DE60118759T2

DE60118759T2 - Zusammensetzung zum verbesserten zellenschutz welche ein lipophiles antioxidans sowie ein hydrophilen antioxidans enthält

Info

Publication number: DE60118759T2
Application number: DE60118759T
Authority: DE
Inventors: Fabio Soldati
Original assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Current assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Priority date: 2000-05-25
Filing date: 2001-05-22
Publication date: 2006-09-14
Anticipated expiration: 2021-05-23
Also published as: US6835401B2; WO2001089542A2; EP1317272B1; DK1317272T3; US6627231B2; PT1317272E; ES2261416T3; JP2003534285A; CN1450905A; MXPA02011528A; JP4750340B2; US20040009248A1; DE60118759D1; ATE322904T1; EP1317272A2; CA2409688A1; US20020012715A1; WO2001089542A3

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Verbesserung des Zellschutzes, welches die Verabreichung der Kombination der Extrakte der Pflanzen Vitis vinifera und Lycopersicum esculentum mit den Vitaminen C, E, β-Carotin und Selen verwendet, sowie die Verwendung einer solchen Kombination zur Behandlung oder Verhütung pathologischer Zustände, die mit der Überproduktion von freien Radikalen verbunden sind, wie Altern, Arteriosklerose oder Krebs.
BESCHREIBUNG DES STANDES DER TECHNIK
Antioxidantien wirken so, dass sie Komponenten des Körpers vor einem Schaden durch freie Radikale schützen [Harman D.; Holliday R. und M. Meydany – Herausgeber, "Towards Prolongation of healthy life span", Annals of the New York Academy of Sciences, Bd. 854, 1998, New York; Stählin H. B., "The Impact of Antioxidants on Chronic Disease in Ageing and Old Age", Int. J. Vitamin. Nutr. Res. 69, 146–149, 1999].
Mehrere epidemiologische Studien stützen die Beobachtung, dass eine Erhöhung der Antioxidans-Einnahme die klinische Äußerung von Koronorarterienerkrankungen und einigen Tumoren beschränkt [Comstock GW; Alberg AJ; Huang HY; Wu K; Burke AE; Hoffman SC; Norkus EP; Gross M; Cutler RG; Morris JS; Spate VL; Helzlsouer KJ, "The risk of developing lung cancer associated with antioxidants in the blood: ascorbic acid, carotenoids, alpha-tocopherol, selenium, and total peroxyl radical absorbing capacity", Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 6, 907–916, 1997]. Personen mit hohen Nahrungseinnahmen von Antioxidantien können eine größere Lebenserwartung haben. Individuelle Bedingungen, Umgebungsstress und oxidativer Stress, der durch Umgebungs- und Ernährungsfaktoren ausgelöst wird, üben ihren Einfluss auf eine große Vielfalt von Individuen mit unterschiedlichen Abwehrfähigkeiten aus.
Allgemein ausgedrückt, werden Individuen mit einem sehr gut ausgeglichenen Abwehrmechanismus frei von chronischer Krankheit sein, werden aber schließlich den Gesamt-Alterungsprozessen unterliegen. Viel wahrscheinlicher ist dies jedoch der Fall, wenn kritische Systeme unzureichend geschützt sind und verletzt werden. Die Folge dieses Prozesses wird klinisch als chronische Krankheit diagnostiziert.
Antioxidantien sind wichtige Elemente in der Abwehr des Körpers gegen oxidativen Stress und weisen so eine allgemeine Antialterungseigenschaft sowie eine spezielle Schutzfunktion vor Krankheit auf. Da die Folgen von chronischer Krankheit unter den führenden Ursachen eines Gebrechens im Alter sind, weist eine primäre Prävention durch eine ausreichende antioxidative Abwehr nicht nur eine "Anti-Aging"-Funktion, sondern, was bedeutender ist, eine spezielle, chronische Krankheit verhütende Funktion auf. Jedoch wird es klar, dass dies ein lebenslanger wichtiger Schutzmechanismus ist: Die primäre Prävention von mit Alter in Beziehung stehenden chronischen Krankheiten muss früh im Leben beginnen und muss während der ganzen Lebenszeit fortgesetzt werden.
Die Beziehung zwischen Antioxidantien und chronischer Krankheit ist wahrscheinlich am besten bei der kardiovaskulären Erkrankung untersucht. Es wurde eine starke reziproke Beziehung zwischen der Plasma-Antioxidanskonzentration, der Morbidität und der Sterblichkeit durch Koronar-Herzkrankheit demonstriert. Die Analysen der Daten ermöglichten es, den Beitrag der verschiedenen antioxidativen Vitamine zu quantifizieren. Gemäß diesen Ergebnissen ist eine ausreichende Einnahme von Vitamin E am wichtigsten, gefolgt von der Vitamin C- und Carotin-Einnahme.
Bei der Analyse einer Population mit einem insgesamt sehr guten Vitamin E-Status wurde eine starke Wirkung von Vitamin C und beta-Carotin beobachtet. Es ist ziemlich gut bekannt, dass andere Antioxidantien ohne Vitamin-Funktionen, die aus Nahrung abstammen, wie Flavonoide, Polyphenole oder Lycopin, sehr wichtige antioxidative Funktionen aufweisen [Fuhrman B.; Ben-Yaish L.; Attias J.; Hayek T.; Avaram M., "Tomato lycopene and beta-carotene inhibit low-density lipoprotein oxidation and this effect depends on the lipoprotein vitamin E content", Nutr. Metab. Cardiovasc. Dis. 7, 433–443, 1997; Pastori M.; Pfander H.; Boscoboinik D.; Azzi A., "Lycopene in association with alpha-tocopherol inhibits at physiological concentrations proliferation of prostate carcinoma cells", Biochem. Biophys. Res. Commun. 250 (3), 582–585, 1998; Boehm F.; Edge R.; McGarvey D. J.; Truscott D. G., "Beta-carotene with vitamins E und C offers synergistic cell protection against Nox", FEBS Lett. 436, 387–389, 1998; Watkins T. R. – Herausgeber, "Wine, Nutritional and Therapeutic Benefits", American Chemical Society Symposium Series 661, 1997, Washington DC].
Im späten Erwachsenenstadium und frühen Alter ist Krebs die führende Ursache von vorzeitigem Tod. Es ist keine Frage, dass eine große Mehrzahl von Krebsen das Ergebnis von Umgebungsfaktoren ist, welche die spezifische genetische Ausstattung von Gewebe mit hohem Risiko für proliferative Störungen angreifen. Epidemiologische Beweise demonstrieren klar, dass eine geringe Einnahme von Früchten und Gemüse und niedrige Plasmakonzentrationen von antioxidativen Vitaminen mit einer signifikant erhöhten Krebsmorbidität und -sterblichkeit korrelierten. Dies trifft für gastrointestinalen Krebs und Lungenkrebs, aber auch für Prostatakrebs und für Brustkrebs zu.
Der neoplastische Prozess ist eine hoch komplexe Reihenfolge von Ereignissen. Viele potentiell gefährliche Mutationen finden kontinuierlich statt. Wenn diese genetischen Änderungen der anfänglichen Abwehr und den Reparaturmechanismen entkommen sind, müssen die veränderten Zellen durch andere Abwehrmechanismen eliminiert werden. Ein wichtiger Mechanismus ist der apoptotische Prozess. Es kann sein, dass festgelegte Zellen im proliferativen Stadium durch Antioxidantien vor den körpereigenen Immun- und apoptotischen Abwehrmechanismen geschützt werden. Dies könnte erklären, warum Antioxidantien in höherer Konzentration in Brustkrebsgewebe vorkommen. Es gibt keinen Zweifel, dass eine lebenslange Einnahme einer Ernährung, die reich an Früchten und Gemüse ist und eine Vielfalt von Antioxidantien enthält, das Risiko von malignen Störungen im späteren Leben wesentlich und signifikant erniedrigt.
Primäre degenerative Gehirnerkrankung und Krankheiten, die mit zerebralen vaskulären Störungen in Beziehung stehen, sind die führende Ursache einer Behinderung im Alter. Der Verlust an Autonomie, die Abhängigkeit und hohen sozialen Kosten für die Individuen und die Gesellschaft sind die Folgen einer Gehirn-Dysfunktion. Die beeindruckende Zunahme der individuellen Lebenserwartung wird durch den Verlust an mentaler Funktion im Alter überschattet. Daher haben sich die Verhütung und Behandlung von Störungen, die zu mentaler Beeinträchtigung führen, als Hauptherausforderung des modernen Gesundheitswesens entwickelt. Wie in den vorangehenden Beispielen wird eine Kombination von mit Alter in Beziehung stehenden funktionellen Änderungen beobachtet, die von Störungen des Blutkreisaufes oder gewisser neuronaler Systeme überlagert werden, was zu spezifischen chronischen Krankheiten führt.
Im Hinblick auf die Bedeutung von Antioxidantien bei der Aufrechterhaltung der Zellintegrität und Zellfunktion können Antioxidantien (Vitamin E, Carotine, Vitamin C) und andere Mikronährstoffe aus der Nahrung, z.B. Polyphenole, Flavonoide, Lycopin, das Risiko von vaskulärer Krankheit verringern, die Neuronen vor oxidativem Stress schützen und so die neuronale Funktion aufrechterhalten. Mehrere epidemiologische Studien bei älteren Menschen haben eine Korrelation zwischen Antioxidantien und kognitiver Leistung aufgezeigt.
Andere epidemiologische Daten haben gezeigt, dass Rotwein die Sterblichkeitsrate aufgrund von Herzkrankheiten verringern kann, das sogenannte "französische Paradoxon". Eine Analyse, die bei 34.014 Männern zwischen 1978 und 1983 in Ostfrankreich durchgeführt worden ist, hat gezeigt, dass eine mäßige Einnahme von Wein (2–5 Gläser Wein) mit einer 24–31%-igen Verringerung der Sterblichkeit jeder Ursache verbunden war [Renaud S. C. et al., "Alcohol and Mortality in Middle-Aged Men from Eastern France", Epidemiology 9, 184–188, 1998].
Obwohl viele Studien mit einzelnen Antioxidans-Verbindungen durchgeführt worden sind, sind die pharmakologischen Auswirkungen der Verabreichung der Kombination von Antioxidans-Substanzen natürlichen Ursprungs, wie Pflanzenextrakten von Vitis vinifera (Weintraube), von Lycopersicum esculentum (Tomate), mit den Vitaminen C, E, beta-Carotin und Selen niemals untersucht worden.
Die israelische Patentanmeldung IL 121112 (19.6.1997) beschreibt eine synergistische Mischung, die Lycopin und Vitamin E enthält, und deren Verwendung bei der Verhütung der LDL-Oxidation. Der Anmelder veröffentlichte die Ergebnisse auch in einer wissenschaftlichen Veröffentlichung, in der er beschreibt, dass der LDL-Schutz durch Lycopin den Schutz durch beta-Carotin übertrifft. Jedoch war diese Auswirkung nur für LDLs mit hohem Vitamin E-Gehalt selektiv und wurde potenziert, wenn die Carotinoide in Kombination mit Vitamin E vorlagen [Fuhrmann B.; Ben-Yaish L.; Attias J.; Hayek T.; Avaram M., oben].
Die WO 99/48386 offenbart eine Nahrungsergänzung, die einen Extrakt von roten Weinreben, Vitamin E (D-alpha-Tocopherol) enthält. Darüber hinaus kann sie beta-Carotin, Ascorbinsäure und/oder Lycopin enthalten. Es wird angenommen, dass eine derartige Nahrungsergänzung vorteilhafte Wirkungen gegen verschiedene Krankheiten, einschließlich der Stimulation des Immunsystems zur Verhütung von Krebs, aufweist.
Die EP 0 712 630 lehrt eine orale Zusammensetzung für die Verhütung von Sonnenallergien, die ein Carotinoid, Vitamin E, Ascorbinsäure und Selen enthält. Zusätzlich ist Lycopin offenbart.
Die FR 2 792 831 offenbart eine kosmetische Zusammensetzung, die Lycopin und Olivenblätterextrakt umfasst. Darüber hinaus wird der Zusatz von Extrakt von roten Weinreben vorgeschlagen.
Die FR 2 799 345 schlägt eine Nahrungsergänzung vor, die 3 Antioxidantien enthält, Lycopin, Vitamin C und Vitamin E. Darüber hinaus schlägt sie zusätzliche Polyphenole vor, von denen angenommen wird, dass sie aus Extrakten von roten Weinreben abstammen.
Das US-Patent 5,648,377 (15.7.1997) betrifft die Kombination von Lycopin mit einem Extrakt von Vitis vinifera, wobei es zeigt, dass die Kombination eine synergistische Antioxidans-Wirkung ausübt.
Fuhrmann B. et al., Antioxidants and Redox Signaling, Bd. 2, Nr. 3, 2000, S. 491–506, lehren, dass Lycopin synergistisch mit Vitamin E und anderen Naturprodukten die LDL-Oxidation hemmt.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Der Gegenstand dieser Erfindung ist die überraschende Entdeckung, dass die Verabreichung der Kombination der Extrakte der Pflanzen Vitis vinifera und Lycopersicum esculentum in Kombination mit Vitamin C, Vitamin E, β-Carotin und gegebenenfalls Selen auf synergistische Weise signifikant den Zellschutz erhöht. Die aus den beschriebenen experimentellen Tests erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass die Verbesserung des Zellschutzes mit der Kombination der erwähnten Substanzen statistisch größer ist als die Kombination eines Extraktes von Vitis vinifera mit Lycopin (US-Patent 5,648,377) oder die Kombination von Vitamin E mit Lycopin (Patentanmeldung IL 121112 ).
Die Erfindung betrifft deshalb ein verbessertes Verfahren zum Schutz der Zelle vor einer Krankheit, die von einer Überproduktion von freien Radikalen verursacht wird, wobei das Verfahren die Verabreichung einer schützenden oder therapeutisch wirksamen Menge einer Zusammensetzung umfasst, die synergistische Mengen eines lipophilen Antioxidans und eines hydrophilen Antioxidans und gegebenenfalls einen annehmbaren Trägers umfasst, wobei die Verbesserung darin liegt, dass das lipophile Antioxidans eine Mischung ist, die im Wesentlichen aus Vitamin E, beta-Carotin und einem Extrakt von Lycopersicum esculentum besteht, und das hydrophile Antioxidans eine Mischung ist, die im Wesentlichen aus Vitamin C und einem Extrakt von Vitis vinifera besteht.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Behandlung einer Person bereit, die an einer Krankheit leidet, welche durch eine Überproduktion von freien Radikalen verursacht wird, umfassend die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Behandlung einer Person bereit, die an einer Entzündung leidet.
In einem weiteren Aspekt ist das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung auf die Behandlung einer Person anwendbar, die an Atherosklerose leidet.
In noch einem weiteren Aspekt gemäß der Erfindung wird ein Verfahren zur Verhütung der mutagenen Aktivität, die von freien Radikalen induziert wird, in einer Person bereitgestellt.
In noch einem weiteren Aspekt ist das Verfahren der vorliegenden Erfindung für die Behandlung einer Person nützlich, die an einem Tumor leidet.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
In einer bevorzugten Ausführungsform schließt das Verfahren gemäß dieser Erfindung die Verabreichung von Vitamin E, beta-Carotin, einem Extrakt von Lycopersicum esculentum, Vitamin C, einem Extrakt von Vitis vinifera und einer Selen-Verbindung ein. Bevorzugte Selen-Verbindungen sind Natriumselenit oder Selenhefe.
Der Ausdruck "Extrakt von Lycopersicum esculentum", wie er vorstehend und nachstehend verwendet wird, umfasst eine verdünnte Lycopin-Zusammensetzung. Das Lycopin kann durch Extraktion aus Pflanzen, Algen, Pilzen oder genetisch modifizierten Organismen oder durch Synthese erhalten werden. Bevorzugt wird der Extrakt aus getrockneter Haut von Tomaten direkt verwendet.
Der Ausdruck "Extrakt von Vitis vinifera", wie vorstehend und nachstehend verwendet, schließt eine verdünnte Zusammensetzung von oligomeren Proanthocyanidinen ein. Bevorzugt wird der Extrakt aus den Kernen von roten Weinreben direkt verwendet.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren gemäß dieser Erfindung die Verabreichung von

(a) 5 bis 20 Teilen, bevorzugt 7,5 bis 15 Teilen Vitamin E, insbesondere Vitamin E-Acetat oder Vitamin E-Succinat;
(b) 1 bis 15 Teilen, bevorzugt 2 bis 10 Teilen beta-Carotin;
(c) 1 bis 4 Teilen, bevorzugt 1,5 bis 3 Teilen in Form eines Extraktes von Lycopersicum esculentum, erhalten aus getrockneter Haut von Tomaten;
(d) 2 bis 60 Teilen, bevorzugt 5 bis 50 Teilen Vitamin C, insbesondere dem Natriumsalz desselben; und
(e) 1 bis 30 Teilen, bevorzugt 1,1 bis 25 Teilen von Vitis vinifera-Extrakt, der insbesondere aus den Samen von roten Weinreben erhalten wird.

Bevorzugt werden das lipophile Antioxidans und das hydrophile Antioxidans in Anwesenheit eines pharmazeutisch annehmbaren Trägers verabreicht. Geeignete Träger sind beispielhaft in: Remington: the science and practice of pharmacy. 19. Aufl., Easton, Mack Publ., 1995, angeführt.
Die bevorzugtesten Träger sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus natürlichen Pflanzenölen, vollständig oder partiell hydrierten Pflanzenölen, insbesondere Sojabohnenöl, vollständig oder partiell hydriertem Sojabohnenöl, Rapssamenöl, Erdnussöl, Lecithinen, insbesondere Sojalecithin oder Eilecithin, Pflanzenphosphatiden, insbesondere Sojaphosphatid, und Naturwachsen, insbesondere Bienenwachs.
Die Zusammensetzungen können als Feststoffe oder Lösungen formuliert werden. Feste Formulierungen können für die Herstellung einer Lösung vor der Injektion vorliegen. Bevorzugt werden die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung in Form von Weich- oder Hartgelatinekapseln, Tabletten, beschichteten Tabletten, Suppositorien oder in transdermaler Form verabreicht. Die Dosierung wird gemäß Faktoren wie Körpergewicht und Gesundheitszustand des Patienten, Natur der zugrunde liegenden Krankheit, therapeutischem Fenster der zu verwendenden Verbindung, Löslichkeit und dergleichen eingestellt. Es liegt innerhalb der Kenntnis des Fachmanns, die Dosierung geeignet einzustellen.
Demgemäß ist ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung die Verwendung einer Zusammensetzung der Erfindung bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung einer Person, die an pathologischen Zuständen leidet, welche zumindest teilweise von einer Überproduktion von freien Radikalen verursacht werden, wie Alterung, Entzündung, Atherosklerose oder Krebs. Weiter ist ein Aspekt der Erfindung ein Verfahren zur Verhütung und/oder Behandlung von Entzündung, Atherosklerose oder Krebs, umfassend die Verabreichung einer wirksamen Menge einer pharmazeutischen Zusammensetzung der Erfindung an einen Patienten.
Das Ziel dieser Studie war es, zuerst die Schutzwirkung der Kombination der Extrakte von Vitis vinifera, Lycopersicum esculentum, von Vitamin C, Vitamin E und beta-Carotin in Ratten-Erythrozyten gegen UVB-induzierten Schaden und das Vorliegen einer kooperierenden Wechselwirkung zwischen ihren Komponenten und dann in Keratinozyten-Zelllinien die Fähigkeit von Selen zu evaluieren, die endogene enzymatische Antioxidans-Abwehr zu erhöhen.
Im Detail wurden die folgenden Untersuchungen durchgeführt:

a) die dosisabhängige Fähigkeit der Kombination des Extrakts von Vitis vinifera, des Extrakts von Lycopersicum esculentum, von Vitamin C, Vitamin E und beta-Carotin, anschließend in diesem Text als "Kombination der aktiven Bestandteile" bezeichnet, eine Hämolyse zu verhüten, die durch große UVB-Dosen (1,5–7,0 J/cm²) induziert wird;
b) die dosisabhängige Fähigkeit einer Mischung der lipophilen Antioxidantien (Lycopersicum esculentum-Extrakt, beta-Carotin + Vitamin E-Acetat), die Hämolyse und Lipidperoxidation in Membranen von roten Zellen zu hemmen;
c) die dosisabhängige Fähigkeit einer Mischung der hydrophilen Antioxidantien (Vitis vinifera-Extrakt und Vitamin C), die Hämolyse und Lipidperoxidation in Membranen von roten Zellen zu hemmen;
d) die Schutzauswirkung auf die Hämolyse und Lipidperoxidation in Membranen von roten Zellen durch die Vereinigung der erwähnten lipophilen und hydrophilen Antioxidantien;
e) die Fähigkeit von Selenhefe, Selen in einem zellulären System (Keratinozyten) freizusetzen: Induktion der Glutathionperoxidase (GSH-PX)-Aktivität und zelluläre Beständigkeit gegen oxidativen Stress, der durch physikalische (UVB) oder chemische (Cumolhydroperoxid) zytotoxische Mittel induziert wird.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1: zeigt die dosisabhängige Schutzauswirkung der Kombination der aktiven Bestandteile auf die UVB-induzierte Hämolyse (Beispiel 1)
2: zeigt die dosisabhängige Schutzauswirkung der lipophilen Komponenten der Kombination der aktiven Bestandteile auf die UVB-induzierte Hämolyse (Beispiel 2)
3: zeigt die dosisabhängige Schutzauswirkung der hydrophilen Komponenten der Kombination der aktiven Bestandteile auf die UVB-induzierte Hämolyse (Beispiel 2)
4: zeigt die UVB-induzierte Hämolyse: kooperierende Antioxidans-Wechselwirkung zwischen lipophilen und hydrophilen Komponenten der Kombination der aktiven Bestandteile (Beispiel 3)
5: zeigt die Schutzauswirkung der Kombination der aktiven Bestandteile auf die RBZ-Hämolyse, die durch 120-minütige Bestrahlung induziert wird (Beispiel 3)
6: zeigt die Auswirkung einer Selenhefe- und Natriumselenit-Ergänzung auf die Keratinozyten-Lebensfähigkeit (Beispiel 4)
7: zeigt die Auswirkung einer Selenhefe- und Natriumselenit-Ergänzung auf die Keratinozyten-Glutathionperoxidase-Aktivität (Beispiel 5)
8: zeigt die Auswirkung einer Selenhefe- und Natriumselenit-Ergänzung auf die Glutathionperoxidase-Aktivität in Keratinozyten, die UVB-Strahlung (50 mJ/cm²) ausgesetzt werden (Beispiel 5)
9: zeigt die Auswirkung einer Selenhefe- und Natriumselenit-Ergänzung auf den Cumolhydroperoxid (CuOOH)-induzierten Zelltod (Beispiel 6)
10: zeigt die Auswirkung einer Selenhefe- und Natriumselenit-Ergänzung auf den CuOOH-induzierten intrazellulären oxidativen Stress (DCF-Bildung)(Beispiel 7)
Die folgenden Abkürzungen werden in den 7 bis 10 verwendet:

Hefe (L) Selenhefe (3,95 μg/ml): 50 nM Se

Hefe (H) Selenhefe (39,5 μg/ml): 500 nM Se

Selenit (L) Na₂SeO₃ 50 nM

Selenit (H) Na₂SeO₃ 500 nM
Der Fachmann wird anerkennen; dass, obwohl spezielle Reagenzien und Reaktionsbedingungen in den folgenden Beispielen angegeben sind, Modifikationen vorgenommen werden können, die vom Bereich der Erfindung eingeschlossen sein sollen. Die folgenden Beispiele sollen deshalb die Erfindung weiter erläutern und sind nicht beschränkend.
BEISPIELE
MATERIALIEN UND METHODEN
Chemikalien
Die verwendeten organischen Lösungsmittel waren von analytischer Güte (Carlo Erba, Mailand, Italien). Die aktiven Bestandteile (Vitis vinifera-Extrakt, Lycopersicum esculentum-Extrakt, beta-Carotin, Lycopin, d,l-α-Tocopherolacetat, Ascorbinsäure, Selenhefe) wurden von Pharmaton SA, CH-6934 Bioggio, Schweiz, geliefert. Cumolhydroperoxid (CuOOH), Thiobarbitursäure (TBA), EDTA, Natriumselenit (Na₂SeO₃), Natriumazid (NaN₃), Natriumpyruvat, 2',7'-Dichlordihydrofluoresceindiacetat (DCFH-DA), DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), Phenolrot-freies DMEM, L-Glutamin, Penicillin-Streptomycin-Lösung wurden von Sigma (Trimital, Mailand, Italien) erworben; fötales Kälberserum und Phosphat-gepufferte Lösungen (PBS) von Hyclone (Belbio, Mailand, Italien); H₂O₂ (30%-ig Vol./Vol.) von Fluka (Trimital, Mailand, Italien); NADH, NADPH, GSH und GSH-Reduktase von Boehringer Mannheim Italien (Mailand, Italien).
Apparaturen
Die spektrophotometrischen und fluorimetrischen Studien wurden in einem Computer-unterstützten Perkin Elmer Lambda 16-Spektrophotometer und einem Computer-unterstützten Perkin Elmer LS50B-Lumineszenzspektrometer (Perkin Elmer, Monza, Italien) durchgeführt.
UVB-Bestrahlung von Erythrozyten (RBZ = rote Blutzellen)
Erythrozyten von männlichen Wistar-Ratten (Charles River, Calco, Italien), die isoliert und durch Waschen von weißen Blutzellen und Blutplättchen befreit wurden, wurden in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, pH 7,4 [125 mM NaCl und 10 mM Natriumphosphat-Puffer (PBS)] suspendiert, bei 4°C aufbewahrt und verwendet, bis sie 4 Tage alt waren. Für die Experimente wurde eine Aliquote der Erythrozyten-Suspension aus dem Vorrat entnommen, 5 min bei 1000 × g zentrifugiert, und 0,1 ml des Pellets wurden mit PBS auf 50 ml verdünnt, um eine 1%-ige Erythrozyten-Suspension (etwa 15 × 10⁷ Zellen/ml) zu erhalten. 50 ml-Aliquoten der RBZ-Suspension wurden in Pyrex-Glasschalen (14 cm Durchmesser) gegeben, die gegenüber Anregungslichtwellenlängen > 290 nm transparent waren, und über verschiedene Zeitspannen UVB-Strahlung ausgesetzt. Wenn die Inhibitoren zu der RBZ-Suspension gegeben wurden, wurde eine Vorinkubationszeitspanne von 30 min bei 37°C angewandt. Die UVB-Bestrahlung wurde mit einer parallelen Bank von zwei Philips TL20W/12-Fluoreszenzröhren (Sara s.r.l., Castellanza, Italien) durchgeführt, welche ein kontinuierliches Spektrum zwischen 280 und 320 nm mit einer Spitzenemission bei 312 nm emittierten. Die Fluenzrate an der Stelle der Zellenbestrahlung (25 cm von der UVB-Quelle entfernt) betrug 0,85 mW/cm², und die verwendeten UVB-Dosen lagen im Bereich von 1,5 bis 7,0 J/cm² (Belichtungszeit 30–150 min), wie mit einem Vilber Lourmat VLX-3W-Radiometer (UVB-Sonde, 312 nm) gemessen.
UVB-induzierte Hämolyse
Nach der Bestrahlung wurden 2 ml-Aliquoten der RBZ-Suspension 1:5 mit gepufferter Kochsalzlösung verdünnt, und die Hämolyse wurde durch Trübungsmessung bei 710 nm in 30-minütigen Zeitabständen über 180 min bestimmt. Die prozentuale Hämolyse wurde bestimmt, indem man als 100% Hämolyse den Extinktionswert einstellte, der in RBZ-Suspensionen bestimmt wurde, die 5 s bei 50% Leistung beschallt worden waren. Es wurden Mittelwerte von 5 Bestimmungen für die Berechnung verwendet.
Keratinozyten
Die NCTC 2544 Human-Keratinozyten-Zelllinie (Flow Laboratories, Irvine, UK) wurde bei 37°C in DMEM kultiviert, das mit 10% fötalem Kälberserum, 2 mM L-Glutamin und Antibiotika (100 E/ml Penicillin und 0,1 mg/ml Streptomycin) ergänzt war. Die Kulturen wurden bei 37°C in einer befeuchteten 5% CO₂-Atmosphäre gehalten. Für die Experimente wurden die Zellen in einer Dichte von 5 × 10⁴/cm² gesät und in 2 cm²-Kunststoff-Zellkulturschalen bis zu 80–90% Konfluenz kultiviert. Die Zelllebensfähigkeit wurde durch Tryptanblau-Ausschluss-Assay und durch Messen des LDH-Leckens bestimmt. Die Protein-Bestimmungen wurden mittels eines modifizierten Lowry-Verfahrens unter Verwendung von Rinder-Serumalbumin als Standard durchgeführt.
Glutathionperoxidase (GSH-PX)-Aktivität
Die gezüchteten Zellen wurden mit Natriumselenit (50, 500 nM) oder Selenhefe (3,95 oder 39,5 μg/ml, entsprechend 50 und 500 nM Se) behandelt und bis zu 90% Konfluenz inkubiert (48 h). Vor Bestrahlen wurden die Zell-Monolayers dreimal mit vorerwärmter PBS gewaschen und UVB (50 mJ/cm²) in Anwesenheit von PBS ausgesetzt. Nach der Bestrahlung wurde die PBS durch Serum-Phenolrot-freies DMEM (K-DMEM) ersetzt, und man inkubierte 24 h (Schein-Kontrollzellen wurden dem gleichen Verfahren ohne UV-Einwirkung unterzogen). Die Medien wurden verworfen, und die Zeilen wurden entfernt, indem man sie vorsichtig in 1 ml 50 mM Tris-HCl-Puffer hinein kratzte, und wurden durch Beschallung lysiert. Die Zellsuspensionen (0,1 ml-Aliquoten) wurden bezüglich der GPX-Aktivität analysiert, indem man die Abnahme der Extinktion bei 340 nm für die Geschwindigkeit des Verschwindens von NADPH in einem thermostatisierten (37°C) Spektrophotometer überwachte. Die GPX-Aktivität wurde unter Verwendung eines molaren Extinktionskoeffizienten von NADPH von 6,22 × 10³ cm^–1m^–1 berechnet und als mE/mg Protein ausgedrückt, worin 1 E Enzymaktivität als μMol verbrauchtes Substrat oder erzeugtes Produkt/min bei 37°C definiert ist.
CuOOH-induzierter oxidativer Stress
Der intrazelluläre oxidative Stress, der durch CuOOH induziert wird, und die Schutzwirkung durch Selenhefe wurden bestimmt, indem man die Zelllebensfähigkeit und den Peroxid-Gehalt unter Verwendung der oxidationsempfindlichen Fluoreszenzsonde DCF (Dichlorfluorescein) maß. Gezüchtete Zellen wurden mit Natriumselenit (50, 500 nM) oder Selenhefe (3,95 oder 39,5 μg/ml, was 50 und 500 nM Se entspricht) behandelt und bis zu 90% Konfluenz inkubiert (48 h). Vorratslösungen von DCFH-DA (Dichlordihydrofluoresceindiacetat)(3,34 mM) wurden in Ethanol hergestellt, mit Stickstoff gespült und in 500 μl-Aliquoten bei –20°C aufbewahrt. Zell-Monolayers wurden mit vorerwärmter PBS gewaschen und mit 10 μM DCFH-DA 30 Minuten bei 37°C in PBS inkubiert. Danach wurde das Medium verworfen, und die Zell-Monolayer wurde dreimal mit vorerwärmter PBS gewaschen, um nicht eingebautes DCFH-DA zu entfernen, und dann mit K-DMEM inkubiert, das 0,5 mM CuOOH enthielt. Schein-Kontrollzellen wurden dem gleichen Verfahren ohne CuOOH-Einwirkung unterzogen. Nach 24-stündiger Inkubation wurden die Medien verworfen, und die Zellen wurden entfernt, indem man sie vorsichtig in 3 ml PBS hinein kratzte. Die Zellsuspension wurde dann in thermostatisierte 1 ml-Fluoreszenzküvetten (25°C) überführt, die mit einem Magnetrührer ausgestattet waren, und die Zunahme der Fluoreszenzintensität der Sonde (λ_Anr 502 nm; λ_Em 520 nm; Bandbreiten 5 nm) wurde aufgezeichnet. Die Fluoreszenzintensitätswerte bei allen Beobachtungszeiten wurden mit dem Proteingehalt korreliert (Mittel ± S.A. von 6 Bestimmungen) und als prozentuale Zunahme der Fluoreszenz bezüglich Kontrollen (Schein-Kontrollzellen) ausgedrückt.
Statistische Analyse
Die Ergebnisse sind als Mittel ± S.A. von 5 unabhängigen Bestimmungen ausgedrückt. Die Daten wurden mittels Einweg-Varianzanalyse (ANOVA), gefolgt vom Tukey-Test, bezüglich statistischer Signifikanz unter Gruppen und durch den Student t-Test (zweiseitig) bezüglich ungepaarter Proben analysiert. Die Unterschiede wurden als signifikant angesehen, wenn p < 0,05. Die statistische Analyse wurde unter Verwendung des Prism-Softwarepakets (GraphPad Software Inc., San Diego CA, USA) durchgeführt.
Beispiel 1: ERYTHROZYTEN ALS ZELLMODELL
Schutzwirkung der Kombination der aktiven Bestandteile
Die Einwirkung von zunehmenden UVB-Dosen auf Ratten-RBZ ergibt die typische Hämolyse-Kurve, die in 1 dargestellt ist: Der hämolytische Prozess beginnt ab 50-minütiger Bestrahlung, was einer UVB-Dosis von etwa 3 J/cm² (8,5 ± 3,2%) entspricht, und erreicht das Plateau zwischen 90 (87,2 ± 6,3%) und 120 Minuten (98,7 ± 4,4%). Die Proben der Kombination der aktiven Bestandteile wurden durch Mischen mit PBS hergestellt und gevortext; die erhaltene homogene Suspension wurde weiter in PBS auf Endkonzentrationen im Bereich von 0,1–10 μg/ml verdünnt. Als unbestrahlte RBZ unter aeroben Bedingungen in Anwesenheit der Kombination der aktiven Bestandteile inkubiert wurden, wurde innerhalb 3 h keine signifikant Hämolyse beobachtet. Die Kombination der aktiven Bestandteile, die vor der Bestrahlung zu der RBZ-Suspension gegeben wurde, schützte die RBZ deutlich und dosisabhängig vor UVB-induzierter Hämolyse (1), mit einer minimalen wirksamen Konzentration von 0,1 μg/ml. Mit 5 μg/ml war der hämolytische Prozess um 30 min verzögert, und nach 120-minütiger Bestrahlung betrug der Prozentsatz an Hämolyse nur 34,5 ± 5,5%, und bei der höchsten Konzentration (10 μg/ml) wurde die RBZ-Integrität bis zu 150 min UVB-Bestrahlung (7 J/cm²) beibehalten. Der IC₅₀-Wert, bei 120 min berechnet, betrug 4 μg/ml.
Beispiel 2: Schutzwirkung der Kombination von lipophilen und hydrophilen Antioxidantien der Kombination
Für ein besseres Verständnis der Schutzwirkung der Kombination der aktiven Bestandteile bei der UVB-induzierte Hämolyse haben wir die Radikal-abfangende Fähigkeit einer Mischung von lipophilen (Vitamin E-Acetat + beta-Carotin + Extrakt von Lycopersicum esculentum) und hydrophilen Antioxidantien (Vitamin C + Extrakt von Vitis vinifera) untersucht.
Vorratslösungen von Vitamin E-Acetat, beta-Carotin und Extrakt von Lycopersicum esculentum wurden in THF unter N₂-Atmosphäre und Rotlicht hergestellt, um eine Autooxidation zu verhindern, und bis zu 1 Woche bei –20°C aufbewahrt. Die Stabilität jedes Antioxidans wurde täglich mittels UV-Spektroskopie überprüft. Um die gleichen Verhältnisse zwischen den in der Kombination der aktiven Bestandteile vorliegenden Antioxidantien beizubehalten, wurde eine gemischte Vorratslösung von 7,04 mg/ml Vitamin E-Acetat, 1,64 mg/ml beta-Carotin und von Extrakt von Lycopersicum esculentum, der 0,88 mg/ml Lycopin entsprach, durch Verdünnung mit THF hergestellt. Eine Verdünnungsreihe wurde hergestellt, um die gemischten lipophilen Antioxidans-Arbeitslösungen bei Endkonzentrationen von 1,2, 2,4, 4,8, 9,6 μg/ml RBZ-Suspension zu ergeben (gesamte lipophile Antioxidantien). In allen Experimenten betrug die THF-Konzentration immer 0,1% (Vol./Vol.).
Die gleiche Vorgehensweise wurde für hydrophile Antioxidantien verwendet: Eine gemischte Vorratslösung von Vitamin C (6,72 mg/ml) und Extrakt von Vitis vinifera (2,8 mg/ml) wurde in PBS hergestellt, und eine Verdünnungsreihe wurde hergestellt, um die gemischten hydrophilen Antioxidans-Arbeitslösungen bei 0,58, 1,16, 2,32, 4,64, 9,28 μg/ml RBZ-Suspension zu ergeben (gesamte hydrophile Antioxidantien).
Wie in den 2 und 3 gezeigt, sind sowohl die lipophile als auch die hydrophile Fraktion der Kombination der aktiven Bestandteile in der Lage, eine UVB-induzierte Hämolyse auf dosisabhängige Weise zu verhüten, obwohl mit unterschiedlicher Potenz. Die größere Aktivität der hydrophilen Mischung beruht hauptsächlich auf der Anwesenheit des Vitis vinifera-Extrakts, von dem in verschiedenen experimentellen Modellen in vitro gezeigt wurde, dass er ein potentes Ketten-zerstörendes Antioxidans ist (Maffei Facino R.; Carini M.; Aldini G.; Bombardelli E.; Morazzoni P.; Morelli. R.; Free radicals scavenging action and anti-enzyme activities of Procyanidines from Vitis vinifera – A mechanism for their capillary protective action; Arzneim. Forsch./Drug Res., 44, 592–601, 1994) und endogenes Vitamin E vor UVB-induziertem Verbrauch durch einen Recycling-Mechanismus (Wasserstoff-Übertragungsreaktion) rettet.
Beispiel 3: Kooperierende Antioxidans-Wechselwirkung zwischen lipophilen und hydrophilen Antioxidantien der Kombination
Die kooperierende Antioxidans-Wechselwirkung zwischen lipophilen und hydrophilen Antioxidantien der Kombination wurde unter Verwendung von Konzentrationen jeder gemischten Arbeitslösung untersucht, welche eine etwa 20–30%-ige Hemmung bei 120-minütiger Bestrahlung ergeben: 2,4 μg/ml der lipophilen (Vitamin E-Acetat 1,76 μg/ml, β-Carotin 0,41 μg/ml, Lycopin 0,22 μg/ml) und 0,58 μg/ml der hydropilen (Vitamin C 0,4 μg/ml, Extrakt von Vitis vinifera 0,18 μg/ml). Die Ergebnisse sind in den 4 und 5 gezeigt. Unter diesen Bedingungen war die Hämolyserate bei beiden Mischungen ähnlich, wobei die hydrophile etwas aktiver war als die lipophile (20%-ige gegenüber 14%-iger Hemmung bei 120 min). Als die Antioxidantien vereinigt wurden, war die Hämolyserate deutlich verlangsamt, und die Integrität der RBZ wurde bis zu 90 min aufrechterhalten. Bei 120 min lag die prozentuale Hemmung (55 ± 2,5%) bei jenseits der Summe der prozentualen Hemmungen (berechnet: 33,8%), die mit den einzelnen Antioxidans-Mischungen beobachtet wurden, was eine synergistische Wechselwirkung anzeigt. Die Schutzwirkung, die durch eine typische Kombination von hydrophilen/lipophilen Antioxidantien (Vitis vinifera-Extrakt + Lycopin) hervorgerufen wurde, unterschied sich nicht signifikant von jener, die mit der Kombination der hydrophilen Bestandteile beobachtet wurde (5); im Gegensatz dazu ergibt die Assoziation zwischen Vitamin E (1,76 μg/ml) und Lycopin (0,22 μg/ml) eine prozentuale Hemmung der Hämolyse, die signifikant niedriger ist als jene, die mit der Kombination der lipophilen Bestandteile erhalten wird (7,1% gegenüber 14%)(5).
Beispiel 4: Auswirkung der Selenhefe-Ergänzung auf das Zellwachstum und die Zelllebensfähigkeit
In kultivierten Keratinozyten hatte Natriumselenit oder Selen keine offensichtliche wachstumsstimulierende Aktivität. Die Lebensfähigkeit, bestimmt durch LDH-Lecken (6), war immer über 95% und bezüglich der Schein-Kontrollzellen bei 50 und 500 nM Se-Dosen nicht signifikant verschieden.
Beispiel 5: Auswirkung der Selenhefe-Ergänzung auf die GSH-PX-Aktivität
7 zeigt die Auswirkungen einer Selenhefe- oder Natriumselenit-Ergänzung (äquimolare Se-Dosen) in Kontrollzellen: Bei Natriumselenit wurde eine maximale Induktion der GSH-PX-Aktivität bei 50 nM gefunden (3,365-fache Zunahme gegenüber Kontrollen; 91,44 ± 10,37 gegenüber 28,31 ± 5,87 mE/mg Protein), und bei einer Konzentration von 500 nM wurde keine weitere Zunahme beobachtet. Selenhefe war als GSH-PX-Induktionsmittel bei der niedrigeren Konzentration weniger potent (2,44-fache Zunahme; 63,05 ± 5,51 mE/mg Protein), aber bei der Konzentration von 39,5 μg/ml (was 500 nM Se entspricht) war die Zunahme der enzymatischen Aktivität mit jener vergleichbar, die mit der äquimolaren Dosis von Natriumselenit erhalten wurde (90,11 ± 10,35 mE/mg Protein). Diese Ergebnisse demonstrieren klar, dass Selenhefe dosisabhängig Selen für eine Enzym-Aktivierung freisetzt.
GSH-PX-Aktivität wurde auch in Keratinozyten bestimmt, die UVB-Bestrahlung (50 mJ/cm²) ausgesetzt wurden, und das Ausmaß der Enzym-Induktion durch Selenhefe oder Natriumselenit wurde im Vergleich zu den Kontrollzellen signifikant erhöht (8), was demgemäß anzeigt, dass Selen auch unter einem Oxidationsmittel-Ungleichgewicht noch aktiv ist.
Beispiel 6: Auswirkung einer Selenhefe-Ergänzung auf den CuOOH-induzierten Zelltod
Cumolhydroperoxid ist ein starker Aktivator von Radikalreaktionen, und die Inkubation von Keratinozyten mit 500 μM CuOOH erzeugte 24 h nach der Einwirkung mehr als 80% Zelltod (9). In Selenhefe-ergänzten Zellen war der Zelltod deutlich und dosisabhängig eingeschränkt, wobei die Zelllebensfähigkeit 64 ± 1,3% bei der niedrigsten Dosis (3,95 μg/ml) und bei der höchsten Se-Dosis (39,5 μg/ml ≈ 500 nM Se) von Kontrollzellen nicht signifikant verschieden war (90 ± 1,2%). Der Schutz, der von 50 nM Natriumselenit bereitgestellt wurde, war etwas größer, da die Zelllebensfähigkeit nahezu vollständig erhalten blieb.
Beispiel 7: Auswirkung einer Selenhefe-Ergänzung auf intrazellulären CuOOH-induzierten oxidativen Stress
Der intrazelluläre oxidative Status wurde durch den empfindlichen fluorimetrischen DCF-Assay bestimmt. Der Assay beruht auf der Fähigkeit des unpolaren, nicht-fluoreszierenden DCFH-DA, durch die Zellmembran zu diffundieren und von zytosolischen Esterasen unter Bildung von polarem nicht-fluoreszierendem Dichlordihydrofluorescein (DCFH) deacetyliert zu werden. Das Letztgenannte wird innerhalb des Zytosols eingefangen, wo es durch Reaktion mit reaktiven Sauerstoff-Spezies, die von CuOOH erzeugt werden, Anlass zur Bildung des fluoreszierenden Derivats Dichlorfluorescein (DCF) gibt.
Die Inkubation von Keratinozyten mit 500 μM CuOOH hat eine signifikante Akkumulation von DCF zur Folge (maximal nach 24 h; mehr als 7-fache Zunahme), was die Ausbreitung eines oxidativen Bursts im Zytosol-Kompartiment bestätigt (10). Die Vorbehandlung der Zellen mit Selenhefe wirkt dem oxidativen Trauma entgegen, da eine 60%-ige Verringerung der DCF-Bildung bei der niedrigeren Dosis (3,95 μg/ml) und ein nahezu vollständiger Schutz bei 39,5 μg/ml (550 nM Se) beobachtet wurde. Natriumselenit verhütet die DCF-Bildung bereits bei der niedrigsten Dosis (50 nM) vollständig.
Diese Ergebnisse dieser Beispiele zeigen, dass es die Assoziation zwischen lipophilen und hydrophilen Antioxidantien, der Gegenstand der vorliegenden Erfindung, ist, welche einen optimalen Zellschutz gegen den oxidativen Angriff von UVB bereitstellt. Mit anderen Worten, es gibt eine synergistische Wechselwirkung unter Antioxidantien, welche das hohe Maß an Schutz erklärt, das mit der Kombination der aktiven Bestandteile erhalten wird.
Da freie Radikale und reaktive Sauerstoff-Spezies (ROS) sowohl in Lipid- als auch in wässrigen Zellkompartimenten erzeugt werden, ist ein Antioxidans-Abwehrsystem, wie in der Kombination der aktiven Bestandteile, dem Gegenstand der vorliegenden Erfindung, das sich sowohl in Lipid- als auch in wässriger Umgebung verteilen kann, für einen Zellschutz höchst geeignet.

Claims

Verwendung einer Zusammensetzung umfassend synergistische Mengen einen lipophilen Antioxidans und eines hydrophilen Antioxidans sowie einen Träger, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus natürlichen Pflanzenölen, vollständig oder teilweise hydrierten Pflanzenölen, Lecithinen, Pflanzen-phosphatiden und natürlichen Wachsen, wobei das lipophile Antioxidans eine Mischung ist, bestehend aus (a) 5 bis 20 Teilen Vitamin E; (b) 1 bis 15 Teilen β-Carotin; und (c) 1 bis 4 Teilen Lycopin in Form eines Extrakts von Lycopersicum esculentum, erhalten aus der getrockneten Haut von Tomaten; und das hydrophile Antioxidans eine Mischung ist, bestehend aus (d) 2 bis 60 Teilen Vitamin C; und (e) 1 bis 30 Teilen Vitis vinifera-Extrakt, erhalten aus Kernen von rotem Wein; für die Herstellung einer Zusammensetzung zum Schutz eines Individuums gegen Erleiden einer Krankheit oder Behandeln eines Individuums, das an einer Krankheit leidet, wobei die Krankheit durch Überproduktion von freien Radikalen verursacht wird und ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Altern, Entzündung, Arteriosklerose oder Krebs.
Verwendung nach Anspruch 1, worin die Zusammensetzung zusätzlich Selen enthält.
Verwendung nach Anspruch 1, worin das lipophile Antioxidans eine Mischung ist, bestehend aus (a) 7,5 bis 15 Teilen Vitamin E; (b) 2 bis 10 Teilen β-Carotin; und (c) 1,5 bis 3 Teilen Lycopin in Form eines Extrakts von Lycopersicum esculentum, erhalten aus der getrockneten Haut von Tomaten; und das hydrophile Antioxidans eine Mischung ist, bestehend aus (d) 5 bis 50 Teilen Vitamin C; und (e) 1,1 bis 25 Teilen Vitis vinifera-Extrakt, erhalten aus Kernen von rotem Wein.
Verwendung nach Anspruch 1, worin das lipophile Antioxidans Vitamin E-acetat oder Vitamin E-succinat umfasst.
Verwendung nach Anspruch 1, worin das hydrophile Antioxidans das Natriumsalz von Vitamin C umfasst.
Verwendung nach Anspruch 2, worin die Zusammensetzung Natriumselenit oder Selenhefe umfasst.
Verwendung nach Anspruch 1, worin der Träger ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Sojaöl, vollständig oder teilweise hydriertem Sojaöl, Rapsöl, Erdnussöl, Sojalecithin, Sojaphosphatid, Eilecithin und Bienenwachs.
Verwendung nach Anspruch 1, worin die Zusammensetzung in Form von Weich- oder Hartgelatinekapseln, Tabletten, beschichteten Tabletten, Suppositorien oder in transdermaler Form verabreicht wird.