DE60117375T2

DE60117375T2 - Verfahren zur erhöhung der expression von einem interessierenden protein durch rekombinante wirtzellen

Info

Publication number: DE60117375T2
Application number: DE60117375T
Authority: DE
Inventors: Si Seattle LOK
Original assignee: Zymogenetics Inc
Current assignee: Zymogenetics Inc
Priority date: 2000-04-26
Filing date: 2001-04-25
Publication date: 2006-10-19
Anticipated expiration: 2021-04-26
Also published as: ATE318317T1; EP1276881B1; WO2001081596A3; EP1276881A2; DE60117375D1; CA2407710A1; WO2001081596A2; JP2003530886A; AU2001255671A1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf Verfahren zur Steigerung der Produktion eines gewünschten Proteins durch rekombinante Wirtszellen. Besonders bezieht sich die vorliegende Erfindung auf eine neue Strategie zur Erzeugung von eukaryotischen Wirtszellen mit in-vitro-polymerisierten Genen.
Hintergrund der Erfindung
Die zunehmende Verwendung von Techniken zur Gewinnung von Nukleotidsequenzdaten warf ein Schlaglicht auf den Bedarf nach effizienten Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Proteinen. Während es möglich ist, Bakterien zu verwenden, um rekombinantes Protein zu synthetisieren, kann dieser Ansatz nicht geeignet auf eukaryotische Proteine, die eine posttranslationale Modifikation für ihre Aktivität erfordern, angewandt werden. Ferner können fremde Proteine als solche durch bakterielle wirtsspezifische Proteasen erkannt werden, was in einer niedrigen Proteinausbeute resultiert.
Eine Strategie für die Gewinnung einer hohen Ausbeute eines rekombinanten Proteins durch eukaryotische Zellen ist, die Gendosis zu steigern. Dies kann durch virale Vektoren wie Rinderpapillomavirus, Affenvirus 40 und Epstein-Barr-Virus erzielt werden, die eine hohe Kopiezahl pro Zelle bereitstellen (siehe zum Beispiel die DiMaio et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 79: 4030 (1982); Yates et al., Nature 313: 812 (1985)). Die Verwendung dieser episomalen Systeme ist jedoch auf gewisse permissive Wirtszellen beschränkt, welche virale Replikation unterstützen können. Zusätzlich ist die Expression oftmals vorübergehend auf Grund von Vektorinstabilität.
Die Vektorstabilität ist verbessert, wenn der Vektor in die genomische DNS der Wirtszelle integriert wird. Ein anderer Ansatz ist deshalb, Zellen zu selektieren, die Vektorsequenzen enthalten, welche nach der Integration in genomische DNS amplifiziert worden sind. Typischerweise wird das Selektionsvorgehen durch die Transfektion von Zellen mit einem Gen durchgeführt, das das gewünschte Protein kodiert, und einem Gen, das ein Protein kodiert, welches Resistenz gegen ein toxisches Arzneimittel verleiht. Die Coamplifikation transfizierter DNS kann eine 100- bis 1000-fache Zunahme in der Expression des gewünschten Proteins bereitstellen.
Obwohl über zwanzig selektierbare und amplifizierbare Gene beschrieben worden sind, ist das populärste selektierbare Markergen für die Amplifikation das Dihydrofolatreduktase-(DHFR-)Gen (Kaufman, Methods Enzymol. 185: 487 (1990)). Bei diesem Ansatz werden die Kopiezahlen des DHFR-Gens und eines assoziierten Gens durch Selektion in Methotrexat gesteigert, das ein kompetitiver Inhibitor des DHFR-Enzyms ist. Schrittweise Zunahmen in der Methotrexatkonzentration resultieren in der Selektion von Klonen, welche oftmals erhöhte DHFR-Spiegel exprimieren, gewöhnlich aufgrund von Genamplifikation und einer gesteigerten Expression des coamplifizierten Gens. Ein Nachteil der DHFR-Coamplifikation ist das Erfordernis einer DHFR-Mangelzelllinie. Ein anderes Hindernis ist, dass die Methotrexatdosis in kleinen Zunahmen in einer schrittweisen Amplifikation gesteigert werden muss, wobei Klone bei jedem Schritt gepickt und expandiert werden müssen. Folglich ist eine signifikante Investition an Zeit erforderlich, um einen hochamplifizierten Klon zu gewinnen (siehe zum Beispiel Barsoum, DNA and Cell Biology 9: 293 (1990)). Als eine Erläuterung, chinesische Hamster-DHFR^–-Zellen werden oftmals für die Synthese von rekombinanten Proteinen verwendet, da die in das Wirtschromosom zusammen mit dem DHFR-Gen integrierten rekombinanten Gene effizient coamplifiziert werden können durch Steigern der Methotrexatkonzentration. Es braucht normalerweise sechs bis zehn Monate, Zelllinien zu etablieren, die die gewünschten Mengen der rekombinanten Proteine nach der Transfektion produzieren (siehe zum Beispiel Choo et al., Gene 46: 277 (1986)).
Genamplifikation wurde auch erreicht unter Verwendung von selektiven Markergenen wie Adensosindesaminase-Genen, Ornithindecarboxylase-Genen und dem menschlichen mehrfach Arzneimittelresistenz-Gen, MDR1 (Kaufman et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83: 3136 (1982); Chiang und McConlogue, Mol. Cell. Biol. 8: 764 (1988); Germann et al., J. Biol. Chem. 264: 7418 (1989); Kane et al., Mol. Cell. Biol. 8: 3316 (1988)). Kaufman, US-Patent Nr. 5,238,820, zog Vorteil aus der Erhältlichkeit von mehrfach amplifizierbaren Genen durch die Gestaltung von Vektoren, die zwei oder mehr unterschiedliche heterologe selektierbare amplifizierbare Markergene tragen. Ziel war, ein höheres Maß an Genamplifikation zu erzielen. Bei diesem Ansatz werden transformierte Zellen als erstes unter geeigneten Bedingungen für das Selektieren und Amplifizieren eines heterologen selektierbaren amplifizierbaren Markergens wachsen gelassen, um die Kopiezahl des gewünschten Proteingens zu steigern. Die Kopiezahl wird dann weiter gesteigert durch Wachsen lassen der Zellen unter geeigneten Bedingungen zum Selektieren und Amplifizieren des zweiten heterologen selektierbaren amplifizierbaren Markergens. Dieser Prozess wird für jeden zusätzlichen selektierbaren Marker wiederholt, der vorhanden sein mag.
Studien zeigen, dass, wenn Plasmide einen Wirtszellkern erreichen, die Plasmide zu den Concatemeren mit hohem Molekulargewicht gespalten und gespliced werden. In-vivo-Genamplifikation hat den Nachteil, dass die Struktur des amplifizierten Gens nicht kontrolliert werden kann und dass Erfolg nicht vorhersagbar ist. Barsoum, DNA and Cell Biology 9: 293 (1990), beschrieben eine Elektroporation mit einer hohen Kopiezahl von chinesischen Hamsterovarzellen mit hohen Konzentrationen an Expressionsvektor, welcher mit einer Restriktionsendonuclease, die kohäsive Enden beließ, linearisiert worden ist. Ein signifikanter Teil der eingeführten DNS wurde in tandemartigen Wiederholungen unbekannter Länge angeordnet, welche die Kopien des Vektors in gemischten Orientierungen umfassten. Obwohl dieses Verfahren eine Kontrolle über die Plasmidspaltungsstelle bereitstellte, waren die In-vivo-Ligation und Integrationsereignisse nicht kontrolliert.
Eine Strategie für die Auferlegung einer größeren Kontrolle bei dem Genamplifikationsprozess ist, das Gen von Interesse in vitro vor dem Einführen der DNS in eine Wirtszelle zu polymerisieren (siehe zum Beispiel Leahy et al., Bioconjugate Chem. 7: 545 (1996); Leahy et al., Nucl. Acids Res. 25: 449 (1997)). Frühe Ansätze, tandemartige Anordnungen von DNS-Fragmenten zu erzeugen, erforderten die Ligation des DNS-Fragmentes in einen geeigneten Vektor und typischerweise ergab dieser einfache Ansatz eine zufällige Orientierung von Fragmenten, was in Polymeren resultierte, die sowohl gleichgerichtete als auch invertierte Wiederholungen enthielten (siehe zum Beispiel Sadler et al., Gene 3: 211 (1978)). Während die Anwesenheit von invertierten Wiederholungen in einem Polymer zu Instabilität der DNS innerhalb der Wirtszelle führte, wurde von einer Reihe von gleichgerichteten Wiederholungen gefunden, dass sie stabile Moleküle bilden.
Ein Problem beim Kontrollieren der Fragmentorientierung ist, dass viele der üblicherweise verwendeten Restriktionsenzyme Enden erzeugen, die rotatorisch äquivalent sind und deshalb geschieht selbst Ligation von DNS-Fragmenten mit solchen Enden zufällig im Hinblick auf Fragmentorientierung. Hartley und Gregori, Gene 13: 347 (1981) berichteten von einer Technik, Fragmentorientierung während der Ligation zu kontrollieren, welche die Einführung von AvaI-Stellen erforderte, die jedes Ende des klonierten Fragmentes flankierten (siehe auch Hartley und Gregori, US-Patent Nr. 4,403,036). Da die AvaI-Spaltung unterscheidbare Enden erzeugt, resultiert die Selbstligation der Fragmente in einer starken Tendenz in Richtung zu Kopf-Schwanz-Orientierung. Dies liegt daran, dass Kopf-Kopf- und Schwanz-Schwanz-Ligation in Basenfehlpaarungen resultiert. Die polymerisierten Moleküle wurden dann in einen Vektor inseriert und verwendet, um E. coli zu transformieren.
In einem ähnlichen Ansatz erzeugten Ikeda et al., Gene 71: 19 (1988) Kopf-Schwanz-Tandemanordnungen eines DNS-Fragmentes, das ein menschliches Haupthistokompatibilitätsantigen kodiert, welches von SfiI-Spaltstellen flankiert war. SfiI erzeugt gespaltene Enden, die nicht rotatorisch äquivalent sind. Ein Cosmidvektor, der das amplifizierte Gen und Gene, die Hygromycin-B-Resistenz verleihen, und dhfr-Gene enthielten, wurde verwendet, um eine Mauszelllinie zu transfizieren.
SfiI-Zellen wurden auch verwendet, um Copolymere von Genexpressionskassetten und Selektionsmarkern zu erzeugen, die verwendet werden können, um Zellen zu transfizieren, Monaco et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 20: 157 (1994); Asselbergs et al., Anal. Biochem. 243: 285 (1996). Nach dem Verfahren von Monaco et al. wird das Copolymer mit NotI behandelt, um die DNS an dem 3'-Ende des selektierbaren Markergens zu spalten. Auf diesem Wege werden transfizierte DNS-Moleküle nur ein selektierbares Markergen pro Copolymer enthalten.
Klasse-IIS-Restriktionsenzyme können vollständig asymmetrische Stellen und komplementäre kohäsive Enden erzeugen. Kim und Szybalski, Gene 71: 1 (1988), zogen aus dieser Eigenschaft Vorteil, indem sie Stellen für BspMI, ein Klasse-IIS-Restriktionsenzym, an jedem Ende der klonierten DNS einführten. Selbstligation der klonierten DNS sorgte für Multimere, die wiederholte Einheiten in derselben Orientierung umfassten. Ähnlich erreichten Takeshita et al., Gene 71: 9 (1988), Tandemgenamplifikation durch Inserieren eines Fragmentes, das menschliches Protein C kodiert, in ein Plasmid, um asymmetrische kohäsive Enden in das Fragment einzuführen. In diesem Falle wurden Stellen für das Klasse-IIS-Enzym, BstXI, verwendet. Das Multimer wurde dann in einen Cosmidvektor, umfassend ein Neo-Gen, kloniert, in Partikel des Phagen Lambda verpackt und in E. coli amplifiziert. Die Cosmidvektoren wurden dann in chinesische Hamsterovar-DHFR^–-Zellen eingeführt, welche mit G418 behandelt worden sind, um für Zellen zu selektieren, welche das Neo-Gen exprimierten. Takeshita et al. fanden auch heraus, dass Zellen menschliches Protein C, allerdings bei niedrigeren Spiegeln, nach der Transfektion mit unverpackter tandemligierter DNS, umfassend Kopien des Cosmidvektors und des menschlichen ProteinC-Gens, exprimierten.
Ein ähnlicher Ansatz wurde auch beschrieben von Lee et al., Genetic Analysis: Biomolecular Engineering 13: 139 (1996), die Ziel-DNS als Tandemmultimere amplifizierten, durch Klonieren der Ziel-DNS in eine Spaltstelle eines Klasse-IIS- Restriktionsenzyms eines Vektors, Ausschneiden eines monomeren Inserts mit dem Klasse-IIS-Restriktionsenzym, Isolieren von monomeren Inserts, Selbstligieren der Inserts und Klonieren der Multimere in einen Vektor. Nach Lee et al. ist dieses Schema nützlich für die Polymerisierung von kurzen DNS-Fragmenten für die Massenproduktion von Peptiden.
Ein anderes Schema für die Forcierung von gerichteter Ligation ist, sich synthetische Linker oder Adapter auszudenken, die verwendet werden, um asymmetrische kohäsive Enden zu schaffen. Zum Beispiel gehen dies Taylor und Hagerman, Gene 53: 139 (1987) an, modifiziert von Hartley-Gregori, durch Anheften von synthetischen gerichteten Adaptern an ein DNS-Fragment, um eine vollständige Kontrolle über die Fragmentorientierung während der Ligation zu etablieren. Nach der Polymerisation wurden die Multimere an einen linearisierten Vektor, geeignet für die E. coli-Transformation, ligiert. Stähl et al., Gene 89: 187 (1990), beschrieben ein ähnliches Verfahren für die Polymerisierung von DNS-Fragmenten in einer Kopf-Schwanz-Anordnung. Hierin wurden synthetische Oligonukleotide gestaltet, um ein Epitop tragendes Peptid mit 5'-vorstehenden Enden, die mit einer asymmetrischen Spaltstelle des Klasse-IIS-Restriktionsenzyms BspMI komplementär sind, zu kodieren. Nach der Polymerisation wurden die Peptid kodierenden Fragmente in die einzige BspMI-Spaltstelle eines Vektors inseriert, der verwendet wurde, um E. coli zu transformieren. Klone wurden unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion gescreent und wurden dann in prokaryotische Expressionsvektoren für die Produktion der Peptide in E. coli subkloniert.
Zusammenfassend, Verfahren, die auf In-vivo-Genamplifikation beruhen, sind nicht nur zeitraubend, sondern es fehlt ihnen auch Kontrolle über die Endstruktur des integrierten und amplifizierten Gens. Während In-vitro-Genamplifikationsverfahren eine gewisse Kontrolle über die Struktur des integrierten Gens bereitstellen, erfordern gegenwärtige Verfahren typischerweise mehrfache Klonierungsschritte in prokaryotischen Wirten. Zusätzlich erfordern die zuvor beschriebenen Verfahren oftmals Selektion transfizierter Zellen mit einem toxischen Arzneimittel, das harmlos gemacht wird durch ein Enzymprodukt eines cotransfizierten Gens. Es gibt keine Sicherheit, dass Zellen, die ein ausreichendes Maß dieser enzymatischen Aktivität besitzen auch eine ausreichende Zahl an Kopien des gewünschten Gens besitzen, um hohe Expressionsspiegel des gewünschten rekombinanten Proteins bereitzustellen.
Trotz Fortschritten beim Gewinnen von hohen Genexpressionsspiegeln in rekombinanten Wirtszellen besteht deshalb immer noch ein Bedarf für eine Strategie, die ein schnelles und einfaches Verfahren für die Erzeugung von hohen Spiegeln an rekombinanten Proteinen in eukaryotischen Zellen sorgt.
Takeshita et al., Gene 1998, 71 (1), Seiten 9–18 beschreiben ein In-vitro-Verfahren für Tandemgenamplifikation, bei welchem Ligationsprodukte in E. coli-Zellen als große Cosmidmoleküle vor dem Einführen in CHO-Zellen amplifiziert werden.
Die vorliegende Erfindung begegnet diesem Bedarf durch Bereitstellen eines Verfahrens für die Herstellung eines Nukleinsäurepolymers, das geeignet ist für die Expression einer Aminosäuresequenz von Interesse in einer eukaryotischen Wirtszelle, so dass das Nukleinsäurepolymer nicht in einer bakteriellen oder einer anderen Zwischenwirtszelle vor dem Einführen in diese eukaryotische Zelle vermehrt wird, umfassend:

(a) Spalten von zwei oder mehr Expressionsvektoren, um entweder nicht-palindromische Enden oder palindromische Enden zu erzeugen, worin gespaltene Expressionsvektoren mit palindromischen Enden weiter behandelt werden, um nicht-palindromische Enden zu erzeugen, worin die Expressionsvektoren eine Expressionskassette umfassen, die ein Gen von Interesse und ein selektierbares Markergen umfasst;
(b) Hinzufügen von Abbrucholigonukleotiden während Ligationsschritt (c) zu den gespaltenen Expressionsvektoren mit nicht-palindromischen Enden, worin die Abbrucholigonukleotide eine Nukleotidsequenz haben, die komplementär ist mit den nicht-palindromischen Enden der gespaltenen Expressionsvektoren, wobei die komplementäre Sequenz es den Abbrucholigonukleotiden ermöglicht, an die nicht-palindromischen Enden der gespaltenen Expressionsvektoren oder an die nicht-palindromischen Enden von aneinander ligierten Expressionsvektoren zu binden und, wenn sie so gebunden sind, inhibiert ein Abbrucholigonukleotid die Verlängerung des Nukleinsäurepolymers; und
(c) Ligieren der gespaltenen Expressionsvektoren mit nicht-palindromischen Enden, um Nukleinsäurepolymere zu erzeugen.

Die vorliegende Erfindung stellt folglich verbesserte Verfahren für die Produktion von Peptiden, Polypeptiden und Proteinen durch rekombinante Wirtszellen bereit. Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Nukleinsäuremoleküle, die Aminosäure kodierende Sequenzen enthalten, in vitro polymerisiert. Die polymerisierten Nukleinsäuremoleküle werden dann in eukaryotische Zellen ohne den Bedarf für die Vermehrung in einem prokaryotischen Wirt eingeführt.
Wie hierin beschrieben stellt die vorliegende Erfindung folglich Verfahren für die Produktion eines Nukleinsäurepolymers bereit, die geeignet sind für die Expression einer Aminosäuresequenz von Interesse, umfassend: (a) Spalten von zwei oder mehr Expressionsvektoren, um entweder nicht-palindromische Enden oder palindromische Enden zu erzeugen, worin gespaltene Expressionsvektoren mit palindromischen Enden weiter behandelt werden, um nicht-palindromische Enden zu erzeugen, worin die Expressionsvektoren eine Expressionskassette umfassen, die ein Gen von Interesse und ein selektierbares Markergen umfasst, und (b) Ligieren von gespaltenen Expressionsvektoren mit nicht-palindromischen Enden, um Nukleinsäurepolymere herzustellen. Palindromische Enden umfassende Expressionsvektoren können behandelt werden, um nicht-palindromische Enden zu erzeugen, durch Inkubieren von Expressionsvektoren mit einem Enzym, das eine 3'-Exonucleaseaktivität bereitstellt. Eine 3'-Exonucleaseaktivität kann bereitgestellt werden durch T4-DNS-Polymerase, E. coli-DNS-Polymerase I, Klenow-Fragment von DNS-Polymerase I, DEEP-VENT-DNS-Polymerase, VENT-DNS-Polymerase und Ähnliches.
Solche Verfahren können weiter den Akt des Fragmentierens des Nukleinsäurepolymers unter Verwendung von mechanischem Scheren einschließen. In anderen Variationen umfassen solche Verfahren weiter den Akt des Hinzufügens von Abbrucholigonukleotiden an gespaltene Expressionsvektoren mit nicht-palindromischen Enden vor dem Akt des Ligierens, worin die Abbrucholigonukleotide komplementär sind mit den nicht-palindromischen Enden der gespaltenen Expressionsvektoren.
Bei gewissen Variationen dieser Verfahren umfassen Nukleinsäurepolymere mehrfache Kopien des Gens von Interesse und das selektierbare Markergen in einem 1:1-Verhältnis. Zusätzlich können Expressionsvektoren eine polycistronische Transkriptionseinheit umfassen.
Geeignete selektierbare Markergene schließen Nukleotidsequenzen ein, die ein titrierbares Protein kodieren. Zum Beispiel kann das selektierbare Markergenprodukt mit einem toxischen Molekül titrierbar sein. Geeignete selektierbare Markergene schließen ein Bleomycinresistenz-Gen, ein Metallothionein-Gen, ein Hygromycin-B-Phosphotransferase-Gen, das AURI-Gen, ein Adenosindesaminase-Gen, ein Aminoglycosidphosphotransferase-Gen, ein Dihydrofolatreduktase-Gen, ein Thymidinkinase-Gen, ein Xanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase-Gen und Ähnliches ein. Zusätzliche Beispiele titrierbarer Proteine schließen grünes fluoreszierendes Protein, rotes fluoreszierendes Protein, alkalische Phosphatase, CD4, CD8, Klasse-I-Haupthistokompatibilitätskomplexprotein und Ähnliches ein.
Expressionsvektoren können mit einem Klasse-IIS-Restriktionsenzym gespalten werden, um nicht-palindromische Enden bereitzustellen. Geeignete Klasse-IIS-Restriktionsenzyme schließen ein AccB7I, AceIII, AclWI, AdeI, AhdI, Alw26I, AlwI, AlwNI, ApaBI, AspEI, AspI, AsuHPI, BpsI, BbvI, BbvII, Bce83I, BcefI, BciVI, BfiI, BglI, BinI, BmrI, BpiI, BpmI, BpuAI, BsaI, Bse3DI, Bse4I, BseGI, BseLI, BseRI, BsgI, BslI, BsmAI, BsmBI, BsmFI, BspMI, BsrDI, Bst71I, BstAP1, BstF51, BstXI, Bsu6I, DraIII, DrdI, DseDI, Eam1104I, Eam1105I, EarI, EchHKI, Eco31I, Eco57I, EcoNI, Esp1396I, Esp3I, FokI, FauI, GsuI, HgaI, HphI, MboII, MsiYI, MwoI, NruGI, PflMI, PflFI, PleI, SfaNI, TspRI, Ksp632I, MmeI, RleAI, SapI, SfiI, TaqII, Tth111I, Tth111II, Van91I, XagI und XcmI.
Zusätzliche Enzyme, die verwendet werden können, um nicht-palindromische Enden zu erzeugen, schließen ein AvaI, Ama87I, BcoI, BsoBI, Eco88I, AvaII, Eco47I, Bme18I, HgiEI, SinI, BanI, AccB1I, BshNI, Eco64I, BfmI, BstSFI, SfcI, Bpu10I, BsaMI, BscCI, BsmI, Mva1269I, Bsh1285I, BsaOI, BsiEI, BstMCI, BseII, BseNI, BsrI, Cfr10I, BsiI, BssSI, Bst2BI, BsiZI, AspS9I, Cfr13I, Sau96I, Bsp1720I, BlpI, Bpu1102I, CelII, Bst4CI, BstDEI, DdeI, CpoI, CspI, RsrII, DsaI, BstDSI, Eco24I BanII, EcoT38I, FriOI, HgiJII, Eco130I, StyI, BssT1I, EcoT14I, ErhI, EspI, BlpI, Bpu1102I, Bsp1720I, CelII, HgiAI, BsiHKAI, Alw21I, AspHI, Bpv12I, HinfI, PspPPI, PpuMI, Psp5II, SanDI, SduI, Bsp1286I, BmyI, SecI, BsaJI, BseDI, SfcI, BfmI, BstSFI und SmlI.
Die vorliegende Erfindung stellt weiter Verfahren für die Produktion einer rekombinanten eukaryotischen Wirtszelle bereit, die ein Peptid oder Polypeptid von Interesse in einer eukaryotischen Wirtszelle exprimiert, so dass das Nukleinsäurepolymer nicht in einer bakteriellen oder anderen Zwischenwirtszelle vor dem Einführen in diese eukaryotische Zelle vermehrt wird, umfassend: (a) Spalten von wenigstens zwei Expressionsvektoren, um entweder nicht-palindromische Enden oder palindromische Enden zu erzeugen, worin gespaltene Expressionsvektoren mit palindromischen Enden weiter behandelt werden, um nicht-palindromische Enden zu erzeugen, und worin der Expressionsvektor eine Expressionskassette umfasst, die ein Gen von Interesse umfasst und ein selektierbares Markergen.
In besonderen Ausführungen umfasst das Nukleinsäurepolymer mehrfache Kopien des Gens von Interesse und ein selektierbares Markergen in einem Verhältnis von ungefähr 1:1. Ein beispielhaftes selektierbares Markergen ist eine Nukleotidsequenz, die ein Protein kodiert, welches titrierbar ist.
Die vorliegende Erfindung schließt weiter Verfahren für die Produktion von rekombinanten Wirtszellen ein, durch Einführen eines Nukleinsäuremoleküls, das Expressionskassetten umfasst, dem jedoch prokaryotische Vektorsequenzen fehlen. Die vorliegende Erfindung stellt auch Nukleinsäurepolymere bereit, umfassend mehrfache Kopien von Expressionskassetten.
Diese und andere Aspekte der Erfindung werden nach Bezugnahme auf die folgende detaillierte Beschreibung ersichtlich sein. Zusätzlich sind verschiedene Referenzen unten identifiziert.
In der folgenden Beschreibung wird eine Anzahl von Begriffen ausgiebig verwendet. Die folgenden Definitionen werden bereitgestellt, um das Verstehen der Erfindung zu erleichtern.
Wie hierin verwendet, bezieht sich „Nukleinsäure" oder „Nukleinsäuremolekül" auf Polynukleotide wie Desoxyribonukleinsäure (DNS) oder Ribonukleinsäure (RNS), Oligonukleotide, durch die Polymerasekettenreaktion (PCR) erzeugte Fragmente und durch jedes von Ligation, Schneiden, Endonukleasetätigkeit und Exonukleasetätigkeit erzeugte Fragmente. Nukleinsäuremoleküle können aus Monomeren zusammengesetzt sein, die natürlich vorkommende Nukleotide sind (wie DNS und RNS) oder Analoga natürlich vorkommender Nukleotide (z. B. α-enantiomere Formen von natürlich vorkommenden Nukleotiden) oder eine Kombination von beidem. Modifizierte Nukleotide können Änderungen in Zuckereinheiten und/oder in Pyrimidin- oder Purinbaseneinheiten haben. Zuckermodifikationen schließen zum Beispiel das Ersetzen von einer oder mehreren Hydroxylgruppen mit Halogenen, Alkylgruppen, Aminen und Azidogruppen ein oder Zucker können funktionalisiert sein als Ether oder Ester. Weiterhin kann die gesamte Zuckereinheit mit sterisch oder elektronisch ähnlichen Strukturen ersetzt sein, wie Aza-Zucker und carbozyklische Zuckeranaloga. Beispiele von Modifikationen in einer Baseneinheit schließen alkylierte Purine und Pyrimidine, acylierte Purine oder Pyrimidine oder andere wohlbekannte heterozyklische Ersetzungen ein. Nukleinsäuremonomere können durch Phosphodiesterbindungen oder Analoga solcher Verknüpfungen verknüpft sein. Analoga von Phosphodiesterverknüpfungen schließen Phosphorthioat, Phosphordithioat, Phosphorselenoat, Phosphordiselenoat, Phosphoranilothioat, Phosphoranilidat, Phosphoramidat und Ähnliche ein. Der Begriff „Nukleinsäuremolekül" schließt auch sogenannte „Peptidnukleinsäuren" ein, welche natürlich vorkommende oder modifizierte Nukleinsäurebasen einschließen, die an ein Polyamidgerüst angeheftet sind. Nukleinsäuren können entweder einzelsträngig oder doppelsträngig sein.
Der Begriff „Komplement eines Nukleinsäuremoleküls" bezieht sich auf ein Nukleinsäuremolekül mit einer komplementären Nukleotidsequenz und umgekehrter Orientierung im Vergleich mit einer Referenznukleotidsequenz. Zum Beispiel ist die Sequenz 5' ATGCACGGG 3' (Sequenz ID Nr. 1) komplementär zu 5' CCCGTGCAT 3' (Sequenz ID Nr. 2).
Der Begriff „Contig" bezeichnet ein Nukleinsäuremolekül, das eine zusammenhängende Strecke mit identischer oder komplementärer Sequenz zu einem anderen Nukleinsäuremolekül hat. Von zusammenhängenden Sequenzen wird gesagt, dass sie mit einer gegebenen Strecke eines Nukleinsäuremoleküls entweder in ihrer Gesamtheit oder entlang einer Teilstrecke des Nukleinsäuremoleküls „überlappen".
Der Begriff „Strukturgen" bezieht sich auf ein Nukleinsäuremolekül, das in Boten-RNS (mRNS) transkribiert wird, die dann in eine Sequenz von Aminosäuren translatiert wird, welche für ein spezifisches Polypeptid charakteristisch ist. Ein „Gen von Interesse" kann ein Strukturgen sein.
„Komplementäre DNS (cDNS)" ist ein einzelsträngiges DNS-Molekül, das aus einer mRNS-Matrize durch das Enzym reverse Transkriptase gebildet wird. Typischerweise wird ein Primer, der mit Teilen von mRNS komplementär ist, für das Starten der reversen Transkription genutzt. Fachleute verwenden auch den Begriff „cDNS", um auf ein doppelsträngiges DNS-Molekül Bezug zu nehmen, das aus solch einem einzelsträngigen DNS-Molekül und seinem komplementären DNS-Strang besteht. Der Begriff „cDNS" bezieht sich auch auf einen Klon eines cDNS-Moleküls, das aus einer RNS-Matrize synthetisiert wird.
Ein „isoliertes Nukleinsäuremolekül" ist ein Nukleinsäuremolekül, das nicht in die genomische DNS eines Organismus integriert wird. Zum Beispiel ist ein DNS-Molekül, das einen Wachstumsfaktor kodiert, welches von der genomischen DNS einer Zelle abgetrennt worden ist, ein isoliertes DNS-Molekül. Ein anderes Beispiel eines isolierten Nukleinsäuremoleküls ist ein chemisch synthetisiertes Nukleinsäuremolekül, das nicht in das Genom eines Organismus integriert ist. Ein Nukleinsäuremolekül, das von einer bestimmten Art isoliert worden ist, ist kleiner als das vollständige DNS-Molekül eines Chromosoms von jener Art.
Ein „Nukleinsäuremolekülkonstrukt" ist ein Nukleinsäuremolekül, entweder einzel- oder doppelsträngig, das durch menschlichen Eingriff modifiziert worden ist, um Segmente von Nukleinsäuren zu enthalten, kombiniert oder gegenübergestellt in einer Anordnung, die in der Natur nicht vorkommt.
„Lineare DNS" bezeichnet nicht-zirkuläre DNS-Moleküle mit freien 5'- und 3'-Enden. Lineare DNS kann aus geschlossenen zirkulären DNS-Molekülen wie Plasmiden durch enzymatische Verdauung oder physikalische Zerstörung zubereitet werden.
„Gerichtete Ligation" bezieht sich auf ein Verfahren der Erzeugung eines Nukleinsäurepolymers, umfassend in einer fixierten Orientierung angeordnete Monomere.
Zum Beispiel kann gerichtete Ligation verwendet werden, um ein Polymer herzustellen, das tandemartige Wiederholungen von Monomeren mit Kopf-Schwanz-Orientierungen umfasst.
Ein „Promoter" ist eine Nukleotidsequenz, welche die Transkription eines Strukturgens lenkt. Typischerweise ist ein Promoter in der 5'-nicht-kodierenden Region eines Gens lokalisiert, in der Nähe der Transkriptionsstartstelle eines Strukturgens. Sequenzelemente in Promotoren, die bei dem Starten der Transkription wirken, sind oftmals gekennzeichnet durch Nukleotidkonsensussequenzen. Diese Promoterelemente schließen RNS-Polymerasebindungsstellen, TATA-Sequenzen, CAAT-Sequenzen, differenzierungsspezifische Elemente (DSEs; McGehe et al., Mol. Endocrinol. 7: 551 (1993)), zyklische AMP-Responseelemente (CREs), Serum-Responseelemente (SREs; Treisman, Seminars in Cancer Biol. 1: 47 (1990)), Glucocortikoid-Responseelemente (GREs) und Bindungsstellen für andere Transkriptionsfaktoren wie CRE/ATF (O'Reilly et al., J. Biol. Chem. 267: 19938 (1992)), AP2 (Ye et al., J. Biol. Chem. 269: 25728 (1994)), SP1, cAMP-Responseelement-Bindungsprotein (CREB; Loeken, Gene Expr. 3: 253 (1993)) und Octamerfaktoren (siehe allgemein Watson et al., Herausgeber, Molecular Biology of the Gene, vierte Auflage (The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 1987) und Lemaigre und Rousseau, Biochem. J. 303: 1 (1994)) ein. Falls ein Promoter ein induzierbarer Promoter ist, dann steigt die Rate der Transkription in Antwort auf ein induzierendes Mittel. Im Gegensatz dazu wird die Rate der Transkription nicht durch ein induzierendes Mittel reguliert, falls der Promoter ein konstitutiver Promoter ist. Reprimierbare Promotoren sind ebenfalls bekannt.
Ein „Core-Promoter" enthält essentielle Nukleotidsequenzen für die Promoterfunktion, einschließlich der TATA-Box und dem Transkriptionsstart. Mit dieser Definition kann ein Core-Promoter detektierbare Aktivität in der Abwesenheit spezifischer Sequenzen haben oder nicht haben, welche die Aktivität steigern können oder eine gewebespezifische Aktivität verleihen können.
Ein „Regulationselement" ist eine Nukleotidsequenz, die die Aktivität eines Core-Promoters moduliert. Zum Beispiel kann ein Regulationselement eine Nukleotidsequenz enthalten, welche mit zellulären Faktoren bindet, was die Transkription ausschließlich oder bevorzugt in bestimmten Zellen, Geweben oder Organellen ermöglicht. Diese Arten an Regulationselementen sind normalerweise mit Genen verbunden, die in einer „zellspezifischen", „gewebespezifischen" oder „organellenspezifischen" Weise exprimiert werden.
Ein „Enhancer" ist eine Art eines Regulationselementes, welche die Effizienz der Transkription steigern kann, ungeachtet des Abstandes oder der Orientierung des Enhancers im Verhältnis zu der Transkriptionsstartstelle.
„Heterologe DNS" bezieht sich auf ein DNS-Molekül oder eine Population aus DNS-Molekülen, die in einer gegebenen Wirtszelle natürlicherweise nicht vorkommen. DNS-Moleküle, die für eine bestimmte Wirtszelle heterolog sind, können DNS enthalten, die von der Wirtszellart stammt (d. h. endogene DNS), solange wie jene Wirts-DNS mit Nicht-Wirts-DNS (d. h. exogene DNS) kombiniert ist. Zum Beispiel wird von einem DNS-Molekül, das ein Nicht-Wirts-DNS-Segment, das ein Polypeptid kodiert, welches an ein einen Transkriptionspromoter umfassendes Wirts-DNS-Segment operabel gekoppelt ist, gedacht, dass es ein heterologes DNS-Molekül ist. Umgekehrt kann ein heterologes DNS-Molekül ein endogenes Gen umfassen, das operabel mit einem exogenen Promoter gekoppelt ist. Als eine andere Erläuterung, von einem DNS-Molekül, umfassend ein von einer Wildtypzelle stammendes Gen, wird gedacht, dass es heterologe DNS ist, falls jenes DNS-Molekül in eine mutierte Zelle eingeführt wird, der das Wildtypgen fehlt.
Ein „Polypeptid" ist ein Polymer aus Aminosäureresten, die durch Peptidbindungen verbunden sind, ob natürlich oder synthetisch erzeugt. Auf Polypeptide mit weniger als ungefähr 10 Aminosäureresten wird allgemein Bezug genommen als „Peptide".
Ein „Protein" ist ein Makromolekül, umfassend eine oder mehrere Polypeptidketten. Ein Protein kann auch nicht-peptidische Bestandteile einschließen, wie Kohlenhydratgruppen. Kohlenhydrate und andere nicht-peptidische Substituenten können zu einem Protein durch die Zelle hinzugefügt werden, in welcher das Protein erzeugt wird, und sie werden mit dem Zelltyp variieren. Proteine werden hierin definiert in Begriffen ihrer Aminosäuregerüststrukturen; Substituenten wie Kohlenhydratgruppen werden allgemein nicht spezifiziert, können jedoch nichtsdestotrotz vorhanden sein.
Ein Peptid oder Polypeptid, das durch ein Nicht-Wirts-DNS-Molekül kodiert wird, ist ein „heterologes" Peptid oder Polypeptid.
Ein „integriertes genetisches Element" ist ein DNS-Abschnitt, der in ein Chromosom einer Wirtszelle eingebaut worden ist, wonach jenes Element in die Zelle durch menschliche Manipulation eingeführt worden ist. In der vorliegenden Erfindung werden integrierte genetische Elemente am häufigsten von linearisierten Plasmiden abgeleitet, die in die Zellen durch Elektroporation oder andere Techniken eingeführt werden. Integrierte genetische Elemente werden von der Ausgangswirtszelle an ihre Nachfahren weitergegeben.
Ein „Kloniervektor" ist ein Nukleinsäuremolekül wie ein Plasmid, Cosmid oder Bakteriophage, das die Fähigkeit hat, in einer Wirtszelle autonom zu replizieren. Kloniervektoren enthalten typischerweise eine oder eine kleine Anzahl von Restriktionsendonukleaseerkennungsstellen, die die Insertion eines Nukleinsäuremoleküls in einer bestimmbaren Weise ohne Verlust einer essentiellen biologischen Funktion des Vektors erlaubt, ebenso wie sie Nukleotidsequenzen enthalten, die ein Markergen kodieren, welches für die Verwendung bei der Identifikation und Selektion von mit dem Kloniervektor transformierten Zellen geeignet ist. Markergene schließen typischerweise Gene ein, welche Tetracyclinresistenz oder Ampicillinresistenz bereitstellen.
Ein „Expressionsvektor" ist ein Nukleinsäuremolekül, das ein Gen kodiert, welches in einer Wirtszelle exprimiert wird. Typischerweise umfasst ein Expressionsvektor einen Transkriptionspromoter, ein Gen und einen Transkriptionsterminator. Genexpression wird gewöhnlich unter die Kontrolle eines Promoters gestellt und von solch einem Gen wird gesagt, dass es an den Promoter „operabel gekoppelt ist". Ähnlich sind ein Regulationselement und ein Core-Promoter operabel gekoppelt, falls das Regulationselement die Aktivität des Core-Promoters moduliert.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „multipel" oder „multimer" auf zwei oder mehr Kopien eines Gens von Interesse, wie zum Beispiel 2 bis 50 Kopien, 2 bis 30 Kopien, 2 bis 20 Kopien, 2 bis 15 Kopien oder 2 bis 10 Kopien. Weitere beispielhafte Bereiche schließen 3 bis 20 Kopien, 3 bis 15 Kopien oder 3 bis 10 Kopien ein. Praktischerweise kann ein Konstrukt 3 oder mehr Kopien (z. B. 3 bis 7 oder 5 bis 10) einschließen. Bereiche von 7 oder mehr, zum Beispiel 7 bis 30 Kopien, 7 bis 20 Kopien oder 7 bis 15 Kopien, können auch nützlich sein.
Eine „polycistronische Transkriptionseinheit" ist eine Transkriptionseinheit, in welcher sich mehr als ein Gen unter der Kontrolle desselben Promoters befinden.
Ein „rekombinanter Wirt" ist eine Zelle, welche ein heterologes Nukleinsäuremolekül wie einen Kloniervektor oder Expressionsvektor enthält.
„Integrative Transformanten" sind rekombinante Wirtszellen, in welchen heterologe DNS in die genomische DNS der Zellen integriert worden ist.
Der Begriff „Expression" bezieht sich auf die Biosynthese eines Genproduktes. Zum Beispiel schließt in dem Falle eines Strukturgens Expression die Transkription des Strukturgens in mRNS und die Translation von mRNS in ein oder mehrere Polypeptide ein.
Der Begriff „sekretorische Signalsequenz" bezeichnet eine DNS-Sequenz, welche ein Peptid (ein „sekretorisches Peptid") kodiert, welches, als ein Bestandteil eines größeren Polypeptids, das größere Polypeptid durch einen Sekretionsweg einer Zelle führt, in welcher es synthetisiert wird. Das größere Polypeptid wird gewöhnlich gespalten, um das sekretorische Peptid während dem Durchgang durch den Sekretionsweg zu entfernen.
Ein „isoliertes Polypeptid" ist ein Polypeptid, das im Wesentlichen frei ist von kontaminierenden zellulären Bestandteilen wie Kohlenhydrat, Lipid oder anderen proteinartigen Verunreinigungen, die mit dem Polypeptid in der Natur verbunden sind, ist. Typischerweise enthält eine Zubereitung aus isoliertem Polypeptid das Polypeptid in einer hochgereinigten Form, d. h. zu wenigstens ungefähr 80% rein, wenigstens ungefähr 90% rein, wenigstens ungefähr 95% rein, mehr als 95% rein oder mehr als 99% rein. Ein Weg, um zu zeigen, dass eine bestimmte Proteinzubereitung ein isoliertes Polypeptid enthält, ist durch das Erscheinen einer einzelnen Bande nach Natriumdodecylsulfat-(SDS-)Polyacrylamid-Gelelektrophorese der Proteinzubereitung und Coomassie-Brilliant-Blau-Färbung des Gens. Der Begriff „isoliert" schließt jedoch die Anwesenheit desselben Polypeptids in alternativen physikalischen Formen wie Dimeren oder alternativ glycosilierten oder derivatisierten Formen nicht aus.
Die Begriffe „aminoterminal" und „carboxyterminal" werden hierin verwendet, um Positionen innerhalb von Polypeptiden zu bezeichnen. Wo es der Zusammenhang erlaubt, werden diese Begriffe verwendet mit Bezugnahme auf eine bestimmte Sequenz oder einen Teil eines Polypeptids, um Nähe oder relative Position zu bezeichnen. Zum Beispiel ist eine gewisse Sequenz, die carboxyterminal zu einer Referenzsequenz in einem Polypeptid positioniert ist, proximal zu dem Carboxyterminus der Referenzsequenz lokalisiert, befindet sich jedoch nicht notwendigerweise an dem Carboxyterminus des vollständigen Polypeptids.
Wie hierin verwendet schließt der Begriff „Immunmodulator" Cytokine, Stammzellwachstumsfaktoren, Lymphotoxine, co-stimulierende Moleküle, hämatopoetische Faktoren und synthetische Analoga dieser Moleküle ein. Beispiele von Immunmodulatoren schließen Tumornekrosefaktor, Interleukine, Koloniestimulationsfaktoren, Interferone, Stammzellwachstumsfaktoren, Erythropoietin und Thrombopoietin ein.
Ein „anti-idiotypischer Antikörper" ist ein Antikörper, der an die Domäne der variablen Region eines Immunglobulins bindet.
Ein „Antikörperfragment" ist ein Teil eines Antikörpers wie F(ab')₂, F(ab)₂, Fab', Fab und Ähnliches. Ungeachtet der Struktur bindet ein Antikörperfragment mit demselben Antigen, das durch den intakten Antikörper erkannt wird.
Der Begriff „Antikörperfragment" schließt auch ein synthetisches oder ein genetisch modifiziertes Polypeptid ein, welches an ein spezifisches Antigen bindet, wie zum Beispiel Polypeptide, die aus der leichten Kette der variablen Region bestehen, „Fv"-Fragmente, bestehend aus den variablen Regionen der schweren und leichten Ketten, rekombinante einzelkettige Polypeptidmoleküle, in welchen leichte und schwere variable Regionen durch einen Peptidlinker verbunden sind („scFv-Proteine"), und Minimalerkennungsstellen, bestehend aus den Aminosäureresten, welche die hypervariable Region nachahmen.
Ein „chimärer Antikörper" ist ein rekombinantes Protein, das die variablen Domänen und komplementaritätsbestimmenden Regionen, abgeleitet von einem Nagerantikörper, enthält, während der Rest des Antikörpermoleküls von einem menschlichen Antikörper stammt.
Ein „Fusionsprotein" ist ein Hybridprotein, das von einem Nukleinsäuremolekül exprimiert wird, umfassend Nukleotidsequenzen aus wenigstens zwei Genen.
Der Begriff „Antikörperfusionsprotein" bezieht sich auf ein rekombinantes Molekül, welches einen Antikörper oder ein Antikörperfragment und ein therapeutisches Mittel einschließt. Beispiele von therapeutischen Mitteln, die für solche Fusionsproteine geeignet sind, schließen Immunmodulatoren („Antikörper-Immunmodulator-Fusionsprotein") und Toxine („Antikörper-Toxin-Fusionsprotein") ein. Beispielhafte Toxinbestandteile schließen eine Pseudomonas-Exotoxineinheit, eine Diphtherie-Toxineinheit, eine RNase-Einheit, eine DNase-I-Einheit, eine Gelonineinheit und eine Staphylokokken-Enterotoxin-A-Einheit ein.
Der Begriff „Affinitätsanhang" wird hierin verwendet, um ein Polypeptidsegment zu bezeichnen, das an ein zweites Polypeptid angeheftet werden kann, um für die Aufreinigung oder Detektion des zweiten Polypeptids zu sorgen oder um Stellen für das Anheften des zweiten Polypeptids an ein Substrat bereitzustellen. Im Prinzip kann jedes Peptid oder Protein, für welches ein Antikörper oder ein anderes spezifisches Bindungsmittel erhältlich ist, als ein Affinitätsanhang verwendet werden. Affinitätsanhänge schließen ein: eine Polyhistidindstrecke, Protein A (Nilsson et al., EMBO J. 4: 1075 (1985), Nilsson et al., Methods Enzymol. 198: 3 (1991)), Glutathion-S-Transferase (Smith und Johnson, Gene 67: 31 (1988)), Glu-Glu-Affinitätsanhang (Grussenmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 7952 (1985)), Substanz P, FLAG-Peptid (Hopp et al., Biotechnology 6: 1204 (1988)), Streptavidinbindungspeptid oder ein anderes antigenes Epitop oder Bindungsdomäne. Siehe allgemein Ford et al., Protein Expression and Purification 2: 95 (1991). DNS-Moleküle, die Affinitätsanhänge kodieren, sind von kommerziellen Lieferanten erhältlich (z. B. Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).
Ein „antigenes Peptid" ist ein Peptid, das ein Haupthistokompatibilitätskomplexmolekül binden wird, um einen MHC-Peptid-Komplex zu bilden, welcher von einer Tierzelle erkannt wird, wodurch eine cytotoxische Lymphozytenantwort nach Präsentation an die T-Zelle induziert wird. Folglich sind antigene Peptide in der Lage, an ein geeignetes Haupthistokompatibilitätskomplexmolekül zu binden und eine cytotoxische T-Zell-Antwort zu induzieren, wie zum Beispiel Zelllyse oder spezifische Cytokinfreisetzung gegen die Zielzelle, welche das Antigen bindet oder es exprimiert. Das Antigenpeptid kann in dem Zusammenhang mit einem Haupthistokompatibilitätskomplexmolekül der Klasse I oder der Klasse II auf einer antigenpräsentierenden Zelle oder auf einer Zielzelle gebunden sein.
Wegen der Ungenauigkeit von analytischen Standardverfahren werden Molekulargewichte und Längen von Polymeren als Näherungswerte verstanden. Wenn solch ein Wert ausgedrückt wird als „ungefähr" X oder „annähernd" X, wird der festgestellte Wert von X als genau ±10% verstanden werden.
3. Produktion eines Nukleinsäurepolymers, enthaltend mehrfache Kopien eines Gens von Interesse
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Zellen mit einem Nukleinsäurepolymer transfiziert, welches mehrere Expressionskassetten einschließt, die sich in derselben Orientierung befinden. Die Schaffung solch einer Tandemanordnung maximiert die Stabilität des Polymers nach Integration in die genomische DNS der Wirtszelle. Jede Expressionskassette umfasst das Folgende: (1) eine Nukleotidsequenz, die eine Aminosäuresequenz von Interesse kodiert, auf welche Bezug genommen wird als das „Gen von Interesse", und (2) eine Nukleotidsequenz, die einen selektierbaren Marker kodiert. Geeignete selektierbare Markergene schließen jene ein, die ein Protein kodieren, welches durch ein Arzneimittel titrierbar ist, wie unten beschrieben. Der Vorteil solcher Markergene liegt darin, dass das Maß an Arzneimittelresistenz der Wirtszelle einen Hinweis auf das Maß der selektierbaren Markergenexpression bereitstellt. Nukleinsäurepolymere können durch ein Verhältnis des Gens von Interesse zu selektierbarem Markergen gekennzeichnet sein, welches X:Y ist, worin X eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist, wenn Y einen Wert von 1 hat, und worin Y eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist, wenn X einen Wert von 1 hat. In jedem Fall schließt der Wertebereich von 1 bis 10 Unterbereiche ein wie 2 bis 9, 3 bis 8, 4 bis 7, 5 bis 6, 2 bis 6, 5 bis 10 und Ähnliches.
Gewisse Nukleinsäurepolymere sind gekennzeichnet dadurch, dass sie ein 1:1-Verhältnis für das Verhältnis des Gens von Interesse zu selektierbarem Markergen haben. Da die relative Menge des Gens von Interesse und des selektierbaren Markergens vorbestimmt ist, stellt Arzneimittelresistenz auch ein Maß des Expressionsspiegels des gewünschten Proteins bereit. Diese Beziehung zwischen der Expression des selektierbaren Markergens und des Gens von Interesse ist stärker, wenn das selektierbare Markergenprodukt ein durch ein Arzneimittel titrierbares Protein ist.
A. Gestaltung der Expressionskassette
Eine Expressionskassette umfasst ein Gen von Interesse und ein selektierbares Markergen. Das Gen von Interesse kann jede gewünschte Aminosäuresequenz kodieren. Beispielhafte Aminosäuresequenzen schließen Proteine, Polypeptide, Peptide und Fusionsproteine ein. Polypeptide können aus ungefähr 10 bis ungefähr 20 Aminosäuren bestehen, ungefähr 20 bis ungefähr 40 Aminosäuren, ungefähr 40 bis ungefähr 100 Aminosäuren oder aus mehr als 100 Aminosäuren.
Beispielhafte Proteine schließen Antikörper und Antikörperfragmente, Rezeptoren, Hormone und andere Proteine mit einem möglichen industriellen oder therapeutischen Wert ein. Zum Beispiel kann eine Expressionskassette ein Nukleinsäuremolekül einschließen, welches ein pharmazeutisch aktives Molekül wie Faktor VIIa, Proinsulin, Insulin, follikelstimulierendes Hormon, Gewebe-Plasminogenaktivator, Tumornekrosefaktor, Interleukine (z. B. Interleukin-1 (IL-1), IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20 und IL-21), das Koloniewachstum stimulierende Faktoren (z. B. das Granulocytenkoloniewachstum stimulierender Faktor und Granulocyten-Makrophagen-Koloniewachstum stimulierender Faktor), Interferone (z. B. Interferone -α, -β, -γ, -ω, -δ, -τ und -ε), ein Stammzellwachstumsfaktor, Erythropoietin und Thrombopoietin, kodiert. Zusätzliche Beispiele eines Proteins von Interesse schließen einen Antikörper, ein Antikörperfragment, einen anti-idiotypischen Antikörper (oder ein Fragment davon), einen chimären Antikörper, einen humanisierten Antikörper, ein Antikörperfusionsprotein und Ähnliches ein.
Rekombinante Wirtszellen können erzeugt werden, die das gewünschte Protein in umgebendes Medium sezernieren. Demgemäß fasst die vorliegende Erfindung Expressionskassetten ins Auge, die eine Nukleotidsequenz einschließen, welche eine sekretorische Signalsequenz kodiert, die auch bekannt ist als ein „Signalpeptid", eine „Leitsequenz", eine „Präpro-Sequenz" oder eine „Prä-Sequenz". Die sekretorische Signalsequenz ist operabel an ein Gen von Interesse gekoppelt, so dass die beiden Sequenzen in dem korrekten Leseraster verbunden sind und positioniert sind, um das neu synthetisierte Protein von Interesse in den Sekretionsweg der Wirtszelle zu lenken. Sekretorische Signalsequenzen werden gewöhnlich 5' zu der Nukleotidsequenz positioniert, die die Aminosäuresequenz von Interesse kodiert, obwohl gewisse sekretorische Signalsequenzen anderswo in der Nukleotidsequenz von Interesse positioniert sein können (siehe zum Beispiel Welch et al., US-Patent Nr. 5,037,743; Holland et al., US-Patent Nr. 5,143,830).
Obwohl die sekretorische Signalsequenz eines Proteins, das von Säugerzellen hergestellt wird (z. B. Gewebeplasminogenaktivatorsignalsequenz, wie beschrieben zum Beispiel im US-Patent Nr. 5,641,655), nützlich ist für die Expression des Gens von Interesse in rekombinanten Säugerwirten, wird eine Hefesignalsequenz für die Expression in Hefezellen bevorzugt. Beispiele geeigneter Hefesignalsequenzen sind jene, die von dem Hefepaarungspheromon-α-Faktor stammen (kodiert durch das MFαI-Gen), Invertase (kodiert durch das SUC2-Gen) oder saure Phosphatase (kodiert durch das PHO5-Gen). Siehe zum Beispiel Romanos et al., „Expression of Cloned Genes in Yeast" in DNA Cloning 2: A Practical Approach, zweite Auflage, Glover und Hames (Herausgeber), Seiten 123–167 (Oxford University Press 1995).
Expressionskassetten können auch Nukleotidsequenzen einschließen, die einen Peptidanhang kodieren, um bei der Aufreinigung des gewünschten Proteins zu helfen. Peptidanhänge, die nützlich sind für die Isolation von rekombinanten Polypeptiden, schließen Polyhistidinanhänge (welche eine Affinität für Nickel komplexierendes Harz haben), c-myc-Anhänge, Calmodulinbindungsprotein (isoliert mit Calmodulinaffinitätschromatographie), Substanz P, der RYIRS-Anhang (welcher mit Anti-RYIRS-Antikörpern bindet), der Glu-Glu-Anhang und der FLAG-Anhang (welcher mit Anti-FLAG-Antikörpern bindet). Siehe zum Beispiel Luo et al., Biochem. Biophys. 329: 215 (1996), Morganti et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 23: 67 (1996) und Zheng et al., Gene 186: 55 (1997). Nukleinsäuremoleküle, die solche Peptidanhänge kodieren, sind erhältlich, zum Beispiel von Sigma-Aldrich Corporation (St. Louis, MO).
Eine große Reihe von selektierbaren Markergenen ist erhältlich (siehe zum Beispiel Kaufman, Meth. Enzymol. 185: 487 (1990); Kaufman, Meth. Enzymol. 185: 537 (1990)). In dem vorliegenden Zusammenhang ist ein geeigneter selektierbarer Marker „titrierbar" dahingehend, dass die Resistenz einer Zelle auf eine hohe Dosis eines toxischen Arzneimittels in das Verhältnis gesetzt wird mit der Zahl von selektierbaren Markergenen, die durch die Zelle produziert wird. Diese Eigenschaft fehlt, wenn der selektierbare Marker ein Enzym ist, das eine hohe Anzahl von toxischen Arzneimittelmolekülen pro Enzym neutralisieren kann.
Ble-Gene, wie das Sh-ble-Gen, sind besonders nützliche selektierbare Markergene für die gegenwärtig beschriebenen Verfahren. Diese Gene erzeugen ein Protein, das die Aktivität von Arzneimitteln vom Bleomycin/Phleomycin-Typ wie ZEOCIN (Gatignol et al., Mol. Gen. Genet. 207: 342 (1987); Drocourt et al., Nucl. Acids Res. 18: 4009 (1990), inhibiert. Das von einem Bleomycin-Resistenzgen kodierte Protein bindet ein Arzneimittel vom Bleomycin-Typ in einem 1:1-Verhältnis, was in einer Absonderung des toxischen Arzneimittels resultiert (siehe zum Beispiel Gatignol et al., FEBS Lett, 230: 171 (1988)). Zusätzlich zu der stöchiometrischen Bindung liegt ein anderer Vorteil dieses Systems darin, dass ZEOCIN in einem großen Bereich von Zelltypen toxisch ist, einschließlich Bakterien-, Pilz-, Pflanzen-, Vogel-, Insekten- und Säugerzellen.
Metallothionein-Gene kodieren Proteine, die eine hohe Affinität für toxische Metalle wie Cadmium, Zink und Kupfer haben (Beach und Palmiter, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 78: 2110 (1981); Huang et al., EXS 52: 439 (1987); Czaja et al., J. Cell. Physiol. 147: 434 (1991)). Demgemäß stellen Metallothionein-Gene geeignete titrierbare Marker für die hierein beschriebenen Verfahren bereit.
Zusätzliche selektierbare Marker schließen Hygromycin-B-Phosphotransferase, das AUR1-Genprodukt, Adenosindesaminase, Aminoglycosidphosphotransferase, Dihydrofolatreduktase, Thymidinkinase und Xanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase ein (siehe zum Beispiel Srivastava und Schlessinger, Gene 103: 53 (1991); Romanos et al., „Expression of Cloned Genes in Yeast" in DNA Cloning 2: Expression Systems, zweite Auflage, Seiten 123–167 (IRL Press 1995); Markie, Methods Mol. Biol. 54: 359 (1996); Pfeifer et al., Gene 188: 183 (1997); Tucker und Burke, Gene 199: 25 (1997); Hashida-Okado et al., FEBS Letters 425: 117 (1998)).
Wenn solche selektierbaren Markergene mit den vorliegenden Verfahren verwendet werden, wird bevorzugt ein toxisches Arzneimittel gewählt, welches die enzymatische Aktivität des Genproduktes inhibiert, um die titrierbare Eigenschaft bereitzustellen. Solche Arzneimittel schließen Moleküle ein, welche mit dem selektierbaren Markergenprodukt mit hoher Affinität oder sogar kovalent binden. Zum Beispiel inhibiert 2,4-Diamino-5-[3,5-dimethoxy-4-(p-bromacetamidphenoxy)benzyl]pyrimidin irreversibel Dihydrofolatreduktase von Neisseria gonorrhoeae (Tansik et al., J. Biol. Chem. 259: 12299 (1984). Weiterhin beschrieben Rosowsky et al., J. Med. Chem. 30: 1463 (1987) ein Verfahren für die Zubereitung von Methotrexatanaloga mit einer starken alkylierenden Aktivität durch Ersetzen der L-Glutamatseitenkette mit N-omega-Haloacetylderivaten von L-Lysin und L-Ornithin. N-epsilon-(Bromacetyl)-L-Lysin- und N-delta-(Bromacetyl)-L-Ornithinanaloga ergaben Ergebnisse in Übereinstimmung mit kovalenter Bindung an Dihydrofolatreduktase von Candida albicans und Mausleukämiezellen. Weitere Beispiele schließen Adenosindesaminaseinhibitoren wie Erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl)adenin- (EHNA)Analoga, einschließend 9'-Chlor-EHNA und 9'-Phthalimid-EHNA (Barankiewicz et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 283: 1230 (1997)), ein. Andere geeignete toxische Arzneimittel sind Fachleuten bekannt.
Ein alternativer Ansatz ist, ein selektierbares Markergen zu verwenden, welches ein mutiertes Enzym kodiert, das weniger aktiv ist als das entsprechende Wildtypenzym. Als eine Erläuterung, Munir et al., Protein Eng. 7: 83 (1994) beschreiben die Gestaltung von mutierten Thymidinkinaseenzymen mit reduzierter Aktivität (siehe auch Liu und Summers, Virology 163: 638 (1988); Mendel et al., Antimicrob. Agents Chemother. 39: 2120 (1995)). Mutanten mit niedriger Aktivität wurden auch beschrieben für Adenosindesaminase und Dihydrofolatreduktase (siehe zum Beispiel Prendergast et al., Biochemistry 27: 3664 (1988); Jiang et al., Hum. Mol. Genet. 6: 2271 (1997); Ercikan-Abali et al., Mol. Pharmacol. 49: 430 (1996)).
Eine andere Art eines selektierbaren Markergens ist ein Gen, das ein leicht detektierbares Protein wie grünes fluoreszierendes Protein, rotes fluoreszierendes Protein, ein Enzym (z. B. alkalische Phosphatase aus Plazenta) oder ein Zelloberflächenprotein, das mit einem Antikörper (z. B. CD4, CD8, Klasse-I-Haupthistokompatibilitätskomplex-(MHC)Protein, etc.) detektiert werden kann, produziert. Die Expressionsprodukte solcher selektierbarer Markergene können verwendet werden, um transfizierte Zellen von untransfizierten Zellen durch solche Standardmittel wie FACS-Sortierung oder Separationstechnologie durch Magnetperlen auszusortieren.
Nukleinsäuremoleküle, die eine Aminosäuresequenz von Interesse oder einen selektierbaren Marker kodieren, können durch Screening einer menschlichen cDNS- oder genomischen Bibliothek unter Verwendung von Standardtechniken erhalten werden. Alternativ können solche Gene erhalten werden durch Synthetisieren von Nukleinsäuremolekülen unter Verwendung von wechselseitig primenden langen Oligonukleotiden oder durch chemische DNS-Synthese. Zusätzlich sind viele geeignete Protein kodierende Nukleinsäuremoleküle im Handel erhältlich.
Um ein Gen von Interesse oder ein selektierbares Markergen zu exprimieren, muss ein die Aminosäuresequenz kodierendes Nukleinsäuremolekül operabel an Regulationssequenzen gekoppelt sein, welche die Transkriptionsexpression kontrollieren, und muss dann in eine Wirtszelle eingeführt werden. Zusätzlich zu Transkriptionsregulationssequenzen wie Promotoren und Enhancern können Expressionsvektoren Transkriptions- und Translationsregulationssequenzen einschließen. Für einen Säugerwirt können die Transkriptions- und Translationsregulationssignale aus viralen Quellen stammen wie Adenovirus, Rinderpapillomavirus, Affenvirus oder Ähnliches, in welchen die Regulationssignale mit einem bestimmten Gen verbunden sind, welches ein hohes Expressionsmaß hat. Geeignete Transkriptions- und Translationsregulationssequenzen können auch aus Säugergenen gewonnen werden, wie Aktin-, Collagen-, Myosin- und Metallothioneingenen.
Geeignete Transkriptionsregulationssequenzen schließen eine Promoterregion ein, die ausreichend ist, den Start der RNS-Synthese zu lenken. Geeignete eukaryotische Promotoren schließen den Promoter des Maus-Metallothionein-I-Gens (Hamer et al., J. Molec. Appl. Genet. 1: 273 (1982)), den TK-Promoter von Herpes-Virus (McKnight, Cell 31: 355 (1982)), den frühen SV40-Promoter (Benoist et al., Nature 290: 304 (1981)), den Rous-Sarcoma-Viruspromoter (Gorman et al., Proc. Nat'l Acad Sci. USA 79: 6777 (1982)), den Cytomegaloviruspromoter (Foecking et al., Gene 45: 101 (1980)) und den Mausbrustdrüsentumorviruspromoter (siehe allgemein Etcheverry, "Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture" in Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (Herausgeber), Seiten 164–181 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)) ein.
Alternativ kann ein prokaryotischer Promoter wie der RNS-Polymerase-Promoter des Bakteriophagen T3 verwendet werden, um die Expression des Gens von Interesse in Säugerzellen zu kontrollieren, falls der prokaryotische Promoter durch einen eukaryotischen Promoter reguliert wird (Zhou et al., Mol. Cell. Biol. 10: 4529 (1990) und Kaufman et al., Nucl. Acids Res. 19: 4485 (1991)). In bestimmten Expressionskassetten wird die Nukleotidsequenz, die stromaufwärts des Startcodons des selektierbaren Markergens sitzt, mutiert, um eine Umgebung zu schaffen, die für den Translationsstart ungünstig ist. Das Ziel dieser Art von Änderung ist, das Expressionsmaß des selektierbaren Markergens pro Expressionseinheit zu reduzieren. Auf diesem Wege spiegelt ein hohes Expressionsmaß des selektierbaren Markergens genauer die Anzahl von in vitro amplifizierten Einheiten, die von der Wirtszelle getragen werden, wider.
Zum Beispiel können wenigstens eine der -3-, -6- und -9-Positionen zu einem Thymidinnukleotid mutiert sein. Ferner können Adenin- oder Cytidinnukleotide, die in wenigstens eine der Positionen -1, -2, -4 und -5 sitzen, zu Guanosin- oder Thymidinnukleotiden mutiert sein, um weiter die Effizienz des Translationsstarts zu reduzieren. Die Nukleotidsequenz 5' ...TCCTGTTGT ATG ...3' (Sequenz ID Nr. 3) ist ein Beispiel einer Nukleotidsequenz, die stromaufwärts eines Startcodons sitzen kann, wodurch eine reduzierte Effizienz des Translationsstarts bereitgestellt wird. Zusätzliche Nukleotidsequenzmodifikationen können von Fachleuten erdacht werden.
In einer anderen Variation kann eine Nukleotidsequenz eingeschlossen sein, welche die Expressionskassette flankiert, um die eingeführten Sequenzen vor unerwünschten Regulationswirkungen von zellulärem Chromatin zu isolieren. Als eine Erläuterung, solch eine Isolationssequenz kann stromaufwärts eines CMV-Promoters platziert sein. Siehe zum Beispiel Chung et al., Cell 74: 505 (1993).
Es mag für rekombinante Wirtszellen vorteilhaft sein, gewisse selektierbare Markergenprodukte auf der Zelloberfläche zu exprimieren. Zum Beispiel kann grünes fluoreszierendes Protein auf der Zelloberfläche exprimiert werden. Zahlreiche Ansätze können verwendet werden, um Oberflächendarstellung zu erzielen durch die Produktion von Fusionsproteinen, welche das selektierbare Markergen und eine Transmembrandomäne aus einem anderen Protein enthalten, um das Fusionsprotein in der Zellmembran zu verankern. Als ein Beispiel, pDisplay^TM ist ein im Handel erhältlicher Vektor, der verwendet wird, um ein Polypeptid auf der Oberfläche einer Säugerzelle abzubilden (INVITROGEN Corp.; Carlsbad, CA). Bei diesem Vektor sitzt eine multiple Klonierungsstelle zwischen Sequenzen, die zwei identifizierbare Peptide, Hämagglutinin A und myc-Epitope, kodieren. Der Vektor schließt auch Sequenzen ein, die ein N-terminales Signalpeptid, abgeleitet aus der Mausimmunglobulin-κ-Kette, und eine Typ-I-Transmembrandomäne von einem von Blutplättchen stammenden Wachstumsfaktorrezeptor, lokalisiert an dem C-Terminus, kodieren. Auf diesem Wege wird ein selektierbares Markergenprodukt durch eine transfizierte Zelle als ein extrazelluläres Fusionsprotein exprimiert, verankert an der Plasmamembran bei dem C-Terminus des Fusionsproteins durch die Transmembrandomäne.
Alternativ kann eine Nukleotidsequenz, die eine Signalankerdomäne vom Typ II kodiert, verwendet werden, um Oberflächendarstellung des selektierbaren Markergenproduktes bereitzustellen. Beispiele von Typ II-Zelloberflächenproteinen, die solche Signalankerdomänen einschließen, schließen ein: Influenzaneuraminidase, die kleinen hydrophoben Proteine des Paramyxovirus-Affenvirus, die Paramyxovirus-Hämagglutinin-Neuraminidase, menschliche und Ratten-Asialoglycoproteinrezeptoren, Hühnerleberlectin, neutrale menschliche und Kaninchen-Endopeptidase, menschliche Darmaminopeptidase, Kaninchen-Sucrase-Isomaltase-Rezeptor, menschlicher Transferrinrezeptor, Leberglycoproteinerezeptor, menschlicher IgE-Rezeptor, Maus-1,4-β-Galactosyltransferase, menschlicher P-Glycoproteinrezeptor, menschliche invariable Ketten von Klasse-II-Histokompatibilitätsantigenen, Rattennatriumkanalproteine, Rattengehirn-, -muskel- und -leberglucosetransporterproteine, bakterielle Leitpeptidase und Mitglieder der Superfamilie an Tumornekrosefaktoren/Nervenwachstumsfaktoren (siehe zum Beispiel Wolfe et al., J. Biol. Chem. 258: 12073 (1983); Chiacchi und Drickamer, J. Biol. Chem. 259: 15440 (1984); Hiebert et al., J. Virol. 54: 1 (1985); Hiebert et al., J. Virol. 55: 744 (1985); Schneider et al., Nature 311: 675 (1984); Spiess und Lodish, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82: 6465 (1985); Strubin et al., EMBO J. 3: 869 (1984); Semenza, Annu. Rev. Cell Biol. 2: 255 (1986); Lipp und Dobberstein, J. Cell Biol. 106: 1813 (1988); Hartmann et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86: 5786 (1989)). Ferner offenbaren Chou und Elrod, Proteins: Structure, Function and Genetics 34: 137 (1999) 152 Membranproteine von Typ II, die sie verwendeten, um ein Verfahren für die Vorhersage, ob eine Aminosäuresequenz die Typ-II-Membranproteinstruktur verleiht, zu ersinnen.
Expressionskassetten können gestaltet werden, um zwei „Transkriptionseinheiten" einzuschließen, wobei jede ein Transkriptionsregulationselement, eine kodierende Region und einen Transkriptionsterminator umfasst. Bei diesem System kodiert eine kodierende Region die Aminosäuresequenz von Interesse, wohingegen die zweite kodierende Region den selektierbaren Marker kodiert. Beide Transkriptionseinheiten können dasselbe Transkriptionsregulationselement enthalten.
Alternativ kann eine Expressionskassette Regionen umfassen, die die Aminosäuresequenz von Interesse und einen selektierbaren Marker kodieren, worin die kodierenden Regionen zwischen einem Transkriptionsregulationselement und einem Transkriptionsterminator liegen, falls jede der kodierenden Regionen ihre eigene Ribosomenbindungsstelle hat (siehe zum Beispiel Lee et al., Nucl. Acids Res. 12: 6797 (1984)). Solch eine Expressionskassette umfasst eine polycistronische Transkriptionseinheit. Zur Erläuterung, eine Expressionskassette kann ein inneres, mit einer Ribosomeneintrittsstelle gekoppeltes selektierbares Markergen einschließen, welches stromabwärts der kodierenden Region für die Aminosäuresequenz von Interesse liegt.
B. Gestaltung eines Vektors, der eine Expressionskassette umfasst
Expressionsvektoren, die für die Produktion eines gewünschten Proteins in eukaryotischen Zellen geeignet sind, enthalten typischerweise: (1) prokaryotische DNS-Elemente, die für einen bakteriellen Replikationsstart und einen Antibiotikaresistenzmarker kodieren, um für das Wachstum und die Selektion des Expressionsvektors in einem bakteriellen Wirt zu sorgen; (2) eukaryotische DNS-Elemente, die den Transkriptionsstart kontrollieren, wie ein Promoter; (3) DNS-Elemente, die das Verarbeiten von Transkripten kontrollieren, wie zum Beispiel eine Transkriptionsterminations/Polyadenylierungssequenz; und (4) ein selektierbares Markergen für eukaryotische Zellen. Wie oben diskutiert, können Expressionsvektoren auch Nukleotidsequenzen einschließen, die eine Sekretionssequenz kodieren, welche das heterologe Polypeptid in den Sekretionsweg einer Wirtszelle lenkt. Weiterhin können Vektoren für die Hochexpression in Hefe Targetingsequenzen einschließen, um die homologe Rekombination in einer genomischen Wirts-DNS zu fördern.
Zusätzlich kann ein Expressionsvektor, der für die Verwendung bei dem hierin beschriebenen Verfahren geeignet ist, wenigstens eine Spaltstelle enthalten, die nicht-palindromische Enden bereitstellt. Von Restriktionsenzymen erkannte Sequenzen sind typischerweise vollständig symmetrische invertierte Wiederholungen, bekannt als Palindrome. Das heißt, die Reihenfolge der Basen ist dieselbe, wenn die beiden Stränge des Palindroms in entgegengesetzte Richtungen gelesen werden. Palindromische Enden sind selbstkomplementär und können mit sich selbst ligieren oder können mit einem identischen Terminus, der in die entgegengesetzte Richtung zeigt, ligieren. Folglich wird Selbstligation von Vektoren mit palindromischen Enden Polymere erzeugen, die Einheiten enthalten, die in gemischten Richtungen orientiert sind.
Restriktionsendonukleasen gehören zu drei allgemeinen Klassen. Restriktionsendonukleasen der Klasse I spalten nach stark variierenden Abständen von ihrer Erkennungsstellen. Restriktionsendonukleasen der Klasse II spalten innerhalb ihrer Erkennungsstellen, während eine Unterklasse, Klasse IIS, an präzisen Abständen außerhalb ihrer Erkennungsstellen spaltet. Ähnlich wie Klasse-IIS-Enzyme haben Klasse-III-Enzyme gesonderte Erkennungs- und Spaltdomänen. Die Restriktionsenzyme und Methyltransferasen der Klasse IIS sind jedoch gesonderte Moleküle, wohingegen sie für die Klasse III eine einzelne Multidomäneneinheit bilden.
Da die Erkennungs- und Spaltstellen dieselben sind für Klasse-II-Enzyme und unterschiedlich sind für Klasse-IIS-Enzyme, haben die Produkte dieser beiden Klassen unterschiedliche Eigenschaften. Klasse-II-Enzyme spalten innerhalb einer symmetrischen Erkennungsstelle, wodurch Sequenzen mit einer Orientierung 5' zu 3' hergestellt werden, welche für beide Stränge identisch sind. Zum Beispiel spaltet EcoRI wie folgt:
Im Gegensatz dazu spaltet eine Restriktionsendonuklease der Klasse IIS außerhalb einer asymmetrischen Erkennungsstelle in einem präzisen Abstand von der Stelle. Wegen dieser Asymmetrie sind die 5'- zu 3'-Erkennungssequenzen für jeden Strang unterschiedlich. Zum Beispiel spaltet BstXI die folgende Sequenz (CCAANNNNNNTGG (Sequenz ID Nr. 4)/GGTNNNNNNACC (Sequenz ID Nr. 5)), wobei „N" irgendein Nukleotid ist:
Wenn DNS-Fragmente, die diese nicht-palindromischen oder „rotatorisch nicht äquivalenten" Enden enthalten, miteinander ligiert werden, werden die Fragmente gerichtet inseriert.
Geeignete Klasse-II-Restriktionsenzyme schließen jene Enzyme ein, die eine fünf Basen enthaltende fortlaufende Sequenz erkennen, wie die folgenden Enzyme und ihre Isoschizomere, die in Klammern angegeben sind: Alw26I (BsmAI), AlwI (AclWI, BinI), AsuHPI (HphI), BbvI (Bst71I), BcefI, BstF5I (BseGI, FokI), FauI, HgaI, MbolI, PleI, SfaNI und TspRI. Die folgenden Klasse-IIS-Enzyme, die eine sechs Basen umfassende fortlaufende Sequenz erkennen, können ebenfalls verwendet werden: AceIII, BbsI (BbvII, BpiI, BpuAI), Bce83I, BciVI, BfiI (BmrI), BpmI (GsuI), BsaI (Eco31I), BseRI, BsgI, BsmBI (Esp3I), BsmFI, BspMI, BsrDI (Bse3DI), Bsu6I (Eam1104I, EarI, Ksp632I), Eco571, FauI, MmeI, RleAI, TaqII und Tth111II. SapI, das eine sieben Basen aufweisende Sequenz erkennt, und SfiI, welches eine acht Basen enthaltende Sequenz erkennt, können auch verwendet werden, um einen Expressionsvektor zu spalten. Weitere Beispiele nützlicher Enzyme schließen jene ein, die eine Vier-Basenpaar-Split-Sequenz erkennen (z. B. Bse4I (BseLI, MsiYI, BslI), MwoI), und Enzyme, die eine Sechs-Basenpaar-Split-Sequenz erkennen (z. B. AccB7I (Esp1396I, PflMI, Van91I), AdeI (DraIII), AhdI (AspEI, Eam1105I, EchHKI, NruGI), AlwNI, ApaBI (BstAPI), AspI (PflFI, Tth111I), BglI, BstXI, DrdI (DseDI), EcoNI (XagI), XcmI). Zusätzliche geeignete Klasse-IIS-Restriktionsenzyme sind Fachleuten bekannt (siehe zum Beispiel Szybalski et al., Gene 100: 13 (1991)).
Es gibt andere Enzyme, die keine Enzyme der Klasse IIS sind, welche nicht-palindromische Enden erzeugen. Diese sind ebenfalls für die gegenwärtig beschriebenen Verfahren geeignet. Beispiele solcher Enzyme schließen ein: AvaI (Ama87I, BcoI, BsoBI, Eco88I), AvaII (Eco47I, Bme18I, HgiEI, SinI), BanI (AccB1I, BshNI, Eco64I), BfmI (BstSFI, SfcI), Bpu10I, BsaMI (BscCI, BsmI, Mva1269I), Bsh1285I (BsaOI, BsiEI, BstMCI), Bse1I (BseNI, BsrI, Cfr10I), BsiI (BssSI, Bst2BI), BsiZI (AspS9I, Cfr13I, Sau96I), Bsp1720I (BlpI, Bpu1102I, CelII), Bst4CI, BstDEI (DdeI), CpoI (CspI, RsrII), DsaI (BstDSI), Eco24I (BanII, EcoT38I, FriOI, HgiJII), Eco130I (StyI, BssT1I, EcoT14I, ErhI), EspI (BlpI, Bpu1102I, Bsp1720I, CelII), HgiAI (BsiHKAI, Alw21I, AspHI, Bbv12I), HinfI, PspPPI (PpuMI, Psp5II), SanDI, SduI (Bsp1286I, BmyI), SecI (BsaJI, BseDI), SfcI (BfmI, BstSFII) und SmlI. Geeignete Enzyme erkennen eine Sechs-Basen-Sequenz, eine Sieben-Basen-Sequenz oder eine Acht-Basen-Sequenz.
Als eine Alternative dazu kann ein Expressionsvektor verwendet werden, welchem eine Enzymspaltstelle fehlt, die nicht-palindromische Enden erzeugen wird. In diesem Fall werden geeignete Enden mit einem Enzym, das Exonukleaseaktivität hat, erzeugt, wie unten beschrieben.
Nach der Konstruktion des Expressionsvektors wird der Vektor in einer Wirtszelle vermehrt, um Nukleinsäuremoleküle für die Schaffung eines Nukleinsäurepolymers zu synthetisieren. Vektorvermehrung wird günstig in einer prokaryotischen Wirtszelle durchgeführt, wie zum Beispiel E. coli oder Bacillus subtilus. Geeignete Stämme von E. coli schließen die Folgenden ein: BL21(DE3), BL21(DE3)pLysS, BL21(DE3)pLysE, DH1, DH4I, DH5, DH5I, DH5IF, DH5IMCR, DH10B, DH10B/p3, DH11S, C600, HB101, JM101, JM105, JM109, JM110, K38, RR1, Y1088, Y1089, CSH18, ER1451 und ER1647 (siehe zum Beispiel Brown (Herausgeber) Molecular Biology Labfax (Academic Press 1991)). Geeignete Stämme von Bacillus subtilus schließen BR151, YB886, MI119, MI120 und B170 ein (siehe zum Beispiel Hardy, „Bacillus Cloning Methods" in DNA Cloning: A Practical Approach, Glover (Herausgeber)(IRL Press 1985)). Standardtechniken für die Vermehrung von Vektoren in prokaryotischen Wirten sind Fachleuten wohl bekannt (siehe zum Beispiel Ausubel et al. (Herausgeber), Short Protocols in Molecular Biology, dritte Auflage (John Wiley & Sons 1995) [„Ausubel 1995"]; Wu et al., Methods in Gene Biotechnology (CRC Press, Inc. 1997)).
C. Erzeugung des Nukleinsäurepolymers
Nach einem Ansatz wird ein Expressionsvektor mit einem Restriktionsenzym gespalten, um nicht-palindromische Enden zu erzeugen. Auf diesem Wege wird die anschließende Ligation ein Polymer produzieren, das Untereinheiten mit derselben Orientierung umfasst.
Es ist auch möglich, einen Expressionsvektor mit einem Enzym zu spalten, das palindromische Enden produziert. Die gespaltene DNS sollte jedoch behandelt werden, um nicht-palindromische Enden zu erzeugen. Dieses Ziel kann zum Beispiel erzielt werden durch Behandlung mit einem Enzym, das eine 3'-Exonukleaseaktivität bereitstellt. Beispielhafte Enzyme schließen T4-DNS-Polymerase, DNS-Polymerase I von E. coli, Klenow-Fragment von DNS-Polymerase I, DEEP-VENT-DNS-Polymerase und VENT-DNS-Polymerase ein.
Zum Beispiel kann die 3'-Exonukleaseaktivität von T4-DNS-Polymerase verwendet werden, um nicht-palindromische Enden aus palindromischen Enden zu erzeugen, wie beschrieben von Kuijper et al., Gene 112: 147 (1992). Als eine Erläuterung, ein Vektor, umfassend die Sequenz ACTGCACCGGAATTCTGTGCGTAGG (Sequenz ID Nr. 6)/TGACGTGGCCTTAAGACACGCATCC (Sequenz ID Nr. 7) kann mit EcoRI gespalten werden, um die folgenden palindromischen Enden zu erzeugen:
Behandlung mit T4-DNS-Polymerase in der Anwesenheit von dTTP wird Nukleotide entfernen solange bis das Enzym ein dT-Nukleotid erreicht. An diesem Punkt wird das Enzym anfangen, zwischen einer Polymerasereaktion und einer Exonukleasereaktion abzuwechseln. Als ein Ergebnis werden die folgenden nicht-palindromischen Enden erhalten:
Auf diese Weise behandelte Expressionsvektoren werden nur als tandemartige Wiederholungen mit Kopf-Schwanz-Orientierungen ligieren. Bestimmte nicht-palindromische Enden können gestaltet werden durch Selektieren geeigneter Desoxynukleotide für die Exonukleasereaktion.
Restriktionsenzyme und DNS-Polymerasen können inaktiviert werden durch Standardverfahren, einschließlich Hitzeinaktivierung. Ferner können diese Enzyme aus einer Mischung, enthaltend ein gespaltenes DNS-Molekül durch Extraktion mit organischen Lösungen wie einer Phenol-Chloroform-Lösung und Ähnlichem entfernt werden.
Allgemeine Verfahren für das Ligieren von Nukleinsäuremolekülen sind Fachleuten bekannt. Siehe zum Beispiel Ausubel et al. (Herausgeber), Short Protocols in Molecular Biology, dritte Auflage (John Wiley & Sons 1995). Nach der Polymerisierung kann es wünschenswert sein, die Größe des Nukleinsäurepolymers zu reduzieren. Dies kann erzielt werden durch Fragmentieren des Nukleinsäurepolymers mit mechanischem Scheren.
Alternativ dazu können Oligonukleotide während der Ligation hinzugefügt werden, um die Größe des Nukleinsäurepolymers zu begrenzen. Bei diesem Ansatz hat ein Ende des „Abbrucholigonukleotids" eine Sequenz, die komplementär zu dem gespaltenen Vektor ist und mit einem anderen gespaltenen Vektor um die Ligation konkurrieren kann. Dem anderen Ende des Oligonukleotids fehlt eine komplementäre Sequenz zu der gespaltenen Vektorsequenz und ihm kann auch eine Phosphatgruppe an dem 5'-Ende fehlen, um eine Ligationsreaktion zu unterstützen. Deshalb inhibiert der Einbau eines Abbrucholigonukleotids durch ein verlängerndes Nukleinsäurepolymer die weitere Verlängerung des Polymers. Auf diesem Wege kann die Länge des Nukleinsäurepolymers kontrolliert werden durch Variieren des molaren Verhältnisses von Abbrucholigonukleotid zu gespaltenem Vektor bei der Ligationsreaktion.
Studien mit Abbrucholigonukleotiden zeigten, dass die Anzahl von Vektoreinheiten in einem Nukleinsäurepolymer proportional zu dem molaren Überschuss von Vektoreinheit zu Abbrucholigonukleotid sein wird. Zum Beispiel scheint ein molares Verhältnis von 1:100 (Abbrucholigonukleotid:Vektor) keine inhibitorische Wirkung auf die Vektorpolymerisation zu haben. Verdopplung der Menge des Abbrucholigonukleotids resultierte auch in einem Polymer mit hohem Molekulargewicht. Im Gegensatz dazu schien ein molares Verhältnis von 10:1 (Abbrucholigonukleotid:Vektor) Polymerisation auf einem Niveau von 90% zu inhibieren. Fachleute können ähnliche Studien durchführen, um die Polymerisation für bestimmte Vektoren oder Expressionskassetten zu optimieren.
Ein Abbrucholigonukleotid kann einzelsträngig oder doppelsträngig sein. Die doppelsträngige Form minimiert eine mögliche Sekundärstruktur, die die Zugänglichkeit der komplementären Enden reduzieren könnte. Ein doppelsträngiges Abbrucholigonukleotid kann als zwei teilweise komplementäre Oligonukleotide hergestellt werden. Die Komplementaritätsregion in einem doppelsträngigen Abbrucholigonukleotid kann von ungefähr 15 bis ungefähr 30 Basenpaaren in der Länge variieren, um für Stabilität zu sorgen, und der Sequenz sollten palindromische Sequenzen fehlen, welche eine Hybridbildung zwischen den Strängen fördern würden. Einzelsträngige Abbrucholigonukleotide sollten kürzer sein als zehn Oligonukleotide, um eine mögliche Sekundärstruktur zu minimieren, welche die Zugänglichkeit des komplementären Endes reduzieren würde.
Abbrucholigonukleotide können unter Verwendung von Standardtechniken synthetisiert werden. Zum Beispiel kann ein Abbrucholigonukleotid als zwei teilweise komplementäre Oligonukleotide hergestellt werden, die durch Erhitzen auf 90°C denaturiert werden und eine doppelsträngigen Konformation unter Bedingungen gebildet wird, welche die DNS-Hybridisierung bevorzugen. Eine geeignete Bedingung wäre 72°C in der Anwesenheit von 10 mM NaCl, pH 8,0.
Die vorliegende Erfindung schließt auch die Produktion von Heteropolymeren ein, welche Expressionsvektoren, enthaltend unterschiedliche Gene, umfassen. Als ein Beispiel, es kann notwendig sein, Zellen mit Genen zu transfizieren, die Posttranslationsverarbeitungsenzyme für das Protein von Interesse kodieren. In diesem Fall können linearisierte Expressionsvektoren, die Gene für die geeigneten Enzyme einschließen, ligiert werden, um ein Heteropolymer zu erzeugen. Die Verarbeitungsgene können durch ähnliche Regulationselemente kontrolliert werden. Weiterhin können die relativen Mengen der Gene kontrolliert werden durch Ändern der Verhältnisse der verschiedenen Expressionsvektoren. Ähnlich können Heteropolymere erdacht werden, um für die Expression von Untereinheiten eines multimeren Proteins zu sorgen, oder um für eine rekombinante Wirtszelle mit mehreren Mitgliedern eines Stoffwechselwegs zu sorgen, die die Eigenschaften der Wirtszelle modifizieren können.
Eine andere Form eines Heteropolymers umfasst zwei Typen von Expressionskassetten, wobei jede ein Nukleotidsequenz umfasst, die dieselbe Aminosäuresequenz von Interesse kodiert, welche unterschiedliche selektierbare Markergene enthält. In diesem Fall werden rekombinante Wirtszellen für Hochexpression der gewünschten Aminosäuresequenz durch eine Expression in einem hohen Maße von beiden selektierbaren Markergenen selektiert. Solch ein Heteropolymer braucht keine Vektorsequenzen einzuschließen. Das heißt, das Heteropolymer kann durch Polymerisation von Expressionskassetten erzeugt werden.
Nach einem anderen allgemeinen Ansatz werden Expressionskassetten polymerisiert, um ein Nukleinsäurepolymer für die Transfektion von eukaryotischen Zellen bereitzustellen. Solch einem Nukleinsäurepolymer kann jede Vektornukleotidsequenz fehlen. Typischerweise ist es notwendig, einen Vektor in einer bakteriellen oder anderen Zwischenzelle zu vermehren, um ausreichend Nukleinsäure für das Einführen in die Wirtszelle zu erzeugen, die verwendet wird für die Expression des rekombinanten Proteins. Dieses Vorgehen hat jedoch etliche Nachteile.

(1) Der Expressionsvektor enthält Bakteriensequenzen, wie zum Beispiel einen Arzneimittelresistenzmarker für die Selektion in mikrobiellen Zellen und einen mikrobiellen Replikationsstartpunkt für die DNS-Replikation. Diese Sequenzen, die gewöhnlich nicht erforderlich sind in der produzierenden Wirtszelle, können für gewisse Zellen inhibitorisch sein oder können die Stabilität der DNS in der produzierenden Wirtszelle reduzieren.
(2) Die Anwesenheit von mikrobieller DNS in der eukaryotischen Wirtszelle reduziert die Kopienzahl rekombinanter Protein-kodierender Sequenzen, die von der produzierenden Wirtszelle getragen werden kann.
(3) Da der mikrobielle Arzneimittelselektionsmarker und die Expressionskassette in dem Vektor liegen, ist es nicht möglich, das Verhältnis dieser Elemente in Bezug aufeinander zu variieren. Dies kann ein Problem darstellen, falls das Selektionsmarkerprotein für einen eukaryotischen Wirt cytotoxisch ist, wenn es in hohen Spiegeln akkumuliert wird. Deshalb kann es vorteilhaft sein, das Verhältnis von Arzneimittelselektionsmarker zu Expressionskassette zu reduzieren, um die Ausbeute des rekombinanten Proteins zu erhöhen.
(4) Eine andere Folge der Verwendung von DNS-Elementen, die an denselben Vektor operabel gekoppelt sind, ist, dass jede Modifikation an den Elementen oder das Einführen, Ersetzen, die Deletion oder das Reshuffling der Elemente die Rekonstruktion des gesamten Plasmids und der zubereiteten DNS vor dem Einführen in Wirtszellen notwendig macht. Nachfolgend ist es nicht günstig mehrfache Varianten des Vektors zu machen, um die Ausbeute des rekombinanten Proteins zu verbessern.

Folglich besteht ein Bedarf für ein bequemes Verfahren, multiple Varianten eines Nukleinsäurepolymers zu machen, welches Expressionskassetten umfasst und das frei von fremden Vektorsequenzen ist, ebenso wie ein Bedarf für ein einfaches Mittel, das Verhältnis, die relative Reihenfolge oder die Zusammensetzung von funktionellen Elementen zu variieren, besteht. Zum Beispiel kann eine Sammlung aus funktionellen Nukleinsäureelementen durch PCR synthetisiert werden oder aus Plasmiden ausgeschnitten werden. Es ist dann möglich, an die Enden dieser Elemente eine Reihe von nicht-palindromischen kohäsiven Enden anzubringen, welche die Ligation der Elemente in einer definierten und vorhersagbaren Zusammensetzung vermitteln. Auf diesem Wege kann eine Vielzahl von Nukleinsäurepolymeren mit nützlichen Funktionen leicht konstruiert und in Wirtszellen eingeführt werden. Da das Nukleinsäurepolymer nicht in einer bakteriellen oder anderen Zwischenzelle vor dem Einführen in die endgültige eukaryotische Wirtszelle vermehrt wird, braucht das DNS-Polymer DNS-Replikations- oder -Selektionselemente nicht einzuschließen, die keine nützliche Funktion in der eukaryotischen Wirtszelle bereitstellen.
4. Produktion von rekombinantem Protein durch Wirtszellen
Das Protein von Interesse kann in jeder prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszelle exprimiert werden. Das Protein von Interesse kann durch eine prokaryotische Zelle erzeugt werden, wie zum Beispiel eine Säugerzelle, Pilzzelle, Insektenzelle, Vogelzelle und Ähnliches. Beispiele geeigneter Säugerwirtszellen schließen Nierenzellen von afrikanischen grünen Meerkatzen (Vero; ATCC CRL 1587), menschliche embryonale Nierenzellen (293-HEK; ATCC CRL 1573), Babyhamsternierenzellen (BHK-21, BHK-570; ATCC CRL 8544, ATCC CRL 10314), Hundenierenzellen (MDCK; ATCC CCL 34), chinesische Hamsterovarzellen (CHO-K1; ATCC CCL61; CHO DG44 (Chasin et al., Som. Cell. Molec. Genet. 12: 555, 1986)), Rattenhypophysenzellen (GH1; ATCC CCL82), HeLa-S3-Zellen (ATCC CCL2.2), Rattenhepatomzellen (H-4-II-E; ATCC CRL 1548), SV40-transformierte Affennierenzellen (COS-1; ATCC CRL 1650) und embryonale Mauszellen (NIH-3T3; ATCC CRL 1658) ein.
Ein Nukleinsäurepolymer kann in Wirtszellen unter Verwendung einer Reihe von Standardtechniken eingeführt werden, einschließlich Calciumphosphattransfektion, liposomvermittelte Transfektion, mikroprojektilvermittelte Zufuhr, Elektroporation und Ähnliches. Transfizierte Zellen können selektiert und vermehrt werden, um rekombinanten Wirtszellen bereitzustellen, welche das Gen von Interesse in das Wirtszellgenom stabil integriert einschließen.
Das Baculovirussystem sorgt für ein effizientes Mittel, klonierte Gene von Interesse in Insektenzellen einzuführen. Geeignete Expressionsvektoren werden auf dem Autographa californica multipler Nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) basiert und enthalten wohlbekannte Promotoren wie das Drosophila-Hitzeschockprotein-(hsp-)70-Promoter, den Immediateearly-Genpromoter (ie-I) von Autographa californica Nucleopolyhedrovirus und den Delayed-early-39K-Promoter, Baculovirus-p10-Promoter und den Drosophila-Metallothionein-Promoter. Ein zweites Verfahren für die Herstellung von rekombinantem Baculovirus nutzt ein auf Transposon basiertes System, beschrieben von Luckow (Luckow et al., J. Virol. 67: 4566 (1993)). Dieses System, welches Transfervektoren nutzt, wird in dem BAC-to-BAC-Kit (Life Technologies Rockville, MD) verkauft. Dieses System nutzt einen Transfervektor, PFASTBAC (Life Technologies), enthaltend ein Tn7-Transposon, um die das Zace2-Polypeptid kodierende DNS in ein Baculovirusgenom, das in E. coli aufrechterhalten wird, in der Form eines großen Plasmids, genannt ein „Bacmid", zu bewegen. Siehe Hill-Perkins und Possee, J. Gen. Virol. 71: 971 (1990); Bonning et al., J. Gen. Virol. 75: 1551 (1994) und Chazenbalk und Rapoport, J. Biol. Chem. 270: 1543 (1995). Zusätzlich können Transfervektoren eine im Leseraster befindliche Fusion mit DNS, die einen Epitopanhang kodiert, an dem C- oder N-Terminus des exprimierten Polypeptids, zum Beispiel einen Glu-Glu-Epitopanhang (Grussenmeyer et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. 82: 7952 (1995)) beinhalten. Unter Verwendung einer in der Technik bekannten Technik wird ein Transfervektor, enthaltend ein Gen von Interesse, in E. coli transformiert und auf Bacmide gescreent, die ein unterbrochenes lacZ-Gen enthalten, was für ein rekombinantes Baculovirus anzeigend ist. Die Bacmid-DNS, enthaltend das rekombinante Baculovirusgenom, wird dann unter Verwendung von üblichen Techniken isoliert.
Das rekombinante Virus oder Bacmid wird verwendet, um Wirtszellen zu transfizieren. Geeignete Insektenwirtszellen schließen Zelllinien ein, die abgeleitet sind von IPLB-Sf-21, einer Puppenovarzelllinie aus Spodoptera frugiperda, wie zum Beispiel Sf9 (ATCC CRL, 1711), Sf21AE und Sf21 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA), ebenso wie Drosophila-Schneider-2-Zellen und die HIGH-FIVEO-Zelllinie (Invitrogen), gewonnen aus Trichoplusia ni (US-Patent Nr. 5,300,435). Im Handel erhältliches serumfreies Medium kann verwendet werden, um die Zellen wachsen zu lassen und aufrechtzuerhalten. Geeignete Medien sind Sf900 II^TM (Life Technologies) oder ESF 921^TM (Expression Systems) für die Sf9-Zellen; und Ex-cellO405^TM (JRH Biosciences, Lenexa, KS) oder Express FiveO^TM (Life Technologies) für die T.ni-Zellen. Wenn rekombinantes Virus verwendet wird, werden die Zellen typischerweise aus einer Inokulationsdichte von annähernd 2–5 × 10⁵ Zellen auf eine Dichte von 1–2 × 10⁶ Zellen wachsen gelassen, zu welchem Zeitpunkt eine rekombinante Virusstammlösung hinzugefügt wird mit einer Multiplizität der Infektion von 0,1 bis 10, typischerweise im Bereich von 3.
Etablierte Techniken für die Produktion von rekombinanten Proteinen in Baculovirussystemen werden bereitgestellt von Bailey et al., „Manipulation of Baculovirus Vectors" in Methods in Molecular Biology, Volume 7: Gene Transfer and Expression Protocols, Murray (Herausgeber), Seiten 147–168 (The Humana Press, Inc. 1991), von Patel et al., „The baculovirus expression system" in DNA Cloning 2: Expression Systems, zweite Auflage, Glover et al. (Herausgeber), Seiten 205–244 (Oxford University Press 1995), von Ausubel (1995) auf den Seiten 16–37 bis 16–57, von Richardson (Herausgeber), Baculovirus Expression Protocols (The Humana Press, Inc. 1995), und von Lucknow „Insect Cell Expression Technology" in Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (Herausgeber), Seiten 183–218 (John Wiley & Sons, Inc. 1996).
Pilzzellen, einschließlich Hefezellen, können auch verwendet werden, um die Gene von Interesse zu exprimieren. Hefearten von besonderem Interesse in dieser Hinsicht schließen Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris und Pichia methanolica ein. Geeignete Promotoren für die Expression in Hefe schließen Promotoren aus GALI (Galactose), PGK (Phosphoglyceratkinase), ADH (Alkoholdehydrogenase), AOXI (Alkoholoxidase), HIS4 (Histidinoldehydrogenase) und Ähnliche ein. Viele Hefekloniervektoren wurden gestaltet und sind leicht erhältlich. Diese Vektoren schließen YIp-basierte Vektoren wie YIp5, YRp-Vektoren wie YRp17, YEp-Vektoren wie YEp13 und YCp-Vektoren wie YCp19 ein. Verfahren zum Transformieren von S.cerevisiae-Zellen mit Fremd-DNS und die Erzeugung von rekombinanten Polypeptiden davon werden offenbart zum Beispiel von Kawasaki, US-Patent Nr. 4,599,311, Kawasaki et al., US-Patent Nr. 4,931,373, Brake, US-Patent Nr. 4,870,008, Welch et al., US-Patent Nr. 4,037,743 und Murray et al., US-Patent Nr. 4,845,075.
Transformierte Zellen werden ausgewählt durch den Phänotypen, bestimmt durch selektierbaren Marker, gewöhnlich Arzneimittelresistenz, oder die Fähigkeit, in der Abwesenheit eines bestimmten Nährstoffes (z. B. Leucin) zu wachsen. Ein beispielhaftes Vektorsystem für die Verwendung in Saccharomyces cerevisiae ist das von Kawasaki et al. (US-Patent Nr. 4,931,373) offenbarte POTI-Vektorsystem, welches es transformierten Zellen erlaubt, durch Wachstum im Glucose enthaltenden Medium selektiert zu werden. Zusätzliche geeignete Promotoren und Terminatoren für die Verwendung in Hefe schließen jene aus glykolytischen Enzymgenen (siehe z. B. Kawasaki, US-Patent Nr. 4,599,311, Kingsman et al., US-Patent Nr. 4,615,974 und Bitter, US-Patent Nr. 4,977,092) und Alkoholdehydrogenasegenen ein. Siehe auch US-Patente Nr. 4,990,446, Nr. 5,063,154, Nr. 5,139,936 und Nr. 4,661,454.
Transformationssysteme für andere Hefen, einschließlich Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia guillermondii und Candida maltosa, sind in der Technik bekannt. Siehe zum Beispiel Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132: 3459 (1986) und Cregg, US-Patent Nr. 4,882,279. Aspergillus-Zellen können nach den Verfahren von McKnight et al., US-Patent Nr. 4,935,349, genutzt werden. Verfahren zum Transformieren von Acremonium chrysogenum sind offenbart von Sumino et al., US-Patent Nr. 5,162,228. Verfahren zum Transformieren von Neurospora sind offenbart von Lambowitz, US-Patent Nr. 4,486,533.
Zum Beispiel wird die Verwendung von Pichia methanolica als Wirt für die Produktion von rekombinanten Proteinen offenbart von Raymond, US-Patent Nr. 5,716,808, Raymond, US-Patent Nr. 5,736,383, Raymond et al., Yeast 14: 11–23 (1998), und in den internationalen Veröffentlichungen mit den Nummern WO 97/17450, WO 97/17451, WO 98/02536 und WO 98/02565. DNS-Moleküle für die Verwendung beim Transformieren von P. methanolica werden gewöhnlich zubereitet als doppelsträngige zirkuläre Plasmide, die vor der Transformation linearisiert werden können. Für die Polypeptidproduktion in P.methanolica können der Promoter und der Terminator in dem Plasmid jene eines P.methanolica-Gens sein, wie zum Beispiel ein P.methanolica-Alkoholnutzgen (AUG1 oder AUG2). Andere nützliche Promotoren schließen jene der Gene der Dihydroxyacetonsynthase (DHAS), Formatdehydrogenase (FMD) und Katalase (CAT) ein. Um die Integration der DNS in das Wirtschromosom zu erleichtern, wird bevorzugt, dass das gesamte Expressionssegment des Plasmids an beiden Enden von Wirts-DNS-Sequenzen flankiert wird. Für industrielle Prozesse im großen Maßstab, wo es wünschenswert ist, die Verwendung von Methanol zu minimieren, können Wirtszellen verwendet werden, in welchen beide Methanolnutzgene (AUG1 und AUG2) deletiert sind. Für die Produktion von sezernierten Proteinen können Wirtszellen verwendet werden, denen Vakuolenproteasegene (PEP4 und PRB1) fehlen. Elektroporation wird verwendet, um das Einführen eines DNS-enthaltenden Plasmids, das ein Polypeptid von Interesse kodiert, in P.methanolica-Zellen zu erleichtern. P methanolica-Zellen können durch Elektroporation unter Verwendung eines exponentiell abfallenden, gepulsten elektrischen Feldes mit einer Feldstärke von 2,5 bis 4,5 kV/cm, bevorzugt ungefähr 3,75 kV/cm, und einer Zeitkonstante (t) von 1 bis 40 Millisekunden, am bevorzugtesten ungefähr 20 Millisekunden, transformiert werden.
Nukleinsäurepolymere können auch in Pflanzenprotoplasten, intakte Pflanzengewebe oder isolierte Pflanzenzellen eingeführt werden. Verfahren für das Einführen von Nukleinsäuremolekülen in Pflanzengewebe schließen die direkte Infektion oder Co-Kultivierung von Pflanzengewebe mit Agrobacterium tumefaciens, die mikroprojektilvermittelte Zufuhr, DNS-Injektion, Elektroporation und Ähnliches ein. Siehe zum Beispiel Horsch et al., Science 227: 1229 (1985), Klein et al., Biotechnology 10: 268 (1992) und Miki et al. „Procedures for Introducing Foreign DNS into Plants" in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick et al. (Herausgeber), Seiten 67–88 (CRC Press, 1993).
Standardverfahren zum Einführen von Nukleinsäuremolekülen in bakterielle, Hefe-, Insekten-, Säuger- und Pflanzenzellen werden zum Beispiel bereitgestellt von Ausubel (1995). Allgemeine Verfahren zum Exprimieren und Wiedergewinnen von Fremdprotein, hergestellt von einem Säugerzellsystem, werden bereitgestellt von zum Beispiel Etcheverry „Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture" in Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (Herausgeber), Seiten 163 (Wiley-Liss, Inc. 1996). Etablierte Verfahren zum Isolieren von rekombinanten Proteinen aus einem Baculovirussystem werden beschrieben von Richardson (Herausgeber), Baculovirus Expression Protocols (The Humana Press, Inc. 1995).
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Nukleinsäurepolymers, das für die Expression einer Aminosäuresequenz von Interesse in einer eukaryontischen Wirtszelle geeignet ist, so dass das Nukleinsäurepolymer nicht in einer bakteriellen oder einer anderen Zwischenwirtszelle vor dem Einführen in diese eukaryontische Zelle vermehrt wird, umfassend: a) Spalten von zwei oder mehr Expressionsvektoren, um entweder nicht-palindromische Enden oder palindromische Enden zu erzeugen, worin gespaltene Expressionsvektoren mit palindromischen Enden weiter behandelt werden, um nicht-palindromische Enden zu erzeugen, worin die Expressionsvektoren eine Expressionskassette umfassen, die ein Gen von Interesse und ein selektierbares Markergen umfasst; b) Hinzufügen von den Zelltod verursachenden Oligonukleotiden während des Ligationsschritts (c) zu den gespaltenen Expressionsvektoren mit nicht-palindromischen Enden, worin die den Zelltod verursachenden Oligonukleotide eine Nukleotidsequenz haben, die komplementär zu den nicht-palindromischen Enden der gespaltenen Expressionsvektoren ist, wobei es die komplementäre Sequenz den Zelltod verursachenden Oligonukleotiden ermöglicht, an die nicht-palindromischen Enden der gespaltenen Expressionsvektoren oder an die nicht-palindromischen Enden der miteinander ligierten Expressionsvektoren zu binden, und worin, wenn es so gebunden ist, ein den Zelltod verursachendes Oligonukleotid die Verlängerung des Nukleinsäurepolymers inhibiert; und c) Ligieren der gespaltenen Expressionsvektoren mit nicht-palindromischen Enden, um Nukleinsäurepolymere herzustellen.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Nukleinsäurepolymere mehrere Kopien des Gens von Interesse und das selektierbare Markergen in einem 1:1-Verhältnis umfassen.
Verfahren nach Anspruch 1, weiterhin umfassend die Maßnahme des Fragmentierens des Nukleinsäurepolymers unter Verwendung von mechanischem Scheren.
Verfahren nach Anspruch 1, worin palindromische Enden umfassende Expressionsvektoren durch Inkubieren der Expressionsvektoren mit palindromischen Enden mit einem Enzym, das eine 3'-Exonukleaseaktivität bereitstellt, behandelt werden, um nicht-palindromische Enden zu erzeugen.
Verfahren nach Anspruch 4, worin das die 3'-Exonukleaseaktivität bereitstellende Enzym aus der Gruppe ausgewählt wird, bestehend aus T4-DNS-Polymerase, E. coli-DNS-Polymerase I, Klenowfragment der DNS-Polymerase I, DEEP-VENT-DNS-Polymerase und VENT-DNS-Polymerase.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Expressionsvektoren eine polycistronische Transkriptionseinheit umfassen.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das selektierbare Markergen ein Protein kodiert, das titrierbar ist.
Verfahren nach Anspruch 7, worin das selektierbare Markergenprodukt mit einem toxischen Molekül titrierbar ist.
Verfahren nach Anspruch 8, worin das selektierbare Markergen aus der Gruppe ausgewählt wird, bestehend aus einem Bleomycinresistenzgen, einem Metallothioneingen, einem Hygromycin-B-Phosphotransferasegen, dem AUR1-Gen, einem Adenosindesaminasegen, einem Aminoglycosidphosphotransferasegen, einem Dihydrofolatreduktasegen, einem Thymidinkinasegen und einem Xanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferasegen.
Verfahren nach Anspruch 7, worin das selektierbare Markergen ein Protein kodiert, das aus der Gruppe ausgewählt wird, bestehend aus grünem fluoreszierenden Protein, rotem fluoreszierenden Protein, alkalischer Phosphatase, CD4, CD8 und Klasse-I-Haupthistokompatibilitätskomplexprotein.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Expressionsvektoren mit einem Klasse-IIS-Restriktionsenzym gespalten werden, um nicht-palindromische Enden bereitzustellen.
Verfahren nach Anspruch 11, worin das Klasse-IIS-Restriktionsenzym aus der Gruppe ausgewählt wird, bestehend aus AccB7I, AceIII, AclWI, AdeI, AhdI, Alw26I, AlwI, AlwNI, ApaBI, AspEI, AspI, AsuHPI, BbsI, BbvI, BbvII, Bce83I, BcefI, BciVI, BfiI, BglI, BinI, BmrI, BpiI, BpmI, BpuAI, BsaI, Bse3DI, Bse4I, BseGI, BseLI, BseRI, BsgI, BslI, BsmAI, BsmBI, BsmFI, BspMI, BsrDI, Bst71I, BstAPI, BstF5I, BstXI, Bsu6I, DraIII, DrdI, DseDI, Eam1104I, Eam1105I, EarI, EchHKI, Eco31I, Eco57I, EcoNI, Esp1396I, Esp3I, FokI, FauI, GsuI, HgaI, HphI, MboII MsiYI, MwoI, NruGI, Pf1MI, Pf1FI, P1eI, SfaNI, TspRI, Ksp632I, MmeI, R1eAI, SapI, SfiI, TaqII, Tth111I, Tth111II, Van91I, XagI und XcmI.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Expressionsvektoren, um nicht-palindromische Enden zu erzeugen, unter Verwendung eines Enzyms gespalten werden, das aus der Gruppe ausgewählt wird, bestehend aus AvaI, Ama87I, BcoI, BsoBI, Eco88I, AvaII, Eco47I, Bme18I, HgiEI, SinI, BanI, AccB1I, BshNI, Eco64I, BfmI, BstSFI, SfcI, Bpu10I, BsaMI, BscCI, BsmI, Mva1269I, Bsh1285I, BsaOI, BsiEI, BstMCI, Bse1I, BseNI, BsrI, Cfr10I, BsiI, BssSI, Bst2BI, BsiZI, AspS9I, Cfr13I, Sau96I, Bsp1720I, BlpI, Bpu1102I, CelII, Bst4CI, BstDEI, DdeI, CpoI, CspI, RsrII, DsaI, BstDSI, Eco24I, BanII, EcoT38I, FriOI, HgiJII, Eco130I, StyI, BssT1I, EcoT14I, ErhI, EspI, BlpI, Bpu1102I, Bsp1720I, CelII, HgiAI, BsiHKAI, Alw21I, AspHI, Bbv12I, HinfI, PspPPI, PpuMI, Psp5II SanDI, SduI, Bsp1286I, BmyI, SecI, BsaJI, BseDI, SfcI, BfmI, BstSFI und SmlI.
Verfahren zur Herstellung einer rekombinanten eukaryontischen Wirtszelle, die ein Peptid oder Polypeptid von Interesse in einer eukaryontischen Wirtszelle exprimiert, so dass das Nukleinsäurepolymer nicht in einer bakteriellen oder einer anderen Zwischenwirtszelle vor dem Einführen in diese Eukaryontenzelle vermehrt wird, umfassend: a) Spalten von wenigstens zwei Expressionsvektoren, um entweder nicht-palindromische Enden oder palindromische Enden zu erzeugen, worin gespaltene Expressionsvektoren mit palindromischen Enden weiter behandelt werden, um nicht-palindromische Enden zu erzeugen, und worin der Expressionsvektor eine Expressionskassette umfasst, die ein Gen von Interesse und ein selektierbares Markergen umfasst; b) Hinzufügen von den Zelltod verursachenden Oligonukleotiden während des Ligationsschritts (c) zu den gespaltenen Expressionsvektoren mit nicht-palindromischen Enden, worin die den Zelltod verursachenden Oligonukleotide eine Nukleotidsequenz haben, die komplementär zu den nicht-palindromischen Enden der gespaltenen Expressionsvektoren ist, wobei es die komplementäre Sequenz den Zelltod verursachenden Oligonukleotiden erlaubt, an die nicht-palindromischen Enden der gespaltenen Expressionsvektoren oder an die nicht-palindromischen Enden von miteinander ligierten Expressionsvektoren zu binden, und worin, wenn es so gebunden ist, ein den Zelltod verursachendes Oligonukleotid die Verlängerung des Nukleinsäurepolymers inhibiert; und c) Ligieren des gespaltenen Expressionsvektors mit nicht-palindromischen Enden, um Nukleinsäurepolymere herzustellen; d) Einführen der Nukleinsäurepolymere in eine eukaryontische Wirtszelle; und e) Kultivieren der rekombinanten eukaryontischen Wirtszelle, welche das Peptid oder Polypeptid von Interesse herstellt.
Verfahren nach Anspruch 14, worin die Nukleinsäurepolymere mehrere Kopien des Gens von Interesse und das selektierbare Markergen in einem 1:1-Verhältnis umfassen.
Verfahren nach Anspruch 14, worin die eukaryontische Wirtszelle aus der Gruppe ausgewählt wird, bestehend aus einer Säugerzelle, einer Pilzzelle, einer Insektenzelle und einer Vogelzelle.
Verfahren nach Anspruch 14, worin das Nukleinsäurepolymer mehrere Expressionskassetten mit Kopf-Schwanz-Orientierungen umfasst, wobei jede Expressionskassette ein Gen von Interesse und ein selektierbares Markergen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 17, worin das Nukleinsäurepolymer mehrere Kopien des Gens von Interesse und ein selektierbares Markergen in einem annähernden 1:1-Verhältnis umfasst.
Verfahren nach Anspruch 17, worin das selektierbare Markergen ein Protein kodiert, welches titrierbar ist.