ES2261416T3

ES2261416T3 - Metodo para mejorar la proteccion celular que comprende un antioxidante lipofilico y un antioxidante hidrofilico.

Info

Publication number: ES2261416T3
Application number: ES01936384T
Authority: ES
Inventors: Fabio Soldati
Original assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Current assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Priority date: 2000-05-25
Filing date: 2001-05-22
Publication date: 2006-11-16
Anticipated expiration: 2021-05-22
Also published as: US6835401B2; WO2001089542A2; EP1317272B1; DK1317272T3; US6627231B2; PT1317272E; DE60118759T2; JP2003534285A; CN1450905A; MXPA02011528A; JP4750340B2; US20040009248A1; DE60118759D1; ATE322904T1; EP1317272A2; CA2409688A1; US20020012715A1; WO2001089542A3

Abstract

El uso de una composición que comprende cantidades sinérgicas de un antioxidante lipofílico, un antioxidante hidrofílico y un transportador seleccionado del grupo que consiste en aceites naturales de plantas, aceites de plantas total o parcialmente hidrogenados, lecitinas, fosfátidos de plantas y ceras naturales, en los que dicho antioxidante lipofílico es una mezcla que consiste en (a) de 5 a 20 partes de vitamina E; (b) de 1 a 15 partes de beta-caroteno; y (c) de 1 a 4 partes de licopeno en forma de un extracto de Lycopersicum esculentum, obtenido de piel seca de tomates; y dicho antioxidante hidrofílico es una mezcla que consiste en (d) de 2 a 60 partes de vitamina C; y (e) de 1 a 30 partes de extracto de Vitis vinifera obtenido de semillas de la viña roja; para la preparación de una composición para proteger a un individuo de sufrir una enfermedad o tratar a un individuo que sufre una enfermedad, siendo dicha enfermedad causada por una sobreproducción de radicales libres y seleccionadade entre el grupo consistente en envejecimiento, inflamación, aterosclerosis o cáncer.

Description

Método para mejorar la protección celular que comprende un antioxidante lipofílico y un antioxidante hidrofílico.

Campo de la invención

La presente invención está relacionada con un método nuevo de mejora de la protección celular, que utiliza la administración de una combinación de extractos de las plantas Vitis vinifera y Lycopersicum esculentum con las vitaminas C, E, beta-caroteno y selenio, así como el uso de dicha combinación para el tratamiento o prevención de enfermedades relacionadas con una sobreproducción de radicales libres como el envejecimiento, la arteriosclerosis y el cáncer.

Descripción de los conocimientos previos

Los antioxidantes actúan para proteger los componentes del cuerpo del daño causado por los radicales libres [Harman D.; Holliday R. y M. Meydany - Editor, "Towards Prolongation of healthy life span", Annals of the New York Academy of Sciences, Vol. 854, 1998, New York; Stählin H.B., "The Impact of Antioxidants on Chronic Disease in Ageing and Old Age", Int. J. Vitamin. Nutr. Res. 69, 146-149, 1999].

Varios estudios epidemiológicos apoyan la observación de que un aumento en el consumo de antioxidantes reduce la expresión clínica de las enfermedades coronarias arteriales y de algunos tumores [Comstock GW; Alberg AJ; Huang HY, Wu K.; Burke AE; Hoffman SC; Norkus EP; Gross M.; Cutler RG; Morris JS; Spate VL; Helzsouer KJ, "The risk of developing lung cancer associated with antioxidants in the blood: ascorbic acid, carotenoids, alpha-tocopherol, selenium, and total peroxyl radical absorbing capacity", Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 6, 907-916, 1997]. Los individuos con un elevado consumo de antioxidantes en su dieta podrían tener una mayor esperanza de vida.

Las condiciones individuales, el estrés ambiental y el estrés oxidativo inducido por factores ambientales y nutricionales influyen en una gran variedad de individuos con diferentes capacidades de defensa.

En términos generales, los individuos con unos mecanismos de defensa muy bien equilibrados se mantendrán libres de enfermedades crónicas, pero al final sucumbirán a los procesos generales de envejecimiento. No obstante, es mucho más probable el caso en el que los sistemas críticos no están suficientemente protegidos y acaban dañándose. La secuencia de este proceso se diagnosticará clínicamente como una enfermedad crónica.

Los antioxidantes, como elementos importantes en la defensa del cuerpo contra el estrés oxidativo, tienen una propiedad general antienvejecimiento, así como una función específica como protectores de enfermedades. Ya que las consecuencias de las enfermedades crónicas están entre las causas principales de incapacidad en la vejez, la prevención primaria mediante una defensa antioxidativa adecuada tiene no solo una función "antienvejecimiento", sino de forma más importante, una función específica en la prevención de enfermedades crónicas. Sin embargo, queda claro que éste es un mecanismo protector importante a lo largo de la vida: la prevención primaria de las enfermedades crónicas relacionadas con la edad se debe iniciar de forma temprana y se debe continuar a lo largo de toda la vida.

En las enfermedades cardiovasculares es en donde probablemente se ha estudiado mejor la relación entre los antioxidantes y las enfermedades crónicas. Se ha demostrado que existe una marcada correlación inversa entre la concentración de antioxidantes en plasma, y la morbilidad y mortalidad por enfermedad cardiaca coronaria. Un análisis de los datos permitió cuantificar la contribución de las diferentes vitaminas antioxidantes. De acuerdo con estos resultados, el consumo suficiente de vitamina E es el más importante, seguido del consumo de vitamina C y caroteno.

En el análisis de una población con un estado general de vitamina E muy bueno, se observó un marcado efecto de la vitamina C y del beta-caroteno. Es bastante bien conocido que otros antioxidantes con origen en la alimentación, sin una función como vitamina, como los flavonoides, polifenoles, o el licopeno tienen funciones antioxidantes muy importantes [Fuhrman B.; Ben-Yaish L.; Attias J.; Hayek T.; Avaram M., "Tomato lycopene and beta-carotene inhibit low-density lipoprotein oxidation and this effect depends on the lipoprotein vitamin E content", Nutr Metab Cardiovasc Dis 7, 433-443, 1997; Pastori M.; Pfander H.; Boscoboinik D.; Azzi A., "Lycopene in association with alpha-tocopherol inhibits at physiological concentrations proliferation of prostate carcinoma cells", Biochem Biophys Res Commun 250 (3), 582-585, 1998; Boehm F.; Edge R.; McGarvey DJ; Truscott TG, "Beta-carotene with vitamins E and C offers synergistic cell protection against Nox", FEBS Lett 436, 387-389, 1998; Watkins T.R. - Editor, "Wine, Nutritional and Therapeutic Benefits", American Chemical Society Symposium Series 661, 1997, Washington DC].

En la edad adulta tardía y en la vejez temprana, el cáncer es la causa principal de muerte prematura. No hay duda de que una gran mayoría de tumores son el resultado de factores ambientales que desafían la dotación genética específica de un tejido con un elevado riesgo de trastorno proliferativo. Las evidencias epidemiológicas demuestran claramente que un bajo consumo de frutas y vegetales, y concentraciones bajas de vitaminas antioxidantes en plasma correlacionan con una morbilidad y mortalidad por cáncer significativamente mayor. Esto es cierto para los tumores gastrointestinales y el cáncer de pulmón, así como para el cáncer de próstata y de mama.

El proceso neoplásico es una secuencia de eventos altamente compleja. Continuamente aparecen muchas mutaciones potencialmente peligrosas. Una vez estos cambios genéticos han escapado de la defensa inicial y de los mecanismos de reparación, estas células alteradas deben ser eliminadas por otros mecanismos de defensa. Un mecanismo importante es el proceso apoptótico. Podría ser que las células situadas en la fase proliferativa estuvieran protegidas por los antioxidantes contra los mecanismos propios de defensa inmunes y apoptóticos. Esto podría explicar por qué los antioxidantes aparecen en elevadas concentraciones en tejidos con cáncer de mama. No hay duda de que un consumo de una dieta rica en frutas y vegetales y con una gran variedad de antioxidantes durante toda la vida disminuye sustancial y significativamente el riesgo de trastornos malignos durante la vejez.

Las enfermedades primarias degenerativas cerebrales y las enfermedades relacionadas con las alteraciones vasculares cerebrales son la causa principal de incapacidad en la vejez. Las consecuencias de las disfunciones cerebrales son la pérdida de la autonomía, la dependencia y unos costes sociales elevados para el individuo y para la sociedad. El notable aumento de la esperanza de vida de los individuos se ve ensombrecido por la pérdida de la función mental en la vejez. En consecuencia, la prevención y el tratamiento de los trastornos que dan lugar a disfunción mental emergen como el gran reto del sistema de cuidado de la salud moderno. Como en los ejemplos anteriores, se ha observado una combinación de cambios funcionales relacionados con la edad que junto a las enfermedades circulatorias o de ciertos sistemas neuronales que dan lugar a diferentes enfermedades crónicas.

Dada la importancia de los antioxidantes en el mantenimiento de la integridad y función celulares, los antioxidantes (vitamina E, carotenos, vitamina C) y otros micronutrientes de los alimentos, por ejemplo, polifenoles, flavonoides o licopeno, pueden disminuir el riesgo de enfermedad vascular, proteger las neuronas del estrés oxidativo y así mantener la función neuronal. Varios estudios epidemiológicos en ancianos han mostrado la correlación entre los antioxidantes y la actividad cognitiva.

Otros datos epidemiológicos han mostrado que el vino tinto puede reducir la tasa de mortalidad por enfermedad cardíaca, es la llamada "paradoja francesa". Un análisis realizado en 34014 hombres entre 1978 y 1983 en el este de Francia mostró que un consumo moderado de vino (2-5 vasos de vino) estaba asociado con una reducción del 24-31% en la mortalidad por todo tipo de causas [Renaud S.C. et al., "Alcohol and Mortality in Middle-Aged Men from Eastern France", Epidemiology 9, 184-188, 1998].

Aunque muchos estudios se han realizado con compuestos antioxidantes simples, nunca se han estudiado los efectos farmacológicos de la administración de una combinación de sustancias antioxidantes de origen natural como los extractos de las plantas Vitis vinifera (uva), de Lycopersicum esculentum (tomate) con las vitaminas C, E, beta-caroteno y selenio.

La Solicitud de Patente Israelí IL 121112 (19/06/1997) describe una mezcla sinérgica que contiene licopeno y vitamina E y su utilización en la prevención de la oxidación del LDL. El solicitante también publicó los resultados en un artículo científico describiendo que la protección del LDL por el licopeno superaba la protección por el \beta-caroteno. No obstante, este efecto era selectivo solamente para los LDL con un elevado contenido de vitamina E y estaba potenciado cuando los carotenoides se encontraban presentes en combinación con la vitamina E [Fuhrman B.; Ben- Yaish L.; Attias J.; Hayek T.; Avaram M., loc. cit.].

La patente WO 99/48386 describe un suplemento alimenticio que contiene un extracto de vino tinto y vitamina E (D-alfa-tocoferol). Además, podía contener beta caroteno, ácido ascórbico y/o licopeno. Se supone que dicho suplemento alimenticio tenía efectos beneficiosos contra diferentes enfermedades incluyendo la estimulación del sistema inmune para prevenir el cáncer.

La patente PE 0 712 630 muestra una composición oral para la prevención de alergias solares que contiene un carotenoide, vitamina E, ácido ascórbico y selenio. Además se describe el licopeno.

La patente FR 2 792 831 muestra una composición cosmética que contiene licopeno y un extracto de hojas de olivo. Además, se sugiere la adición de extracto de vino tinto.

La patente FR 2 799 345 sugiere un suplemento alimenticio que contiene los tres antioxidantes licopeno, vitamina C y vitamina E. Además, sugiere la adición de polifenoles, que se asume que se originan en los extractos de vino tinto.

La patente Estadounidense 5.648.377 (15/07/1997) se refiere a la combinación de licopeno con un extracto de Vitis vinifera y muestra que la combinación ejerce una acción antioxidante sinérgica.

El artículo de Fuhrmann B. et al., Antioxidants and Redox Signaling, Vol. 2, No. 3, 2000, pp 491-506 muestra que el licopeno inhibe sinérgicamente la oxidación del LDL con vitamina E y otros productos naturales.

Resumen de la invención

El objeto de esta invención es el sorprendente descubrimiento de que la administración de una combinación de los extractos de las plantas Vitis vinifera y Lycopersicum esculentum combinados con vitamina C, vitamina E, \beta-caroteno y, opcionalmente selenio, aumenta significativamente y de una forma sinérgica, la protección celular. Los resultados obtenidos en las pruebas experimentales descritas muestran que la mejora de la protección celular con la combinación de sustancias mencionada es estadísticamente mayor que la de la combinación de un extracto de Vitis vinifera con licopeno (Patente Estadounidense 5,648,377) o la combinación de vitamina E con licopeno (Solicitud de Patente IL 121112).

Asimismo, la invención se refiere a un método mejorado de protección de las células de las enfermedades causadas por una sobreproducción de radicales libres y dicho método comprende la administración de una cantidad protectora o terapéuticamente efectiva de una composición que contiene cantidades sinérgicas de un antioxidante lipofílico y un antioxidante hidrofílico, y opcionalmente un transportador adecuado, en la que la mejora es que dicho antioxidante lipofílico es una mezcla que consiste esencialmente en vitamina E, beta-caroteno y un extracto de Lycopersicum esculentum, y dicho antioxidante hidrofílico es una mezcla que consiste esencialmente en vitamina C y un extracto de Vitis vinifera.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para tratar a un individuo que sufre una enfermedad, que esté causada por una sobreproducción de radicales libres, mediante la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición de acuerdo con la presente invención.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para tratar a un individuo que sufre de una inflamación.

En otro aspecto, el método de acuerdo con la presente invención es aplicable al tratamiento de un individuo que sufre de aterosclerosis.

En un nuevo aspecto, se proporciona un método de acuerdo con la invención para la prevención de la actividad mutagénica inducida por los radicales libres en un individuo.

En un nuevo aspecto diferente, el método de la presente invención es útil para el tratamiento de individuos que sufren un tumor.

Descripción detallada de la invención

En una realización preferida, el método de acuerdo con esta invención incluye la administración de vitamina E, beta caroteno, un extracto de Lycopersicum esculentum, vitamina C, un extracto de Vitis vinifera y un compuesto con selenio. Los compuestos con selenio preferidos son el selenito sódico o la levadura de selenio.

El término "extracto de Lycopersicum esculentum",como se ha usado hasta aquí y de ahora en adelante, incluye una composición diluida de licopeno. Dicho licopeno puede obtenerse mediante su extracción de plantas, algas, hongos u organismos genéticamente modificados, o mediante síntesis. Preferiblemente, se utiliza directamente un extracto de piel de tomate seca.

El término "extracto de Vitis vinifera", como se ha usado hasta aquí y de ahora en adelante, incluye una composición diluida de oligómeros prociandólicos. Preferiblemente, se utiliza directamente un extracto de las semillas de la viña roja.

En otra realización preferida, el método de acuerdo con esta invención incluye la administración de

(a) de 5 a 20 partes, preferiblemente de 7,5 a 15 partes de vitamina E, en particular acetato de vitamina E o succinato de vitamina E;

(b) de 1 a 15 partes, preferiblemente de 2 a 10 partes de beta-caroteno;

(c) de 1 a 4 partes, preferiblemente de 1,5 a 3 partes de licopeno, en forma de un extracto de Lycopersicum esculentum obtenido de piel seca de tomates.

(d) de 2 a 60 partes, preferiblemente de 5 a 50 partes de vitamina C, en particular la sal sódica de la misma; y

(e) de 1 a 30 partes, preferiblemente de 1,1 a 25 partes de extracto de Vitis vinifera, en particular el obtenido de las semillas de la viña roja.

Preferiblemente, el antioxidante lipofílico y el antioxidante hidrofílico se administran en presencia de un transportador farmacológicamente aceptable. Los excipientes adecuados se ejemplifican en: Remington: La ciencia y la práctica de la farmacia. 19ª Ed. Easton: Mack Publ., 1995.

Los transportadores más preferibles se seleccionan de entre el grupo consistente en aceites de plantas naturales, aceites de plantas total o parcialmente hidrogenados, en particular aceite de soja, aceite de soja total o parcialmente hidrogenado, aceite de colza, aceite de cacahuete, lecitinas, en particular lecitina de soja o lecitina de huevo, fosfátidos de plantas, en particular fosfátido de soja, y ceras naturales, en particular la cera de abeja.

Las composiciones pueden formularse como sólidos o como soluciones. Las formulaciones sólidas pueden ser para la preparación de una solución inyectable. Preferiblemente, las composiciones farmacéuticas de la invención se administran en forma de cápsulas blandas o duras de gelatina, comprimidos, comprimidos recubiertos, supositorios o por la vía transdérmica. La dosificación se ajustará de acuerdo con factores como el peso corporal y el estado de salud del paciente, la naturaleza de la enfermedad subyacente, la ventana terapéutica del compuesto a administrarse, la solubilidad, y similares. Ajustar la dosis de forma adecuada forma parte del conocimiento del
experto.

De acuerdo con esto, otro aspecto de la presente invención es el uso de una composición de la invención para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de un individuo que sufre de condiciones patológicas causadas, al menos en parte, por una sobreproducción de radicales libres, como el envejecimiento, la inflamación, la aterosclerosis o el cáncer. Además, un aspecto de la invención es un método de prevención y/o tratamiento de la inflamación, la aterosclerosis o el cáncer, que comprende la administración de una cantidad efectiva de una composición farmacéutica de la invención a un paciente.

El objetivo de este estudio fue evaluar, en primer lugar en eritrocitos de rata, el efecto protector de la combinación de los extractos de Vitis vinifera, Lycopersicum esculentum, vitamina C, vitamina E y beta-caroteno contra el daño inducido por UVB y la existencia de una interacción cooperativa entre sus componentes, y posteriormente en líneas celulares de queratinocitos, la capacidad del selenio de aumentar las defensas antioxidantes enzimáticas
endógenas.

Detalladamente, se han llevado a cabo las siguientes investigaciones:

a) la capacidad de la combinación del extracto de Vitis vinifera, del extracto de Lycopersicum esculentum, vitamina C, vitamina E y beta-caroteno, a partir de este momento denominado en este texto la "combinación de los ingredientes activos", de prevenir la hemólisis inducida por grandes dosis de UVB de forma dependiente de la dosis (1,5-7,0 J/cm^{2});

b) la capacidad de una mezcla de los antioxidantes lipofílicos (extracto de Lycopersicum esculentum, beta-caroteno + acetato de vitamina E) de inhibir la hemólisis y la peroxidación lipídica en membranas de eritrocitos de forma dependiente de la dosis;

c) la capacidad de una mezcla de los antioxidantes hidrofílicos (extracto de Vitis vinifera y vitamina C) de inhibir la hemólisis y la peroxidación lipídica en membranas de eritrocitos de forma dependiente de la dosis;

d) el efecto protector frente a la hemólisis y la peroxidación lipídica en membranas de eritrocitos mediante la asociación de los mencionados antioxidantes lipofílicos e hidrofílicos;

e) la capacidad de la levadura de selenio de liberar selenio en un sistema celular (queratinocitos), de inducir la actividad de la glutatión peroxidasa (GSH-PX) y la resistencia celular al estrés oxidativo, inducido por agentes citotóxicos, físicos (UVB) o químicos (hidroperóxido de cumeno).

Breve descripción de las figuras

Figura 1: muestra el efecto protector dependiente de la dosis de la combinación de ingredientes activos sobre la hemólisis inducida por UVB (Ejemplo 1)

Figura 2: muestra el efecto protector dependiente de la dosis de los componentes lipofílicos de la combinación de ingredientes activos sobre la hemólisis inducida por UVB (Ejemplo 2)

Figura 3: muestra el efecto protector dependiente de la dosis de los componentes hidrofílicos de la combinación de ingredientes activos sobre la hemólisis inducida por UVB (Ejemplo 2)

Figura 4: muestra la hemólisis inducida por UVB: la interacción antioxidante cooperativa entre los componentes lipofílicos e hidrofílicos de la combinación de ingredientes activos (Ejemplo 3)

Figura 5: muestra el efecto protector de la combinación de ingredientes activos sobre la hemólisis de los eritrocitos inducida por una irradiación de 120 min (Ejemplo 3)

Figura 6: muestra el efecto de un suplemento de levadura de selenio y selenito sódico en la viabilidad de los queratinocitos (Ejemplo 4)

Figura 7: muestra el efecto de un suplemento de levadura de selenio y selenito sódico en la actividad glutatión peroxidasa de los queratinocitos (Ejemplo 5)

Figura 8: muestra el efecto de un suplemento de levadura de selenio y selenito sódico en la actividad glutatión peroxidasa de los queratinocitos expuestos a radiación UVB (50mJ/cm^{2}) (Ejemplo 5)

Figura 9: muestra el efecto de un suplemento de levadura de selenio y selenito sódico en la muerte celular inducida por hidroperóxido de cumeno (CuOOH) (Ejemplo 6)

Figura 10: muestra el efecto de un suplemento de levadura de selenio y selenito sódico en el estrés oxidativo intracelular inducido por CuOOH (formación de DCF) (Ejemplo 7)

En las Figuras de la 7 a la 10 se han utilizado las siguientes abreviaturas:

Levadura (L): Levadura de selenio (3,95 \mug/ml): 50 nM Se

Levadura (H): Levadura de selenio (39,5 \mug/ml): 500 nM Se

Selenito (L): Na_{2}SeO_{3} 50 nM

Selenito (H): Na_{2}SeO_{3} 500 nM

Alguien versado en la materia notará que aunque los reactivos específicos y las condiciones de reacción se perfilan en los siguientes ejemplos, pueden hacerse modificaciones, que se pretende abarcar por el alcance de la invención. Así, los siguientes ejemplos pretenden ilustrar la invención pero no son limitantes.

Ejemplos Materiales y métodos Químicos

Los disolventes orgánicos utilizados fueron de grado analítico (Carlo Erba, Milán, Italia). Los ingredientes activos (extracto de Vitis vinifera, extracto de Lycopersicum esculentum, beta-caroteno, licopeno, acetato de d,l-\alpha tocoferol, ácido ascórbico, levadura de selenio) fueron suministrados por Pharmaton SA, CH 6934 Bioggio, Suiza. El hidroperóxido de cumeno (CuOOH), ácido tiobarbitúrico (TBA), EDTA, selenito sódico (Na_{2}SeO_{3}), azida sódica (NaN_{3}), piruvato sódico, diacetato de 2',7'-diclorodihidrofluoresceína (DCFH-DA), DMEM (medio de Eagle modificado de Dulbecco), DMEM libre de rojo fenol, L-glutamina y la solución de penicilina-estreptomicina se obtuvieron de Sigma (Trimital, Milán, Italia); las soluciones de suero bovino fetal y tampón fosfato (PBS) de Hyclone (Belbio, Milán, Italia); el H_{2}O_{2} (30% v/v) de Fluka (Trimital, Milán, Italia); el NADH, NADPH, GSH y la GSH-reductasa de Boehringer Mannheim Italy (Milan, Italia).

Equipamiento

Los estudios espectrofotométricos y fluorimétricos se llevaron a cabo en un espectrofotómetro Perkin Elmer Lambda 16 asistido por computador y un espectrómetro de luminiscencia Perkin Elmer LS50B asistido por computador (Perkin Elmer, Monza, Italia).

Irradiación con UVB de los eritrocitos (=RBC)

Se aislaron eritrocitos de las ratas macho Wistar (Charles River, Calco, Italia), de las células de la línea blanca sanguínea y de las plaquetas, y se lavaron y resuspendieron en tampón fosfato salino, pH 7,4 [125 mM NaCl y 10 mM tampón fosfato sódico (PBS)], se guardaron a 4ºC y se utilizaron hasta 4 días después. Para los experimentos, se separó de la reserva una alícuota de la suspensión de eritrocitos, se centrifugó a 1000 x g durante 5 min y se diluyeron 0,1 ml del botón en 50 ml de PBS, para obtener una suspensión de eritrocitos al 1% (aproximadamente 15 x 10^{7} células/ml).

Las alícuotas de 50 ml de la suspensión de RBC se dispensaron en placas de vidrio Pyrex (de 14 cm de diámetro), transparente a longitudes de onda de excitación > 290 nm, y se expusieron a radiación UVB durante diferentes intervalos de tiempo. Cuando se añadieron los inhibidores a la suspensión de RBC, éstos se sometieron a un periodo de preincubación de 30 min a 37ºC. La irradiación con UVB se llevó a cabo con un banco paralelo de dos tubos fluorescentes Philips TL20W/12 (Sara s.r.l., Castellanza, Italia) que emitían un espectro continuo entre 280 y 320 nm con un pico de emisión a 312 nm. La tasa de fluencia en el lugar de la irradiación celular (a 25 cm de la fuente de UVB) fue de 0,85 mW/cm^{2} y las dosis de UVB empleadas oscilaron entre 1,5 y 7,0 J/cm^{2} (tiempo de exposición de 30-150 min), como se detectó con un radiómetro Vilber Lourmat VLX-3W (sonda UVB,
312 nm).

Hemólisis inducida por UVB

Tras la irradiación, alícuotas de 2 ml de la suspensión de RBC se diluyeron 1:5 con salina tamponada y se determinó la hemólisis por turbidimetría a 710 nm, en intervalos de 30 min durante 180 min. Los porcentajes de hemólisis se determinaron fijando como 100% de hemólisis el valor de absorbancia determinado en una suspensión de RBC sonicada durante 5s al 50% de potencia. Para el cálculo se usó el valor medio de 5 determinaciones.

Queratinocitos

La línea celular de queratinocitos humanos NCTC 2544 (Flow Laboratories, Irvine, UK) se cultivó a 37ºC en DMEM suplementado con suero fetal bovino al 10% con L-glutamina 2 mM y antibióticos (100 U/ml penicilina y 0,1 mg/mlestreptomicina). Los cultivos se mantuvieron a 37ºC en una atmósfera húmeda al 5% de CO_{2}. Para los experimentos, las células se sembraron a una densidad de 5 x 10^{4}/cm^{2} y se cultivaron en placas de plástico de cultivo celular de 2 cm^{2} hasta que se alcanzó una confluencia del 80-90%. La viabilidad celular se determinó por el ensayo de exclusión con azul tripano y mediante la medición de la pérdida de LDH. Las determinaciones de proteínas se realizaron mediante un método de Lowry modificado, utilizando albúmina sérica bovina como estándar.

Actividad glutatión peroxidasa (GSH-PX)

Los cultivos celulares se trataron con selenito sódico (50, 500 nM) o levadura de selenio (3,95 o 39,5 \mug/ml que corresponden a 50 y 500 nM Se), y se incubaron hasta alcanzar una confluencia del 90% (48 h). Antes de la irradiación las monocapas celulares se lavaron tres veces con PBS precalentado y se expusieron a UVB (50 mJ/cm^{2}), en presencia de PBS. Tras la irradiación, el PBS se sustituyó por DMEM libre de suero y de rojo fenol (K-DMEM) y se incubó durante 24 h (como control negativo las células se sometieron al mismo procedimiento pero sin exposición a UV). Se descartó el medio, se recuperaron las células mediante un rascado suave en 1 ml de tampón Tris-HCl 50 mM y se lisaron por sonicación. En las suspensiones celulares (alícuotas de 0,1 ml) se analizó la actividad GPX mediante la monitorización del descenso de la absorbancia a 340 nm para la tasa de desaparición de NADPH en un espectrofotómetro termoregulado (37ºC). La actividad GPX se calculó utilizando un coeficiente de extinción molar para el NADPH de 6,22 x 10^{3} cm^{-1} m^{-1} y se expresó como mU/mg de proteína, donde 1 U de actividad enzimática se definió como los \mumoles de sustrato consumido o de producto producido/min a 37ºC.

Estrés oxidativo inducido por CUOOH

El estrés oxidativo intracelular inducido por CuOOH y el efecto protector de la levadura de selenio se determinó mediante el análisis de la viabilidad celular y el contenido de peróxido utilizando la sonda fluorescente DCF (Diclorofluoresceína) sensible a la oxidación. Los cultivos celulares se trataron con selenito sódico (50, 500 nM) o con levadura de selenio (3,95 o 39,5 \mug/ml que corresponden a 50 y 500 nM Se) y se incubó hasta una confluencia del 90% (48 h). Se preparó una solución de reserva de DCFH-DA (Diacetato de diclorodihidrofluoresceína) (3,34 mM) en etanol, se purgó con nitrógeno y se guardó a -20ºC en alícuotas de 500 ml. Las monocapas celulares se lavaron con PBS precalentado y se incubaron con DCFH-DA 10 \muM en PBS durante 30 min a 37ºC. Entonces, el medio se descartó y la monocapa celular se lavó tres veces con PBS precalentado para eliminar el DCFH-DA no incorporado, y luego se incubó con K-DMEM que contenía CuOOH 0,5 mM. Las células control negativo se sometieron al mismo procedimiento sin exposición a CuOOH. Tras 24 h de incubación, se descartó el medio y las células se recuperaron mediante un rascado suave en 3 ml de PBS. La suspensión celular se transfirió entonces a cubetas de fluorescencia termoreguladas (25ºC) de 1 ml equipadas con un agitador magnético y se registró el aumento de la intensidad de fluorescencia de la sonda (\lambda_{exc} 502 nm; \lambda_{em} 520 nm; anchos de banda 5 nm). Los valores de intensidad de fluorescencia en todos los puntos de observación se correlacionaron con el contenido proteico (media \pm DE de 6 determinaciones) y se expresaron como porcentajes de aumento de la fluorescencia respecto a los controles (células control
negativo).

Análisis estadístico

Los resultados están expresados como media \pm DE de 5 determinaciones. Los datos se analizaron mediante análisis de la varianza unidireccional (ANOVA), seguido del test de Tukey para la significación estadística entre grupos y del test t de Student (dos colas) para las muestras no pareadas. Las diferencias se consideraron significativas cuando p<0,05. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el paquete de programas Prism (GraphPad Software Inc., San Diego CA, USA).

Ejemplo 1 Los eritrocitos como modelo celular El efecto protector de la combinación de los ingredientes activos

La exposición de los RBC de rata a dosis crecientes de UVB dio lugar a la típica curva de hemólisis que se muestra en la Figura 1: el proceso hemolítico empezó desde los 60 min de irradiación, y con una dosis de UVB de aproximadamente 3 J/cm^{2} (8,5 \pm 3,2%) alcanzó una meseta entre 90 (87,2 \pm 6,3%) y 120 minutos (98,7 \pm 4,4%). Las muestras de la combinación de ingredientes activos se prepararon mediante una mezcla con PBS y agitación; la suspensión homogénea obtenida se diluyó posteriormente en PBS hasta concentraciones finales que oscilaban entre 0,1 y 10 \mug/ml.

Cuando los RBC no irradiados se incubaron en condiciones aeróbicas en presencia de la combinación de ingredientes activos no se observó una hemólisis significativa durante las 3 h. La combinación de los ingredientes activos añadidos a la suspensión de RBC antes de la irradiación, protegió los RBC de la hemólisis inducida por UVB de forma marcada y dependiente de la dosis (Figura 1), con una concentración mínima efectiva de 0,1 \mug/ml. A 5 \mug/ml el proceso hemolítico se retrasó alrededor de 30 min, y tras 120 min de irradiación el porcentaje de hemólisis fue de solo 34,5 \pm 5,5%, y a la máxima concentración (10 \mug/ml) la integridad de los RBC se mantuvo hasta los 150 min de irradiación con UVB (7 J/cm^{2}). El valor CI_{50}, calculado a 120 min, fue 4 \mug/ml.

Ejemplo 2 Efecto protector de la combinación de antioxidantes lipofílicos e hidrofílicos en la combinación

Para un mejor entendimiento del efecto protector de la combinación de ingredientes activos sobre la hemólisis inducida por UVB, se ha investigado la capacidad de una mezcla de antioxidantes lipofílicos (acetato de vitamina E + beta-caroteno + extracto de Lycopersicum esculentum) e hidrofílicos (vitamina C + extracto de Vitis vinifera) de neutralizar los radicales.

Se prepararon soluciones de reserva de acetato de vitamina E, beta-caroteno y extracto de Lycopersicum esculentum en THF, en una atmósfera de N_{2} y luz roja para prevenir la autooxidación y se almacenó a -20ºC hasta 1 semana. La estabilidad de cada antioxidante se comprobó diariamente mediante espectroscopía de UV. Para mantener las mismas proporciones entre los antioxidantes presentes en la combinación de ingredientes activos, se preparó una solución de reserva de la mezcla de 7,04 mg/ml de acetato de vitamina E, 1,64 mg/ml de beta-caroteno y una cantidad de extracto de Lycopersicum esculentum que corresponde a 0,88 mg/ml de licopeno, mediante dilución con THF. Se realizó una dilución seriada para proporcionar las soluciones de trabajo de la mezcla de antioxidantes lipofílicos a las concentraciones finales de 1,2, 2,4, 4,8, 9,6 \mug/ml de la suspensión de RBC (antioxidantes lipofílicos totales). En todos los experimentos, la concentración de THF fue siempre del 0,1% (v/v).

La misma aproximación se utilizó para los antioxidantes hidrofílicos: se preparó una solución de reserva de la mezcla de vitamina C (6,72 mg/ml) y de extracto de Vitis vinifera (2,8 mg/ml) en PBS, y se realizó una dilución seriada para proporcionar las soluciones de trabajo de la mezcla de antioxidantes hidrofílicos a 0,58, 1,16, 2,32, 4,64, 9,28 \mug/ml de la suspensión de RBC (antioxidantes hidrofílicos totales).

Como se muestra en las Figuras 2 y 3, tanto las fracciones lipofílicas como las hidrofílicas de la combinación de ingredientes activos son capaces de prevenir la hemólisis inducida por UVB, de forma dependiente de la dosis, aunque con diferente potencia. La mayor actividad de la mezcla hidrofílica se debe principalmente a la presencia del extracto de Vitis vinifera, que ya se había mostrado en diferentes modelos experimentales in vitro como un potente antioxidante que rompe la cadena (Maffei Facino R.; Carini M.; Aldini G.; Bombardelli E.; Morazzoni P.; Morelli R.; Free radicals scavenging action and anti-enzyme activities of Procyanidines from Vitis vinifera - A mechanism for their capillary protective action; Arzneim. Forsch./ Drug Res., 44, 592-601, 1994) y que evita el consumo de vitamina E endógena inducido por UVB, a través de un mecanismo de reciclado (reacción de transferencia de hidrógeno).

Ejemplo 3 Interacción antioxidante cooperativa entre los antioxidantes lipofílicos e hidrofílicos de la combinación

La interacción antioxidante cooperativa entre los antioxidantes lipofílicos e hidrofílicos de la combinación se estudió mediante la utilización de concentraciones de cada solución de trabajo de la mezcla que proporcionaban una inhibición de aproximadamente el 20-30% a los 120 min de irradiación: 2,4 \mug/ml para la lipofílica (acetato de vitamina E 1,76 \mug/ml, \beta-Caroteno 0,41 \mug/ml, licopeno 0,22 \mug/ml) y 0,58 \mug/ml para la hidrofílica (Vitamina C 0,4 \mug/ml, extracto de Vitis vinifera 0,18 \mug/ml). Los resultados se muestran en las Figuras 4 y 5. Bajo estas condiciones, la tasa de hemólisis fue similar para ambas mezclas, siendo la hidrofílica ligeramente más activa que la lipofílica (20% frente a 14% de inhibición a los 120 min). Cuando se combinaron los antioxidantes, la tasa de hemólisis se redujo de forma marcada y la integridad de los RBC se mantuvo hasta 90 min. A los 120 min el porcentaje de inhibición (55 \pm 2,5%) era mucho mayor que la suma de los % de inhibición (calculado: 33,8%) observados con las mezclas de antioxidantes individuales, indicando una interacción sinérgica. El efecto protector observado en una combinación típica de antioxidantes hidrofílicos/lipofílicos (extracto de Vitis vinifera + licopeno) no se diferencia significativamente del observado en una combinación de los ingredientes hidrofílicos (Figura 5); por el contrario, la asociación entre vitamina E (1,76 \mug/ml) y licopeno (0,22 \mug/ml) da lugar a un porcentaje de inhibición de la hemólisis significativamente menor que el obtenido con la combinación de los ingredientes lipofílicos (7,1% frente al 14%) (Figura 5).

Ejemplo 4 Efecto de un suplemento de levadura de selenio sobre el crecimiento y la viabilidad celular

En queratinocitos cultivados, el selenito sódico o la levadura de selenio no tienen una actividad aparente de estimulación del crecimiento. La viabilidad celular, determinada por la pérdida de LDH (Figura 6), fue siempre superior al 95% y no se encontraron diferencias significativas respecto a las células control con dosis de 50 y 500 nM de Se.

Ejemplo 5 Efecto de un suplemento de levadura de selenio sobre la actividad GSH-PX

La Figura 7 muestra los efectos de un suplemento de levadura de selenio o selenito sódico (dosis equimolares de Se) en células control: con selenito sódico, se describió una inducción máxima de la actividad GSH-PX a 50 nM (aumento de 3,365 veces la de los controles; 91,44 \pm 10,37 frente a 28,31 \pm 5,87 mU/mg de proteína), y no se observó un mayor incremento a concentración 500 nM. La levadura de selenio fue menos potente como inductor de la GSH-PX a la concentración menor (aumento de 2,44 veces; 63,05 \pm 5,51 mU/mg deproteína), pero a una concentración de 39,5 \mug/ml (que corresponden a 500 nM de Se) el aumento de la actividad enzimática fue comparable al obtenido con la dosis equimolar de selenito sódico (90,11 \pm 10,35 mU/mg de proteína). Estos resultados demuestran claramente que la levadura de selenio libera selenio, de forma dependiente de la dosis, para la activación enzimática.

La actividad GSH-PX se determinó también en queratinocitos expuestos a irradiación UVB (50 mJ/cm^{2}), y el alcance de la inducción enzimática por la levadura de selenio o el selenito sódico fue significativamente mayor comparado con la de las células control (Figura 8), indicando de esta manera que bajo condiciones de desequilibrio oxidativo el selenio es todavía activo.

Ejemplo 6 Efecto de un suplemento de levadura de selenio sobre la muerte celular inducida por CuOOH

El hidroperóxido de cumeno es un fuerte promotor de reacciones de radicales libres, y la incubación de los queratinocitos con CuOOH 500 \muM produjo una muerte celular de más del 80% de las células 24 h tras la exposición (Figura 9). En las células con un suplemento de levadura de selenio, la muerte celular se redujo de forma marcada y dependiente de la dosis, siendo la viabilidad celular de 64 \pm 1,3% a la dosis menor (3,95 \mug/ml) y sin diferencias significativas respecto a la de las células control (90 \pm 1,2%) en la dosis más alta de Se (39,5 \mug/ml \approx 500 nM de Se). La protección conseguida con selenito sódico 50 nM fue ligeramente superior, ya que la viabilidad celular se recuperó casi completamente.

Ejemplo 7 Efecto de un suplemento de levadura de selenio sobre el estrés oxidativo inducido por CuOOH

El estado oxidativo intracelular se determinó mediante el sensible ensayo fluorimétrico de la DCF. El ensayo se basa en la capacidad de la DCFH-DA, no polar y no fluorescente, de difundir a través de la membrana celular y ser deacetilada por las esterasas citosólicas para formar diclorodihidrofluoresceína (DCFH), que es polar y no fluorescente. Ésta última queda atrapada en el citosol, donde al reaccionar con los compuestos reactivos de oxigeno generados por el CuOOH, da lugar a la formación del derivado fluorescente diclorofluoresceína (DCF).

La incubación de queratinocitos con CuOOH 500 mM resulta en una acumulación significativa de DCF (máxima tras 24 h; aumento de más de 7 veces), lo que confirma la expansión de una explosión oxidativa en el compartimiento citosólico (Figura l0). El pretratamiento de las células con levadura de selenio neutraliza el deterioro oxidativo, ya que se observa una reducción del 60% en la formación de DCF con la dosis menor (3.95 \mug/ml) y una protección casi completa a 39.5 \mug/ml (550 nM de Se). El selenito sódico previene totalmente la formación de DCF ya con la dosis más baja (50 nM).

Los resultados de estos ejemplos indican que la asociación entre los antioxidantes lipofílicos e hidrofílicos, que es el objeto de la presente invención, la que proporciona una protección celular óptima contra el desafío oxidativo de la UVB. En otras palabras, existe una interacción sinérgica entre los antioxidantes que explica el elevado grado de protección que se alcanza con una combinación de los ingredientes activos.

Como los radicales libres y los compuestos reactivos de oxigeno (ROS) se generan tanto en el compartimiento celular lipídico como en el acuoso, un sistema de defensa antioxidante como el de la combinación de los ingredientes activos objeto de la presente invención, que puede disgregarse tanto en el ambiente lipídico como en el acuoso, es altamente adecuado para la protección celular.

Claims

1. El uso de una composición que comprende cantidades sinérgicas de un antioxidante lipofílico, un antioxidante hidrofílico y un transportador seleccionado del grupo que consiste en aceites naturales de plantas, aceites de plantas total o parcialmente hidrogenados, lecitinas, fosfátidos de plantas y ceras naturales, en los que dicho antioxidante lipofílico es una mezcla que consiste en

(a) de 5 a 20 partes de vitamina E;

(b) de 1 a 15 partes de beta-caroteno; y

(c) de 1 a 4 partes de licopeno en forma de un extracto de Lycopersicum esculentum, obtenido de piel seca de tomates;

y dicho antioxidante hidrofílico es una mezcla que consiste en

(d) de 2 a 60 partes de vitamina C; y

(e) de 1 a 30 partes de extracto de Vitis vinifera obtenido de semillas de la viña roja;

para la preparación de una composición para proteger a un individuo de sufrir una enfermedad o tratar a un individuo que sufre una enfermedad, siendo dicha enfermedad causada por una sobreproducción de radicales libres y seleccionada de entre el grupo consistente en envejecimiento, inflamación, aterosclerosis o cáncer.

2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, donde la composición comprende adicionalmente selenio.

3. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho antioxidante lipofílico es una mezcla que consiste en

(a) de 7,5 a 15 partes de vitamina E;

(b) de 2 a 10 partes de beta-caroteno; y

(c) de 1,5 a 3 partes de licopeno en forma de un extracto de Lycopersicum esculentum, obtenido de piel seca de tomates;

y dicho antioxidante hidrofílico es una mezcla que consiste en

(d) de 5 a 50 partes de vitamina C; y

(e) de 1,1 a 25 partes de extracto de Vitis vinifera obtenido de semillas de la viña roja.

4. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, donde el antioxidante lipofílico comprende acetato de vitamina E o succinato de vitamina E.

5. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, donde el antioxidante hidrofílico comprende la sal sódica de la vitamina C.

6. La composición de uso de acuerdo con la reivindicación 2, donde la composición comprende selenito sódico o levadura de selenio.

7. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho transportador se selecciona de entre el grupo consistente en aceite de soja, aceite de soja total o parcialmente hidrogenado, aceite de colza, aceite de cacahuete, lecitina de soja, fosfátido de soja, lecitina de huevo y cera de abeja.

8. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, donde la composición se administra en forma de cápsulas blandas o duras de gelatina, comprimidos, comprimidos recubiertos, supositorios o por la vía transdérmica.