilasa en una muestra
clínica
b) determinación de la
expresión del mRNA de la dihidripirimidina deshidrogenasa en dicha
muestra clínica
c) determinación del cociente
del valor obtenido en el paso a) y el valor obtenido en el paso
b)
d) determinación de si el
cociente obtenido en el paso c) excede un determinado valor de
corte.
2. Un método de acuerdo con la
reivindicación 1, donde dicho valor de corte es al menos 3 y
preferiblemente al menos 3,7.
3. Un método de acuerdo con la
reivindicación 2, donde dicho valor de corte no sea mayor que 10 y
preferiblemente no sea mayor que 8,2.
4. Un método de acuerdo con las
reivindicaciones de la 1 a la 3, que además se caracteriza en
que un nivel de expresión del mRNA absoluto o relativo de la
dihidropirimidina deshidrogenasa y un valor de expresión por debajo
de un cierto valor de corte es adicionalmente indicativo de
susceptibilidad al 5-Fluorouracilo y/o análogos del
5-Fluorouracilo.
5. Un método de acuerdo con las
reivindicaciones de la 1 a la 4, caracterizado por un nivel
de expresión del mRNA de la timidina fosforilasa y/o la
dihidropirimidina deshidrogenasa, que se determina mediante la PRC
con trascripción inversa.
6. Un método de acuerdo con la
reivindicación 5, caracterizado en que una secuencia
específica de cebador de timidina fosforilasa y/o una secuencia
específica de cebador de dihidropirimidina deshidrogenasa que se
elonga durante el paso de la síntesis del cDNA.
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