DE19939677A1

DE19939677A1 - Verfahren zur Inaktivierung von zellwandlosen Bakterien, insbesondere der Mykoplasmen durch Anwendung hohen hydrostatischen Drucks

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Publication number: DE19939677A1
Application number: DE1999139677
Authority: DE
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1999-08-20
Filing date: 1999-08-20
Publication date: 2001-02-22

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Sterilisation wässriger Lösungen, die mit Mykoplasmen oder anderen zellwandlosen Bakterien kontaminiert sind. Dabei werden diese Lösungen einer Hochdruckbehandlung unterzogen.

In der Biotechnologie, insbesondere beim Arbeiten mit Zellkulturen, stellt die Kontamination mit Mykoplasmen ein Problem dar. Diese zellwandlosen Bakterien passieren die vom EuAB 97 für Wirkstoffe und Zubereitungen, die nicht im Endbehältnis sterilisiert werden können, vorgeschriebenen Membranfilter der Porenweite 0,22 µm. An dem Bakterium Mycoplasma pneumoniae konnte gezeigt werden, daß es bei 40°C und einem Druck von 250 MPa innerhalb von 15 min möglich ist, wässrige Lösungen mit einer Ausgangskeimzahl von 10⁹ Bakterien/ml zu sterilisieren. Die Aktivität eines zu Testzwecken bei den gleichen Bedingungen mituntersuchten Albumin-Antikörpers blieb in vollem Umfang erhalten.

1. Einleitung

Mykoplasmen zählen zu den kleinsten, selbständig vermehrungsfähigen Prokaryonten. Anstelle einer Zellwand besitzen sie eine stabile cytoplasmische Membran, deren Stabilität durch den Einbau von Cholesterol erhöht wird. Aufgrund ihrer geringen Größe und ihrer hohen Flexibilität werden sie bei der Sterilfiltration mit den üblichen bakteriendichten Filtern (Porenweite 0,22 µm) nicht zurückgehalten. Dies stellt besonders dann ein Problem dar, wenn die kontaminierten und somit zu sterilisierenden wirkstoffhaltigen Lösungen hitzeempfindlich sind und somit auch nicht mit Hilfe der üblichen Hitzesterilisation behandelt werden können.

In früheren Veröffentlichungen wurde bereits gezeigt, daß vegetative Bakterien bei niedrigen oder leicht erhöhten Temperaturen durch Hochdruckbehandlung inaktiviert werden können [1], [2]. Diese Untersuchungen beschäftigten sich jedoch nicht mit Mykoplasmen.

Mykoplasmen leben parasitisch in Pflanzen und Tieren. Sie zählen zu den extrazellulären Parasiten. Sehr häufig sind Zellkulturen mit Mykoplasmen kontaminiert. Im menschlichen Organismus kommen die Mykoplasmen hauptsächlich auf den Epithelien der Trachea, der Bronchien und der Bronchiolen vor, daneben auch im Gentitaltrakt. Mycoplasma pneumoniae zählt als Erreger der atypischen Pneumonie zu den humanpathogenen Keimen. Die Untersuchungen bei der vorliegenden Erfindung wurden mit diesem pathogenen Keim durchgeführt.

Entscheidende Parameter zur erfolgreichen industriellen Anwendung der Hochdrucktechnologie sind die Dauer der Hochdruckanwendung und die Höhe des erforderlichen Druckes. In den üblichen Hochdruckapparaturen können Drücke bis zu 1000 MPa realisiert werden. Die Kosten der Hochdruckapparaturen steigen jedoch deutlich mit dem vorgegebenen maximal zu erreichenden Druck. Die Dauer der Hochdruckbehandlung entscheidet dagegen über die Höhe der Produktionskosten bei Anwendung der Technologie auf ein zu sterilisierendes Gut. Letztlich ist - will man hitzeempfindliche Wirkstoffe wie z. B. antikörperhaltige Seren sterilisieren - eine moderate Temperatur vorgegeben.

Die in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Parameter zur Inaktivierung von Mycoplasma pneumoniae liegen mit einem Druck von 250 MPa und 15 min Behandlungsdauer bei einer Temperatur von 40°C in einem Bereich, der die industrielle Nutzung dieser Sterilisationsmethode ermöglicht.

2. Material und Methoden

Die Hochdruckexperimente wurden mit einer Hochdruckapparatur durchgeführt, die es erlaubt, mit Hilfe von Wasser als druckübertragendem Medium Drücke bis zu 700 MPa aufzubauen. Die Apparatur besteht aus 10 Druckbehältern, die in Gruppen von je 5 Behältern getrennt thermostatisiert werden können. Dieser Aufbau ermöglicht kinetische Untersuchungen [3].

Die Bakterienkulturen wurden in Polyethylen-Gefäße (je 0,4 ml) gefüllt und unter Druck gesetzt. Die Zahl der überlebenden Bakterien wurde mittels der Most-Probable-Number- Methode [4], [5] bestimmt.

Die Aktivität des parallel untersuchten polyklonalen Antikörpers wurde mittels eines ELISA- Tests überprüft.

3. Ergebnisse

Die Inaktivierung von Mycoplasma pneumoniae wurde bei verschiedenen Temperaturen untersucht. Am erfolgreichsten verlief sie bei einer Temperatur von 40°C. Bei dieser Temperatur beginnt die Inaktivierung bei Drücken ab 100 MPa. Die Inaktivierungsrate steigt im Druckbereich von 250 bis 300 MPa stark an. Der Anstieg verlangsamt sich bei weiterer Druckerhöhung. Bei 450 MPa konnten nach nur 5 min Behandlungsdauer keine Bakterien mehr nachgewiesen werden (Abb. 1).

Die Untersuchungen zur Drucktoleranz von Mycoplasma pneumoniae bilden die Grundlage zur Entwicklung einer Sterilisationsverfahrens für Lösungen, die mit zellwandlosen Bakterien wie den Mykoplasmen verseucht sind. Die zu optimierenden Parameter sind Druck, Temperatur und Zeitdauer der Druckbehandlung. Der minimale aufzuwendende Druck beträgt bei 25°C 250 MPa und bei 40°C 150 MPa. Bei diesen Bedingungen sind die Behandlungszeiten jedoch relativ lang. Höherer Druck führt zu kürzeren Behandlungszeiten. Bei 40°C und 250 MPa folgt die Inaktivierung nach einer kurzen Inkubationszeit einer Reaktionskinetik 1. Ordnung. Die Abnahme um eine Zehnerpotenz (D- Wert) erfolgt in 1,1 min. Nach 15 min sind, ausgehend von einer Keimzahl von 10⁹ Bakterien pro ml, keine Bakterien mehr nachweisbar (Abb. 2).

Um die Möglichkeit der Anwendung der Hochdruckbehandlung für die Sterilisation proteinhaltiger Seren zu demonstrieren, wurde als Modellprotein ein polyklonaler Albumin- Antikörper untersucht. Der Antikörper wurde bei einer Temperatur von 40°C für 20 min Drücken von 200, 250, 300, 400 und 500 MPa ausgesetzt. In Kontrollexperimenten wurde der Temperatureinfluß auf die Aktivität des Antikörpers ermittelt. Bei 200 und 250 MPa scheint die Aktivität des Antikörpers um 5 bzw. 3% anzusteigen. Bei 300 MPa ist im Vergleich zur Kontrolle bei Atmosphärendruck keine Veränderung der Aktivität feststellbar. Erst bei Drücken von 400 und 500 MPa sinkt die Aktivität um 2 bzw. 8%. Eine Temperaturerhöhung von 25 auf 40°C führte zu einem Absinken der Aktivität um 1% (Abb. 3).

Es konnte somit gezeigt werden, daß die Aktivität eines polyklonalen Antikörpers bei den zur Sterilisation von mit Mykoplasmen verseuchten Seren ausreichenden Bedingungen (250 MPa, 40°C und 15 min Behandlungsdauer) nicht abnimmt. Somit ist diese Sterilisationsmethode zur Behandlung kontaminierter proteinhaltiger Seren geeignet.

4. Literatur

[1] von Almsick, G.; Schreck, Ch.; Ludwig, H.: Pressure induced inactivation of microorganisms. In: Basic and applied high pressure biology IV. Jean-Claude Rostain, Alister G. Macdonald and Robert E. Marquis (eds.). Medsubhyp International 1995, tome 5 (1995) 69-75.
[2] Ludwig, H.; Bieler, C.; Hallbauer, K.; Scigalla W.: Inactivation of microorganisms by hydrostatic pressure. High Pressure and Biotechnology, Colloque Inserm Vol. 224 (1992) 25-32.
[3] Sojka, B.; Ludwig, H.: Pressure induced germination and inactivation of Bacillus subtilis spores. Pharm. Ind. 56 (1994) 660-663.
[4] Wallhäußer, K. H..: Praxis der Sterilisation - Desinfektion - Konservierung. 5. Aufl. Georg Thieme Verlag Stuttgart New York (1995)
[5] Hess, H.; Knüsel, F.; Mullen, K.: Control of low-level microbial contamination of drug preparation. Pharmazeutuca Acta Helvitica 44 (1968) 174-191

Claims

1. Verfahren zur Inaktivierung von zellwandlosen Bakterien, insbesondere von Mykoplasmen, dadurch gekennzeichnet, daß die Inaktivierung der Bakterien durch Anwendung hohen hydrostatischen Drucks auf das zu sterilisierende Medium erfolgt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Hochdruckbehandlung bei Drücken zwischen 100 und 1000 MPa erfolgt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das zu sterilisierende Gut der Hochdruckbehandlung über einen Zeitraum von einer Sekunde bis mehreren Stunden unterzogen wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Temperatur während der Hochdruckbehandlung unter 50°C liegt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, 2, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß das zu behandelnde Gut vor der Hochdruckbehandlung in ein Verkaufsbehältnis abgefüllt wird.

6. Verfahren nach den Ansprüchen 1, 2, 3, 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem zu sterilisierenden Gut um proteinhaltige Seren handelt.

7. Verfahren nach den Ansprüchen 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem zu sterilisierenden Gut um Zellkulturmedien handelt.