DE60110047T2

DE60110047T2 - Zahn-vorläuferzelle und methode für deren herstellung

Info

Publication number: DE60110047T2
Application number: DE60110047T
Authority: DE
Inventors: Paul Thomas Sharpe
Original assignee: Odontis Ltd
Current assignee: Odontis Ltd
Priority date: 2000-02-18
Filing date: 2001-02-16
Publication date: 2006-03-09
Anticipated expiration: 2021-02-17
Also published as: ES2240406T3; ATE293161T1; JP2003523200A; DE60110047D1; US7498168B2; AU3386901A; WO2001060981A8; AU784228B2; EP1259593A1; GB0003930D0; DK1259593T3; WO2001060981A1; CA2400607A1; EP1259593B1; US20030103950A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung bezieht sich auf die Herstellung einer Zahnvorläuferzelle. Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf die Verwendung einer kultivierten Stammzelle, um eine Zahnvorläuferzelle herzustellen, wobei die Stammzelle keine humane embryonale Stammzelle ist.
Hintergrund der Erfindung
Zähne sind für das Überleben von Tieren essentielle Organe und von offensichtlicher klinischer und/oder kosmetischer Wichtigkeit. Es gibt viele Beispiele, bei denen Zahnersatz wünschenswert ist und gegenwärtige Behandlungen beschränken sich auf künstliche Prothesen oder Implantate.
Zahnprimordienexplantate können in vitro kultiviert werden und ermöglichen eine Vielzahl von Manipulationstudien einschließlich die Einbringung von Genen und/oder Proteinen und Geweberekombinationen. Manipulierte Primordien können in Nierenkapseln von adulten Tieren (wie bspw. Mäusen) transferiert werden, um Bedingungen für die Entwicklung von adulten Zähnen zu schaffen. Diese Kultivierungstechniken erfordern jedoch das häufige Töten von Tieren. Dies ist eines der mit dem Stand der Technik verbundenen Probleme.
Ansätze im Stand der Technik, um Zahnprimordien herzustellen, sind auf die Geweberekombination in vitro angewiesen. Es wurden unabhängig voneinander zwei verschiedene Gewebetypen aus dem tierischen Embryo präpariert und diese wurden im Labor rekombiniert. Signale aus dem einen Gewebe können dann die Bildung von Zahnprimordien in dem anderen Gewebe induzieren. Dies ist ein mühsames, aufwändiges Verfahren, das von hoch geschulten Fachkräften ausgeführt wird und große chirurgische Fähigkeiten erfordert.
Gemäß des Standes der Technik verändern sich für das Fortschreiten der Zahnentwicklung früh in der Entwicklung die Gewebeerfordernisse. Es wird vermutet, dass für die Initiation das orale Epithel essentiell ist und Zähne ausbilden kann, wenn es mit beliebigen mesenchymalen Zellen rekombiniert wird, solange diese aus der Neuralleiste stammen. Deshalb sind gemäß des Standes der Technik aus der Neuralleiste stammende Zellen essentiell für die Ausbildung von Zahnvorläuferzellen.
Die vorliegende Erfindung versucht zumindest einige der mit dem Stand der Technik verbundenen Probleme zu überwinden.
Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
Wie oben erläutert, wurde früher die Herstellung von Zahnprimordien nur durch Verwendung von Geweberekombinationstechniken bewerkstelligt. Hier wird nun überraschenderweise gezeigt, dass die Herstellung von Zahnvorläuferzellen durch die Verwendung von im Labor kultivierten Stammzellen bewerkstelligt werden kann, wobei die Stammzellen keine embryonalen Stammzellen sind. Insbesondere können Zahnvorläuferzellen durch die Verwendung von im Labor kultivierten nicht-humanen embryonalen Stammzellen (ES-Zellen) hergestellt werden.
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung einer kultivierten Stammzelle zur Herstellung einer Zahnvorläuferzelle bereit, wobei die Stammzelle keine humane embryonale Stammzelle ist. Vorzugsweise ist die kultivierte Stammzelle eine nicht-humane ES-Zelle.
Die Herstellung von Zahnvorläuferzellen aus kultivierten Stammzellen kann vorteilhafterweise durch die Induktion der nicht-humanen ES-Zellen mit oralem Epithel bewerkstelligt werden.
Eine Zahnvorläuferzelle ist eine solche, die bestimmte molekulare Marker exprimiert, die für Zahnvorläuferzellen charakteristisch sind. Beispielsweise gilt eine Zelle als eine Zahnvorläuferzelle, wenn diese einen oder mehrere zahnmesenchymale Zellmarker exprimiert. Beispiele solcher Marker umfassen Barxl, Dlx2, Dlx5, Msx1, Pax9, Activin βA, Lhx6, Lhx7 und andere. Diese Marker können durch beliebige geeignete Mittel detektiert werden, wie Western Blot, Immunfluoreszenz, radioaktive in situ-Hybridisierung oder andere geeignete Mittel, die unten detaillierter beschrieben werden.
Das orale Epithel kann aus einer beliebigen Quelle stammen, wie bspw. aus der Maus. Die Präparation von oralem Epithel wird unten detaillierter diskutiert.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Gemäß eines ersten Aspektes betrifft die Erfindung die Verwendung einer kultivierten Stammzelle, um eine Zahnvorläuferzelle herzustellen, wobei die Stammzelle keine humane embryonale Stammzelle ist.
Gemäß eines zweiten Aspektes betrifft die Erfindung die Verwendung einer kultivierten Stammzelle, um eine Zahnvorläuferzelle herzustellen, wobei die kultivierte Stammzelle eine neurale Stammzelle (NSC) oder eine nicht-humane embryonale Stammzelle (ES-Zelle) sein kann. Vorzugsweise ist die kultivierte Stammzelle eine nicht-humane embryonale Stammzelle (ES-Zelle).
Gemäß eines dritten Aspektes betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Zahnvorläuferzelle aus einer kultivierten Stammzelle, wobei das Verfahren folgende Schritte aufweist: Bereitstellen einer kultivierten Stammzelle, In-Kontakt-Bringen der kultivierten Stammzelle mit einer oder mehreren oralen Epithelzellen, und Inkubieren für eine Zeit, die ausreichend ist, um die Zahnvorläuferzelle herzustellen, wobei die Stammzelle keine humane embryonale Stammzelle ist.
Gemäß eines vierten Aspektes betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Zahnvorläuferzelle aus einer kultivierten Stammzelle, wobei die kultivierte Stammzelle eine nicht-humane ES-Zelle ist, wobei das Verfahren folgende Schritte aufweist: Bereitstellen einer kultivierten nicht-humanen ES-Zelle, In-Kontakt-Bringen der kultivierten nicht-humanen ES-Zelle mit einer oder mehreren oralen Epithelzellen, und Inkubieren für eine Zeit, die ausreichend ist, um die Zahnvorläuferzelle herzustellen.
Gemäß eines fünften Aspektes betrifft die Erfindung eine Zahnvorläuferzelle, die aus einer kultivierten Stammzelle hergestellt ist, wobei die Stammzelle keine humane embryonale Stammzelle ist.
Gemäß eines sechsten Aspektes betrifft die Erfindung eine Zahnvorläuferzelle, die aus einer kultivierten Stammzelle hergestellt ist, wobei die kultivierte Stammzelle eine nicht-humane ES-Zelle ist.
Zur Vereinfachung der Bezugnahme werden diese und weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung nun unter geeigneten Abschnittsüberschriften diskutiert. Die Lehren aus jedem Abschnitt sind jedoch nicht notwendigerweise auf jeden speziellen Abschnitt beschränkt.
Bevorzugte Merkmale
Vorzugsweise ist die kultivierte Stammzelle eine nicht-humane ES-Zelle.
Die Inkubation der kultivierten nicht-humanen ES-Zelle mit der (den) Epithelzelle(n) erfolgt für eine Zeit, die ausreichend ist, um die Zahnvorläuferzelle herzustellen. Vorzugsweise beträgt diese Zeit etwa 72 Std.
Vorzugsweise sind hier die Zahnvorläuferzellmarker beschrieben. Vorzugsweise werden solche Marker durch in situ-Hybridisierung bestimmt.
Vorteile
Die vorliegende Erfindung hat viele Vorteile. Diese Vorteile werden durch die folgende Beschreibung deutlich.
Die vorliegende Erfindung ist z.B. vorteilhaft, da sie ein Minimum an getöteten Tieren erfordert.
Die vorliegende Erfindung ist ferner vorteilhaft, da sie personalsparend ist.
Des Weiteren ist die vorliegende Erfindung vorteilhaft, da sie mit keinen multiplen chirurgischen Geweberekombinationen verbunden ist.
Zahnentwicklung
Die Entwicklung des Säugetierzahns ist ein anerkanntes Modellsystem für die Untersuchung der epithelialen/mesenchymalen Wechselwirkungen während der Organogenese. Die Zähne beginnen sich früh in der Säugetierembryogenese (11 Tage bei Mäusen, 6 Wochen beim Menschen) aus einer Reihe von reziproken Wechselwirkungen zwischen zwei Zelltypen, den oralen Epithel- und aus den Neuralleisten stammenden Mesenchymalzellen, zu entwickeln.
Aus dem Epithel kommen induktive Signale für die Zahnentwicklung, woraufhin die angesprochenen mesenchymalen Zellen dazu programmiert werden, odontogenisch zu werden (2). Odontogene mesenchymale Zellen stellen dann instruktive Signale für die weitere Zahnentwicklung bereit (3). Die Epithelzellen führen ggf. zu Ameloblasten, die verantwortlich sind für die Schmelzbildung und die Mesenchymzellen bilden Odontoblasten, die Dentin produzieren.
Die Identität dieser verschiedenen instruktiven Signale wurde durch Genexpressionsstudien und Implantationsexperimente ersichtlich. FGF8, BMP4 und SHH werden als frühe instruktive Signale aus dem oralen Epithel etabliert (3). BMPs, FGFs und Activin sind unter den frühen Signalen aus dem Mesenchym (3, 4).
Schlüsselmoleküle, die in die Signalgebung der Zahnorganogenese involviert sind, umfassen Activin βA, das in dem voraussichtlichen Zahnkeimmesenchym exprimiert wird und ein Signalmolekül in der Zahnentwicklung ist. Activinproteine werden aus zwei Genprodukten hergestellt, Activin βA und Activin βB, welche dimerisieren, um Activin A (βA:βB), Activin B (βB:βB) und Activin AB (βA:βB) zu bilden. Die eng verwandten Inhibine, Inhibin A und Inhibin B, sind Dimere, die aus einer Activin βA- oder βB-Untereinheit bestehen, die mit einer Inhibin spezifischen α-Untereinheit verbunden ist (Vale et al., 1990; Roberts et al., 1991; Roberts und Barth, 1994).
Die Analyse der Zahnentwicklung in Activin βA-mutierten Embryos zeigt, dass jenseits des Knospenstadiums keine Entwicklung der Schneidezähne und Backenzähne des Unterkiefers erfolgt. Activin βA ist deshalb eine essentielle Komponente der Zahnentwicklung und ein Markergen von mesenchymalen Zellen.
Marker der Zahngenexpression
Die Expression von gut charakterisierten mesenchymalen und epithelialen Markergenen kann durch beliebige geeignete Verfahren untersucht werden. Beispielsweise kann an Embryonen eine radioaktive in situ-Hybridisierung, beispielsweise bis zum Knospenstadium, durchgeführt werden. Geeignete Gene, um die Expressionsmuster zu untersuchen, können Barx-1, Msx-1, Dlx-2, Pax-9, Gli-3, Lef-1, syndecan-1, Tgfβ-1, Tgfβ-3, Bmp-4, Bmp-7, Shh, CD44, Otlx-2, Lhx6, Lhx7, FGF8, Pitx2, oder andere geeignete Markergene umfassen. Dies wird unten detaillierter diskutiert.
Mesenchymale Marker
Beispiele solcher Marker umfassen Barx1, Dlx2, Dlx5, Msx1, Pax9, Activin βA, Lhx6, Lhx7 und andere. Diese Marker können durch beliebige Mittel detektiert werden, wie bspw. Western Blot, Immunfluoreszenz, radioaktive in situ-Hybridisierung oder andere geeignete Mittel.
In Wildtypzähnen wird im Knospenstadium die Barx-1 Genexpression grundsätzlich im Backenzahnbereich des Unter- und Oberkiefers gefunden und zeigt sich eher in breiten Bereichen der aus der Neuralleiste stammenden mesenchymalen Zellen, als dass diese auf das Dentalmesenchym beschränkt wäre (Ferguson et al., Tissier-Seta et al., 1995).
Msx-1, Lef-1 und Bmp-4 werden im Dentalmesenchym (d.h. den sich verdichtenden mesenchymalen Zellen, die assoziiert sind mit invagierenden Schneide- und Backenzahnepithelknospen) als Antwort auf die epitheliale Signalgebung exprimiert (Ferguson et al., 1998; Mackenzie et al., 1991; Kratochwil et al., 1996; Vainio et al., 1993).
Die Dlx-2 Expression wird grundsätzlich in mesenchymalen Zellen gefunden, die die epitheliale Knospe unmittelbar umgeben, ist jedoch auch in dem Dentalepithel auf der bukkalen Seite der Knospen vorhanden (Ferguson et al., 1998; Thomas et al., 1995; Qui et al., 1997).
Pax-9, Lhx6 und Lhx7 werden im frühen Zahnmesenchym vor der Knospenbildung und anschließend in dem sich verdichtenden Mesenchym im Knospenstadium exprimiert (Ferguson et al., 1998; Neubüser et al., 1997).
Gli-3 wird im Mesenchym von E10.5 an exprimiert. Im Knospen- und Kappenstadium ist die Gli-3-Expression etwas mehr örtlich begrenzt, als die Pax-9-Expression und ist in der Dentalpapille und dem Dentalfollikel konzentriert (Ferguson et al., 1998; Hardcastle and Sharpe, 1998).
Syndecan-1, ein Zelloberflächenheparinsulfat-Proteoglycan, wird transient im dentalen Mesenchym exprimiert und es wird vermutet, dass es die dentale mesenchymale Zellverdichtung unterhalb des invaginierenden Dentalepithels reguliert (Ferguson et al., 1998; Thesleff et al., 1996).
Tgfβ-1 wird im dentalen Mesenchym und schwach im Epithel der Schneidezähne gefunden und taucht in den Backenzähnen lediglich im Dentalepithel im Kappenstadium auf (Ferguson et al., 1998; Vaahtokari et al., 1991).
Die Tgfβ-3-Expression ist im Mesenchym des Gesichtes weit verbreitet, sie scheint jedoch nicht in den sich verdichtenden mesenchymalen Zellen, die unmittelbar an die Epithelknospen der Schneide- und Backenzähne anliegen, stattzufinden (Ferguson et al., 1998; Chai et al., 1994).
Epitheliale Marker
Beispiele solcher Marker umfassen Pitx2, p21, Wnt7b und andere. Diese Marker können durch beliebige geeignete Mittel detektiert werden, wie bspw. Western Blot, Immunfluoreszenz, radioaktive in situ-Hybridisierung oder andere geeignete Mittel.
Gene, die bekanntermaßen im Dentalkeimepithel exprimiert werden, umfassen Bmp-7, Sonic hedgehog (Shh), CD44, FGF8, Pitx2 und Otlx-2.
In Wildtypembryos wird Bmp-7 anfänglich im Dentalepithel exprimiert, wobei sich die Expression von E13.5 an auf das Mesenchym um die Zahnknospen herum verschiebt (Åberg et al., 1997). Bei E13.5 wird die mesenchymale Bmp-7-Expression nur in den unteren Schneidezähnen gefunden, die zu diesem Stadium in ihrer Entwicklung am weitesten fortgeschritten sind, wohingegen die Expression im Epithel der oberen Schneidezähne und Backenzähne andauert (Ferguson et al., 1998).
Shh wird in der epithelialen Verdickung der frühen Zahnkeime exprimiert und ist vermutlich eine wichtige Komponente der Signale, die während dieses frühen Stadiums vom Epithel zum darunter liegenden Mesenchym führen, die Genexpression im Mesenchym veranlassen und dieses dazu anweisen, die Verdichtung zu beginnen (Bitgood and McMahon, 1995; Thesleff and Sharpe, 1997). In späteren Stadien wird Shh herunterreguliert, wobei jedoch die Transkripte wieder in den Epithelzellen erscheinen, die den Schmelzknoten bilden, ein transientes Signalzentrum, das im Dentalepithel im späten Knospenstadium der Zahnentwicklung entsteht (Ferguson et al., 1998; Vaahtokari et al., 1996).
CD44 und Otlx-2 werden im oralen Epithel weiter verbreitet exprimiert, als Shh (Ferguson et al., 1998; Mucchielli et al., 1997). CD44 codiert für den Hyaluronanrezeptor und Otlx-2 ist das Maushomolog des humanen Genes, das, wenn dieses mutiert ist, die als Riegersyndrom bekannte Krankheit verursacht, bei der keine Zähne vorhanden sind (Semina et al.; 1996).
Follistatin ist ein Activin-Bindeprotein, für das gezeigt wurde, dass dieses die Aktivität von Activin inhibiert (Michel et al., 1993; De Winter et al., 1996). Das Expressionsmuster von Follistatin kann durch in situ-Hybridisierungsanalyse untersucht werden (Ferguson et al., 1998). Die Follistatinexpression wird von E11.5 an in Zahnkeimepithelzellen gefunden, die unmittelbar an Activin βA exprimierende Zellen anliegen. In späteren Stadien sind Follistatin-Transkripte auf die säulenförmigen Zellen beschränkt, die die äußerste Schicht der epithelialen Knospe bilden, wohingegen der zentrale Kern der epithelialen Zellen follistatin-negativ ist (Ferguson et al., 1998). Follistatin wird deshalb in dem Zahnepithel, das an das Zahnmesen chym anliegt, und in einem komplementären Muster zu Activin βB exprimiert.
Zahnprimordien
Zahnprimordien können in vitro kultiviert werden, was eine Vielzahl von Manipulationsstudien erlaubt, einschließlich die Einbringung von Genen und/oder Proteinen und Geweberekombinationen. Am bedeutendsten ist, dass manipulierte Primordien in Nierenkapseln von adulten Tieren (wie bspw. Mäusen) transferiert werden können, um Bedingungen für die Entwicklung von adulten Zähnen zu schaffen. Vorzugsweise können erfindungsgemäße Zahnvorläuferzellen zur Herstellung von Zahnpromordien oder völlig entwickelten Zähnen verwendet werden.
Es ist daran gedacht, dass ein Verfahren zur Gewebeherstellung, basierend auf den hier offenbarten Lehren in Bezug auf die Zahnentwicklung, dazu verwendet werden kann, um in vitro und in vivo Zähne in einer adulten Mundhöhle herzustellen.
Nicht-humane ES-Zellen
Wie hier gezeigt, können kultivierte Zellen, wie bspw. nicht-humane ES-Zellen, aus der Neuralleiste stammende Mesenchymalzellen in der Produktion von Zahnvorläuferzellen ersetzen. Gleichermaßen kann, wie hier offenbart, künstliches Epithel konstruiert werden, um embryonales orales Epithel nachzubilden. Es ist denkbar, dass die hier offenbarten kultivierten Epithelzellen in der Herstellung von künstlichem Epithel verwendet werden können, und dieses Epithel kann dazu konstruiert sein, um Merkmale eines oralen Epithels aufzuweisen, wodurch nicht- humanes embryonales Epithel durch konstruiertes Epithel in der Herstellung von Zahnvorläuferzellen ersetzt werden kann.
Andere Quellen von Stammzellen, die aus der Neuralleiste stammenden Mesenchymalzellen ersetzen können, können primäre adulte neurale Stammzellen umfassen, wobei die Stammzellen keine humanen embryonalen Stammzellen sind. Diese können durch Verwendung von etablierten Verfahren erhalten werden, bspw. wie beschrieben in Johansson et al. (Cell vol. 96, p25 (1999)) und/oder Clarke et al. (Science vol. 288, p1660 (2000)). Diese Zellen sind sogar in der Lage Neuralleistenzellen auszubilden, wenn diese in Mausblastozysten transplantiert werden. (Eine) Zelllinie(n) von kultivierten neuralen Stammzellen kann auch dazu verwendet werden, um aus der Neuralleiste stammende mesenchymale Stammzellen gemäß der Verfahren der vorliegenden Erfindung zu ersetzen, wobei die Stammzellen keine humanen embryonalen Stammzellen sind.
Es ist denkbar, dass die erfindungsgemäßen Zahnvorläuferzellen nutzbringend dazu verwendet werden können, um Mauszähne vollständig aus kultivierten Stammzellen durch das Kombinieren von nicht-humanen ES-Zellaggregaten mit Epithel, das aus immortalisierten Zelllinien und nicht-humanen ES-Zelllinien produziert wird, zu generieren.
Die Fähigkeit von nicht-humanen ES-Zellen, primitive Ectodermähnliche Zellpopulationen zu bilden, wurde nachgewiesen (5, 6). Die Kombination von sekretierten Signalen, die erforderlich sind, um in solchen Zellen die Odontogenese zu induzieren, kann durch experimentelle Manipulation der Zellen erfolgen, bspw. durch die Verwendung des Kugel-Applikationsystemes, wie dies hier beschrieben ist. Des Weiteren ist daran gedacht, dass das Ectoderm, das aus nicht-humanen ES-Zellen stammt, vorteilhafterweie odontogenes Ectoderm ersetzen kann, sobald die Signalgebungsrichtung auf das odontogene Mesenchym übergegangen ist.
Stammzellkultur zur Zahnbildung
Wie hier erläutert, umfasst die vorliegende Erfindung (ein) Verfahren zur Herstellung eines mesenchymalen Gewebes, das in der Lage ist Zähne aus kultivierten Stammzellen zu bilden, wobei die Stammzellen keine humanen embryonalen Stammzellen sind. Die Stammzellen können zur Induktion/Interaktion auf vielfältige Weise hergestellt werden. Sie können bspw. pelletiert werden, um kleine Aggregate zu bilden. Dies kann dadurch bewerkstelligt werden, dass diese auf Filter pelletiert werden. Solche Filter können ein beliebiges Substrat aufweisen, wie bspw. vorgelatinisierte Millipore-Filter. Aus Zweckmäßigkeitsgründen können die Filter von Metallgittern getragen werden, wie bspw. beschrieben in Ferguson et al. (1998). Die Stammzellen können in kleine Löcher pelletiert werden, die in einem Gel oder einem anderen geeigneten halbfesten Träger vorgesehen sind. Das Gel kann ein Kollagengel sein. Das Gel kann das Collaborative Biomedical Products' Matrigel oder ein ähnliches Substrat sein. Das Epithel wird über die Stammzellen gelegt, um das Loch zu bedecken, welches dann mit einer dünnen Schicht eines Gels bedeckt und inkubiert wird. Die in diesem Zusammenhang verwendeten Gele können selbst von (einer) Membran(en) und/oder Metallgittern getragen werden, wie oben und in dem Abschnitt der Beispiele skizziert.
Zahnersatz
Die vorliegende Erfindung kann für den Zahnersatz, insbesondere für den humanen Zahnersatz verwendet werden. Es wäre vorteilhaft, wenn die gewebekonstruierten Zähnen in der adulten Mundhöhle wachsen gelassen werden, wodurch ein direkter Zahnersatz ermöglicht würde.
Es ist bekannt, dass embryonale Zahnprimordien sich in der adulten Umgebung entwickeln und normal wachsen können, bspw. durch Verwendung von renalem Transfer (1, 4). Es scheint, dass Stellen, wie bspw. die adulte Niere und das Auge, eine geeignete Umgebung weitgehend dadurch bereitstellen, dass eine adäquate Blutzufuhr ermöglicht wird. Wir denken deshalb, dass sich Zahnrudimente, die chirurgisch in die Mundhöhle implantiert werden, normal entwickeln.
Neben der Möglichkeit eine Reihe von Verfahren zu entwickeln, die einen Zahnersatz ermöglichen, ist es zusätzlich wünschenswert, dass die sich in situ entwickelnden Zähne die richtige Form und Größe haben. Es ist eine Anzahl von Genen bekannt, die die Zahnform festlegen, und durch Manipulation dieser Gene ist es möglich, die Zahnform zu verändern (1, 4, 7, 8). Gleichermaßen wurde experimentell gezeigt, dass die Modulierung von Signalereignissen zur Veränderung der Zahngröße führt. Beispielsweise führt die Inhibierung der Wnt-Signalgebung zur Entwicklung von kleineren Zähnen (9). Diese Beobachtungen können in den Verfahren der vorliegenden Erfindung vorteilhaft ausgenutzt werden.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können nutzvoll in einem Ansatz zur Gewebekonstruktion angewendet werden, um ein vollständiges Säugetierorgan, einen Zahn, de novo aus kultivierten Stammzellen zu generieren, wobei die Stammzellen keine humanen embryonalen Stammzellen sind. Dieses Verfahren umfasst den Ersatz von nicht-humanen embryonalen Geweben, die Zähne bilden, durch Gewebe, die aus kultivierten Stammzellen generiert wurden, wie hier offenbart.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft nicht-humanes embryonales orales Epithel, das, wenn es mit Mesenchym rekombiniert wird, welches von kultivierten nicht-humanen embryonalen Stammzellen (ES-Zellen) abgeleitet ist, in dem nicht-humanen ES-Zellgewebe die zahnspezifische Genexpression und frühe Zahnentwicklung induziert.
Im Stand der Technik ist bekannt, dass der zweite Pharyngialbogen von Säugetierembryos keine Zähne entwickelt. In einem Ausführungsbeispiel der Erfindung, in dem eine Doppelrekombinationstechnik mit Geweben verwendet wird, die aus genetisch markierten Mausstämmen stammen, wird im zweiten Pharyngialbogenmesenchym die Odontogenese induziert. Es wird ferner demonstriert, dass dieses Gewebe dann in der Lage ist in dem Epithel des zweiten Pharyngialbogens Odontogenese zu induzieren. Aus diesen rekombinanten Geweben werden dann gemäß der vorliegenden Erfindung Zahnkeime im frühen Stadium gebildet. Die Bildung dieser Zahnkeime wird dann durch die Überwachung der Expression von geeigneten molekularen Markern bestätigt, wie oben beschrieben. Deshalb ist ein vorteilhaftes Merkmal der vorliegenden Erfindung, das nicht-odontogenes Gewebe zur Bildung von Zähnen hergestellt werden kann, wie hier offenbart.
In einem weiteren Ausführungsbeispiel betrifft die Erfindung die Induktion von Mesenchym, das auf nicht-humanen ES-Zellen basiert, um die Odontogenese zu durchlaufen. Das orale Epithel wird mit Mesenchym aus einer nicht-humanen embryonalen Stammzelle rekombiniert. Epitheliale Invaginationen (Zahnknospen) werden gebildet. Unter Verwendung von molekularen Markern für Zahnknospen wird demonstriert, dass die Expression dieser Marker in dem nicht-humanen ES-Zell-Mesenchym um die epithelialen Invaginationen herum induziert wird, wodurch angezeigt wird, dass frühe Odontogenese stattfindet und wodurch die Bildung von Zahnknospen bestätigt wird.
Es ist deshalb ein vorteilhaftes Merkmal der vorliegenden Erfindung, dass Mesenchym, das auf nicht-humanen ES-Zellen basiert, dazu induziert werden kann, Odontogenese zu durchlaufen.
Vorzugsweise können die Verfahren der vorliegenden Erfindung dazu genutzt werden, Zähne vollständig aus nicht-humanen embryonalen Geweben zu bilden, die normalerweise keine Zähne bilden.
Es ist daran gedacht, dass die vorliegende Erfindung es ermöglicht, dass nicht-humane ES-Zellen nicht-humane aus der Neuralleiste stammende embryonale Zellen ersetzen und die Zahnentwicklung ermöglichen.
Vorzugsweise können Epithelzellen aus Zelllinien hergestellt werden und in vitro als ein Ersatz für das orale Epithel verwendet werden.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können vorzugsweise auf den Ersatz der nicht-humanen embryonalen Umgebung, die normalerweise für die Zahnentwicklung erforderlich ist, durch eine adulte Umgebung, angewendet werden, wie bspw. über die Implantation von Zahnvorläuferzellen oder Strukturen, die daraus hervorgehen, in einen adulten Kiefer zur Entwicklung. Zähne, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt/transplantiert werden, wachsen und entwickeln sich weiter, wenn diese in den Kieferknochen implantiert werden und gehen mit diesem eine feste Verbindung ein.
Es ist daran gedacht, dass die vorliegende Erfindung dafür sorgt, dass Stammzellen dazu ausgerichtet werden, um in Kultur einem odontogenen Signalweg zu folgen und diese sich daraufhin zu reifen Zähnen entwickeln, wenn sie in eine Säugetierniere und/oder einen -kiefer implantiert werden, wobei die Stammzellen keine humanen embryonalen Stammzellen sind.
Es ist ein Vorteil der vorliegenden Erfindung, dass die erfolgreiche Zahnentwicklung aus kultivierten Stammzellen erfolgen kann.
Es wird hier demonstriert, dass erfindungsgemäß odontogene Signale in mesenchymale und Epithelzellen geleitet werden können, die normalerweise keine Zähne ausbilden, um diese in Kultur zur anschließenden Zahnentwicklung zu programmieren.
Es ist ein Vorteil der vorliegenden Erfindung, dass mesenchymale Zellen in Kultur durch Exposition an odontogene Signale (z.B. aus oralem Epithel) dazu programmiert werden können, nach der Implantation (z.B. renale Implantation oder Implantation in den Kiefer) Zähne auszubilden.
Es ist ein Vorteil der vorliegenden Erfindung, dass Zahnprimordien sich nach einer Implantation in den Kiefer erfolgreich anheften und entwickeln.
Es ist daran gedacht, dass die vorliegende Erfindung den Ersatz von oralem Epithel durch (eine) kultivierte Stammzelllinie(n) erleichtert, und/oder den Ersatz des Epithels durch Proteinsignale erleichtert, die vorzugsweise als Protein und/oder als Gen(e) verabreicht werden, das (die) das Letztere codiert (codieren), und/oder die Verwendung von Stammzellen, wie bspw. neuralen Stammzellen und/oder nicht-humanen embryonalen Stammzellen zur Herstellung von gewebekonstruierten Zähnen erleichtert.
BEISPIELE
Die vorliegende Erfindung wird nun beispielhaft beschrieben, wobei Bezug genommen wird auf:
1, die einen gefärbten Schnitt zeigt; und
2, die einen gefärbten Schnitt zeigt.
Im Detail zeigen:
1 eine sich entwickelnde Knospe; und
2 die visualisierte Expression von Markergenen für Zahnvorläufer.
Allgemeine Verfahren
Die vorliegenden Erfindungen werden an Mausembryoexplantaten durchgeführt, die unter Verwendung eines etablierten Systems kultiviert wurden (siehe hierzu bspw. Ferguson et al., 1998, et seq.). Unter Verwendung von etablierten Verfahren, die die Trennung des Epithels und des Mesenchyms mit Dispase umfassen, wurden Rekombinationen durchgeführt (4). Die Histologie umfasst das Schneiden und Färben von Wachsschnitten und die in situ-Hybridisierung mit Genmarkern unter Verwendung von ³⁵S-RNA-Sonden mit verschiedenen Sonden, die für die anliegenden Abschnitte benutzt wurden. Renale Transfers wurden in sechs Wochen alten männlichen CDl Mäusen unter Verwendung eines für den Hauptsitz in Großbritannien genehmigten Verfahrens durchgeführt, renale Extrakte wurden über 10 bis 16 Tage gesammelt, in EDTA dekalzifiziert, seriell geschnitten und gefärbt. Die Organ-/Gewebekultivierung erfolgt gemäß im Stand der Technik bekannter Verfahren, wie bspw. beschrieben in ("Organ culture in the analysis of tissue interactions." I. Thesleff and C. Sahlberg, aus Molecular Embryology Methods and Protocols, Vol. 97, Ch. 3, Herausgeber: PT Sharpe und I. Mason; Humana Press 1999). Die ES-Zellen werden gemäß Standardprotokollen propagiert, gehalten und präpariert, die sich bspw. finden in ("CRE recombinase mediated alterations of the mouse genome using embryonic stem cells." Hadjantonakis et al., aus Molecular Embryology Methods and Protocols, Vol. 97, Ch. 8, Herausgeber: PT Sharpe und I. Mason; Humana Press 1999). Die ES-Zellen können ggf. auf Filter pelletiert werden oder wachsen vorzugsweise auf vorgelatinisierten Filtern unter Verwendung von Standardkultivierungsbedingungen, wie oben erläutert.
Beispiel 1
Zahnentwicklung aus nicht-odontogenen, nicht-humanen embryonalen Geweben
Das Ausmaß, bis zu dem sich Zähne aus Rekombinationen von embryonalen Geweben entwickeln können, die normalerweise keine Zähne ausbilden, wird bestimmt.
Orales Epithel (erster Pharyngialbogen) aus E10-Embryos wird mit Mesenchym aus dem zweiten Pharyngialbogen rekombiniert. Diese Explantate werden für drei Tage kultiviert, um in dem Mesenchym die Odontogenese zu initiieren, was durch in situ-Hybridisierung mit molekularen Markern bestätigt wird.
Rekombinationen aus Epithel- und mesenchymalem Gewebe
Rekombinationen werden bei E11.5 und E13.5 durchgeführt. Die Backenzahnanlagen der Unterkiefer werden mit Glutamax-1 in DMEM herauspräpariert. Das Epithel und Mesenchym werden nach einer Inkubation für 10–15 Minuten bei 37°C in Dispaselösung (Gibco BRL), die in Kalzium und magnesiumfreiem PBS mit 2 Einheiten pro ml hergestellt wurde, isoliert. Nach der Inkubation wurden die Unterkiefer in D-MEM mit 10%igem fötalem Kälberserum (FKS) gewaschen und die Gewebe werden mechanisch unter Verwendung feiner Wolframnadeln voneinander getrennt. Zur Rekombination werden Epithel und Mesenchym (wie beschrieben in Ferguson et al., 1998) auf der Oberseite von transparenten Nucleoporemembranfiltern (0,1 Mikrometer Porendurchmesser; Costar) in der richtigen Orientierung ausgerichtet. Die Rekombinationen werden für 24 bis 48 Stunden in D-MEM mit 10%igem fötalem Kälberserum kultiviert, danach werden sie entweder fixiert und für die radioaktive in situ-Hybridisierung verarbeitet, oder unter die Nierenkapsel von männlichen adulten Mäusen transplantiert und für weitere 10 Tage kultiviert, um die volle Zahnentwicklung zu ermöglichen.
In situ-Hybridisierung
An Embryos bei E10.5 bis E14.5 wurden radioaktive in situ-Hybridisierungsverfahren durchgeführt, wie in Wilkinson (1995) beschrieben. Die radioaktiven Gegensinn-Sonden werden aus Maus-cDNA-Klonen generiert, wie z.B. Activin βA, Follistatin, Barx-1, Bmp-4, Bmp-7, CD44, Dlx-2, Fgf8, Gli-3, Otlx-2, Pax-9, Shh, Syndecan-1, Tgfβ-1, Tgfβ-3, oder andere, wie hier diskutiert.
Nach drei Tagen wird das orale Epithel entfernt und durch das Epithel des zweiten Pharyngialbogens ersetzt. Zu dieser Zeit findet sich das odontogene Potential in dem Mesenchym des zweiten Pharyngialbogens (induziert durch das orale Epithel), das dann die induktiven Signale zurück an das Epithel des zweiten Pharyngialbogens abgibt. Die Explantate werden für weitere drei Tage kultiviert und durch Histologie und molekulare Marker auf die Bildung von Zahnknospen untersucht.
1 zeigt die Bildung von Zahnknospen in diesem System (Pfeile).
Identische Explantate werden in Nierenkapseln transferiert, um zu demonstrieren, dass sich normale Zähne aus einer Kombination von Geweben des zweiten Pharyngialbogens bilden können, die normalerweise keine Zähne bilden. In diesen Experimenten ist es wichtig, dass keine Kontamination der Gewebe des zweiten Pharyngialbogens durch Zellen des ersten Bogens stattfindet. Dies wird durch die Verwendung von getrennten Embryos aus ROSA 26- und GFP-Mäusen überwacht, deren Zellen einfach voneinander unterschieden werden können, in dem darin die konstruierten Marker verwendet werden. Durch Gewinnung der Gewebe des ersten Bogens aus GFP-Mäusen und Gewebe des zweiten Bogens aus ROSA 26-Mäusen können die Ursprünge sämtlicher gebildeter Zellen durch Lac Z-Färbung und GFP-Detektion untersucht werden.
Induktion von Zahnprimordien aus mesenchymalem Gewebe
Demonstriert wird die in vitro-Induktion von Zahnprimordien aus mesenchymalem Gewebe. Die erforderlichen Signale werden künstlich durch Verwendung von proteingetränkten Kugeln bereitgestellt. Diesen Zahnvorläufen wird dann in vivo in adulten Tieren die Entwicklung in vollständig entwickelte Zähne ermöglicht.
Es werden Unterkiefer aus Embryos bei E11.5, E12.5 und E13.5 in D-MEM mit Glutamax-1 (Gibco BRL) präpariert. Der Rest des Embryos wird für die Genotypisierung verwendet. Zur Kultivierung bei E11.5 und E13.5 werden individuelle Backenzahnanlagen aus dem umgebenden oralen und aboralen Gewebe isoliert, während für Kulturen bei E12.5 gesamte Unterkiefer verwendet werden. Diese werden mit nach oben orientierten oralen Oberflächen auf Membranfiltern platziert, die von Metallgittern getragen werden, wobei man der von Saxen modifizierten Trowell-Technik folgt (Trowell, 1959; Saxen, 1966). Affi-Gel-Agarose-Kugeln (BioRad) werden mehrere Male in PBS gewaschen und dann ausgetrocknet, bevor diese zu rekombinantem Activin-A-Protein mit 1 mg/ml hinzugegeben werden, eine Konzentration, von der bekannt ist, dass diese die Mesodermbildung in „Xenopus-Animal-Cap-Assays" induziert (Ferguson et al., 1998), oder zu BSA mit der gleichen Konzentration, für eine Stunde bei 37°C. Die Kugeln werden so in das Mesenchym gedrückt, dass sich diese in unmittelbarer Nähe zu den sich entwickelnden Zahnkeimen befinden. Die Unterkieferexplantate bei E11.5 und E13.5 werden mit den Kugeln für 24 bis 72 Stunden in D-MEM mit 10%igem fötalem Kälberserum kultiviert. Die E12.5-Unterkieferexplantate werden mit den Kugeln für 6 Tage kultiviert, dann in 4% Paraformaldehyd (SIGMA) fixiert und zur histologischen Untersuchung unter Verwendung der Hämotoxylin/Eosin-Färbung weiterbehandelt. Es wird ein Standardinkubator bei 37°C mit einer Atmosphäre von 5% CO₂ in der Luft und mit 100% Feuchtigkeit verwendet. Sämtliche Lösungen enthalten Penicillin und Streptomycin bei 20 IU/ml. Nach der Kultivierungsdauer werden die E11.5- und E13.5-Explantate von ihren Membranfiltern entfernt und unter die Nierenkapseln von männlichen adulten Mäusen transplantiert. Während dieses Verfahrens dissoziieren die meisten Kugeln von den Explantaten. Die Explantate werden für 10 Tage in Wirtsnieren kultiviert, um die volle Entwicklung der Zähne zu ermöglichen. Die resultierenden Gewebe werden dann in Bouins-Lösung (SIGMA) fixiert, dehydriert und eingebettet. Es werden serielle Schnitte von 7 μm gefertigt und unter Verwendung von Alzianblau/Chlorontin Fast Red gefärbt.
Induktion von Zahnvorläuferzellen unter Verwendung von künstlichen Fgf-8/Bmp-4-Signalen
Die Unterkiefer werden bei E11.5 präpariert. Wenn erforderlich, wird das Epithel nach Inkubation in Dispase (2 Einheiten pro ml) für 10 Minuten bei 37°C inkubiert. Zur Applizierung von Fgf8-Protein werden Heparin-Acrylkugeln (SIGMA) gewaschen und anschließend über Nacht in 1 mg/ml Fgf-8-Protein (rekombinantes Maus-FGF-8b; R&D Systems, Europa) bei 4°C inkubiert. Zur Applizierung des Bmp-4-Proteins werden Affi-Gel-Agarose-Kugeln gewaschen und mit Protein (rekombinantes humanes Bmp-4) für 1 Stunde bei 37°C vollgesaugt. Es wurde eine Konzentration von 100 μg/μl Bmp-4 verwendet, da für diese Konzentration gezeigt werden konnte, dass sie die Pax-9-Expression in einem vergleichbaren Test inkibiert (Neubüser et al., 1997). Nach 24 bis 48 Stunden der Kultivierung werden die Explantate fixiert und für die in situ-Hybridisierung weiterverarbeitet. Eine Digoxygenin-„wholemount" in situ-Hybridisierung wird durchgeführt, wie beschrieben von Pownall et al. (1996).
Beispiel 2
Verwendung von kultivierten Stammzellen in der Herstellung von Zahnvorläuferzellen
Demonstriert wird der Ersatz von aus Neuralleisten stammenden mesenchymalen Zellen durch nicht-humane ES-Zellen und die anschließende Bestimmung dieser als Zahnvorläuferzellen.
Gezeigt wird hier ein Weg zur reproduzierbaren Herstellung eines festen mesenchymalen Gewebes aus kultivierten Stammzel len, wie bspw. nicht-humanen ES-Stammzellen, wobei das Gewebe in der Lage ist, mit oralem Epithel zu interagieren und Zähne zu bilden.
Um zu etablieren, dass nicht-humane ES-Zellen dazu verwendet werden können, um aus Neuralleisten stammende mesenchymale Zellen zu ersetzen, werden Maus-ES-Zellen auf Filter pelletiert, um kleine Aggregate zu bilden. Diese Aggregate werden mit oralem Epithel aus E10-Mausembryonen überschichtet und es wird eine Entwicklung für 3 Tage in Kultur ermöglicht. Die Histologie der Kulturen weist epitheliale Invaginationen mit umgebender Expression der Markergene Barx1 und D1x5 nach, wie in 2 gezeigt. Wildtyp-129-ES-Zellen wachsen und verbleiben in einem pluripotenten Stadium, wobei die gleichen Bedingungen verwendet werden, die routinemäßig für Gen-Targeting verwendet werden. Die Zellen werden auf vorgelatinisierte Millipore-Filter pelletiert und es wird ein Wachstum für eins bis drei Tage ermöglicht, um Aggregate zu bilden.
Die ES-Zellaggregate werden mit oralem E10-Epithel aus ROSA 26-Embryos überschichtet und für drei bis fünf Tage kultiviert. Die Histologie, die Analysen der molekularen Marker und des renalen Transfers werden wie hier beschrieben durchgeführt. Als Kontrolle werden ES-Zellen verwendet, die homozygot für ein Zielallel von Msx1 sind. Msx1^+/– -ES- und ^–/–-Zellen werden durch Reelektroporation von ^+/–-ES-Zellen mit dem Originaltargetingkonstrukt, gefolgt von einer Selektion mit einer höheren Konzentration von G418, hergestellt. Da Msx1^–/–-Embryonen keine Zähne entwickeln, ermöglichen ^–/–-ES-Zellen keine Zahnentwicklung jenseits des Knospenstadiums, wenn diese mit oralem Epithel rekombiniert werden (10).
Des Weiteren kann dem in Beispiel 1 dargestellten Protokoll gefolgt werden, in dem, nach Induktion des odontogenen Potentials in nicht-humanem ES-Zellengewebe, das orale Epithel durch nicht-odontogenes Epithel des zweiten Pharyngialbogens ersetzt wird.
Beispiel 3
Verwendung von kultivierten Zellen in der Bildung von oralem Epithel
Demonstriert wird der Ersatz von oralem Epithel durch kultivierte Zelllinien aus odontogenem Epithel.
Es wird hier gezeigt, wie orales Epithel durch ein Epithel ersetzt wird, das abgeleitet ist aus immortalisierten Linien von Zahnepithelzellen. Zuerst wird eine Anzahl von klonalen Linien von immortalisierten Zellen hergestellt, die aus dem frühen odontogenen Epithel stammen.
Epitheliale Kulturen
Nach 10minütiger Inkubation von E11.5-Unterkiefern in Dispase (2 Einheiten pro ml) bei 37°C wird orales Epithel isoliert. Das Epithel wird in Matrigel (Collaborative Biomedical Products) auf Membranfiltern, die von Metallgittern getragen werden, wie in (Ferguson et al., 1998) beschrieben, kultiviert. Matrigel ist eine solubilisierte Basalmembran, die aus der Engelbreth-HolmSwarm-Maus-Sarcomzelllinie isoliert wurde und eine Matrix bereitstellt, in der sich Epithelzellen entwickeln können. Bei Temperaturen zwischen 22°C und 35°C härtet das Gel schnell und irreversibel aus. Deshalb wird das Produkt auf Eis gehalten und es werden vorgekühlte Pipetten verwendet. Die Filter werden mit Matrigel beschichtet, das auf 37°C gebracht wird, bevor die Epithelien darauf pipettiert werden. Um die Epithelien zu visualisieren, werden diese schwach mit Neutralrot angefärbt, bevor diese auf Matrigel platziert werden. Affi-Gel-Agarose-Kugeln (BioRad), die mit rekombinantem Activin-A-Protein (1 mg/ml) oder BSA vollgesaugt sind, werden, wie hier beschrieben, präpariert. Die Kugeln werden oben auf die Epithelien gelegt, die dann wiederum mit weiterem Matrigel bedeckt werden, so dass die Kulturen umschlossen sind. Die Epithelien mit den Kugeln werden für 48 Stunden in D-MEM mit 10%igem fötalem Kälberserum kultiviert. Nach der Kultivierungsdauer werden die Kulturen in eiskaltem Methanol für 1 Minute gewaschen und dann in frischem, 4%igem Paraformaldehyd für 1 Stunde bei RT fixiert. Die Kulturen werden dann für die ³⁵S-Abschnitts-in situ-Hybridisierung präpariert.
Es werden immortalisierte Linien von odontogenen Epithelzellen hergestellt. Die hergestellten Zelllinien werden auf ihre odontogenen induktiven Kapazitäten getestet. Es werden Linien etabliert, die Amelogenine exprimieren, bei denen es sich um einmalige zahnspezifische Proteine handelt, die in die Schmelzbildung involviert sind. Es werden molekulare Marker analysiert, um zu bestimmen, ob die Signalgebungseigenschaften des frühen oralen Epithels gut etabliert sind.
Zellen, die Eigenschaften von Ameloblasten aufweisen, werden durch Screenen der Linien auf Amelogeninexpression identifiziert. Zum Screenen der Expression von FGF8, BMP4, SHH und Pitx2 (der früheste Marker des oralen Epithels) wird die RT-PCR verwendet, um zu bestimmen, welche Zelllinien wahrscheinlich in der Lage sind, orales Ectoderm zu ersetzen.
Um die odontogene induzierende Kapazität von Zelllinien zu testen, werden mesenchymale Explantate (Epithel entfernt) aus Unterkieferprimordien von E12-Embryonen auf Filtern in kleinen Vertiefungen in Kollagengelen kultiviert. Die kultivierten Zellen aus den gescreenten Linien werden auf die mesenchymalen Explantate geschichtet und die Explantate werden für 3 Tage kultiviert. Das Ausmaß der Epithelbildung und Invagination wird histologisch und mit molekularen Zahnmarkern untersucht.
Da bei E11.5 die odontogene induzierende Kapazität im Mesenchym lokalisiert ist, reagiert natürliches Epithel auf diese Signale und ermöglicht die Zahnentwicklung. Wenn das Wachstumsmedium, das in den Kulturen verwendet wird, nicht die Faktoren enthält, die für die Zelllinien erforderlich sind, um ein odontogenes Epithel zu produzieren, können konditionierte Medien aus Kulturen von intakten Unterkieferprimordienexplantaten verwendet werden.
Die induktiven odontogenen Eigenschaften der immortalisierten Zelllinien werden durch Anwendung der Verfahren aus den oben genannten Beispielen untersucht, wobei das Unterkieferprimordienmesenchym durch Mesenchym des zweiten Pharyngialbogens ersetzt wird.
Wenn die Epithelzellen die Odontogenese nicht korrekt induzieren, wird die Expression der induktiven Signalmoleküle (FGF8, BMP4, SHH, etc.) in den Kollagenexplantatkulturen untersucht, und die fehlenden Signale werden entweder durch gereinigte Proteine auf Kugeln oder durch Elektroporation von Genexpressionskonstrukten (siehe unten) ersetzt.
Beispiel 4
Konstruktion von künstlichem Epithel
Wie hier beschrieben, können oralepithelinduktive Signale unter Verwendung von gereinigten Proteinen zugeführt werden. Die folgenden experimentellen Ansätze werden verwendet, um induktive Signale in dem oralen Epithel zu reproduzieren (zu ersetzen), das aus immortalisierten kultivierten Zellen/nicht-humanen ES-Zellen hergestellt ist.
Es wurde eine Anzahl von Signalproteinen identifiziert, die von dem oralen Epithel sekretiert werden, das mesenchymale Zellen dazu veranlasst, odontogen zu werden und epitheliale Zahnknospen zu bilden. Diese Signale umfassen MGF8, BMP4 und SHH (3, 11). Diese Faktoren können ausreichend sein, um die Zahninitiation in nicht-odontogenen Zellen zu induzieren.
Getestet wird die Ausführbarkeit der Konstruktion eines künstlichen oralen Epithels. Kugeln, die mit einer Kombination von Signalproteinen, die in die Initiation involviert sind, vollgesaugt sind, werden in das Epithel von Extrakten des zweiten Pharyngialbogens implantiert und die Zahnentwicklung wird analysiert.
Auf dem zweiten Pharyngialbogen entwickeln sich keine Zähne und deshalb impliziert jedes Anzeichen von Zahnentwicklung, welche auf die Zugabe von exogenen Signalen folgt, eine Initiation.
Getestet werden eine Reihe von Konzentrationen und Kombinationen.
In den mit den Faktoren behandelten Explantaten bilden sich Strukturen, die sich nicht in den Kontrollexplantaten bilden.
Alternativ kann die Elektroporation dazu verwendet werden, um Genexpressionskonstrukte in lokalisierte epitheliale Stellen zu transferieren, um in dem zweiten Pharyngialbogen die räumliche Anordnung dieser drei Signalmoleküle im ersten Pharyngialbogen zu reproduzieren.
Beispiel 5
Herstellung von Epithel, das von nicht-humanen ES-Zellen abgeleitet ist
In der erfindungsgemäßen Herstellung von Zahnvorläuferzellen ist es wünschenswert, dass orales Epithel durch von nicht-humanen ES-Zellen abgeleitetes Epithel (d.h. von kultivierten Stammzellen abgeleitet) ersetzt wird.
Die Herstellung von Tierzahnvorläufern wie auch von humanen Zahnvorläufern wird vorzugsweise vollständig aus kultivierten Stammzellen bewerkstelligt.
Für ES-Zellen wurde gezeigt, dass diese in der Lage sind, Ectoderm-/epitheliale Zellen zu bilden und ähnlichen Linien zu folgen, wie diese oben für immortalisierte epitheliale Zelllinien beschrieben wurden, wobei die Erfordernisse für nicht- humane ES-Zellen zur Herstellung von induktivem odontogenem Epithel untersucht werden.
Als Kontroll-ES-Zellen werden Pitx2^–/–-ES-Zellen verwendet, da Pitx2 im frühen oralen Epithel exprimiert wird und Pitx2^–/–-Embryos keine Zahnknospen im Kappenstadium ausbilden (12, 13, 14).
Vorzugsweise werden sowohl odontogenes Epithel als auch Mesenchym mit den Verfahren der obigen Beispiele in einem einzigen Explantat durch Epithel und Mesenchym ersetzt, das aus nicht-humanen ES-Zellen hergestellt ist.
Beispiel 6
Entwicklung der Zahnexplantate in der Mundhöhle
Zahnexplantate können sich zumindest an zwei adulten Stellen entwickeln, der Nierenkapsel und der anterioren Kammer des Buges. Es wird bestimmt, ob sich die Explantate in der adulten Mundhöhle entwickeln können.
Adulte männliche Mäuse werden anästhetisiert und einzelne erste Backenzähne extrahiert. Extrakte aus Backenzahnprimordien, die für 3 Tage wie in den obigen Beispielen kultiviert wurden, werden in die Extraktionsstelle implantiert. Die oralen Schleimhäute werden über dem Explantat geschlossen, vernäht und für 10 bis 16 Tage zur Entwicklung belassen, währenddessen wird dem Tier eine Weichdiät verfüttert.
Das Ausmaß der explantierten Zahnentwicklung wird histologisch untersucht. Diese Experimente erfordern den Einsatz von Mikrochirurgie. Die chirurgische Erfahrung wird zuerst an getöteten Mäusen erworben, bevor eine Anwendung an lebenden Tieren erfolgt.
Der Fachmann kennt vielfältige Modifikationen und Variationen der beschriebenen Verfahren und des Systems der vorliegenden Erfindung, die innerhalb der Reichweite und des Gedankens der vorliegenden Erfindung liegen. Obwohl die vorliegende Erfindung im Zusammenhang mit speziellen bevorzugten Ausführungsbeispielen beschrieben wurde, versteht sich, dass die Erfindung, wie diese beansprucht ist, nicht unangemessen auf die spezifischen Ausführungsbeispiele begrenzt ist. Tatsächlich ist beabsichtigt, dass vielzählige Modifikationen der beschriebenen Ausführungsformen der Erfindung, die für einen in der Biochemie und Biotechnologie oder verwandten Gebieten geschulten Fachmann offensichtlich sind, von den vorliegenden Ansprüchen umfasst sind.
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Claims

Verwendung einer kultivierten Stammzelle, um eine Zahnvorläuferzelle herzustellen, wobei die Stammzelle keine humane embryonale Stammzelle ist.
Verwendung einer kultivierten Stammzelle, um eine Zahnvorläuferzelle gemäß Anspruch 1 herzustellen, wobei die kultivierte Stammzelle eine embryonale Stammzelle ist (ES-Zelle).
Verfahren zur Herstellung einer Zahnvorläuferzelle aus einer kultivierten Stammzelle, wobei das Verfahren folgende Schritte aufweist: i) Bereitstellung einer kultivierten Stammzelle, ii) In-Kontakt-Bringen der kultivierten Stammzelle aus (i) mit einer oder mehreren oralen Epithelzellen, und iii) Inkubieren für eine Zeit, die ausreichend ist, um die Zahnvorläuferzelle herzustellen, wobei die Stammzelle keine humane embryonale Stammzelle ist.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die kultivierte Stammzelle eine ES-Zelle ist.
Zahnvorläuferzelle erhältlich aus einer kultivierten Stammzelle, wobei die Stammzelle keine humane embryonale Stammzelle ist.
Zahnvorläuferzelle erhältlich aus einer kultivierten Stammzelle gemäß Anspruch 5, wobei die kultivierte Stammzelle eine ES-Zelle ist.