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1. Das technische Gebiet, zu dem die Erfindung gehört, soweit sie sich nicht aus den Ansprüchen oder den Angaben vom Stand der Technik ergibt
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- Medizin, Tiermedizin, Pflanzenschutz, Lebensmittel, Kosmetika, Reinigungsmittel
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2. Stand der Technik
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Mit dem mikrobiologischen Untersuchungsverfahren der „fraktionierten Germination” (
DE 10 2014 006 485 B3 ) wurden bei einem hohen Anteil der untersuchten Fertigarzneimittel-Chargen Verunreinigungen durch Bakteriensporen nachgewiesen, die nach ihrem Auskeimen Antibiotika-Resistenzen aufweisen.
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In den „Hinweisen für die Verbraucher” (Packungsbeilagen) der Fertigarzneimittel finden sich aber noch keine Informationen, die auf die Verunreinigung dieser Erzeugnisse mit Bakterien oder Bakteriensporen hinweisen, und schon gar nicht, welche Resistenzdeterminanten durch diese Medikamentechargen verbreitet werden.
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Die Verbreitung von Resistenzgenomen durch apathogene Keime in Pharmaprodukten hat nach unserer Kenntnis bisher noch nicht zu Rückrufaktionen geführt.
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Die klinische Bedeutung der Kontamination von Arzneimitteln und anderen zur Anwendung bei Mensch und Tier bestimmten biologischen Erzeugnissen liegt nicht nur darin, dass dadurch pathogene vegetative Bakterien und Sporen pathogener Bakterienstämme auf die Patienten übertragen werden, sondern auch in der Verbreitung meist apathogener vegetativer Bakterien und Bakteriensporen, die Antibiotika-Resistenzdeterminanten durch horizontalen Gentransfer übertragen.
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Die sehr rasch, oft schon innerhalb weniger Tage verlaufenden Resistenzübertragungen zwischen verschiedenen Bakterienarten sind in zahlreichen Publikationen („Erworbene Resistenz”, in: 1.5 Genetik von Bakterien und Viren, 1.5.2 Resistenz, zum.de/Faecher/Materialien/beck/13/bs13-8.htm), (Stecher, Bärbel: „Gut inflammation can boost horizontal gene transfer between pathogenic and commensal Enterobacteriaceae”, PNAS, 2012; doi:10.1073/pnas.1113246109) im Internet seit einigen Jahren hinreichend belegt und gehören zum Stand der Technik.
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Der Anteil an resistenzkontaminierten Chargen bei Fertigarzneimittel beträgt gegenwärtig bis über 30%, und es ist jetzt möglich geworden, zum Beispiel mit Hilfe der „fraktionierten Germination” (
DE 10 2014 006 485 B3 )
- • einerseits die Bestandteile zu ermitteln, welche die Resistenzgenome in die bisher zugelassenen Arzneimittel hineintragen, und
- • andererseits solche Herstellungsverfahren zu entwickeln, die Alternativen mit ausschließlich sporenfreien Ausgangsstoffen darstellen.
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Seit mit dem in
DE 10 2014 006 485 B3 vorgestellten Untersuchungsverfahren der „fraktionierten Germination” bakterielle Kontaminationen auch in registrierten homöopathischen Arzneimitteln nachzuweisen sind, können diese Erzeugnisse demzufolge nicht mehr als arzneimittelrechtlich „unschädlich” bezeichnet werden, wie dies oft pauschal den Homöopathika auch von Amts wegen zugestanden wird („Ausdrücklich nahm die Bundesbehörde einige Mittel der Homöopathie nicht mit in die Rückruf-Aktion auf. Laut Pommer sind die homöopathischen Arzneien unbedenklich, da aufgrund der hochkonzentrierten Alkohollösung keine Bakterien überleben können.”; www.heilpraxisnet.de/naturheilpraxis/bockshornkleesamen-arzneien-unter-eher-verdacht-163.php). Hier weicht der bisher bekannte Stand der Technik erheblich von der heutigen Realität ab.
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Schließlich begünstigt die Anwendung mit Resistenzgenomen belasteter Pharmaka das Entstehen langfristig wirkender Gefahren, indem durch schon einmaligen Kontakt mit kontaminierten Medikamenten und ohne eigenen Kontakt zu einem Antibiotikum (Tierklinik.de Escherichia coli – Colibacillose Fortpflanzung der Bakterien – Konjugation) ein gleichzeitiger oder späterer therapeutischer Einsatz solcher Antibiotika wirkungslos gemacht wird.
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Es war nicht Aufgabe in
DE 10 2014 006 485 B3 , gleichzeitig schon eigene Verfahren zur Herstellung keimfreier Medikamente und anderer keimfreier Erzeugnisse zu entwickeln, sondern es sollte zunächst ein Untersuchungsverfahren geschaffen werden, durch welches bisher keimbelastete Bestandteile ermittelt, verändert oder ausgesondert und solche durch geprüft keimfreie Komponenten ersetzt werden können.
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Bei den von uns mittels dieser fraktionierten Germination geprüften Medikamenten wurden jeweils bei etwa 30–40% der geprüften Präparate keine bakteriellen Träger von Antibiotika-Resistenzen festgestellt. Eine Produktion von bakterien- und sporenfreien Pharmaka ist demzufolge in vielen Pharmaunternehmen technisch möglich, ohne dass nach dem bekannten Stand der Technik die verfahrenstechnischen Zusammenhänge offenbart worden wären.
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Der Jahresumsatz der mit diesem Verfahren zu prüfenden industriell gefertigten Erzeugnisse bewegt sich allein in Deutschland im zweistelligen Milliardenbereich. Das Verfahren kann einer „kontinuierlichen Überwachung von Arzneimitteln auch nach der Zulassung” (Aktories und Mitarb., Allg. u. spez. Pharmakologie u. Toxikologie, 9. Aufl., Urban & Fischer, München Jena 2005, S. 93) dienen.
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Das Verfahren zur mikrobiologischen Prüfung von industriell gefertigten pharmakologischen und anderen biologischen Erzeugnissen durch fraktionierte Germination ist eine wesentliche Voraussetzung für:
- • Prüfung auf Unschädlichkeit im Sinne der Freiheit von resistenzübertragenden Sporen durch die Hersteller,
- • Prüfung auf Unschädlichkeit im oben genannten Sinne auf Veranlassung der staatlichen Zulassungsbehörden vor der Zulassung bzw. Wiederzulassung neuer Chargen,
- • Prüfung auf Unschädlichkeit im oben genannten Sinne auf Veranlassung solcher Krankenkassen, die preiswertere Austauschpräparate bzw. Generika empfehlen,
- • Prüfung auf Unschädlichkeit im oben genannten Sinne innerhalb von stationären Einrichtungen,
- • Prüfung auf Unschädlichkeit im oben genannten Sinne durch oder auf Veranlassung von Ärzten, Zahnärzten, Tierärzten und Pharmazeuten.
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Mit diesem Untersuchungsverfahren (
DE 10 2014 006 485 B3 ) ist es uns möglich, die einzelnen Bestandteile in den pharmazeutischen Erzeugnissen auf das Vorhandensein von übertragbaren Antibiotika-Resistenzdeterminanten in Bakteriensporen zu überprüfen, und für die technische Aufgabe, solche kontaminierten Ausgangsstoffe von einer weiteren Verarbeitung entweder auszuschließen, zu ersetzen oder verfahrenstechnisch zu behandeln, und auch solche neuartigen technischen Lösungen zu entwickeln, die sich „nicht in nahe liegender Weise für den Fachmann aus dem Stand der Technik ... ergeben” (Schulte-Moufang, PatG, 9. Aufl., § 4 Rdn 53 und 55).
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Die von Konrich und Stutz eingeführten „Resistenzstufen” und deren Grenzen bei der Abtötung in strömendem Wasserdampf bei 100°C, in gespanntem gesättigten Wasserdampf bei 134°C und die von Sykes 1967 ermittelten Abtötungszeiten verschiedener Bakteriensporen bei feuchter und bei trockener Hitze jeweils bei unterschiedlichen Temperaturen, wobei manche Erdsporen Temperaturen über 180°C mehrere Minuten lang überstehen, wurden von Mehlhorn zitiert (Mehlhorn, G., in „Lehrbuch der Tierhygiene”, Hrsg. G. Mehlhorn, VEB Gustav Fischer Verlag Jena, 1979 S. 448 f., Tabellen 89 und 90). Zur thermischen Sterilisation gehört auch die Heißluftsterilisation mittels erhitzter trockener Luft bei 160°C und darüber (ebenda S. 456). „Die Sterilisatoren ... müssen Temperaturen bis 220°C an allen Stellen des Nutzraumes halten können” (ebenda S. 513).
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„Die Sterilisation muss die Abtötung nativer Erdsporen (Resistenzstufe III) gewährleisten. Es sind deshalb für die Heißluftsterilisation eine Sterilisiertemperatur von 180–200°C und eine Abtötungszeit ... von 25 min erforderlich” (ebenda S. 513).
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Noch 1993 schreibt Jens Schutt dazu unter dem Titel „Grundlagen der Sterilisation”: „Bei Anwendung entsprechend hoher Temperaturen und ausreichender Erhitzung lassen sich alle in einem Lebenssmittel vorhandenen Mikroorganismen, auch die hitzeresistenten Bakteriensporen, sicher abtöten.” und bezieht sich auf „thermische Belastungen des Doseninhaltes ... in hermetisch verschlossenen Behältnissen ... bei 105 ... 121°C”. (www.jens-schuett.de, Diplomarbeit 1993, S. 24 f.)
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In der Dissertation von R. Bültermann (R. Bültermann, „Untersuchungen zur Hitzeresistenz von Bakteriensporen und zum Pasteurisieren von oberflächlich verkeimten Lebensmitteln”, Diss. Universität Fridericiana Karlsruhe (Technische Hochschule), v. 12.07.1997) finden sich Untersuchungen zur Abtötungskinetik von Bakteriensporen auf der Oberfläche von Pfefferkörnern bei Temperaturen, die weit über den Thermoresistenzbereich von Geobacillus stearothermophilus hinausgehen.
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Demgegenüber ist aber bekannt, dass Bazillensporen im Brot sogar den Backvorgang überleben können und beispielsweise der Kartoffelbazillus (Bacillus mesentericus) das Fadenziehen des Brotes verursacht (www.wissensforum-backwaren.deles/wfb_broschuere25_d.pdf), wobei im Backofen zum Anbacken Temperaturen von 230 bis 280°C und zum Ausbacken von 180–230°C herrschen.
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Sterilisation wird bei Mehlhorn 1979 definiert als „Abtöten oder Entfernen aller lebensfähigen Vegetativ- und Dauerformen von pathogenen und apathogenen Mikroorganismen in Stoffen, Zubereitungen oder an Gegenständen.” (ebenda S. 456). Nachfolgend heißt es in diesem Kapitel: „Es ist jedoch darauf hinzuweisen, dass die lediglich unter bestimmten kulturellen Bedingungen zu züchtenden höchstresistenten thermophilen Sporen durch die z. Z. üblichen Sterilisationsverfahren nicht abgetötet werden. Daraus leitet sich ab, dass Stoffe, Zubereitungen oder Gegenstände dann als steril bezeichnet werden, wenn sie einem Sterilisationsverfahren unterzogen wurden, es mit geeigneten Prüfverfahren nicht gelungen ist, lebende Mikroorganismen oder Parasiten mit ihren Dauer- bzw. Fortpflanzungsformen nachzuweisen und eine erneute Kontamination nicht stattfinden konnte. Die Sterilität ist somit eine von der Prüfmethode bzw. Nachkultur abhängige Einschätzungsfrage, so dass der Hinweis „steril gemäß der vorgeschriebenen Prüfmethode laut Vorschrift ...” angebracht erscheint. Dies trifft vor allem für die medizinisch-pharmazeutische Sterilität zu.” (ebenda S. 456).
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Aktualisiert ist demgemäß heute der Hinweis angebracht: „steril gemäß einer vorgeschriebenen Prüfmethode, welche den Stand der Technik vor dem 29.04.2014 berücksichtigt.”
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3. Das der Erfindung zu Grunde liegende Problem
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Es ist bekannt, dass verschiedene Bestandteile von Fertigarzneimitteln wie auch von anderen Erzeugnissen einer Hitzebehandlung in so genannten Autoklaven unterzogen werden. Trotzdem haben wir aber mit einem prozentualen Anteil im zweistelligen Bereich in solchen Fertigarzneimitteln germinationsfähige Sporen nachgewiesen.
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Wir finden im Stand der Technik zur „Sterilisation”, also zur beabsichtigten Abtötung sowohl von vegetativen Bakterien als auch von Bakteriensporen, keine Beachtung des Sachverhaltes, dass beim Übergang des Wassers vom flüssigen in den gasförmigen Aggregatszustand Verdunstungskälte entsteht.
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Desgleichen finden wir im Stand der Technik zur „Sterilisation” nur selten eine Beachtung des Sachverhaltes, dass aus etwa 18 ml flüssigem Wasser (ein Mol) beim Sieden 22,4 Liter Wasserdampf (ebenfalls ein Mol) entsteht, mithin eine Volumenerhöhung auf das 1250 fache, wodurch in jedem geschlossenen Gefäß beim Sieden des Wasseranteiles ein Überdruck entstünde, der den erzielbaren Innendruck in den zur angestrebten Sterilisation verwendeten Druckbehälter („Autoklaven”) um ein Vielfaches übersteigt und diese geschlossenen Behältnisse zur Explosion bringen würde.
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Wenn im Sterilisationsgut in Gläsern oder in luftdichten Verpackungen aus Plaste mit beispielsweise 250 ml Inhalt, dessen Flüssigkeitsgehalt etwa 80% beträgt, nur 5 Gewichts-%, also etwa 10 ml davon, verdampfen würden, ergäbe das bereits ein Wasserdampfvolumen von 12400 ml, also rechnerisch einen Gasdruck im luftdicht verschlossenen Glas oder in der Plasteverpackung von 49,6 Atmosphären. Eine Explosion solcher Verpackungen findet in den „Autoklaven” jedoch nicht statt, und beim Backen des Brotes auch nicht.
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Sind diese physikalischen Grundlagen dafür verantwortlich, dass eine Sporenabtötung gar nicht stattfinden kann, solange Wasser in flüssigem Aggregatszustand im Inneren des zur Sterilisation vorgesehenen Stoffgemisches durch die Abkühlungsgröße ein vom Innendruck abhängiges Sieden seiner Wasseranteile verhindert?
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Diese Überlegungen stimmen auch mit anderen offenkundigen Phänomenen überein:
Solange der Wasseranteil im Inneren der äußerlich angerösteten Erzeugnisse nicht vollständig verdunstet ist, postulieren wir in solchen „evaporationsbedingten sporenprotektiven Zonen” eine temporäre Temperaturkonstanz unterhalb der – vom Innendruck in den Backwaren abhängigen – Siedetemperatur durch die Verdunstungskälte als Ursache für den Sachverhalt, dass wir im Inneren der verzehrsfertig gebackenen Brötchen und Brote germinationsfähige Bakteriensporen mit unterschiedlichem Koloniewachstum und unterschiedlichem Resistenzverhalten nachweisen können, die nach ihrem Auskeimen in Nährböden bei Temperaturen zwischen 20°C und 60°C Resistenzgenome gegen verschiedene Antibiotika aufweisen.
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Ein weiteres der Erfindung zu Grunde liegendes Problem besteht darin, dass die zur Prüfung des Sterilisationsgutes verwendeten Erdsporen der Gattung Geobacillus stearothermophilus als (apathogenen) Testkeim nicht zu solchen „höchstresistenten thermophilen Sporen” gehören, wie sie bei Mehlhorn (ebenda S. 513) beschrieben werden.
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Solche „höchstresistenten thermophilen Sporen” keimen nach einmaliger Hitzeexposition unter 150°C auch bei über 30 Minuten Einwirkungszeit noch nicht aus, überdauern aber in umhüllender Substanz selektiv auch Temperaturen über 200°C und können nach ihrer Germination dann die zu ihren Gunsten veränderte metabiotische Bakterienkonkurrenz zur selektiven Vermehrung und Verbreitung ihrer Resistenzgenome ausnutzen.
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Die von Konrich und Stutz benannte Resistenzstufe IV mit einer Sporen – „abtötung in gespanntem gesättigten Wasserdampf bei 134°C bei 30 min” reicht für eine Verhinderung der Übertragung von Resistenzgenomen durch „höchstresistente thermophile Sporen” nach unseren Ergebnissen (
DE 10 2014 006 485 B3 ) nicht aus. Dieser Sachverhalt trifft, von uns bakteriologisch nachgewiesen, auch für die bisher unzureichende thermische Behandlung fester Bestandteile von Fertigarzneimitteln einschließlich der Hilfsstoffe für homöopathische Arzneimittel zu.
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„Die Thermoresistenz ist so abgestimmt, dass die Sporen – von Geobacillus stearothermophilus ATCC 7953 (sporulationsoptimiert) – durch Erhitzen in gespanntem Dampf nach 15 Minuten bei nicht weniger als 121° ± 0,5°C (245 kPa) eine vollständige Abtötung erfahren” (www.unimarburg.de/sicherheit/autoklavencheck.pdf). Diese Bakterienspezies mit nativen Erdsporen gehört demnach nur zur Resistenzstufe III (vgl. s. o. Mehlhorn, S. 513).
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Autoklavierung unter 140°C bewirkt eine selektive Sporozidie der oligothermoresistenten Bakteriensporen und damit eine selektive Vermehrung der mesothermoresistenten und der extrem hitzeresistenten Sporen tragenden Spezies, und dadurch tragen die autoklavierten Fertigarzneimittel und andere autokiavierte Erzeugnisse (wie Babynahrung) zu einer weltweiten selektiven Verbreitung multiresistenter Genome bei.
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Im Ergebnis des hier offenbarten neuen Standes der Technik kann es deshalb sinnvoll sein, die von Konrich und Stutz benannte Resistenzstufe IV weiter zu unterteilen und für die oligothermostabilen, die mesothermostabilen und die „höchstresistenten thermophilen” Sporen, letztere exakter zu benennen als „höchstresistente thermostabile” Sporen, praktikable Grenzwerte an Hand ihrer Tenazität gegenüber trockener Hitze festzulegen, beispielsweise bei 140°C und 190°C.
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Gegenüber den „höchstresistenten thermophilen Sporen” versagen deshalb auch alle auf der Basis von Geobacillus stearothermophilus arbeitenden handelsüblichen „Bioindikatoren zur Autoklavierungskontrolle pharmazeutischer Produkte” grundsätzlich, und deren Verwendung zur Freigabe von Fertigarzneimitteln ist in großem Umfange mitverantwortlich für den pharmakogenen horizontalen Gentransfer von Antibiotika-Resistenzgenomen der letzten Jahre (s. auch Mehlhorn 1979, S. 456). Veränderungen der Krankenhaushygiene haben auf dieses Phänomen der pharmakogenen Verbreitung von Multiresistenzen keinen Einfluss.
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4. Die Erfindung, für die in den Patentansprüchen Schutz begehrt wird
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Ziel der Erfindung
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Das Ziel der Erfindung besteht darin, die iatrogene Weiterverbreitung von Antibiotika-Resistenzgenomen durch Fertigarzneimittel wesentlich einzuschränken.
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In der Roten Liste 2012 (52. Ausgabe, Frankfurt/Main 2012) werden etwa eintausend verschiedene Wirkstoffe (Remedia cardinalia) aufgeführt, deren Herstellung nicht in jedem Falle eine Sporenfreiheit ohne Wirkungsverlust ermöglicht. Demgegenüber steht eine relativ überschaubare Anzahl von Hilfsstoffen als Remedia adjuvantes, Remedia corrigentes und Remedia constituentes, die in einer Vielzahl von Fertigarzneimitteln (z. B. Pulver, Pillen, Tabletten, Kapseln, Mixturen, Emulsionen, Salben) Anwendung finden.
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Auch wegen der vielseitigen Verwendbarkeit gerade der Hilfsstoffe ist es das Ziel dieser Erfindung, solche sporenfreien Erzeugnisse als Ausgangsstoffe für Medikamente und andere Produkte herzustellen und ein dafür geeignetes Verfahren zu offenbaren.
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Darüber hinaus ist es bei der Herstellung homöopathischer Arzneimittel auch ein realisierbar erscheinendes Ziel, neben der Sporenfreiheit ihrer Hilfsstoffe auch den technischen Vorgang der Potenzierungen in sporenfreiem Milieu zu gewährleisten.
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Aufgabenstellung
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Die Aufgabenstellung dieser Anmeldung besteht zunächst in der Entwicklung und Kombination technischer Verfahrensschritte, mit denen untersucht werden kann
- • ob überhaupt, unter welchen Bedingungen und in welchen Grenzen
- • sporenbelastete natürliche Ausgangsstoffe für die Herstellung von Fertigarzneimitteln und anderen Erzeugnissen durch Hitzebehandlung keimfrei gemacht werden können, und
- • welche systemischen technischen Ursachen – neben anderen, hier nicht untersuchten Einflüssen (wie Kontaminationen während des Herstellungsprozesses) – dem Sachverhalt zu Grunde liegen, dass germinationsfähige Bakteriensporen in „autoklavierten” Fertigarzneimitteln und anderen Erzeugnissen nachgewiesen werden können.
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Auf der Grundlage der mittels dieser technischen Verfahrensschritte erzielten Ergebnisse sind darüber hinaus Schlussfolgerungen zu ziehen, welche technischen Wege zur Herstellung sporenfreier Fertigarzneimittel und anderer Erzeugnisse in Zukunft offen stehen. Diese Schlussfolgerungen gelten auch für die Auswahl und verfahrenstechnische Vorbehandlung von Hilfsstoffen für homoöpathische Arzneimittel.
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Mittel und Wege
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Das hier vorgestellte mehrstufige technische Verfahren beinhaltet Mittel und Wege, mit welchen die Möglichkeiten und Grenzen für die Schaffung und Gewährleistung von Sporenfreiheit bei der Herstellung fester Fertigarzneimittel (1) und anderer fester Erzeugnisse (1) durch gespannten Dampf (14) über 120°C sowie durch trockene Hitze über 200°C (50), (51) sowohl an Erzeugnissen mit glatten Oberflächen als auch innerhalb von Schichten feuchtigkeitshaltiger fester Partikel (6) untersucht werden können. Auf der Grundlage der hierbei gewonnenen Ergebnisse werden technische Möglichkeiten und Herstellungsansprüche für die Erzeugung von solchen Arzneimittelbestandteilen hergeleitet und erprobt, für die eine Freiheit von Resistenzen übertragenden Bakteriensporen gewährleistet werden kann.
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Vor Beginn der technischen Verfahrensschritte wird die Sporenfreiheit aller derjenigen verwendeten Materialien hergestellt, die Kontakt zu den Erzeugnisproben während der nachfolgend beschriebenen Verfahrensschritte haben. Hierzu werden alle hitzestabilen Behältnisse aus Glas (3) und (5) und die anderen hitzestabilen Materialien mit glatten Oberflächen von anhaftenden Verunreinigungen gesäubert, in hitzedestilliertem Wasser (15) gespült und in trockener Hitze bei über 200°C mindestens 60 Minuten lang im Heißluftsterilisator (56) getrocknet und sterilisiert.
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Die Chargen der für unser Verfahren spezifischen sporenfreien festen pulverigen oder körnigen Evaporationsteststoffe (6), die routinemäßig für die weiteren Untersuchungen verwendet werden sollen, werden zuvor mindestens drei Mal mit dem Verfahren der fraktionierten Germination auf die herstellungsbedingt zu erwartende Sporenfreiheit geprüft und zusätzlich in trockener Hitze bei über 200°C im Heißluftsterilisator (56) in Schichten von maximal 2 cm Höhe mindestens 6 Stunden lang sterilisiert. Diese Evaporationsteststoffe (6) sollen die Fähigkeit zu einer bis über ihr Eigengewicht hinausgehenden Wasserspeicherung besitzen.
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Geeignete rein mineralische Katzenstreu beispielsweise vermag einen größeren Gewichtsanteil Wasser zu binden, als ihr Eigengewicht nach dieser Trockensterilisation beträgt. Diese Voraussetzungen ermöglichen es, eine ausreichende Menge von hitzedestilliertem Wasser in flüssiger Form innerhalb der Evaporationszonen weitgehend ortsgebunden um die festen Untersuchungsmaterialien (1) herum zu positionieren, um auf diese Weise innerhalb der Dampfdruckbehälter (8) mehrere Stunden lang funktionsfähige „sporenprotektiven evaporativen Zonen” aufrecht zu halten und die und die zu untersuchenden Erzeugnisproben (1) in stabil bleibender Lage umhüllen.
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Die anschließenden Verfahrensschritte werden unter aseptischen Bedingungen weitergeführt, wozu auch als Wasser nur auf Sporenfreiheit geprüftes hitzedestilliertes Wasser (15) benutzt werden darf.
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Die Proben der zu prüfenden Fertigarzneimittel, pharmazeutischen Ausgangsstoffe und anderen Erzeugnisse (1) werden mit sterilen Instrumentarien aus den handelsüblichen Verpackungen (2) entnommen und in unveränderter Konsistenz den Hitzeexpositionen zur Verfügung gestellt werden.
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Zur Prüfung von Möglichkeiten und Grenzen für die Schaffung und Gewährleistung von Sporenfreiheit durch Dampfdruck (14) sowohl an Erzeugnissen mit glatten Oberflächen als auch innerhalb von Schichten fester Partikel (6) wird ein an seinen Rändern luftdicht verschließbarer Druckkochtopf (8) mit intaktem Regelventil (9) für die thermische Behandlung von Stoffen im Überdruckbereich gemäß Ziffer 7 verwendet. Auf dem Boden dieses Druckkochtopfes (8) befindet sich 2 bis 6 cm hoch hitzedestilliertes Wasser (15), in welchem ein mindestens 2 cm über die Wasseroberfläche hinausragender unterer metallener Einsatz (13) mit glatten Oberflächen steht und über welchen weitere siebartig gelochte metallene Einsätze (12) mit glatten Oberflächen stehen können. Auf diese Einsätze (12) werden dann die mit Untersuchungsmaterial (1) befüllten offenen (3) bzw. lose verschlossenen (5) hitzestabilen Behältnisse gestellt.
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Der Druckkochtopf (8) wird nach seiner Befüllung luftdicht verschlossen, daraufhin das unter Druck siedende hitzedestillierte Wasser (15) bei einer Einstellung der Heizquelle (16) auf 140°C und einer Wassertemperatur von mindestens 120°C jeweils 10 (17), (19) bzw. 40 Minuten (18), (20) lang erhitzt. Nach Beendigung der Energiezufuhr bleibt der Druckkochtopf (8) ungeöffnet bis zu seiner Abkühlung unter 60°C Außenwandtemperatur luftdicht verschlossen. Unmittelbar nach ihrer Entnahme aus dem Druckkochtopf (8) werden die zuvor offenen Glasbehältnisse (3) mit Deckeln verschlossen bzw. bleiben (5) dies bis zu weiteren Untersuchungen.
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Zur Prüfung der technischen Möglichkeiten und Grenzen von Sporozidie und thermogener Germinationsinduktion durch gespannten Dampf im Druckkochtopf (8) über 120°C an Erzeugnissen mit glatten Oberflächen als auch innerhalb von Schichten fester Partikel (6) dienen als Erzeugnisproben (1) feste Arzneimittel und Arzneimittelbestandteile mit nachgewiesener Sporenkontamination oder auch ursprünglich sporenfreie Erzeugnisse (1), die in aufgeschwemmten Bakterien-Sporen-Suspensionen aus zuvor mittels fraktionierter Germination untersuchten sporenhaltigen Fertigarzneimitteln (1) in fabrikneuen froststabilen Zentrifugenröhrchen (54) im Brutschrank (28) 24 Stunden lang bei 37°C kontaminiert wurden.
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Diese kontaminierten Erzeugnisproben (1) werden im Druckkochtopf (8) einerseits ohne umhüllende Evaporationsteststoffe (6) in offenen Behältnissen aus Glas (3) jeweils 10 (17) bzw. 40 Minuten (18) lang gespanntem Dampf (14) über 120°C ausgesetzt, und anderseits eingehüllt von einer jeweils 1 bis 2 cm darunter und darüber liegenden Schicht feuchtigkeitsgesättigter fester, pulveriger oder körniger und nachgewiesen sporenfreier Evaporationsteststoffe (6) in mit Deckeln lose verschlossenen Behältnissen aus Glas (5) ebenso jeweils 10 (19) bzw. 40 Minuten (20) lang gespanntem Dampf (14) über 120°C ausgesetzt.
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Zur Kontrolle aseptischen Arbeitens werden sporenfreie feste Arzneimittel (1) oder andere sporenfreie Erzeugnisse (1) und ebenso in regelmäßigen Abständen auch Proben der verwendeten Evaporationsteststoffe (6) in gleicher Weise gespanntem Dampf im Druckkochtopf (14) ausgesetzt.
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Zur Prüfung von Möglichkeiten und Grenzen für die Schaffung und Gewährleistung von Sporenfreiheit durch trockene Hitze (50) und (51) sowohl an Erzeugnissen mit glatten Oberflächen als auch innerhalb von Schichten fester Partikel (6) wird ein Heißluftsterilisator (56) bis über 225°C Heiztemperatur verwendet. Die Temperaturspeicher (53) im Heißluftsterilisator (56) werden mindestens 4 Stunden lang auf über 200°C vorgeheizt, und zur Befüllung und Entnahme des Untersuchungsgutes wird die Tür des Heißluftsterilisators (56) maximal eine Minute lang geöffnet. Wir verwenden als Wärme speicherndes Material Klinkersteine (53) mit glatten Oberflächen mit insgesamt mindestens 10-fachem Gewicht gegenüber dem Gesamtgewicht der zu erhitzenden gefüllten Behältnisse.
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Die mit Untersuchungsmaterial (1) befüllten offenen (3) bzw. mit passenden Glasdeckeln lose verschlossene (5) hitzestabile Behältnisse stehen auf den metallenen Einsätzen (52) des Heißluftsterilisators (56) und werden jeweils 10 (50) bzw. 40 Minuten (51) lang trockener Hitze über 200°C im Heißluftsterilisator (56) ausgesetzt. Unmittelbar nach ihrer Entnahme aus dem Heißluftsterilisator (56) werden die zuvor offenen Glasbehältnisse (3) mit Deckeln verschlossen bzw. bleiben (5) dies bis zu weiteren Untersuchungen.
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Zur Prüfung der technischen Möglichkeiten und Grenzen von Sporozidie und thermogener Germinationsinduktion durch trockene Hitze über 200°C (50), (51) sowohl an Erzeugnissen mit glatten Oberflächen als auch innerhalb von Schichten fester Partikel (6) verwenden wir als Erzeugnisproben (1) feste Arzneimittel und Arzneimittelbestandteile mit glatten Oberflächen und nachgewiesener Sporenkontamination oder auch ursprünglich sporenfreie Erzeugnisse (1), die in aufgeschwemmten Bakterien-Sporen-Suspensionen aus zuvor mittels fraktionierter Germination untersuchten sporenhaltigen Fertigarzneimitteln (1) in fabrikneuen froststabilen Zentrifugenröhrchen (54) im Brutschrank (28) 24 Stunden lang bei 37°C kontaminiert wurden (26).
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Diese kontaminierten Erzeugnisproben (1) werden im Heißluftsterilisator (56) einerseits ohne umhüllende Evaporationsteststoffe (6) in offenen Behältnissen aus Glas (3) jeweils 10 (50) bzw. 40 Minuten (51), anderseits in mit Deckeln lose verschlossenen Behältnissen aus Glas (5) von einer 1 bis 2 cm darunter und darüber liegenden Schicht feuchtigkeitsgesättigter fester, pulveriger oder körniger Evaporationsteststoffe (6) eingehüllt ebenso jeweils 10 (50) bzw. 40 Minuten (51) lang trockener Hitze über 200°C ausgesetzt.
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Zur Kontrolle aseptischen Arbeitens werden sporenfreie feste Arzneimittel (1) oder andere sporenfreie Erzeugnisse (1) und ebenso in regelmäßigen Abständen auch Proben der verwendeten Evaporationsteststoffe (6) in gleicher Weise im Heißluftsterilisator (56) trockener Hitze über 200°C ausgesetzt (50) und (51).
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Für die nachfolgenden bakteriologischen Untersuchungen der eine feuchte Hitze über 120°C im Druckkochtopf (8) exponierten überlebenden und ausgekeimten Sporen dienen als Untersuchungsmaterial zunächst die Proben derjenigen Fertigarzneimittel und anderen Erzeugnisse (1), die ohne umhüllende feste Evaporationsteststoffe (6) im Druckkochtopf (8) exponiert wurden. Sie werden mit sterilen Instrumentarien aus ihren Glasbehältnissen (3) und (5) entnommen und in jedes der insgesamt 12 fabrikneuen, froststabilen Zentrifugenröhrchen (54) mit jeweils > 6 ml sterilem Flüssignährböden (55) verbracht.
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Hierbei werden keine Selektivnährböden verwendet, und bei Probenentnahmen und zum Ausgleich von Verdunstungsverlusten kommen nur geprüft steriler Flüssignährboden (55) oder hitzedestilliertes Wasser (15) zum Einsatz.
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Zum Auskeimen der Sporen in Flüssignährböden (55) werden die Zentrifugenröhrchen (54) in jeweils drei Gruppen unterschiedlicher Thermophilität ihrer vegetativen Bakterienformen unterteilt, und zwar die Röhrchen (21a), (22a), (23a) und (24a) für eine Inkubation im Brutschrank (28) bei 20 ± 2°C für 72 Stunden (25), bzw. im Kühlschrank bei unter 5°C bis über 10 Tage lang (letztere Variante ist nicht Teil des Ausführungsbeispieles), die Röhrchen (21b), (22b), (23b) und (24b) für eine Inkubation (28) bei 37 ± 2°C für 24 Stunden (26) und die Röhrchen (21c), (22c), (23c) und (24c) für eine Inkubation bei 60 ± 2°C 12 Stunden (27).
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Anschließend an diese Inkubationszeiten (25), (26) und (27) werden aus jedem der vier Röhrchen dieser drei Röhrchengruppen mit sterilen Wattetupfern (33) Tupferproben entnommen, und die jeweils vier Tupfer aus jeder der drei Röhrchengruppen auf dem festen Nährboden jeweils einer gemeinsamen Petrischale ausgestrichen (34), (35) und (36). Auf diese Petrischalen (34), (35) und (36) werden keine Testplättchen für eine Antibiotika-Resistenzbestimmung aufgebracht, wenn keine ausführliche „fraktionierte Germination” durchgeführt werden soll.
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Unmittelbar nach dem Ausstreichen der ausgekeimten Sporen in den jeweils drei Petrischalen (34), (35) und (36) werden je eine Petrischale (34) mit den Ausstrichen aus den Röhrchen (29a), (30a), (31a) und (32a) im Brutschrank (28) bei 20 ± 2°C 72 Stunden (37) bzw. im Kühlschrank bei unter 5°C bis über 10 Tage lang, eine Petrischale (35) mit den Ausstrichen aus den Röhrchen (29b), (30b), (31b) und (32b) im Brutschrank (28) bei 37 ± 2°C 24 Stunden lang (38) und eine Petrischale (36) mit den Ausstrichen aus den Röhrchen (29c), (30c), (31c) und (32c) im Brutschrank (28) bei 60 ± 2°C 12 Stunden lang (39) inkubiert.
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Für die ausgekeimten Bakterien wird auf ihre morphologische Zuordnung zu einzelnen Bakterienspezies verzichtet, und zur Dokumentation der ausgekeimten und als Kolonien gewachsenen Bakterien werden die Petrischalen (40), (41) und (42) als Figuren (43), (44) und (45) fotografiert.
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Zur Probensicherung werden neben Originalproben der geprüften Erzeugnisse (1) die nach den Probenentnahmen übrig bleibenden Proben in > 6 ml Flüssignährboden (55) für Wiederholungsuntersuchungen in den froststabilen und verschlossenen Einweg-Zentrifugenröhrchen (29a), (30a), (31a) und (32a); (29b), (30b), (31b) und (32b); (29c), (30c), (31c) und (32c) bei –18°C eingefroren und aufbewahrt (47), (48) und (49).
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Auf die gleiche Weise werden die mit Umhüllung durch feste und feuchtigkeitsgesättigte Evaporationsteststoffe (6) einer feuchten Hitze über 120°C im Druckkochtopf (8) exponierten überlebenden und ausgekeimten Sporen bakteriologisch untersucht, wie obern für die nicht umhüllten Untersuchungsobjekte (1) beschrieben.
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Zur Kontrolle aseptischen Arbeitens werden die nachweislich sporenfreien Erzeugnisse mit den gleichen Geräten und Materialien bakteriologisch untersucht, wie in den vorangegangenen Ausführungen beschrieben.
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Die nachfolgenden bakteriologischen Untersuchungen der die trockene Hitze über 200°C im Heißluftsterilisator (56) überlebenden und ausgekeimten Sporen werden auf die gleiche Weise durchgeführt, wie in den vorangegangenen Ausführungen beschrieben, und auch in diesen Verfahrenslinien werden die zur Kontrolle aseptischen Arbeitens nachweislich sporenfreien Erzeugnisse mit den gleichen Geräten und Materialien bakteriologisch untersucht.
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Auf der Basis der fotographischen Dokumentation des Bakterienwachstums auf den Petrischalen erfolgt dann die Analyse der Tenazität der die Erzeugnisse (1) kontaminierenden Bakteriensporen gegenüber feuchter und gegenüber trockener Hitze in den mit den hier beschriebenen Verfahren geprüften festen Fertigarzneimitteln, ihrer Ausgangsstoffe, ihrer wirksamen und ihrer sonstigen Bestandteile und ebenso die der anderen geprüften Erzeugnisse (1), die als Träger und Überträger von Antibiotika-Resistenzgenomen durch Bakteriensporen von Bedeutung sind oder werden können.
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Mit diesen als technisches Ergebnis unsere Untersuchungen offen gelegten Mitteln und Wegen können folgende Schlussfolgerungen für die Herstellung von Fertigarzneimitteln und anderen Erzeugnissen (1) gezogen werden, die frei von germinationsfähigen Bakteriensporen sind, darunter insbesondere auch solcher Stoffgruppen von Fertigarzneimitteln, die bis heute unvermindert Antibiotika-Resistenzgenome perpetuiert und durch horizontalen Gentransfer auf die gesamte globale Bakterienpopulation übertragen haben:
- 1. Ausgangsstoffe für die Herstellung von Fertigarzneimitteln, in denen von uns keine Bakteriensporen nachgewiesen werden konnten, sind insbesondere
• Rohstoffe biologischer Herkunft, in denen entweder nur solche durch fraktionierte Germination nachweisbare Bakteriensporen enthalten sind, die durch wenigstens eines der acht der Verfahrensvarianten gemäß Anspruch 1 sicher abgetötet werden können,
• Rohstoffe biologischer Herkunft, in denen mittels „fraktionierter Germination” ( DE 10 2014 006 485 B3 ) keine Bakteriensporen nachzuweisen sind, und in denen keine solchen Bakteriensporen nachweisbar sind, bei denen durch Verfahren gemäß Anspruch 1 in Druckkochtöpfen (8) und in Heißluftsterilisatoren (56) eine Germination provoziert werden kann,
• chemisch neu synthetisierte und chemisch vollständig umgewandelte feste Substanzen, bei denen weder durch das Herstellungsverfahren, noch durch spätere Be- und Verarbeitung, Verpackung und Verteilung Kontaminationen mit Bakteriensporen zu erwarten sind und bei denen ebenfalls durch Verfahren gemäß Anspruch 1 in Druckkochtöpfen (8) und in Heißluftsterilisatoren (56) keine Germination provoziert werden kann.
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Als Beispiele für Hilfsstoffe in Fertigarzneimitteln, die in dem Sinne sporenfrei sind, dass mittels „fraktionierter Germination” keine Bakteriensporen nachgewiesen werden können, konnten wir ermitteln:
Carboxymethylstärke-Natrum (Typ A) (Ph. Eur.), Croscarmellose-Natrium, Crospovidon Typ A, hochdisperses Siliciumdioxid, hydriertes Rizinusöl, Lactose-Monohydrat, Magnesiumstearat (Ph. Eur.), Maisstärke, mikrokristalline Cellulose, Natriumdodecylsulfat, Povidon K25, Povidon K30, Talkum.
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Auch zahlreiche Wirkstoffe in Fertigarzneimitteln sind in dem Sinne sporenfrei, dass mittels „fraktionierter Germination” keine Bakteriensporen nachgewiesen werden konnten.
- 2. Für die Herstellung von Bakteriensporen freien Fertigarzneimitteln sind dagegen nach den Ergebnissen unserer Untersuchungen nicht geeignet:
• Rohstoffe biologischer Herkunft, die durch feuchte Hitze in Druckkochtöpfen (8) auf Grund ihrer Hitzeempfindlichkeit oder ihrer Feuchtigkeitsempfindlichkeit nicht bis zu einer mittels „fraktionierter Germination” nachweisbaren Sporenfreiheit sterilisiert werden können
• Rohstoffe biologischer Herkunft, die durch feuchte Hitze in Druckkochtopf (14) deshalb nicht bis zur Sporenfreiheit sterilisiert werden können, weil das biophysikalische Phänomen der persistierenden Verdunstungskälte in den von uns so genannten „sporenprotektiven evaporativen Zonen” eine sporozide Kerntemperatur in der Umgebung der Sporen verhindert.
- 3. Rohstoffe biologischer Herkunft, deren Bakteriensporen durch trockene Hitze im Heißluftsterilisator (56) nicht Struktur erhaltend bis zur durch fraktionierte Germination nachweisbaren Sporenfreiheit sterilisiert werden können, sind für die Herstellung von Bakteriensporen freien festen Fertigarzneimittel nur bedingt geeignet, insofern nach reversiblen oder irreversiblen Strukturveränderungen eine Sporenfreiheit eingetreten und nachgewissen ist.
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Das biophysikalische Phänomen der persistierenden Verdunstungskälte ist auch dafür ursächlich, dass in wasserdicht verschlossenen Behältnissen aus Glas, Metall und Folien in dieses „sporenprotektive evaporative Zonen” während des Aufenthaltes dieser Behältnisse in den „Autoklaven” nicht alle Resistenzen verbreitende Bakteriensporen zerstört werden können, und ist auch die Hauptursache dafür, dass wir außer in Fertigarzneimitteln auch seit Jahren regelmäßig infektionspotente Bakteriensporen in Babynahrung, Krankenhaus- und Altenheimkost, „Bio”-Konserven und in Medizinalfuttermitteln nachweisen können.
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5. In welcher Weise ist der Gegenstand der Erfindung gewerblich anwendbar?
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Die gewerbliche Anwendbarkeit dieser Erfindung ermöglicht die Aufdeckung bisheriger systemischer Ursachen im industriellen Herstellungsprozess von Fertigarzneimitteln und anderen Erzeugnissen, die für die Persistenz germinationsfähiger und Resistenzen übertragender Bakteriensporen ursächlich sind und die bisher pauschal zu den Hospitalismus genannten multiresistenten „Krankenhauskeimen” gerechnet wurden, die man vergeblich durch Hygienemaßnahmen einzudämmen versuchte.
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Solche Antibiotika-Resistenzen verbreitende mikrobielle Verunreinigungen finden sich in Fertigarzneimitteln und Kosmetika mit einem weltweiten Jahresumsatz von – auch vorsichtig geschätzt – vielen Milliarden Euro.
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Durch die Aufdeckung der verfahrenstechnischen Ursachen für diese Sporenpersistenz und ihrer thermophysikalischen Ursachen wird für die Pharmaindustrie eine Tür geöffnet, sich nicht mehr ungeprüft in falschen Sicherheiten zu wiegen und in Unkenntnis Multiresistenzen verbreitende Produkte auf den Markt zu bringen, sondern alternative technische Möglichkeiten für die Herstellung von nicht bakteriell verunreinigten Fertigarzneimitteln zunutzen, weiter zu entwickeln und im industriellen Maßstab anzuwenden.
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Ohne substantielle Veränderungen derjenigen gewerblichen Herstellungsverfahren vornehmen zu müssen, die das Wesen der homöopathischen Zubereitung betreffen, kann eine Abkehr von der bisherigen Verwendung sporenhaltiger Ausgangsstoffe als Hilfsstoffe für diese Stoffgruppe von Fertigarzneimitteln verfahrenstechnische Wege zu einer Freiheit von vegetativen Bakterien und Bakteriensporen auch in vielen homöopathischen Arzneimitteln und Kosmetika weisen.
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Auf der Grundlage solcher veränderter Voraussetzungen für alternative Herstellungsverfahren in der Pharmaindustrie werden, sobald sich der Wille dazu durchsetzt, sporenfreie Fertigarzneimittel den bisher beachtlichen Anteil solcher Resistenzen verbreitender Erzeugnisse durch bakteriensporenfreie Fertigarzneimittel verdrängen.
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6. Vorteile der Erfindung
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Der grundlegende Vorteil dieser Erfindung für die Pharmaindustrie besteht in dem verfahrenstechnischen Nachweis der thermophysikalischen Grundlagen für die Anwesenheit „evaporationsbedingter sporenprotektiver Zonen” innerhalb von umhüllenden Substanzen, in welchen der Feuchtigkeitsgehalt der zur Sterilisation durch Autoklavierung bestimmten festen Substanzen die Ursache für eine temporäre Temperaturkonstanz unterhalb der – vom Innendruck abhängigen – Siedetemperatur durch die Verdunstungskälte darstellt.
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Diese temporäre Temperaturkonstanz ist die thermophysikalische Ursache für die Sporenpersistenz innerhalb dieser festen, feuchtigkeitshaltigen Substanzen, die in Druckbehältern mit feuchtem Dampf (Autoklaven) erhitzt werden.
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Hierdurch wird die Pharmaindustrie in den Stand gesetzt, nicht mehr nach nahe liegenden Verbesserungen in der Autoklavierungstechnik zu suchen, deren mikrobiologischer Effekt auf höchstresistente thermostabile Bakteriensporen innerhalb von feuchtigkeitshaltigen Substanzen thermophysikalisch unmöglich ist.
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Diese hier verfahrenstechnisch nachgewiesenen thermophysikalischen Grundlagen wirken auch bei Untersuchung und Nachweis der Möglichkeiten und Grenzen sporozider Sterilisation durch trockene Hitze bis über 200°C.
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Unter der Voraussetzung, dass in Fertigarzneimitteln eine Freiheit von Verunreinigungen durch Multiresistenzen verbreitende Bakterien angestrebt wird, sind alternative technische Möglichkeiten für die Herstellung von nicht bakteriell verunreinigten Fertigarzneimitteln zu nutzen, weiter zu entwickeln und in der Pharmaindustrie anzuwenden.
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Eine von uns geschlussfolgerte und erfolgreich überprüfte Möglichkeit für die Herstellung sporenfreier Medikamente und anderer sporenfreier Erzeugnisse ist die Verwendung ausschließlich solcher Bestandteile für die Zusammensetzung von Fertigarzneimitteln, die aus chemisch synthetisierten Erzeugnissen und ohne Kontakt zu potentiell Bakteriensporen beinhaltenden pflanzlichen, tierischen oder mikrobiellen Rohstoffen hergestellt werden.
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7. Ausführungsbeispiel
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- 1. Wie in 1 dargestellt, werden die zu untersuchenden Erzeugnisproben (1) mittels (gemäß Anspruch 1 Ziffer 1.1.1, 1.1.2 und 1.1.3) sterilisierter Instrumente aus der handelsüblichen Verpackungen (2) hinausgenommen und zum einen in offene hitzestabile Behältnisse aus Glas (3) ohne Evaporationshülle (6) verbracht,
- 2. parallel dazu werden ebenfalls Erzeugnisproben (1) mittels steriler Instrumente in lose verschlossene hitzestabile Behältnisse aus Glas (5) verbracht, welche mit einem umhüllenden, mit hitzedestilliertem Wasser ( DE 10 2012 023 761 A4 ) feuchtigkeitsgesättigtem sterilen Evaporationsteststoff (6) gefüllt sind.
- 3. Die Glasbehältnisse (3) und (5) mit den Erzeugnisproben (1) werden anschließend in einem luftdicht verschließbaren Druckkochtopf (8) auf mindestens 2 cm über der Wasseroberfläche befindliche siebartige metallene Einsätze (12), (13) gestellt
- 4. und dort entweder bei 120°C für 10 Minuten (10)
- 5 oder für 40 Minuten (11) in dem Druckkochtopf (8) erhitzt.
- 6 Die Erzeugnisproben (1) in den offenen hitzestabilen Behältnissen aus Glas (3) werden nach ihrer 10-minütigen Erhitzung (17)
- 7. bzw. nach ihrer 40-minütigen Erhitzung (18) aus dem Druckkochtopf (8) entnommen,
- 8. und ebenso die Erzeugnisproben (1) in mit Deckel verschlossenen hitzestabilen Behältnissen aus Glas (3) nach ihrer 10-minütigen Erhitzung (19)
- 9. bzw. nach ihrer 40-minütigen Erhitzung (20) aus dem Druckkochtopf (8) entnommen.
- 10. 2 zeigt in Fortsetzung zu 1, wie
- 11. die Erzeugnisproben (21a, b, c) aus (17) mittels (gemäß Anspruch 1 Ziffer 1.1.1, 1.1.2 und 1.1.3) sterilisierter Instrumente in drei fabrikneue froststabile Zentrifugenröhrchen (54) mit sterilem Flüssignährboden (55),
- 12. die Erzeugnisproben (22a, b, c) aus (18) ebenso in drei Zentrifugenröhrchen (54) mit sterilem Flüssignährboden (55),
- 13. die Erzeugnisproben (23a, b, c) aus (19) ebenso in drei Zentrifugenröhrchen (54) mit sterilem Flüssignährboden (55)
- 14. und die Erzeugnisproben aus (20) ebenso in drei Zentrifugenröhrchen (24a, b, c) mit sterilem Flüssignährboden (55) verbracht werden.
- 15. Anschließend werden jeweils die Zentrifugenröhrchen (21a), (22a), (23a) und (24a) zum Auskeimen der Sporen für 72 h bei 20 ± 2°C (25),
- 16. jeweils die Zentrifugenröhrchen (21b), (22b), (23b) und (24b) zum Auskeimen der Sporen für 24 h bei 37 ± 2°C (26),
- 17. und jeweils die Zentrifugenröhrchen (21c), (22c), (23c) und (24c) zum Auskeimen der Sporen für 12 h bei 60 ± 2°C (27) im Brutschrank (28) inkubiert.
- 18 Nach Auskeimen der Sporen nach Inkubation von 72 h bei 20 ± 2°C (25) werden die Zentrifugenröhrchen jetzt als (29a), (30a), (31a) und (32a),
- 19. nach Auskeimen der Sporen für 24 h nach Inkubation von 37 ± 2°C (26) jetzt als Zentrifugenröhrchen (29b), (30b), (31b) und (32b)
- 20. und nach dem in diesem Ausführungsbeispiel nach Inkubation von 12 h bei 60 ± 2°C (27) nicht erfolgten Auskeimen von Sporen jetzt als Zentrifugenröhrchen (29c), (30c), (31c) und (32c) aus dem Brutschrank (28) entnommen.
- 21. Wie in 3 dargestellt, werden mittels eines sterilen Wattestäbchens (33) die Proben (29a), (30a), (31a) und (32a) nach 72 h Inkubation im Brutschrank (28) bei 20 ± 2°C aus dem Flüssignährboden (55) in den jeweiligen Zentrifugenröhrchen entnommen und auf eine Petrischale mit Festnährboden ausgestrichen (34),
- 22. die Proben (29b), (30b), (31b) und (32b) nach 24 h Inkubation im Brutschrank (28) bei 37 ± 2°C auf die Petrischale (35)
- 23. und die Proben (29c), (30c), (31c) und (32c) nach 12 h Inkubation im Brutschrank (28) bei 37 ± 2°C auf die Petrischale (36) ausgestrichen.
- 24. Jetzt wird die Petrischale (34) im Brutschrank (28) für 72 h bei 20 ± 2°C inkubiert (37),
- 25. die Petrischale (35) für 24 h bei 37 ± 2°C (37)
- 26. und die Petrischale (36) für 12 h bei 20 ± 2°C (39).
- 27. Nach der jeweiligen Inkubationszeit der Petrischalen (37) und (38) wird das auf ihnen sichtbare Koloniewachstum fotografiert (43) und (44), und ebenso auch das auf der Petrischale (39) ausgebliebene Bakterienwachstum (45).
- 28. Die Zentrifugenröhrchen (29a), (30a), (31a) und (32a), (29b), (30b), (31b) und (32b) sowie (29c), (30c), (31c) und (32c) werden für Wiederholungsversuche oder anderweitige Untersuchungen im Tiefkühlschrank (46) eingefroren (47), (48) und (49).
- 29. 4 zeigt im Unterschied zu 1 für die Erhitzung der Erzeugnisproben (1) anstelle des Druckkochtopfes (8) einen stufenlos einstellbaren Heißluftsterilisator (56) mit Temperaturen bis über 200°C.
- 30. In diesem Heißluftsterilisator (56) werden die Erzeugnisproben (1) ebenfalls sowohl in offenen hitzestabilen Behältnisse aus Glas (3) ohne Evaporationshülle (6) als auch in lose verschlossenen hitzestabilen Behältnisse aus Glas (5) mit einem umhüllenden Evaporationsteststoff (6) und jeweils auch wieder für 10 Minuten (50) bzw. 40 Minuten (51) bei über 200°C in trockener Luft erhitzt.
- 31. Dabei dienen Klinkersteine (53) am Boden des Heißluftsterilisators (56) als Wärme speicherndes Material.
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Bezugszeichenliste
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Fig. 1:
- 1
- Erzeugnisproben
- 2
- handelsübliche Verpackungen
- 3
- offene Behältnisse aus Glas
- 4
- Erzeugnisprobe (1) ohne Evaporationshülle
- 5
- Behältnisse aus Glas mit Deckel
- 6
- sporenfreie Evaporations-Teststoffe
- 7
- Erzeugnisprobe (1) innerhalb einer Evaporationshülle (6)
- 8
- Druckkochtopf
- 9
- Regelventil
- 10
- Glasbehältnisse (3) mit Erzeugnisproben (1)
- 11
- Glasbehältnisse (3) mit Erzeugnisproben (1)
- 12
- metallener Einsatz
- 13
- unterster metallener Einsatz
- 14
- gespannter Dampf im Druckkochtopf (8)
- 15
- hitzedestilliertes Wasser
- 16
- Wärmequelle
- 17
- Erzeugnisproben (1) nach 10 minütiger Erhitzung in offenem Glasbehältnis
- 18
- Erzeugnisproben (1) nach 40 minütiger Erhitzung in Glasbehältnis mit Deckel
- 19
- Erzeugnisproben (1) nach 10 minütiger Erhitzung in offenem Glasbehältnis
- 20
- Erzeugnisproben (1) nach 40 minütiger Erhitzung in Glasbehältnis mit Deckel
Fig. 2: -
- In dieser 2 finden sich Hinweise auf Bezugszeichen aus 1: (17), (18), (19) und (20).
- 17
- Erzeugnisproben (1) nach 10 minütiger Erhitzung Erhitzung in offenem Glasbehältnis
- 18
- Erzeugnisproben (1) nach 40 minütiger Erhitzung in Glasbehältnis mit Deckel
- 19
- Erzeugnisproben (1) nach 10 minütiger Erhitzung Erhitzung in offenem Glasbehältnis
- 20
- Erzeugnisproben (1) nach 40 minütiger Erhitzung in Glasbehältnis mit Deckel
- 21a, b, c
- Zentrifugenröhrchen (54) mit Erzeugnisproben (1) in Flüssignährboden (55)
- 22a, b, c
- Zentrifugenröhrchen (54) mit Erzeugnisproben (1) in Flüssignährboden (55)
- 23a, b, c
- Zentrifugenröhrchen (54) mit Erzeugnisproben (1) in Flüssignährboden (55)
- 24a, b, c
- Zentrifugenröhrchen (54) mit Erzeugnisproben (1) in Flüssignährboden (55)
- 25
- Zentrifugenröhrchen (54) im Brutschrank (28) 72 h bei 20 ± 2°C
- 26
- Zentrifugenröhrchen (54) im Brutschrank (28) 24 h bei 37 ± 2°C
- 27
- Zentrifugenröhrchen (54) im Brutschrank (28) 12 h bei 60 ± 2°C
- 28
- Brutschrank, z. B. ein stufenlos einstellbarer Heißluftsterilisator (56)
- 29a, 30a, 31a, und 32a
- Zentrifugenröhrchen (25) im Brutschrank (28) nach 72 h bei 20 ± 2°C
- 29b, 30b, 31b, und 32b
- Zentrifugenröhrchen (26) im Brutschrank (28) nach 24 h bei 37 ± 2°C
- 29c, 30c, 31c und 32c
- Zentrifugenröhrchen (27) im Brutschrank (28) nach 12 h bei 60 ± 2°C
- 33
- sterile Wattestäbchen
Fig. 3: -
- In dieser 3 finden sich Hinweise auf Bezugszeichen aus 2: (29a bis 32c)
- 34
- Petrischale mit Ausstrichen der bebrüteten Proben aus (29a), (30a), (31a) und (32a)
- 35
- Petrischale mit Ausstrichen der bebrüteten Proben aus (29b), (30b), (31b) und (32b)
- 36
- Petrischale mit Ausstrichen der bebrüteten Proben aus (29c), (30c), (31c) und (32c)
- 37
- Inkubation der Petrischale (34) 72 h lang bei 20 ± 2°C
- 38
- Inkubation der Petrischale (35) 24 h lang bei 37 ± 2°C
- 39
- Inkubation der Petrischale (36) 12 h lang bei 60 ± 2°C
- 40
- Petrischalen nach Inkubation (37) mit Bakterienkolonien
- 41
- Petrischalen nach Inkubation (38) mit Bakterienkolonien
- 42
- Petrischalen nach Inkubation (39) ohne Bakterienwachstum
- 43
- Fotografieren des Koloniewachstums auf der Petrischale (40)
- 44
- Fotografieren des Koloniewachstums auf der Petrischale (42)
- 45
- Fotografieren der Petrischale (42) ohne Bakterienwachstum
- 46
- Tiefkühlschrank
- 47
- Zentrifugenröhrchen (29a), (30a), (31a) und (32a) im Tiefkühlschrank (46)
- 48
- Zentrifugenröhrchen (29b), (30b), (31b) und (32b) im Tiefkühlschrank (46)
- 49
- Zentrifugenröhrchen (29c), (30c), (31c) und (32c) im Tiefkühlschrank (46)
Fig. 4: -
- In dieser 4 finden sich Hinweise auf Bezugszeichen aus 1: (1), (2), (3), (5) (6), (7), (18), (19) und (20)
- 50
- Erhitzen für 10 Minuten im Heißluftsterilisator (56)
- 51
- Erhitzen für 40 Minuten im Heißluftsterilisator (56)
- 52
- metallene Einsätze
- 53
- Klinkersteine
- 54
- Zentrifugenröhrchen
- 55
- Flüssignährboden
- 56
- Heißluftsterilisator
