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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Hochdruck-Sterilisation
von empfindlichen Wirkstoffen, insbesondere Peptiden, Oligonukleotiden
oder Proteinen.
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Bekannt
ist die Sterilisation von agrarischen Lebensmittelprodukten durch
Druck wie das in der europäischen
Patentanmeldung Nr. 894440 beschriebene Verfahren. Dieses Verfahren
ermöglicht, Flüssigkeiten
kontinuierlich durch Behandlung der Flüssigkeiten in einer Reihe von
Stufen zu behandeln, in denen die Drücke zunehmen. Wenn die Flüssigkeit
die letzte Stufe mit sehr hohem Druck ereicht, wird die Flüssigkeit
einer schnellen Depression ausgesetzt, die die Mikroorganismen zerstört.
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Andere
Verfahren sehen vor, hohen Druck mit hohen Temperaturen zu kombinieren.
Auf diese Weise werden schwach saure Lebensmittel, die schon konditioniert
sind, einer Vordrucktemperatur ausgesetzt werden, dann wird für einen
kurzen Moment das Ganze auf einen sehr hohen Druck gebracht, was
die Temperatur augenblicklich auf hohe Werte steigen lässt. Der
Druck wird auf den Ausgangsdruck zurückgeführt, so dass die Temperatur unmittelbar
abfällt.
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Diese
Verfahrensweisen ermöglichen,
Mikroorganismen wie Viren, Bakterien und Schimmelpilze in Flüssigkeiten
zu zerstören,
da die Flüssigkeiten
die ausgeübten
Drücke
isostatisch perfekt übertragen.
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Die
deutsche Patentanmeldung DE-A-19 905159 beschreibt ein Verfahren
zur Sterilisation von Substanzen oder Wirkstoffen, die zum Einbringen
in Medikamente vorgesehen sind, bei Drücken zwischen 20 und 9000 bar
und Temperaturen zwischen 25 °C
und 200 °C.
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Solche
Temperaturen bewirken den Abbau bestimmter Wirkstoffe und das Ziel
ist allgemein die Sterilisation von sehr beständigen Wirkstoffen.
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Die
internationale Patentanmeldung WO 98 47503 offenbart ein Verfahren
zum Sterilisieren von Präparaten
auf Basis von Ibuprofen. Das Ziel ist, eine Hochdruckbehandlung
bei 3000 bis 10000 bar zu bewirken, wobei Temperaturen unter der
Schmelztemperatur von Ibuprofen eingehalten werden.
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Bei
der Patentanmeldung FR-A-2 740 993 wird eine isostatische Presse
zum Behandeln von eingefüllten
Flüssigkeiten
angeführt,
um die Konservierungsdauer zu erhöhen, insbesondere im Bereich von
Agrarlebensmitteln.
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Hingegen
sind in wirtschaftlicher Hinsicht solche Verfahrensweisen wenig
geeignet für
Produkte mit geringem Wert, da sie bedeutende Investitionen beinhalten,
die schwer zu amortisieren sind.
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Es
sind andere Mittel zur Sterilisation durch radioaktive Verfahrensweisen
bekannt, aber obwohl bestimmte Bestrahlungen zufriedenstellend wirken können, stellen
sich in diesen Fällen
komplexe Probleme bezüglich
ihrer Handhabung und bringen vor allem Fragen bezüglich der
Risiken für
die Umwelt auf, die mit ihrer Verwendung verbunden sind.
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Sterilisierende
Membranen sind auch ein gutes Mittel zum Zurückhalten von unerwünschten
Partikeln, aber es ist auch notwendig, dass das Sieben zweckmäßig ist
und dass man die verschiedenen Kategorien mechanisch trennen kann.
Allgemein machen die industriellen Regeln, die die Filtration aufstellt,
diese bei der Durchführung
wenig praktisch und beschränken
sie auf einzelne Flüssigkeiten.
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Die
gängigste
Technik besteht im Sterilisieren durch Wärme unter Druck wie es zuvor
angegeben wurde oder einfach durch Wärme bei Umgebungsdruck. Diese
Methode ist nur bei Produkten anwendbar, die die Temperatureinwirkung
ertragen, doch viele Wirkstoffe sind wärmeempfindlich. Die Wirkstoffe
sind insbesondere aus der Biotechnologie erhalten, wie Peptide oder
Moleküle,
die aus der DNA-Analyse erhalten sind.
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Aus
der Druckschrift WO-A-00/72703 ist ein Verfahren zur Inaktivierung
von Mikroorganismen in einer Lebensmittelflüssigkeit, wie Milch, bekannt,
das darin besteht, diese Flüssigkeit
einer Homogenisierungsbehandlung durch dynamischen Hochdruck zu unterziehen,
bei dem die Mikroorganismen durch die Kombination von Mechanismen
zerstört
werden, die einen scharfen Druckabfall, Scherbelastungen, Kavitation
und Stoßwellen
umfassen. Das Verfahren ist bei einem flüssigen Produkt kontinuierlich
einsetzbar, aber nicht bei empfindlichen Wirkstoffen, die nicht
in flüssiger
Form vorliegen können.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
schlägt Schritte
vor, die es ermöglichen,
durch eine Behandlung unter Hochdruck empfindliche Wirkstoffe zu
sterilisieren, ohne sie abzubauen, und unter Durchführungsbedingungen,
die für
die Industrie geeignet sind. Ein solches Verfahren ist bei therapeutischen Stoffen
von hohem Wert wirtschaftlich geeignet, aber es besteht ein Verdacht,
dass die empfindlichen Wirkstoffe durch das Durchlaufen sehr hoher
Drücke abgebaut
werden und dass die Verwendung von sehr hohen Drücken als bakterizides und viruzides
Mittel nicht geeignet ist.
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Im
Gegensatz zu dem, was aus dem Stand der Technik bekannt ist, ermöglicht die
Temperatur im negativen Bereich, die Sterilisationseffekte unter Druck
zu verstärken.
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Es
wird auch festgestellt, dass die Anwendung des Sterilisationsverfahrens
bei Feststoffen in zerkleinerter Form besonders die Sterilisationskapazitäten für andere
Produkte als Flüssigkeiten
aufzeigt.
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Zu
diesem Zweck ist das Sterilisationsverfahren für mindestens einen empfindlichen
Wirkstoff gemäß der Erfindung
dadurch gekennzeichnet, dass der genannte Wirkstoff ein Peptid,
ein Antikörper,
ein Protein oder ein Enzym ist und einer isostatischen Druckanwendung
mit Druckwerten zwischen 3000 und 6000 bar und Temperaturen zwischen –30 °C und +25 °C unterzogen
wird.
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Insbesondere
weist der behandelte Wirkstoff ein Molekulargewicht unter oder gleich
170000 g/mol auf.
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Bevorzugt
wird das Verfahren bei negativen Temperaturen bis –30 °C durchgeführt und
sogar direkt an einer Formulierung, die den Wirkstoff in pulverförmigem Milieu
enthält.
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Um
den gewünschten
Sterilisierungseffekt zu erreichen, werden der Druck und die Temperatur eingestellt,
um eine logarithmische Reduzierung der Verunreinigung mit Mikroorganismen über 6 zu
erreichen.
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Das
Verfahren wird nun durch Angabe mehrerer Beispiele und Versuchsergebnisse
beschrieben, mit Bezug zu den begleitenden Zeichnungen, in denen
die verschiedenen Figuren darstellen:
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1A:
Kurve der Auflösungskinetik
von komprimiertem Ibuprofen erhalten durch isostatischen Druck unter
Hochdruck,
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1B:
Vergleichskurve der Auflösungskinetik
von komprimiertem Ibuprofen erhalten durch uniaxialen Druck unter
Hochdruck,
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2A–2D:
Chromatographiekurven von Insulin nach Behandlung unter Hochdruck,
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3:
Kurve der immunologischen Aktivität von unter Hochdruck behandelten
Antikörpern,
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4:
Tabelle der Ergebnisse von Tests mit Pseudomonas aeruginosa,
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5:
Tabelle der Ergebnisse von Tests mit Candida albicans,
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6:
Tabelle der Ergebnisse von Tests mit Aspergillus niger und
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7:
Tabelle der Ergebnisse von Tests mit Bacillus subtilis, direkt auf
einem pulverförmigen
Milieu.
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Zunächst werden
Möglichkeiten
zur Behandlung von fragilen Molekülen durch hohe Drücke definiert,
wobei gezeigt wird, dass die Struktur der Wirkstoffe nach Einwirkung
dieser Drücke
unverändert bleibt.
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Unter
fragilen Elementen sind Moleküle
wie Proteine, Antikörper,
Peptide, Enzyme zu verstehen, aber auch Medikamentenvektoren wie
Mikrokugeln, Nanokapseln oder Liposome. Diese fragilen Elemente
können
Temperaturanstiege oder Bestrahlungen nicht aushalten.
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Man
weiß,
dass bei isostatischer Druckeinwirkung sehr wenig Energie auf die
behandelten Produkte übertragen
wird, was ihr Potential erhält.
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Die
folgende Beschreibung ist auf die Sterilisation von Pulvern anwendbar,
wie Pulvern für
sofort zu verabreichende Präparate,
die zum Injizieren vorgesehen sind. Ferner ist es möglich, direkt
durch Druckanwendung aus Pulvern Presslinge in gewünschter
Form auszubilden, und zum Anwenden zu sterilisieren. Es ist nur
notwendig, eine geeignete Matrize vorzusehen, um reproduzierbar
eine gewünschte
Form und Masse zu erhalten.
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Die
Versuche wurden mit einem nicht steroiden Entzündungshemmer der Propiongruppe
durchgeführt,
Derivat der Carbonsäure,
Ibuprofen in Basenform.
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Insbesondere
wird die folgende Formulierung erhalten:
IBUPROFEN: 60 % (Herstellung
der Firma Knoff unter Produktkode UPSA)
LACTOSE: 35 % (Herstellung
der Firma Seppic unter Produktkode A16M07)
AEROSIL 200: 0,5
% (Herstellung der Firma Degussa unter Produktkode M01 03 E330)
Mg-STEARAT
200: 0,5 %(Herstellung der Firma Cpf unter Produktkode M01 03 E677)
TALK:
4,0 % (Herstellung der Firma Cpf unter Produktkode M01 03 E044)
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Es
werden durch isostatische Druckanwendung von 2000 bar Presslinge
ausgebildet.
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Es
werden Auflösungstests
unter Rühren
mit 100 Umdrehungen pro Minute bei 37 °C und einem pH von 7,2 vorgenommen.
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Die
Kurve der 1A zeigt, dass die Auflösungskinetik
im Falle einer isostatischen Druckanwendung praktisch linear ist,
aber mit einer verlängerten
Freisetzungsdauer des Wirkstoffs nach 4 Stunden.
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Zum
Vergleich wird eine uniaxiale Kompression mit der selben Formulierung
vorgenommen und mit dem selben ausgeübten Druck, die entsprechende
Kurve ist in 1B angegeben. Es ist festzustellen,
dass das gesamte Ibuprofen in weniger als zwei Stunden freigesetzt
wird.
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Ein
erster Vorteil des isostatischen Drucks ist eine verbesserte Auflösungskinetik.
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Es
wurden komplementäre
Versuche durchgeführt,
um die Unschädlichkeit
der Behandlung durch Hochdruck auf fragile Elemente zu zeigen. In dem
Fall liegen diese Elemente gelöst
oder in Form eines Pulvers vor.
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Zu
diesem Zweck werden fragile Elemente mit Molekulargewicht über oder
gleich 170 000 g/mol verwendet, wie Peptide, Proteine und Antikörper, insbesondere:
ein
Decapeptid: Gramicidin (Molgewicht = 1 140 g/mol) in Pulverform,
Insulin 40 UI (Molgewicht = 5 800 g/mol) und
ein monoklonaler
Antikörper
wie der Antikörper
Antivirusgrippe A (Molgewicht = 150 000 g/mol).
- a/
Das Peptid, in diesem Fall das Gramicidin, wird einer Behandlung
unter Hochdruck bis zu 5000 bar unterzogent, und seine Reinheit
wurde gleichermaßen
durch HPLC geprüft,
wobei die Schwankungen unter 1 bleiben. Hochdruck hat keinen Einfluss
auf die Struktur.
- b/ Das Insulin wurde mit 40 UI gewählt, handelsüblich, und
auf 1/100 bei pH 2,5 verdünnt.
Für die Messung
wird der Durchfluss mit einer Rate von 1 ml/min in einem HPLC-Gerät (HPLC,
high pressure liquid chromatography) vorgenommen.
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Es
wurden verschiedene Proben bei Raumtemperatur und bei negativer
Temperatur von –20 °C unterzogen:
Atmosphärendruck
als Referenz,
4000 bar für
10 min,
5000 bar für
10 min, und
6000 bar für
10 min.
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Die
Proben wurden nach Behandlung bei 214 nm in einem Chromatographiegerät mit automatischer
Injektion analysiert. Es wurden die fol genden in den 2A, 2B und 2C und 2D gezeigten
Ergebnisse erhalten.
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Es
ist festzustellen, dass in den verschiedenen Kurven der einer Sterilisation
durch Hochdruckbehandlung unterzogenen Proben die selben Peaks mit
im Wesentlichen den selben Intensitäten erscheinen und die in den
selben Temperaturbereichen zentriert sind, wie im Fall der Referenzprobe
bei Atmosphärendruck,
darunter auch, wenn die Temperatur negativ ist.
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Es
gibt keine merklichen Modifikationen oder Veränderungen der Struktur des
Produkts.
- c/ Bezüglich der monoklonalen Antikörper wurden monoklonale
Antikörper
getestet, die gegen den Virus der Grippe A gerichtet sind mit Molekulargewicht
von 150 000 g/mol, die man Hochdruck von 4000, 5000 und 6000 bar
während
10 min bei Raumtemperatur ausgesetzt hat.
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Ein
ELISA-Test zeigt, dass die immunologische Aktivität der bei
bis 5000 bar behandelten Antikörper
erhalten bleibt, während
diese Aktivität
sich ab 6000 bar verringert. Dies ist in den Kurven der 3 gezeigt.
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Da
die hohen Drücke
die Wirkstoffe nicht abbauen, wurden nun die folgenden Versuche
durchgeführt,
um die Wirksamkeit der Behandlung gegenüber Mikroorganismen aufzuzeigen.
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Weil
es keinen genormten mikrobiologischen Indikator für die Wirksamkeit
gibt, um die Sterilisierungsbehandlungen zu qualifizieren, wurden
vier pathogene Mikroorganismen ausgewählt, um eine Probe der repräsentativsten
dieser Mikroorganismen in flüssigem
Milieu auszubilden:
- – ein Gram: Pseudomonas aeruginosa,
- – eine
Hefe: Candida albicans und
- – eine
Schimmelspore: Sporen von Aspergillus niger.
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Gemäß der europäischen Pharmakopöe erfordert
eine sterilisierende Behandlung eine Verdünnung von 6 log der Mikroorganismenpopulation.
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Tests an: Pseudomonas
aeruginosa
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Die
Ergebnisse sind in der Tabelle von 4 dargestellt,
die die logarithmische Verringerung zeigt. Es ist festzustellen,
dass der Druck immer eine sterilisierende Wirkung erzeugt, unter
der Bedingung, dass große
Drücke
von 4000 bar erreicht werden.
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Es
ist bei diesen Versuchen festzustellen, dass die Arbeiten bei Raumtemperatur
und bei Frosttemperaturen von –17 °C durchgeführt wurden.
Es wurde überraschend
eine Verbesserung der Sterilisierungseffekte durch Druck festgestellt
und ab 3000 bar wird die gesuchte Sterilisierungswirkung erreicht.
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Tests an Candida
albicans
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Dieser
Mikroorganismus ist besonders druckempfindlich, aber es wurde erneut
die Wirkung von tiefen Temperaturen festgestellt, die die Wirkung verstärken und
es erlauben, ab 2000 bar praktisch das Differential von 6 log zu
erreichen. Tabelle in 5.
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Tests an Sporen
von Aspergillus niger
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Die
Versuche zeigen, dass es notwendig ist, 6000 bar zu erreichen, um
einen logarithmischen Verringerungswert von mehr als 6 zu erzielen,
unterstützt
von den zugehörigen
Wirkungen, die durch die Frosttemperaturen von –17 °C hervorgerufen sind. Tabelle
in 6.
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Es
wurden weitere Versuche direkt an pulverförmigen Stoffen vorgenommen.
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Der
verwendete pulverförmige
Stoff ist Lactose, eine Grundmasse, die man bei der Herstellung zahlreicher
pharmazeutischer Tabletten oder bei Pulvern für Injektionspräparate findet.
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Es
wurde der Stamm Bacillus subtilis verwendet.
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Zur
Bestimmung des Hintergrundrauschens von Lactose, das die Messung
stören
könnte,
wird eine Pulverreferenzprobe vorgesehen. Dies ermöglicht,
eventuell in der Lactose vorhandene Verunreinigung zu berücksichtigen.
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Jede
Probe wird in eine dichte Hülle
eingebracht und Hochdruck von 4000 bar durch isostatischen Druck
ausgesetzt.
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Die
beiden anderen Proben umfassten erstens die Lactose mit Bacillus
subtilis in lyophilisierter Form und zweitens eine gleiche Dosis
der Bakterien Bacillus subtilis, lyophilisiert aber einfach in einem Verdünnungsmittel,
um die Bakterienprobe einer sterilisierenden Wirkung zu unterziehen.
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Die
Ergebnisse sind in der Tabelle in 7 dargestellt.
Sie zeigen, dass die Lactose schon Mikroorganismen enthält und dass
diese Bewohner alle wie die zugefügte Ladung zerstört wurden,
wobei die logarithmische Verringerung 7,31 beträgt.
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Es
ist eine geringere Wirksamkeit der Behandlung bei Hochdruck auf
die mikrobielle Probe in flüssigem
Milieu festzustellen.
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Ebenso
ist anzumerken, dass die Druckbehandlungen mit einer negativen Temperatur
ermöglichen,
die Durchführung
der Sterilisation zu verbessern, insbesondere wenn während der
Druckbehandlung die Temperatur auf –17°C, sogar auf –20 °C und –30°C anstelle
der Raumtemperatur gehalten wird.
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Ebenso
kann die Sterilisationsbehandlung unter Druck, zwischen 3000 und
6000 bar, insbesondere von Pulvern gemäß der vorliegenden Erfindung in
einem Temperaturbereich von –30 °C bis +25°C durchgeführt werden.
Diese Behandlung beeinflusst die enthaltenen Wirkstoffe nicht.