DE60106117T2 - 2-oxo-Imidazolidin-4-Carboxsäure Hydroxamid Derivate als Matrix Metalloproteinase Inhibitoren - Google Patents

2-oxo-Imidazolidin-4-Carboxsäure Hydroxamid Derivate als Matrix Metalloproteinase Inhibitoren Download PDF

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Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft 2-Oxo-imidazolidin-4-carbonsäure-hydroxamidderivate und derartige Derivate umfassende pharmazeutische Zusammensetzungen und die Verwendung derartiger Derivate bei der Behandlung von Arthritis, einer Entzündung, von Krebs und anderen Erkrankungen, die im folgenden beschrieben sind.
  • Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind Inhibitoren von Zink-Metalloendopeptidasen, insbesondere denjenigen, die zu den Matrixmetalloproteinase(auch als MMP oder Matrixin bezeichnet)- und Reprolysin(auch als Adamylsin bekannt)-Unterfamilien der Metzincine gehören (Rawlings et al., Methods in Enzymology, 248, 183–228 (1995) und Stocker et al., Protein Science, 4, 823–840 (1995)).
  • Die MMP-Unterfamilie von Enzymen enthält derzeit 17 Mitglieder (MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-16, MMP-17, MMP-18, MMP-19, MMP-20). Die MMPs sind für ihre Rolle der Regulierung des Turnovers von Proteinen der extrazellulären Matrix am besten bekannt und spielen als solche wichtige Rollen bei normalen physiologischen Prozessen, wie Reproduktion, Entwicklung und Differenzierung. Außerdem werden die MMPs in vielen pathologischen Situationen, in denen ein anomales Bindegewebeturnover erfolgt, exprimiert. Beispielsweise wurde für MMP-13, ein Enzym mit starker Aktivität beim Abbau von Typ-II-Kollagen (das Hauptkollagen in Knorpel) gezeigt, dass es im osteoarthritischen Knorpel überexprimiert wird (Mitchell et al., J. Clin. Invest., 97, 761 (1996)). Andere MMPs (MMP-2, MMP-3, MMP-8, MMP-9, MMP-12) werden ebenfalls im osteorarthritischen Knorpel überex primiert, und es wird erwartet, dass die Hemmung von einigen oder allen dieser MMPs die beschleunigte Abnahme von Knorpel, die für Gelenkerkrankungen wie Osteoarthritis oder rheumatoide Arthritis typisch ist, verlangsamt oder blockiert.
  • Eine Überexpression von bestimmten Metalloproteinasen ist auch mit der Metastasierung von Tumorzellen verbunden. Es wird angenommen, dass diese Aktivität für die Invasion in gesunde Gewebe wesentlich ist. Es wird angenommen, dass die Hemmung der Aktivität von einigen oder allen dieser Proteinasen die Ausbreitung bösartiger Zellen beschränkt. Außerdem sind bestimmte Metalloproteinasen für die Angiogenese notwendig, ein Verfahren, wodurch beispielsweise ein wachsender Tumor eine zusätzliche Blutversorgung durch neue Vaskularisation erhält. Daher wird angenommen, dass die Hemmung dieser Enzyme das Tumorwachstum verlangsamt oder stoppt.
  • Es wird auch angenommen, dass die Verbindungen der Erfindung in geeigneter Weise weitere Enzymklassen mit wichtigen Rollen bei sowohl normalen als auch pathologischen Prozessen hemmen. Beispielsweise sind die Säugerreprolysine als ADAMs (A Disintegrin And Metalloproteinase) bekannt (Wolfberg et al., J. Cell Biol., 131, 275–278 (1995)), die eine Disintegrindomäne zusätzlich zu einer Metalloproteinase-ähnlichen Domäne enthalten. Bisher wurden 23 unterschiedliche ADRMs identifiziert. ADAM-17, das auch als Tumor Necrosis Factor-α Converting Enzyme (TACE) bekannt ist, ist die bekannteste ADAM.
  • ADAM-17 (TACE) ist für die Spaltung von zellgebundenen Tumornekrosefaktor α (TNF-α, auch als Cachectin bekannt) verantwortlich. TNF-α ist bekanntlich an vielen infektiösen und Autoimmunerkrankungen beteiligt (W. Friers, FEBS Let ters, 285, 199 (1991)). Ferner wurde gezeigt, dass TNF-α der primäre Mediator der bei Sepsis und septischem Schock beobachteten Entzündungsreaktion ist (Spooner et al., Clinical Immunology and Immunopathology, 62 S11 (1992)). Es gibt zwei Formen von TNF-α, ein Typ-II-Membranprotein der relativen Molekülmasse 26000 (26 kD) und eine lösliche 17-kD-Form, die aus dem zellgebundenen Protein durch eine spezifische proteolytische Spaltung erzeugt wird. Die lösliche 17-kD-Form von TNF-α wird von der Zelle freigesetzt und sie ist mit den Schadwirkungen von TNF-α verbunden. Diese Form von TNF-α kann auch an vom Syntheseort entfernten Orten wirken. Daher verhindern Inhibitoren von TACE die Bildung von löslichem TNF-α und sie verhindern die Schadwirkungen des löslichen Faktors.
  • In einem weiteren Beispiel ist Aggrecanase ein Enzym, das beim Abbau von Knorpelaggrecan wichtig ist. Es wird angenommen, dass Aggrecanase eine ADAM ist. Der Verlust von Aggrecan aus der Knorpelmatrix ist ein wichtiger Faktor beim Fortschreiten von Gelenkerkrankungen, wie Osteoarthritis und rheumatoider Arthritis, und es wird angenommen, dass die Hemmung von Aggrecanase den Knorpelverlust in durch diese Erkrankungen beeinflussten Geweben verlangsamt oder blockiert.
  • Andere ADAMs, die eine Expression in pathologischen Situationen zeigten, umfassen ADAM TS-1 (Kuno et al., J. Biol. Chem., 272, 556–562 (1997)) und die ADAMs 10, 12 und 15 (Wu et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 235, 437–442 (1997)). Mit zunehmenden Kenntnissen der Expression, physiologischen Substrate und der Verbindung mit Krankheiten der ADAMs wird die volle Bedeutung der Rolle der Hemmung dieser Klasse von Enzymen erkannt.
  • Die Verbindungen der Erfindung sind bei der Behandlung von Arthritis (einschließlich von Osteoarthritis und rheumatoider Arthritis), einer entzündlichen Darmerkrankung, Morbus Crohn, einem Emphysem, akutem Atemnotsyndrom, Asthma, chronisch-obstruktiver Lungenerkrankung, Alzheimer-Erkrankung, Toxizität bei einem Organtransplantat, Kachexie, allergischen Reaktionen, einer Entzündung, allergischer Kontaktüberempfindlichkeit, Krebs (wie eine Krebserkrankung mit festen Tumoren, die Kolonkrebs, Brustkrebs, Lungenkrebs und Prostatakrebs umfasst, und bösartige Hämatopoeseerkrankungen, die Leukämie und Lymphome umfassen), Gewebeulzeration, Restenose, einer Parodontopathie, Epidermolysis bullosa, Osteoporose, Lockerwerden künstlicher Gelenkimplantate, Atherosklerose (einschließlich von atherosklerotischer Plaqueruptur), Aortaaneurysma (einschließlich von Bauchaortaaneurysma und Hirnaortaaneurysma), kongestiver Herzinsuffizienz, Myokardinfarkt, Schlaganfall, Hirnischämie, Kopftrauma, einer Rückenmarkschädigung, (akuten und chronischen) neurodegenerativen Störungen, Autoimmunerkrankungen, Chorea Huntington, Parkinson-Krankheit, Migräne, Depression, peripherer Neuropathie, Schmerz, zerebraler Amyloidangiopathie, nootroper oder Wahrnehmungsverstärkung, amyotrophischer Lateralsklerose, Multipler Sklerose, Augenangiogenese, einer Korneaschädigung, Makuladegeneration, anomaler Wundheilung, Verbrennungen, Diabetes, Tumorinvasion, Tumorwachstum, Tumormetastasen, Korneanarbenbildung, Skleritis, AIDS, Sepsis oder septischem Schock verwendbar.
  • Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind auch bei der Behandlung von Erkrankungen verwendbar, bei denen eine Hemmung von MMPs und/oder ADAMs einen therapeutischen Nutzen ergibt, die beispielsweise durch die Expression von einer Matrixmetalloproteinase oder ADAM gekennzeichnet sind.
  • Matrixmetalloproteinase- und Reprolysininhibitoren sind in der Literatur bekannt. Insbesondere betrifft die europäische Patentveröffentlichung 606046, veröffentlicht am 13. Juli 1994, bestimmte heterocyclische MMP-Inhibitoren. Die PCT-Veröffentlichung WO 98/08825 und WO 98/08815, beide veröffentlicht am 5. März 1998, betreffen bestimmte cyclische Hydroxamsäure-MMP-Inhibitoren. Das US-Patent 5 861 510, erteilt am 19. Januar 1999, betrifft cyclische Arylsulfonylaminohydroxamsäuren, die als MMP-Inhibitoren verwendbar sind. Die PCT-Veröffentlichung WO 98/34918, veröffentlicht am 13. August 1998, betrifft cyclische Hydroxamsäuren, die bestimmte dialkylsubstituierte Verbindungen umfassen, die als MMP-Inhibitoren verwendbar sind.
  • Die PCT-Veröffentlichungen WO 96/27583 und WO 98/07697, veröffentlicht am 7. März 1996 bzw. 26. Februar 1998, betreffen Arylsulfonylhydroxamsäuren. Die PCT-Veröffentlichung WO 98/03516, veröffentlicht am 29. Januar 1998, betrifft Phosphinate mit MMP-Aktivität. Die PCT-Veröffentlichung WO 98/33768, veröffentlicht am 6. August 1998, betrifft N-unsubstituierte Arylsulfonylaminohydroxamsäuren. Die europäische Patentveröffentlichung EP 935963 , veröffentlicht am 18. August 1999, betrifft die Verwendung von MMP-13-selektiven Inhibitoren zur Behandlung von Osteoarthritis. Die US-Patentanmeldungen 09/290022, 09/287930 und 09/287508, eingereicht am 9. April 1999, 7. April 1999 bzw. 7. April 1999, betreffen Verfahren zur Herstellung von Hydroxamsäuren. Die United States Provisional Patent Application mit dem Titel "Selective Inhibitors of Aggrecanase in Osteoarthritis Treatment", eingereicht am 12. August 1999, betrifft MMP-, Aggrecanase- und TACE-Inhibitoren und weitere Verfahren zur Herstellung von Hydroxamsäuren. Die United States Non-Provisional Application mit dem Titel "TACE Inhibitors", eingereicht am 12. August 1999, betrifft heterocyclische Hydroxamsäuren.
  • Die WO 99/65867 betrifft Hydroxamsäuren mit MMP-, Aggrecanase- und TNF-Hemmaktivität.
  • Es ist bekannt, dass unterschiedliche Kombinationen von MMPs und ADAMs in unterschiedlichen pathologischen Situationen exprimiert werden. Daher können Inhibitoren mit spezifischen Selektivitäten für individuelle ADAMs und/oder MMPs für individuelle Erkrankungen bevorzugt sein. Beispielsweise ist rheumatoide Arthritis eine entzündliche Gelenkerkrankung, die durch übermäßige TNF-Spiegel und den Verlust von Gelenkmatrixbestandteilen gekennzeichnet ist. In diesem Fall kann eine Verbindung, die TACE und Aggrecanase sowie MMPs, wie MMP-13, hemmt, die bevorzugte Therapie sein. Im Gegensatz dazu können bei einer weniger entzündlichen Gelenkerkrankung, wie Osteoarthritis, Verbindungen, die matrixabbauende MMPs, wie MMP-13, jedoch nicht TACE hemmen, bevorzugt sein.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine Verbindung gemäß der Formel (I)
    Figure 00060001
    oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz oder Solvat derselben, worin R1 aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus (C6-C10)Aryl, (C1-C9)Heteroaryl, (C6-C10)Aryl(C1-C6)alkyl, (C1-C9)Heteroaryl(C1-C6)alkyl, (C6-C10)Aryl(C6-C10)aryl, (C1-C9)Heteroaryl(C6-C10)aryl, (C6-C10)Aryl(C1-C9)heteroaryl, (C1- C9)Heteroaryl(C1-C9)heteroaryl, (C6-C10)Aryloxy(C6-C10)aryl, (C1-C9)Heteroaryloxy(C6-C10)aryl, (C6-C10)Aryloxy(C1-C9)heteroaryl, (C1-C9)Heteroaryloxy(C1-C9)heteroaryl, (C6-C10)Aryloxy(C1-C6)alkyl, (C1-C9)Heteroaryloxy(C1-C6)alkyl, (C6-C10)Aryl(C1-C6)alkyl(C6-C10)aryl, (C1-C9)Heteroaryl(C1-C6)alkyl(C6-C10)aryl, (C6-C10)Aryl(C1-C6)alkyl(C1-C9)heteroaryl, (C1-C9)Heteroaryl(C1-C6)alkyl(C1-C9)heteroaryl, (C6-C10)Aryl(C1-C6)alkoxy(C6-C10)aryl, (C1-C9)Heteroaryl(C1-C6)alkoxy(C6-C10)aryl, (C6-C10)Aryl(C1-C6)alkoxy(C1-C9)heteroaryl, (C1-C9)Heteroaryl(C1-C6)alkoxy(C1-C9)heteroaryl, (C6-C10)Aryloxy(C1-C6)alkyl(C6-C10)aryl, (C1-C9)Heteroaryloxy(C1-C6)alkyl(C6-C10)aryl, (C6-C10)Aryloxy(C1-C6)alkyl(C1-C9)heteroaryl, (C1-C9)Heteroaryloxy(C1-C6)alkyl(C1-C9)heteroaryl, (C6-C10)Aryl(C6-C10)aryl(C1-C6)alkyl, (C1-C9)Heteroaryl(C6-C10)aryl(C1-C6)alkyl, (C6-C10)Aryl(C1-C9)heteroaryl(C1-C6)alkyl, (C1-C9)Heteroaryl(C1-C9)heteroaryl(C1-C6)alkyl, (C6-C10)Aryl(C1-C6)alkoxy(C1-C6)alkyl und (C1-C9)Heteroaryl(C1-C6)alkoxy(C1-C6)alkyl bestehen,
    wobei unabhängig voneinander jedes der Ringkohlenstoffatome der (C6-C10)Aryl- und (C1-C9)Heteroaryleinheiten, das eine weitere Bindung bilden kann, optional mit einer Gruppe, die aus Fluor, Chlor, Brom, (C1-C6)Alkyl, (C1-C6)Alkoxy und Perfluor(C1-C3)alkyl und Perfluor(C1-C3)alkoxy ausgewählt ist, substituiert ist;
    R2 und R3 jeweils unabhängig voneinander aus Wasserstoff und (C1-C6)Alkyl ausgewählt sind oder zusammengenommen einen Spiroring der Formel
    Figure 00070001
    worin X eine Bindung, CH2, O, S, NH oder N(C1-C6)Alkyl bedeutet, n unabhängig voneinander 1 oder 2 ist und m unabhängig voneinander 1 oder 2 ist, bilden; und
    R4 Wasserstoff oder (C1-C6)Alkyl bedeutet.
  • In einem bevorzugten Aspekt der Erfindung ist R1 ausgewählt aus der Gruppe, die aus (C6-C10)Aryl, (C1-C9)Heteroaryl, (C6-C10)Aryloxy(C6-C10)aryl, (C1-C9)Heteroaryloxy(C6-C10)aryl, (C6-C10)Aryl(C6-C10)aryl, (C1-C9)Heteroaryl(C6-C10)aryl, (C6-C10)Aryl(C1-C6)alkoxy(C6-C10)aryl und (C1-C9)Heteroaryl(C1-C6)alkoxy(C6-C10)aryl besteht.
  • In stärker bevorzugten Aspekten der Erfindung ist R1 ausgewählt:
    • (a) aus der Gruppe, die aus 4-[(C6-C10)Aryl]phenyl, 4-[(C6-C10)Aryloxy]phenyl und 4-[(C6-C10)Aryl(C1-C6)alkoxy]phenyl besteht; oder
    • (b) aus der Gruppe, die aus 4-[(C1-C9)Heteroaryl]phenyl, 4-[(C1-C9)Heteroaryloxy]phenyl und 4-[(C1-C9)Heteroaryl(C1-C6)alkoxy]phenyl besteht.
  • Stark bevorzugte Beispiele umfassen diejenigen, worin R1 4-(4-Fluorphenoxy)phenyl, 4-(4-Chlorphenoxy)phenyl und 4-(Naphthalin-2-yloxy)phenyl bedeutet.
  • In einem bevorzugten Aspekt der Erfindung bilden R2 und R3 zusammengenommen einen Spiroring der Formel
    Figure 00080001
    worin X eine Bindung, CH2, O, S, NH oder N(C1-C6)Alkyl bedeutet, n 1 oder 2 ist und m 1 oder 2 derart ist, dass n gleich m ist.
  • In einem stärker bevorzugten Aspekt der Erfindung sind R2 und R3 aus Wasserstoff und (C1-C6)Alkyl ausgewählt. Gemäß diesem Aspekt der Erfindung ist R2 vorzugsweise gleich R3, d. h. R2 und R3 sind jeweils Wasserstoff oder jeweils (C1-C6)Alkyl derart, dass R2 gleich R3 ist.
  • In bevorzugten Beispielen der Erfindung bedeuten R4 (C1-C6)Alkyl; R4 Wasserstoff; und R2, R3 und R4 jeweils Wasserstoff.
  • In einer stark bevorzugten Ausführungsform der Erfindung besitzt der Ringkohlenstoff, an den R4 gebunden ist, die R-Konfiguration. Daher werden bevorzugte Verbindungen der Erfindung gemäß der Formel (I') bereitgestellt
    Figure 00090001
    wobei die Bevorzugung der Wahl der Gruppen R1, R2, R3 und R4 wie im vorhergehenden im Hinblick auf Verbindungen, in denen die stereospezifische Konfiguration am Ringkohlenstoffatom, an das R4 gebunden ist, nicht genannt ist, ist.
  • Daher umfassen bevorzugte Verbindungen der Erfindung
    (4R)-1-[4-(4-Fluorphenoxy)benzyl]-2-oxo-imidazolidin-4-carbonsäurehydroxyamid;
    (4R)-1-[4-(Naphthalin-1-yloxy)benzyl]-2-oxo-imidazolidin-4-carbonsäurehydroxyamid;
    (4R)-1-[4-(Naphthalin-2-yloxy)benzyl]-2-oxo-imidazolidin-4-carbonsäurehydroxyamid;
    (4R)-1-(4-Methoxybenzyl)-2-oxo-imidazolidin-4-carbonsäurehydroxyamid;
    (4R)-1-[3-(4-Fluorphenoxy)benzyl]-2-oxo-imidazolidin-4-carbonsäurehydroxyamid;
    (4R)-1-Naphthalin-2-ylmethyl-2-oxo-imidazolidin-4-carbonsäurehydroxyamid;
    (4R)-1-(4'-Fluorbiphenyl-4-ylmethyl)-2-oxo-imidazolidin-4-carbonsäurehydroxyamid;
    (4R)-1-(4-Benzyloxybenzyl)-2-oxo-imidazolidin-4-carbonsäurehydroxyamid; und
    (4R)-1-[4-(2-Chlor-4-fluorbenzyloxy)benzyl]-2-oxo-imidazolidin-4-carbonsäurehydroxyamid.
  • Weitere bevorzugte Verbindungen der Erfindung umfassen:
    (4R)-1-[4-(4-Chlorphenoxy)benzyl]-2-oxo-imidazolidin-4-carbonsäurehydroxyamid;
    (4R)-1-[4-(4-Fluorphenoxy)benzyl]-2-oxo-7-oxa-1,3-diazaspiro[4.4]nonan-4-carbonsäurehydroxyamid;
    (4R)-2-Oxo-1-[4-(pyridin-4-yloxy)benzyl]imidazolidin-4-carbonsäurehydroxyamid;
    (4R)-4-Methyl-2-oxo-1-[4-(pyridin-4-yloxy)benzyl]imidazolidin-4-carbonsäurehydroxyamid;
    (4R)-5,5-Dimethyl-2-oxo-1-[4-(pyridin-4-yloxy)benzyl]imidazolidin-4-carbonsäurehydroxyamid;
    (4R)-1-[4-(4-Fluorphenoxy)benzyl]-5,5-dimethyl-2-oxo-imidazolidin-4-carbonsäurehydroxyamid;
    (4R)-1-[4-(4-Chlorphenoxy)benzyl]-5,5-dimethyl-2-oxo-imidazolidin-4-carbonsäurehydroxyamid;
    (4R)-1-[4-(4-Fluorphenoxy)benzyl]-4-methyl-2-oxo-imidazolidin-4-carbonsäurehydroxyamid;
    (4R)-1-[4-(4-Chlorphenoxy)benzyl]-4-methyl-2-oxo- imidazolidin-4-carbonsäurehydroxyamid;
    (4R)-1-[4-(4-Fluorphenoxy)benzyl]-2-oxo-1,3-diazaspiro[4.4]nonan-4-carbonsäurehydroxyamid;
    (4R)-1-[4-(4-Chlorphenoxy)benzyl]-2-oxo-1,3-diazaspiro[4.4]nonan-4-carbonsäurehydroxyamid;
    (4R)-1-[4-(4-Fluorphenoxy)benzyl]-4,5,5-trimethyl-2-oxo-imidazolidin-4-carbonsäurehydroxyamid;
    (4R)-1-[4-(4-Chlorphenoxy)benzyl]-4,5,5-trimethyl-2-oxo-imidazolidin-4-carbonsäurehydroxyamid;
    (4R)-4-Methyl-1-[4-(naphthalin-2-yloxy)benzyl]-2-oxo-imidazolidin-4-carbonsäurehydroxyamid;
    (4R)-5,5-Dimethyl-1-[4-(naphthalin-2-yloxy)benzyl]-2-oxo-imidazolidin-4-carbonsäurehydroxyamid;
    (4R)-1-[4-(5-Fluorpyridin-2-yloxy)benzyl]-4-methyl-2-oxo-imidazolidin-4-carbonsäurehydroxyamid;
    (4R)-2-Oxo-1-(4-pyridin-4-ylbenzyl)imidazolidin-4-carbonsäurehydroxyamid und
    (4R)-2-Oxo-1-(4-pyridylmethyl)imidazolidin-4-carbonsäurehydroxyamid.
  • Der hier verwendete Ausdruck "Alkyl" umfasst, falls nicht anders angegeben, gesättigte einwertige Kohlenwasserstoffreste mit geraden, verzweigten oder cyclischen Einheiten oder Kombinationen derselben.
  • Der hier verwendete Ausdruck "Alkoxy" umfasst O-Alkylgruppen, wobei "Alkyl" wie im vorhergehenden definiert ist.
  • Der hier verwendete Ausdruck "Aryl" umfasst, falls nicht anders angegeben, einen organischen Rest, der von einem monocyclischen oder bicyclischen aromatischen (C6-C10)-Kohlenwasserstoff durch Entfernen eines Wasserstoffs abgeleitet wurde, wie Phenyl oder Naphthyl, der optional mit Substituenten substituiert ist, die aus der Gruppe von Fluor, Chlor, Brom, Perfluor(C1-C6)alkyl (einschließlich von Tri fluormethyl), (C1-C6)Alkoxy, Perfluor(C1-C3)alkoxy (einschließlich von Trifluormethoxy und Difluormethoxy) und (C1-C6)Alkyl ausgewählt sind. Falls nicht anders angegeben, ist die Auswahl jedes optionalen Substituenten unabhängig von der Auswahl aller anderen optionalen Substituenten, und die Zahl der Substituenten ist vorzugsweise 0 oder zwischen 1 und 3.
  • Der hier verwendete Ausdruck "Heteroaryl" umfasst, falls nicht anders angegeben, einen organischen Rest, der von einer monocyclischen oder bicyclischen aromatischen heterocyclischen (C1-C9)-Verbindung durch Entfernen eines Wasserstoffs abgeleitet wurde, wie Pyridyl, Furyl, Pyrroyl, Thienyl, Isothiazolyl, Imidazolyl, Benzimidazolyl, Tetrazolyl, Pyrazinyl, Pyrimidyl, Chinolyl, Isochinolyl, Benzofuryl, Isobenzofuryl, Benzothienyl, Pyrazolyl, Indolyl, Isoindolyl, Purinyl, Carbazolyl, Isoxazolyl, Thiazolyl, Oxazolyl, Benzthiazolyl und Benzoxazolyl, die optional mit Substituenten substituiert sind, die aus der Gruppe von Fluor, Chlor, Trifluormethyl, (C1-C6)Alkoxy, Trifluormethoxy, Difluormethoxy und (C1-C6)Alkyl ausgewählt sind. Falls nicht anders angegeben, ist die Auswahl jedes optionalen Substituenten unabhängig von der Auswahl aller anderen optionalen Substituenten, und die Zahl der Substituenten ist vorzugsweise 0 oder zwischen 1 und 2.
  • "Ein geeigneter Substituent" soll eine chemisch und pharmazeutisch akzeptable funktionelle Gruppe, d. h. eine Einheit, die die Hemmaktivität der erfindungsgemäßen Verbindungen nicht wesentlich zunichte macht, und/oder eine Einheit, die zur Herstellung, Lagerung oder Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen als Pharmazeutika verwendbare Eigenschaften beiträgt, bedeuten. Derartige geeignete Substituenten können durch den Fachmann bestimmt werden. Erläuternde Beispiele für geeignete Substituenten umfassen, ohne hierauf beschränkt zu sein, Alkylgruppen, Hydroxygruppen, Alkylthiogruppen, Alkoxygruppen, Gruppen, Carboxygruppen, Aminogruppen, Alkyl- und Dialkylaminogruppen, Carbamoylgruppen, Alkylcarbonylgruppen, Alkoxycarbonylgruppen, Alkylaminocarbonylgruppen, Dialkylaminocarbonylgruppen, Arylcarbonylgruppen, Aryloxycarbonylgruppen, Alkylsulfonylgruppen, Arylsulfonylgruppen und dgl.
  • Die Verbindung der Formel I kann chirale Zentren besitzen und daher in unterschiedlichen enantiomeren Formen existieren. Die vorliegende Erfindung betrifft alle optischen Isomere, Tautomere und Stereoisomere der Verbindungen der Formel I und Gemische derselben.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die pharmazeutisch akzeptablen Säureadditionssalze von Verbindungen der Formel I. Die Säuren, die zur Herstellung der pharmazeutisch akzeptablen Säureadditionssalze der im vorhergehenden genannten Baseverbindungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind diejenigen, die nichttoxische Säureadditionssalze, d. h. pharmakologisch akzeptable Anionen enthaltende Salze, wie die Hydrochlorid-, Hydrobromid-, Hydroiodid-, Nitrat-, Sulfat-, Bisulfat-, Phosphat-, sauren Phosphat-, Acetat-, Lactat-, Citrat-, sauren Citrat-, Tartrat-, Bitartrat-, Succinat-, Maleat-, Fumarat-, Gluconat-, Saccharat-, Benzoat-, Methansulfonat-, Ethansulfonat-, Benzolsulfonat-, p-Toluolsulfonat- und Pamoat-[d. h. 1,1'-Methylen-bis(2-hydroxy-3-naphthoat)]salze, bilden.
  • Die Erfindung betrifft ferner Baseadditionssalze der Formel I. Die chemischen Basen, die als Reagentien zur Herstellung pharmazeutisch akzeptabler Basesalze der Verbindungen der Formel I, die saurer Natur sind, verwendet werden können, sind diejenigen, die nichttoxische Basesalze mit derartigen Verbindungen bilden. Diese nichttoxischen Basesalze umfas sen, ohne hierauf beschränkt zu sein, diejenigen, die von pharmakologisch akzeptablen Kationen, wie Alkalimetallkationen (beispielsweise Kalium und Natrium) und Erdalkalimetallkationen (beispielsweise Calcium und Magnesium), abgeleitet sind, Ammoniumsalze oder Additionssalze wasserlöslicher Amine, wie N-Methylglucamin (Meglumin), und die Niederalkanolammonium- und andere Basesalze pharmazeutisch akzeptabler organischer Amine.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst auch isotopenmarkierte Verbindungen, die mit den in Formel I angegebenen identisch sind, mit Ausnahme der Tatsache, dass ein oder mehrere Atome durch ein Atom mit einer Atommasse oder Massenzahl, die von der üblicherweise in der Natur gefundenen Atommasse oder Massenzahl verschieden ist, ersetzt sind. Beispiele für Isotope, die in Verbindungen der Erfindung eingearbeitet werden können, umfassen Isotope von Wasserstoff, Kohlenstoff, Stickstoff, Sauerstoff, Phosphor, Fluor und Chlor wie 2H, 3H, 13C, 14C, 15N, 18O, 17O, 31P, 32P, 35S, 18F bzw. 36Cl. Verbindungen der vorliegenden Erfindung, Prodrugs derselben und pharmazeutisch akzeptable Salze der Verbindungen oder der Prodrugs, die die im vorhergehenden genannten Isotope und/oder andere Isotope anderer Atome enthalten, liegen innerhalb des Schutzumfangs dieser Erfindung. Bestimmte isotopenmarkierte Verbindungen der vorliegenden Erfindung, beispielsweise diejenigen, in die radioaktive Isotope, wie 3H und 14C eingearbeitet sind, sind in Arzneimittel- und/oder Substratgewebeverteilungstests verwendbar. Tritium-, d. h. 3H-, und Kohlenstoff-14-, d. h. 14C-, Isotope sind wegen ihrer leichten Herstellung und Nachweisbarkeit besonders bevorzugt. Ferner kann eine Substitution mit schwereren Isotopen, wie Deuterium, d. h. 2H, bestimmte therapeutische Vorteile infolge der größeren Metabolisierungsstabilität, beispielsweise einer erhöhten In-vivo-Halbwertszeit oder geringerer Dosisanforderungen, bie ten und daher in einigen Fällen bevorzugt sein. Isotopen-markierte Verbindungen der Formel I der vorliegenden Erfindung und Prodrugs derselben können im allgemeinen durch Durchführen der in den folgenden Reaktionsschemata und/oder Beispielen und Herstellungsbeispielen offenbarten Verfahren durch Ersetzen eines nicht-isotopenmarkierten Reagens durch ein ohne weiteres verfügbares isotopenmarkiertes Reagens hergestellt werden.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ferner eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung eines Zustands, der ausgewählt ist aus der Gruppe von Arthritis (einschließlich von Osteoarthritis und rheumatoider Arthritis), einer entzündlichen Darmerkrankung, Morbus Crohn, einem Emphysem, akutem Atemnotsyndrom, Asthma, chronisch-obstruktiver Lungenerkrankung, Alzheimer-Erkrankung, Toxizität bei einem Organtransplantat, Kachexie, allergischen Reaktionen, allergischer Kontaktüberempfindlichkeit, Krebs (wie eine Krebserkrankung mit festen Tumoren, die Kolonkrebs, Brustkrebs, Lungenkrebs und Prostatakrebs umfasst, und bösartige Hämatopoeseerkrankungen, die Leukämie und Lymphome umfassen), Gewebeulzeration, Restenose, einer Parodontopathie, Epidermolysis bullosa, Osteoporose, Lockerwerden künstlicher Gelenkimplantate, Atherosklerose (einschließlich von atherosklerotischer Plaqueruptur), Aortaaneurysma (einschließlich von Bauchaortaaneurysma und Hirnaortaaneurysma), kongestiver Herzinsuffizienz, Myokardinfarkt, Schlaganfall, Hirnischämie, Kopftrauma, einer Rückenmarkschädigung, (akuten und chronischen) neurodegenerativen Störungen, Autoimmunerkrankungen, Chorea Huntington, Parkinson-Krankheit, Migräne, Depression, peripherer Neuropathie, Schmerz, zerebraler Amyloidangiopathie, nootroper oder Wahrnehmungsverstärkung, amyotrophischer Lateralsklerose, Multipler Sklerose, Augenangiogenese, einer Korneaschädigung, Makuladegeneration, anomaler Wundheilung, Verbrennungen, Diabetes, Tumorinvasion, Tumorwachstum, Tumormetastasen, Korneanarbenbildung, Skleritis, AIDS, Sepsis oder septischem Schock, bei einem Säuger einschließlich eines Menschen, die eine bei derartigen Behandlungen wirksame Menge einer Verbindung der Formel I oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes derselben und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ferner eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Erkrankungen, die durch Metalloproteinaseaktivität (vorzugsweise MMP-13) gekennzeichnet sind, und anderen Erkrankungen, die durch Säugerreprolysinaktivität (zweckmäßigerweise Aggrecanaseaktivität, vorzugsweise Aggrecanaseaktivität) gekennzeichnet sind, bei einem Säuger einschließlich eines Menschen, die eine bei derartigen Behandlungen wirksame Menge einer Verbindung der Formel I oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes derselben und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ferner eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Hemmung von (a) Matrixmetalloproteinasen oder anderen Metalloproteinasen, die am Matrixabbau beteiligt sind, oder (b) eines Säugerreprolysins (wie Aggrecanase oder die ADAMs TS-1, 10, 12, 15 und 17, vorzugsweise Aggrecanase) bei einem Säuger einschließlich eines Menschen, die eine wirksame Menge einer Verbindung der Formel I oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes derselben und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Zustands, der ausgewählt ist aus der Gruppe von Arthritis (einschließlich von Osteoarthritis und rheumatoider Arthritis), einer entzündlichen Darmerkrankung, Morbus Crohn, einem Emphysem, akutem Atemnotsyndrom, Asthma, chronisch-obstruktiver Lungenerkrankung, Alzheimer-Erkrankung, Toxizität bei einem Organtransplantat, Kachexie, allergischen Reaktionen, einer Entzündung, allergischer Kontaktüberempfindlichkeit, Krebs (wie eine Krebserkrankung mit festen Tumoren, die Kolonkrebs, Brustkrebs, Lungenkrebs und Prostatakrebs umfasst, und bösartige Hämatopoeseerkrankungen, die Leukämie und Lymphome umfassen), Gewebeulzeration, Restenose, einer Parodontopathie, Epidermolysis bullosa, Osteoporose, Lockerwerden künstlicher Gelenkimplantate, Atherosklerose (einschließlich von atherosklerotischer Plaqueruptur), Aortaaneurysma (einschließlich von Bauchaortaaneurysma und Hirnaortaaneurysma), kongestiver Herzinsuffizienz, Myokardinfarkt, Schlaganfall, Hirnischämie, Kopftrauma, einer Rückenmarkschädigung, (akuten und chronischen) neurodegenerativen Störungen, Autoimmunerkrankungen, Chorea Huntington, Parkinson-Krankheit, Migräne, Depression, peripherer Neuropathie, Schmerz, zerebraler Amyloidangiopathie, nootroper oder Wahrnehmungsverstärkung, amyotrophischer Lateralsklerose, Multipler Sklerose, Augenangiogenese, einer Korneaschädigung, Makuladegeneration, anomaler Wundheilung, Verbrennungen, Diabetes, Tumorinvasion, Tumorwachstum, Tumormetastasen, Korneanarbenbildung, Skleritis, AIDS, Sepsis oder septischem Schock, bei einem Säuger einschließlich eines Menschen unter Verwendung einer zum Behandeln eines derartigen Zustands wirksamen Menge einer Verbindung der Formel I oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes derselben.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Erkrankungen, die durch Matrixmetalloproteinaseaktivität (vorzugsweise MMP-13-Aktivität) gekennzeichnet sind, und anderen Erkrankungen, die durch Säugerreprolysinaktivität (vorzugsweise Aggrecanaseaktivität) gekennzeichnet sind, bei einem Säuger einschließlich eines Menschen, die das Verabreichen einer zum Behandeln eines derartigen Zustands wirksamen Menge einer Verbindung der Formel I oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes derselben an den Säuger umfasst.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Herstellung eines Medikaments zur Hemmung von (a) Matrixmetalloproteinasen oder anderen Metalloproteinasen, die am Matrixabbau beteiligt sind, oder (b) eines Säugerreprolysins (wie Aggrecanase oder die ADAMs TS-1, 10, 12, 15 und 17, vorzugsweise Aggrecanase) bei einem Säuger einschließlich eines Menschen, die das Verabreichen einer wirksamen Menge einer Verbindung der Formel I oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes derselben an den Säuger umfasst.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Herstellung eines Medikaments zur Hemmung der Abspaltung von TNF-α von Zellmembranen bei einem Säuger, das das Verabreichen einer wirksamen Menge einer Verbindung der Formel I, die Aggrecanase hemmt, an den Säuger umfasst.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Arthritis bei einem Säuger, das das Verabreichen einer wirksamen Menge eines Aggrecanaseinhibitors an den Säuger umfasst, wobei der Aggrecanaseinhibitor selektiv Aggrecanase bevorzugt gegenüber MMP-1 hemmt.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Arthritis bei einem Säuger, die das Verabreichen einer wirksamen Menge eines Aggrecanaseinhibitors an den Säuger umfasst, wobei der Aggrecanaseinhibitor selektiv Aggrecanase mindestens zehnmal so gut wie MMP-1 hemmt.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Arthritis bei einem Säuger, die das Verabreichen einer wirksamen Menge eines Aggrecanaseinhibitors an den Säuger umfasst, wobei der Aggrecanaseinhibitor selektiv Aggrecanase und MMP-13 bevorzugt gegenüber MMP-1 hemmt.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Arthritis bei einem Säuger, die das Verabreichen einer wirksamen Menge eines Aggrenanaseinhibitors an den Säuger umfasst, wobei der Aggrecanaseinhibitor selektiv Aggrecanase und MMP-13 mindestens zehnmal so gut wie MMP-1 hemmt.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Behandlung von Arthritis bei einem Säuger, die das Verabreichen einer wirksamen Menge eines Hydroxamsäure-Aggrenanaseinhibitors an den Säuger umfasst, wobei der Aggrecanaseinhibitor selektiv Aggrecanase und MMP-13 bevorzugt gegenüber MMP-1 hemmt.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Arthritis bei einem Säuger, das das Verabreichen einer wirksamen Menge eines Hydroxamsäure-Aggrenanaseinhibitors umfasst, wobei der Aggrecanaseinhibitor selektiv Aggrecanase und MMP-13 mindestens zehnmal so gut wie MMP-1 hemmt.
  • Der hier verwendete Ausdruck "Behandeln" bezeichnet das Aufheben, Mildern, Hemmen des Fortschreitens oder das Verhindern der Erkrankung oder des Zustands, für die dieser Ausdruck dient, oder von einem oder mehreren Symptomen dieser Erkrankung oder dieses Zustands. Der hier verwendete Ausdruck "Behandlung" bezeichnet den Akt des Behandelns, wobei "Behandeln" wie im vorhergehenden definiert ist.
  • Die Verbindungen der Formel I mit freien Amino-, Amido-, Hydroxy- oder Carbonsäuregruppen können in Prodrugs umgewandelt werden. Prodrugs umfassen Verbindungen, in denen ein Aminosäurerest oder eine Polypeptidkette aus zwei oder mehreren (beispielsweise 2, 3 oder 4) Aminosäureresten, die durch Peptidbindungen an freie Amino-, Hydroxy- oder Carbonsäuregruppen von Verbindungen der Formel I gebunden sind. Die Aminosäurereste umfassen die 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren, die gewöhnlich durch Drei-Buchstaben-Symbole bezeichnet werden, und sie umfassen auch 4-Hydroxyprolin, Hydroxylysin, Demosin, Isodemosin, 3-Methylhistidin, Norvalin, β-Alanin, γ-Aminobuttersäure, Citrullin, Homocystein, Homoserin, Ornithin und Methioninsulfon. Prodrugs umfassen auch Verbindungen, worin Carbonate, Carbamate, Amide und Alkylester kovalent mit den obigen Substituenten der Formel I über die Carbonylkohlenstoff-Prodrugseitenkette gebunden sind.
  • Einem Fachmann üblicher Erfahrung ist klar, dass die Verbindungen der Erfindung bei der Behandlung einer breiten Palette von Erkrankungen verwendbar sind. Einem Fachmann üblicher Erfahrung ist auch klar, dass bei der Verwendung der Verbindungen der Erfindung bei der Behandlung einer speziellen Erkrankung die Verbindungen der Erfindung mit verschiedenen existierenden therapeutischen Mitteln, die für die Erkrankung verwendet werden, kombiniert werden können.
  • Für die Behandlung von rheumatoider Arthritis können die Verbindungen der Erfindung mit Mitteln wie TACE-Inhibitoren, TNF-α-Inhibitoren, wie Anti-TNF-monoklonalen-Antikörpern und TNF-Rezeptor-Immunglobulinmolekülen (wie Enbrel®), COX-2-Inhibitoren, niedrig dosiertem Methotrexat, Lefunimid, Hydroxychloroquin, d-Penicillamin, Auranofin oder parenteralem oder oralem Gold kombiniert werden.
  • Die Verbindungen der Erfindung können auch in Kombination mit existierenden therapeutischen Mitteln zur Behandlung von Osteoarthritis verwendet werden. In Kombination zu verwendende geeignete Mittel umfassen nichtsteroidale entzündungshemmende Mittel (im folgenden als NSAIDs bezeichnet), wie Piroxicam, Diclofenac, Propionsäuren, wie Naproxen, Flubiprofen, Fenoprofen, Ketoprofen und Ibuprofen, Fenamate, wie Mefenamsäure, Indomethacin, Sulindac, Apazon, Pyrazolone, wie Phenylbutazon, Salicylate, wie Aspirin, COX-2-Inhibitoren, wie Celecoxib und Rofecoxib, Analgetika und intraartikuläre Therapeutika, wie Corticosteroide und Hyaluronsäuren, wie Hyalgan und Synvisc.
  • Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können auch in Kombination mit Anti-Krebsmitteln, wie Endostatin und Angiostatin, oder zytotoxischen Arzneimitteln, wie Adriamycin, Daunomycin, cis-Platin, Etoposid, Taxol, Taxotere, und Alkaloiden, wie Vincristin, und Antimetaboliten, wie Methotrexat, verwendet werden.
  • Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können auch in Kombination mit kardiovaskulären Mitteln, wie Calciumkanalblockern, Lipid senkenden Mitteln, wie Stativen, Fibraten, Betablockern, ACE-Inhibitoren, Angiotensin-2-Rezeptorantagonisten und Plättchenaggregationsinhibitoren, verwendet werden.
  • Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können auch in Kombination mit ZNS-Mitteln, wie Antidepressiva (wie Sertralin), Anti-Parkinson-Arzneimitteln (wie Deprenyl, L-Dopa, Requip, Miratex, MAOB-Inhibitoren, wie Selegin und Rasagilin, comP-Inhibitoren, wie Tasmar, A-2-Inhibitoren, Dopamin-Wiederaufnahmeinhibitoren, NMDA-Antagonisten, Nicotinagonisten, Dopaminagonisten und Inhibitoren von neuronaler Stickoxidsynthase) und Anti-Alzheimer-Arzneimitteln, wie Donepezil, Tacrine, COX-2-Inhibitoren, Propentofyllin oder Metryfonat, verwendet werden.
  • Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können auch in Kombination mit Osteoporosemitteln, wie Roloxifen, Droloxifen oder Fosomax, und Immunsuppressiva, wie FK-506 und Rapamycin, verwendet werden.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Die folgenden Reaktionsschemata erläutern die Herstellung der Verbindungen der vorliegenden Erfindung. Falls nicht anders angegeben, sind R1, R2 und R3 und R4 in den folgenden Reaktionsschemata und der folgenden Diskussion wie im vorhergehenden definiert.
  • Reaktionsschema 1
    Figure 00230001
  • Allgemeine Reaktionsbedingungen
  • Bezugnehmend auf Reaktionsschema 1 können Verbindungen der Formel I aus Verbindungen der Formel II durch Entfernen der Hydroxyamid-Schutzgruppe P2, wobei P2 tert-Butyl, Benzyl, 2-Trimethylsilylethyl oder Allyl sein kann, hergestellt werden. Die bevorzugte Schutzgruppe ist 2-Trimethylsilylethyl. Wenn P2 Benzyl ist, wird das Entfernen der Hydroxyamidschutzgruppe durch Hydrogenolyse unter Verwendung von katalytischem Palladium-auf-Bariumsulfat in einem polaren Lösemittel, wie Methanol, bei einer Temperatur von etwa 20°C durchgeführt. Wenn P2 2-Trimethylsilylethyl ist, wird das Entfernen der Hydroxyamidschutzgruppe unter Verwendung von Bortrifluoridetherat in einem inerten Lösemittel, wie Methylenchlorid oder Chloroform, vorzugsweise Methylenchlorid, bei einer Temperatur von etwa 0°C bis etwa 50°C, vorzugsweise etwa 20°C, durchgeführt. Wenn P3 tert-Butyl ist, wird das Entfernen der Schutzgruppe unter Verwendung einer starken Säure, wie Trifluoressigsäure, in einem inerten Lösemittel, wie Methylenchlorid oder Chloroform, vorzugsweise Methylenchlorid, bei einer Temperatur von etwa 0°C bis etwa 50°C, vorzugsweise etwa 20°C, durchgeführt. Wenn P2 Allyl ist, kann das Entfernen der Schutzgruppe durch eine Behandlung mit Tributylzinnhydrid und Essigsäure in Gegenwart von katalytischem bis(Triphenylphosphin)palladium(II)-chlorid durchgeführt werden.
  • Bezugnehmend auf Reaktionsschema 1 können Verbindungen der Formel II aus Carbonsäuren der Formel III durch Reaktion mit einem Hydroxylaminderivat der Formel P2ONH2 in Gegenwart eines Aktivierungsmittels, wie 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid und 1-Hydroxybenztriazol, in einem aprotischen Lösemittel, wie Methylenchlorid oder N,N-Dimethylformamid, vorzugsweise Methylenchlorid, hergestellt werden. Die Reaktion wird bei einer Temperatur von etwa 0°C bis etwa 50°C, vorzugsweise etwa 20°C, durchgeführt. Das Hydroxylamin der Formel P2ONH2 wird vorzugsweise in situ aus einer Salzform, wie dem Hydrochlorid, in Gegenwart einer Base, wie Triethylamin oder Diisopropylethylamin, vorzugsweise Diisopropylethylamin, erzeugt.
  • Die Verbindungen der Formel III können aus Verbindungen der Formel IV durch Entfernen der Carbonsäureschutzgruppe P1, wobei P1 Methyl, Ethyl oder tert-Butyl, vorzugsweise tert-Butyl, ist, hergestellt werden. Wenn P1 Methyl oder Ethyl ist, wird das Entfernen der Schutzgruppe P1 durch Reaktion mit einem Überschuss eines Metallhydroxids, wie Natriumhydroxid oder Lithiumhydroxid, vorzugsweise Lithiumhydroxid, in einem protischen Lösemittel, wie wässriges Ethanol, bei einer Temperatur von etwa 0°C bis etwa 100°C, vorzugsweise etwa 20°C, durchgeführt. In Fällen, in denen die Löslichkeit von IV beschränkt ist, kann Tetrahydrofuran zu dem Reaktionsgemisch als Colösemittel zugesetzt werden. Wenn P1 tert-Butyl ist, wird das Entfernen der Schutzgruppe P1 durch Behandlung mit einer starken Säure, wie Salzsäure oder Trifluoressigsäure, vorzugsweise Trifluoressigsäure, in einem inerten Lösemittel, wie Chloroform oder Methylenchlorid, vorzugsweise Methylenchlorid, durchgeführt. Die Reaktion wird bei einer Temperatur von etwa 0°C bis etwa 50°C, vorzugsweise etwa 20°C, durchgeführt.
  • Die Verbindungen der Formel IV können aus Verbindungen der Formel V durch Hydrieren unter einer Wasserstoffatmosphäre in Gegenwart eines Katalysators in einem reaktionsinerten Lösemittel hergestellte werden. Geeignete Katalysatoren umfassen Palladium-auf-Kohle, Palladiumhydroxid-auf-Kohle oder Palladiumschwarz, vorzugsweise Palladium-auf-Kohle. Geeignete Lösemittel umfassen einen Alkohol, wie Ethanol oder Methanol, vorzugsweise Methanol. Die genannte Reaktion kann bei einem Druck von etwa 1 bis etwa 5 Atmosphären, vorzugsweise etwa 3 Atmosphären, durchgeführt werden. Geeignete Temperaturen für die genannte Reaktion liegen im Bereich von etwa 20°C (Raumtemperatur) bis etwa 60°C, vorzugsweise etwa 20°C.
  • Die Verbindungen der Formel V können aus den Verbindungen der Formel VI durch Reaktion mit einer Base und einem Alkylierungsmittel der Formel R1(CH2)-X, wobei X eine Abgangsgruppe, wie Br, I oder para-Toluolsulfonat, ist, hergestellt werden. Geeignete Basen umfassen Kaliumcarbonat, Cäsiumcarbonat, Kaliumhexamethyldisilazid oder Natriumhydrid, vorzugsweise Kaliumcarbonat. Das Reaktionsgemisch wird in einem polaren Lösemittel, wie Aceton, N,N-Dimethylformamid oder N-Methylpyrrolidin-2-on, bei einer Temperatur von etwa 0°C bis etwa 50°C, vorzugsweise etwa 20°C, gerührt.
  • Die Verbindungen der Formel V, worin R4 (C1-C6)Alkyl ist, können durch Alkylierung von Verbindungen der Formel V, worin R4 Wasserstoff ist, erhalten werden. Die Alkylierung wird durch Reaktion eines Zwischenprodukts der Formel V, worin R4 Wasserstoff ist, mit einem Alkylhalogenid der Formel CH3(CH2)nX, worin n 0 bis 5 ist und X Brom oder Iod ist, durchgeführt. Die genannte Reaktion wird in Gegenwart einer gehinderten starken Base, wie Lithiumdiisopropylamid oder Lithiumhexamethyldisilazid, in einem inerten Lösemittel, wie Diethylether oder Tetrahydrofuran, bei einer Temperatur von etwa –78°C bis etwa 0°C, vorzugsweise etwa –78°C, durchgeführt.
  • Die Verbindungen der Formel VI können aus Verbindungen der Formel VII durch Reaktion mit Benzylchlorformiat in Gegenwart einer Base, wie Triethylamin oder Diisopropylethylamin, vorzugsweise Triethylamin, und einer katalytischen Menge von 4-Dimethylaminopyridin hergestellt werden. Die genannte Reaktion wird in einem Lösemittel, wie Tetrahydrofuran, Methylenchlorid oder Chloroform, vorzugsweise Methylenchlorid, bei einer Temperatur von etwa 0°C bis etwa 20°C, vorzugsweise etwa 20°C, durchgeführt.
  • Die Verbindungen der Formel VII können aus Diaminoverbindungen der Formel VIII durch Reaktion mit Phosgen, Carbonyldiimidazol oder Triphosgen, vorzugsweise Triphosgen, in Gegenwart einer Base, wie Pyridin oder Triethylamin, vorzugsweise Triethylamin, erhalten werden. Die genannte Reaktion wird in einem Lösemittel, wie Tetrahydrofuran, Methylenchlorid oder Chloroform, vorzugsweise Tetrahydrofuran, bei einer Temperatur von etwa 0°C bis etwa 20°C, vorzugsweise etwa 20°C, durchgeführt.
  • Verbindungen der Formel VIII, worin P1 Methyl oder Ethyl ist, R4 Wasserstoff ist und R2 und R3 unabhängig voneinander (C1-C6)Alkyl sind, können aus Ketonen der Formel R2R3CO, worin R2 und R3 unabhängig voneinander (C1-C6)Alkyl sind, erhalten werden. In ähnlicher Weise können Verbindungen der Formel VIII, worin P1 Methyl oder Ethyl ist, R4 Wasserstoff ist und R2 und R3 zusammen einen Spiroring der Formel
    Figure 00270001
    worin X eine Bindung, CH2, O, S, NH oder N(C1-C6)Alkyl bedeutet, n unabhängig voneinander 1 oder 2 ist und m unabhängig voneinander 1 oder 2 ist, bilden, aus cyclischen Ketonen der Formel (IX), worin X eine Bindung, CH2, O, S, NH oder N(C1-C6)Alkyl bedeutet, n unabhängig voneinander 1 oder 2 ist und m unabhängig voneinander 1 oder 2 ist, hergestellt werden.
  • Figure 00280001
  • Die Verfahren sind die gleichen wie die bei Schollkopf et al. für den Fall, dass R2 und R3 Methyl sind, beschriebenen (Liebigs Ann. Chem. 1973, 611 und Liebigs Ann. Chem. 1977, 1183).
  • Verbindungen der Formel VIII, worin R1 Methyl oder Ethyl ist und R3 und R4 Wasserstoff sind, können aus Verbindungen der Formel X:
    Figure 00280002
    worin R3 (C1-C6)Alkyl ist, hergestellt werden. Die Verfahren sind die gleichen wie die bei Mohan et al. für den Fall, dass R3 Isopropyl ist, beschriebenen (J. Med. Chem. 1991, 34, 2404). Mehrere Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel IX sind in der Literatur bekannt, beispielsweise Shin et al., Bull. Chem. Soc. Jpn. 1972, 45, 3595.
  • Die Verbindung der Formel VI, worin P1 tert-Butyl ist und R2, R3 und R4 Wasserstoff sind, ist aus der Literatur als das S-Enantiomer bekannt (Shiba et al., Bull. Chem. Soc. Japan, 1968, 41, 2748). Das entsprechende R-Enantiomer wird gemäß der Beschreibung für das S-Enantiomer hergestellt, wobei N-Benzyloxycarbonyl-D-aspargin anstelle von N-Benzyloxycarbonyl-L-aspargin als Ausgangsmaterial verwendet wird.
  • Die Verbindungen der Formel I, die basischer Natur sind, können eine breite Vielzahl unterschiedlicher Salze mit verschiedenen anorganischen und organischen Säuren bilden. Obwohl derartige Salze zur Verabreichung an Lebewesen pharmazeutisch akzeptabel sein müssen, ist es häufig in der Praxis günstig, zunächst eine Verbindung der Formel I aus dem Reaktionsgemisch als pharmazeutisch nicht-akzeptables Salz zu isolieren und dann einfach das letztere in die Verbindung der freien Base durch Behandlung mit einem alkalischen Reagens zurück umzuwandeln und anschließend die freie Base in ein pharmazeutisch akzeptables Säureadditionssalz umzuwandeln. Die Säureadditionssalze der Baseverbindungen dieser Erfindung werden ohne weiteres durch Behandeln der Baseverbindung mit einer im wesentlichen äquivalenten Menge der gewählten anorganischen oder organischen Säure in einem wässrigen Lösemittelmedium oder in einem geeigneten organischen Lösemittel, wie Methanol oder Ethanol, hergestellt. Bei vorsichtigem Abdampfen des Lösemittels wird das gewünschte feste Salz erhalten.
  • Die Säuren, die zur Herstellung der pharmazeutisch akzeptablen Säureadditionssalze der Baseverbindungen dieser Erfindung verwendet werden, sind diejenigen, die nichttoxische Säureadditionssalze, d. h. Salze, die pharmakologisch akzeptable Anionen enthalten, wie Hydrochlorid-, Hydrobromid-, Hydroiodid-, Nitrat-, Sulfat- oder Bisulfat-, Phosphat- oder saure Phosphat-, Acetat-, Lactat-, Citrat- oder saure Citrat-, Tartrat- oder Bitartrat-, Succinat-, Maleat-, Fumarat-, Gluconat-, Saccharat-, Benzoat-, Methansulfonat- und Pamoat[d. h. 1,1'-Methylen-bis-(2-hydroxy-3-naphthoat)]-Salze, bilden.
  • Die Verbindungen der Formel I, die auch saurer Natur sind, können Basesalze mit verschiedenen pharmakologisch akzeptablen Kationen bilden. Beispiele für derartige Salze umfas sen die Alkalimetall- oder Erdalkalimetallsalze und insbesondere Natrium- und Kaliumsalze. Diese Salze werden alle durch herkömmliche Verfahren hergestellt. Die chemischen Basen, die als Reagentien zur Herstellung der pharmazeutisch akzeptablen Basesalze dieser Erfindung verwendet werden, sind diejenigen, die nichttoxische Basesalze mit den hier beschriebenen sauren Verbindungen der Formel I bilden. Diese nichttoxischen Basesalze umfassen die von pharmakologisch akzeptablen Kationen, wie Natrium, Kalium, Calcium und Magnesium und dgl., abgeleiteten. Diese Salze können ohne weiteres durch Behandeln der entsprechenden Säureverbindungen mit einer wässrigen Lösung, die die gewünschten pharmakologisch akzeptablen Kationen enthält, und anschließendes Eindampfen der gebildeten Lösung zur Trockne, vorzugsweise unter vermindertem Druck, hergestellt werden. Alternativ können sie auch durch Mischen von Niederalkanollösungen der Säureverbindungen und dem gewünschten Alkalimetallalkoxid und anschließendes Eindampfen der gebildeten Lösung zur Trockne in der gleichen Weise wie zuvor hergestellt werden. In jedem der beiden Fälle werden stöchiometrische Mengen der Reagentien vorzugsweise verwendet, um die Vollständigkeit der Reaktion und maximale Produktausbeuten sicherzustellen.
  • Zur Verabreichung an Säuger einschließlich Menschen zur Hemmung von Matrixmetalloproteinasen, zur Hemmung der Produktion von Tumornekrosefaktor (TNF) und beispielsweise zur Hemmung von Säugerreprolysin (vorzugsweise Hemmung von Aggrecanase) kann eine Vielzahl einer Vielzahl herkömmlicher Wege verwendet werden, die oral, parenteral (beispielsweise intravenös, intramuskulär oder subkutan), bukkal, anal und topisch umfassen. Im allgemeinen werden die Verbindungen der Erfindung (im folgenden auch als die aktiven Verbindungen angegeben) in Dosierungsmengen zwischen etwa 0,1 und 25 mg/kg Körpergewicht des zu behandelnden Subjekts pro Tag, vorzugsweise etwa 0,3 bis 5 mg/kg verabreicht. Vorzugsweise wird die aktive Verbindung oral oder parenteral verabreicht. Jedoch erfolgt eine gewisse Variation der Dosierung zwangsläufig in Abhängigkeit vom Zustand des behandelten Subjekts. Die für die Verabreichung verantwortliche Person bestimmt in jedem Fall die passende Dosis für das individuelle Subjekt.
  • Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können in einer breiten Vielzahl unterschiedlicher Dosierungsformen verabreicht werden, wobei im allgemeinen die therapeutisch wirksamen Verbindungen dieser Erfindung in diesen Dosierungsformen in Konzentrationsmengen im Bereich von etwa 5,0 bis etwa 70 Gew.-% vorhanden sind.
  • Zur oralen Verabreichung können Tabletten, die verschiedene Streckmittel, wie mikrokristalline Cellulose, Natriumcitrat, Calciumcarbonat, Dicalciumphosphat und Glycin, enthalten, zusammen mit verschiedenen den Zerfall fördernden Mitteln, wie Stärke (und vorzugsweise Mais-, Kartoffel- oder Tapiokastärke), Alginsäure und bestimmten komplexen Silicaten, zusammen mit Granulationsbindemitteln, wie Polyvinylpyrrolidon, Saccharose, Gelatine und Akaziengummi, verwendet werden. Ferner sind Gleitmittel, wie Magnesiumstearat, Natriumlaurylsulfat und Talkum, häufig für Tablettierungszwecke sehr günstig. Feste Zusammensetzungen einer ähnlichen Art können auch als Füllstoffe in Gelatinekapseln verwendet werden; bevorzugte Materialien in diesem Zusammenhang umfassen ferner Lactose oder Milchzucker sowie Polyethylenglykole mit hohem Molekulargewicht. Wenn wässrige Suspensionen und/oder Elixiere zur oralen Verabreichung gewünscht werden, kann der Wirkstoff mit verschiedenen Süßungs- oder Aromatisierungsmitteln, Farbsubstanzen oder Farbstoffen und, falls gewünscht, auch Emulgatoren und/oder Suspendiermitteln zusammen mit Verdünnungsmitteln, wie Wasser, Ethanol, Propylenglykol, Glycerin, und verschiedenen ähnlichen Kombinationen derselben verwendet werden. Im Falle von Tieren sind sie vorteilhafterweise in einem Tierfuttermittel oder Trinkwasser in einer Konzentration von 5–5000 ppm, vorzugsweise 25–500 ppm, enthalten.
  • Zur parenteralen Verabreichung (intramuskulären, intraperitonealen, subkutanen und intravenösen Verwendung) wird üblicherweise eine sterile injizierbare Lösung des Wirkstoffs hergestellt. Lösungen einer therapeutischen Verbindung der vorliegenden Erfindung in entweder Sesam- oder Erdnussöl oder in wässrigem Propylenglykol können verwendet werden. Die wässrigen Lösungen sollten, falls notwendig, in geeigneter Weise, vorzugsweise auf einen pH-Wert von größer als 8, eingestellt und gepuffert werden, und das flüssige Verdünnungsmittel sollte zunächst isotonisch gemacht werden. Diese wässrigen Lösungen sind für Zwecke einer intravenösen Injektion geeignet. Die öligen Lösungen sind für Zwecke einer intraartikulären, intramuskulären und subkutanen Injektion geeignet. Die Zubereitung all dieser Lösungen unter sterilen Bedingungen wird ohne weiteres durch dem Fachmann bekannte pharmazeutische Standardverfahren erreicht. Im Falle von Tieren können Verbindungen intramuskulär oder subkutan in Dosierungsmengen von etwa 0,1 bis 50 mg/kg/Tag, vorteilhafterweise 0,2 bis 10 mg/kg/Tag, die in einer Einzeldosis oder bis zu drei Teildosen gegeben werden, verabreicht werden.
  • Die aktiven Verbindungen der Erfindung können auch in rektalen Zusammensetzungen, wie Suppositorien oder Retentionsklistieren, die beispielsweise herkömmliche Suppositoriumgrundlagen, wie Kakaobutter oder andere Glyceride, enthalten, formuliert werden. Zur intranasalen Verabreichung oder Verabreichung durch Inhalation werden die aktiven Verbindungen der Erfindung herkömmlicherweise in der Form einer Lösung oder Suspension aus einem Pumpsprühbehälter, der vom Patienten gedrückt oder gepumpt wird, oder als Aerosolspraydarreichung aus einem Druckbehälter oder einer Vernebelungsvorrichtung unter Verwendung eines geeigneten Treibmittels, beispielsweise Dichlordifluormethan, Trichlorfluormethan, Dichlortetrafluorethan, Kohlendioxid oder ein anderes geeignetes Gas, abgegeben. Im Falle eines druckbeaufschlagten Aerosols kann die Dosierungseinheit durch Anbringen eines Ventils zur Abgabe einer abgemessenen Menge bestimmt werden. Der Druckbehälter oder die Vernebelungsvorrichtung können eine Lösung oder Suspension der aktiven Verbindung enthalten. Kapseln und Patronen (die beispielsweise aus Gelatine bestehen) zur Verwendung in einer Inhalationsvorrichtung oder Einblasvorrichtung können so formuliert werden, dass sie ein Pulvergemisch aus einer Verbindung gemäß der Erfindung und einer geeigneten Pulvergrundlage, wie Lactose oder Stärke, enthalten.
  • Die Fähigkeit der Verbindungen der Formel I oder von deren pharmazeutisch akzeptablen Salzen (im folgenden auch als die Verbindungen der vorliegenden Erfindung bezeichnet) zur Hemmung von Metalloproteinasen oder Säugerreprolysin und infolgedessen zum Belegen von deren Wirksamkeit zur Behandlung von Erkrankungen, die durch eine Metalloproteinasen oder die Produktion von Tumornekrosefaktor gekennzeichnet sind, wird durch die folgenden In-vitro-Tests gezeigt.
  • BIOLOGISCHE TESTS
  • Hemmung der Produktion von löslichem TNF
  • Die Fähigkeit der Verbindungen oder pharmazeutisch akzeptablen Salze derselben zur Hemmung der zellulären Produktion/Freisetzung von TNF und infolgedessen Belegen von deren Wirksamkeit zur Behandlung von Erkrankungen, die die Dysregulation von TNF umfassen, wird durch den folgenden In-vitro-Test gezeigt.
  • Verfahren zur Bewertung der Aktivität von rekombinantem TNF-α Converting Enzyme
  • 1) Herstellung von rekombinantem TACE
  • Ein DNA-Fragment mit Codierung für die Signalsequenz, Prodomäne und katalytische Domäne von TACE (Aminosäuren 1–473) wurde durch Polymerasekettenreaktion unter Verwendung einer cDNA-Bibliothek humaner Lunge als Templat amplifiziert. Das amplifizierte Fragment wurde in den Vektor pFastBac kloniert. Die DNA-Sequenz des Inserts wurde für beide Stränge festgestellt. Ein Bacmid, das unter Verwendung von pFastBac in E. coli DH10Bac hergestellt wurde, wurde in SF9-Insektenzellen transfiziert. Die Viruspartikel wurden zu den Stadien P1, P2, P3 amplifiziert. Das P3-Virus wurde sowohl in Sf9- als auch High-Five-Insektenzellen hineininfiziert und 48 h bei 27°C gezüchtet. Das Medium wurde gewonnen und für Tests und zur weiteren Reinigung verwendet.
  • 2) Herstellung eines Substrats mit Fluoreszenzlöschung
  • Ein Modell-Peptid-TNF-α-Substrat (LY-LeucinAlaninGlutaminAlaninValinArgininSerinSerinLysin(CMCTR)-Arginin (LY = Lucifer Yellow; CMTR = 5-Carboxytetramethyl-rhodamin)) wurde hergestellt, und die Konzentration wurde durch die Extinktion bei 560 nm (E560, 60000 M–1cm–1) gemäß dem Verfahren von KF Geoghegan, "Improved method for converting an unmodified peptide to an energy-transfer substrate for a proteinase", Bioconjugate Chem. 7, 385–391 (1995) abgeschätzt. Dieses Peptid umfasst die Spaltungsstelle auf Pro-TNF, die in vivo durch TACE gespalten wird.
  • 3) Enzymreaktion
  • Die Reaktion, die in einer 96-Vertiefungen-Platte (Dynatech) durchgeführt wurde, bestand aus 70 μl einer Pufferlösung (25 mM Hepes-HCl, pH-Wert 7,5, + 20 μM ZnCl2), 10 μl von 100 μM Substrat mit Fluoreszenzlöschung, 10 μl einer DMSO(5%)-Lösung einer Testverbindung und einer Menge des r-TACE-Enzyms, die 50% Spaltung in 60 min bewirkt, in einem Gesamtvolumen von 100 μl. Die Spezifität der Enzymspaltung an der Amidbindung zwischen Alanin und Valin wurde durch HPLC und Massenspektrometrie verifiziert. Die Anfangsraten der Spaltung wurden durch Ermitteln der Zunahmerate der Fluoreszenz bei 530 nm (Anregung bei 409 nm) während 30 min überwacht. Das Experiment wurde wie folgt kontrolliert: 1) hinsichtlich der Hintergrundfluoreszenz des Substrats, 2) hinsichtlich der Fluoreszenz von voll gespaltenem Substrat, 3) hinsichtlich der Fluoreszenzlöschung oder -verstärkung von Testverbindung enthaltenden Lösungen.
  • Die Daten wurden wie folgt analysiert. Die Raten der keine Testverbindung enthaltenden "Kontroll"-Reaktionen wurden gemittelt, um den 100%-Wert zu ermitteln. Die Reaktionsrate in Gegenwart einer Testverbindung wurde mit der in Abwesenheit einer Verbindung verglichen und als Tabelle als "Prozent der keine Testverbindung enthaltenden Kontrolle" angegeben. Die Ergebnisse wurden als "% der Kontrolle" gegen den Logarithmus der Verbindungskonzentration aufgetragen, und der halbmaximale Punkt oder IC50-Wert wurde bestimmt. Der IC50-Wert für den obigen Test ist ein Maß der Hemmung der TNF-α-Proteolyseaktivität von TACE. Die hier verwendete Blockierung der Bindung von TNF-α an TACE entspricht der Beschreibung in US-Patent 5 830 742, erteilt am 3. November 1998.
  • Monocytentest
  • Humane mononukleäre Zellen wurden aus anti-koaguliertem humanem Blut unter Verwendung eines einstufigen Ficoll-Hypaque-Trennverfahrens isoliert. (2) Die mononukleären Zellen wurden dreimal in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) mit zweiwertigen Kationen gewaschen und zu einer Dichte von 2 × 106/ml in 1% BSA enthaltender HBSS resuspendiert. Differentielle Zellraten, die unter Verwendung des Abbott Cell Dyn 3500 Analyzer bestimmt wurden, ergaben, das die Monocyten in diesen Zubereitungen im Bereich von 17 bis 24% der gesamten Zellen lagen.
  • 180 ml der Zellsuspension wurden als Aliquots in 96-Vertiefungen-Platten mit ebenem Boden (Costar) gegeben. Die Zugabe von Verbindungen und LPS (100 ng/ml Endkonzentration) ergab ein Endvolumen von 200 μl. Alle Bedingungen wurden dreifach durchgeführt. Nach 4-stündiger Inkubation bei 37°C in einem befeuchteten CO2-Inkubator wurden die Platten entfernt und zentrifugiert (10 min mit etwa 250 × g) und die Überstände entfernt und auf TNF-α unter Verwendung des R & D Elisa Kit getestet.
  • MMP-Tests
  • Die hier verwendeten Kollagenase-3(Matrixmetalloproteinase-13)-selektiven Inhibitoren bezeichnen Mittel, die eine mindestens 100-fache Selektivität für die Hemmung der Kollagenase-3-Enzymaktivität gegenüber der Kollagenase-1-Enzymaktivität und eine Wirksamkeit von weniger als 100 nM gemäß der Definition durch die IC50-Ergebnisse der im folgenden beschriebenen MMP-13/MMP-1-Fluoreszenztests zeigen. Kollagenase-3-selektive Inhibitoren können durch Screening der Inhibitoren der vorliegenden Erfindung durch die im folgenden beschriebenen MMP-13/MMP-1-Fluoreszenztests und Auswählen der Mittel mit IC50-Verhältnissen der MMP-13/MMP-1-Hemmung von 100 oder größer und einer Wirksamkeit von weniger als 100 nM identifiziert werden.
  • Die hier verwendeten nicht-selektiven Kollagenaseinhibitoren bezeichnen Mittel, die eine weniger als 100-fache Selektivität für die Hemmung der Kollagenase-3-Enzymaktivität gegenüber der Kollagenase-1-Enzymaktivität oder eine Wirksamkeit von mehr als 100 nM gemäß der Definition durch die TC50-Ergebnisse der im folgenden beschriebenen MMP-13/MMP-1-Fluoreszenztests zeigen.
  • Die Fähigkeit von Kollagenaseinhibitoren zur Hemmung der Kollagenaseaktivität ist einschlägig bekannt. Die folgenden Tests können zur Identifizierung von Matrixmetalloproteinaseinhibitoren verwendet werden.
  • Hemmung von humaner Kollagenase (MMP-1)
  • Humane rekombinante Kollagenase wird mit Trypsin unter Verwendung des folgenden Verhältnisses: 10 μg Trypsin pro 100 μg Kollagenase, aktiviert. Trypsin und Kollagenase werden bei Raumtemperatur 10 min inkubiert, und dann wird ein 5-facher Überschuss (50 μg/10 μg Trypsin) eines Soja-Trypsininhibitors zugesetzt.
  • 10-mM-Stammlösungen von Inhibitoren werden in Dimethylsulfoxid hergestellt und dann unter Verwendung des folgenden Schemas verdünnt:
    10 mM → 120 μM → 12 μM → 1,2 μM → 0,12 μM
  • 25 Mikroliter jeder Konzentration werden dann in dreifacher Ausführung in passende Vertiefungen einer 96-Vertiefungen-Mikrofluoreszenzplatte gegeben. Die Endkonzentration des Inhibitors ist nach der Zugabe von Enzym und Substrat eine 1 : 4-Verdünnung. Positive Kontrollen (Enzym, kein Inhibitor) werden in den Vertiefungen D1–D6 eingerichtet und Leerwerte (kein Enzym, keine Inhibitoren) werden in den Vertiefungen D7–D12 eingerichtet.
  • Kollagenase wird auf 400 ng/ml verdünnt und 25 μl werden dann zu passenden Vertiefungen der Mikrofluoreszenzplatte gegeben. Die Endkonzentration von Kollagenase in dem Test beträgt 100 ng/ml.
  • Substrat (DNP-Pro-Cha-Gly-Cys(Me)-His-Ala-Lys(NMA)-NH2) wird als 5-mM-Stammlösung in Dimethylsulfoxid hergestellt und dann in Testpuffer auf 20 mM verdünnt. Der Test wird durch die Zugabe von 50 μl Substrat pro Vertiefung der Mikrofluoreszenzplatte, wobei eine Endkonzentration von 10 μM erhalten wird, initiiert.
  • Fluoerszenzablesungen (360 nm Anregung, 460 nm Emission) werden zum Zeitpunkt 0 und dann in Abständen von 20 min durchgeführt. Der Test wird bei Raumtemperatur mit einer typischen Testdauer von 3 Stunden durchgeführt.
  • Die Fluoreszenz wird dann gegen die Zeit für sowohl die Blindlösung bzw. den Leerwert als auch die Kollagenase enthaltenden Proben aufgetragen (die Daten von Dreifachbestimmungen werden gemittelt). Ein Zeitpunkt, der ein gutes Signal ergibt (der Leerwert) und der auf einem linearen Teil der Probe liegt (üblicherweise um 120 min), wird zur Bestimmung der IC50-Werte gewählt. Der Zeitpunkt 0 wird als Leerwert für jede Verbindung bei jeder Konzentration verwendet, und diese Werte werden von den 120-min-Daten subtrahiert. Die Daten werden als Inhibitorkonzentration gegen % Kontrolle (Inhibitorfluoreszenz geteilt durch die Fluoreszenz von Kollagenase allein × 100) aufgetragen. Die IC50-Werte werden aus der Inhibitorkonzentration, die ein Signal ergibt, das 50% der Kontrolle beträgt, bestimmt.
  • Wenn IC50-Werte als < 0,03 μM angegeben werden, sind die Inhibitoren mit Konzentrationen von 0,3 μM, 0,03 μM, 0,03 μM und 0,003 μM getestet.
  • Hemmung von Gelatinase (MMP-2)
  • Die Hemmung der Gelatinaseaktivität wird unter Verwendung des Dnp-Pro-Cha-Gly-Cys(Me)-His-Ala-Lys(NMA)-NH2-Substrats (10 μM) unter den gleichen Bedingungen wie die Hemmung von humaner Kollagenase (MMP-1) getestet.
  • 72-kD-Gelatinase wird mit 1 mM APMA (p-Aminophenylquecksilber(II)-acetat) 15 h bei 4°C aktiviert und verdünnt, wobei eine Endkonzentration im Test von 100 mg/ml erhalten wird. Die Inhibitoren werden wie zur Hemmung von humaner Kollagenase (MMP-1) verdünnt, wobei Endkonzentrationen im Test von 30 μM, 3 μM, 0,3 μM und 0,03 μM erhalten werden. Jede Konzentration wird in dreifacher Ausführung hergestellt.
  • Fluoreszenzablesungen (360 nm Anregung, 460 nm Emission) werden zum Zeitpunkt 0 und dann in Abständen von 20 min während 4 h durchgeführt.
  • Die IC50-Werte werden entsprechend der Hemmung von humaner Kollagenase (MMP-1) bestimmt. Wenn IC50-Werte von weniger als 0,03 μM angegeben werden, werden die Inhibitoren mit Endkonzentrationen von 0,3 μM, 0,03 μM, 0,003 μM und 0,003 μM getestet.
  • Hemmung von Stromelysinaktivität (MMP-3)
  • Die Hemmung der Stromelysinaktivität basiert auf einem modifizierten spektrophotometrischen Test gemäß der Beschreibung bei Weingarten und Feder (H. Weingarten und J. Feder, Spectrophotometric Assay for Vertebrate Collagenase, Anal. Biochem. 147, 437–440 (1985)). Die Hydrolyse des Thiopeptolidsubtrats [Ac-Pro-Leu-Gly-SCH[CH2CH(CH3)2]CO-Leu-Gly-OC2H5] ergibt ein Mercaptanfragment, das in Gegenwart von Ellman-Reagens überwacht werden kann.
  • Humanes rekombinantes Prostromelysin wird mit Trypsin unter Verwendung eines Verhältnisses von 1 μl einer 10 mg/ml Trypsinstammlösung pro 26 mg Stromelysin aktiviert. Trypsin und Stromelysin werden 15 min bei 37°C inkubiert und anschließend mit 10 μl eines 10 μg/ml Soja-Trypsininhibitors 10 min bei 37°C inkubiert, um die Trypsinaktivität zu quenchen.
  • Die Tests werden in einem Gesamtvolumen von 250 ml eines Testpuffers (200 mM Natriumchlorid, 50 mM MES und 10 mM Calciumchlorid, pH-Wert 6,0) in 96-Vertiefungen-Mikrotiterplatten durchgeführt. Aktiviertes Stromelysin wird in Testpuffer auf 25 μg/ml verdünnt. Ellman-Reagens (3-Carboxy-4-nitrophenyldisulfid) wird als 1 M Stammlösung in Dimethylformamid hergestellt und auf 5 mM in Testpuffer verdünnt, wobei 50 ml pro Vertiefung eine Endkonzentration von 1 mM ergeben.
  • 10 mM Stammlösungen von Inhibitoren werden in Dimethylsulfoxid hergestellt und reihenmäßig in Testpuffer derart verdünnt, dass die Zugabe von 50 μl zu den passenden Vertiefungen Endkonzentrationen von 3 μM, 0,3 μM, 0,003 μM und 0,0003 μM ergibt. Alle Bedingungen werden in dreifacher Ausführung durchgeführt.
  • Eine 300 mM Dimethylsulfoxid-Stammlösung des Peptidsubstrats wird auf 15 mM in Testpuffer verdünnt, und der Test wird durch Zugabe von 50 μl zu jeder Vertiefung, wobei eine Endkonzentration von 3 mM Substrat erhalten wird, initiiert. Leerwerte bestehen aus dem Peptidsubstrat und Ellman- Reagens ohne das Enzym. Die Produktbildung wurde bei 405 nm mit einem Molecular Devices UVmax Plate Reader überwacht.
  • Die IC50-Werte wurden in der gleichen Weise wie für Kollagenase bestimmt.
  • Hemmung von MMP-13
  • Humane rekombinante MMP-13 wird mit 2 mM APMA (p-Aminophenylquecksilber(II)-acetat) 1,5 h bei 37°C aktiviert und auf 400 mg/ml in Testpuffer (50 mM Tris, pH-Wert 7,5, 200 mM Natriumchlorid, 5 mM Calciumchlorid, 20 μM Zinkchlorid, 0,02% Brij) verdünnt. 25 Mikroliter verdünntes Enzym werden pro Vertiefung einer 96-Vertiefungen-Mikrofluoreszenzplatte zugegeben. Das Enzym wird dann auf ein 1 : 4-Verhältnis in dem Test durch die Zugabe von Inhibitor und Substrat verdünnt, wobei eine Endkonzentration in dem Test von 100 mg/ml erhalten wird.
  • 10 mM Stammlösungen von Inhibitoren werden in Dimethylsulfoxid hergestellt und dann in Testpuffer gemäß dem Inhibitorverdünnungsschema zur Hemmung von humaner Kollagenase (MMP-1) verdünnt: 25 Mikroliter jeder Konzentration werden in dreifacher Ausführung zu der Mikrofluoreszenzplatte gegeben. Die Endkonzentrationen in dem Test sind 30 μM, 3 μM, 0,3 μM und 0,03 μM.
  • Substrat (Dnp-Pro-Cha-Gly-Cys(Me)-His-Ala-Lys(NMA)-NH2) wird wie zur Hemmung von humaner Kollagenase (MMP-1) hergestellt, und 50 ml werden zu jeder Vertiefung gegeben, wobei eine Endtestkonzentration von 10 μM erhalten wird, Fluoreszenzablesungen (360 nM Anregung, 450 Emission) werden zum Zeitpunkt 0 und alle 5 min während 1 h durchgeführt.
  • Positive Kontrollen bestehen aus Enzym und Substrat ohne Inhibitor, und Blindlösungen bzw. Leerwerte bestehen nur aus Substrat.
  • Die IC50-Werte werden gemäß der Hemmung von humaner Kollagenase (MMP-1) bestimmt. Wenn IC50-Werte von weniger als 0,03 μM angegeben werden, werden die Inhibitoren dann mit Endkonzentrationen von 0,3 μM, 0,03 μM, 0,003 μM und 0,0003 μM getestet.
  • Kollagenfilm-MMP-13-Test
  • Typ-I-Kollagen von Ratten wird mit 14C-Acetanhydrid radioaktiv markiert (T. E. Cawston und A. J. Barrett, Anal. Biochem., 99, 340–345 (1979)) und zur Herstellung von 96-Vertiefungen-Platten, die radioaktiv markierte Kollagenfilme enthalten, verwendet (Barbara Johnson-Wint, Anal. Biochem., 104, 175–181 (1980)). Wenn eine Kollagenase enthaltende Lösung zu der Vertiefung gegeben wird, spaltet das Enzym das unlösliche Kollagen, das sich entspiralisiert und daher solubilisiert wird. Die Kollagenaseaktivität ist direkt proportional der Menge des solubilisierten Kollagens, die durch den Anteil der in dem Überstand freigesetzten Radioaktivität, die in einem Standardszintillationszähler ermittelt wurde, bestimmt wurde. Kollagenaseinhibitoren sind daher Verbindungen, die die freigesetzten radioaktiven Zählmengen gegenüber Kontrollen, bei denen kein Inhibitor vorhanden ist, verringern. Eine spezielle Ausführungsform dieses Tests wird im folgenden detailliert beschrieben.
  • Zur Bestimmung der Selektivität von Verbindungen für MMP-13 gegenüber MMP-1 unter Verwendung von Kollagen als Substrat wird das folgende Verfahren verwendet. Rekombinantes humanes pro-MMP-13 oder pro-MMP-1 wird gemäß den oben angegebenen Verfahren aktiviert. Das aktivierte MMP-13 oder MMP-1 wird mit Puffer (50 mM Tris, pH-Wert 7,5, 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 μM ZnCl2, 0,05% Brij-35, 0,02% Natriumazid) auf 0,6 μg/ml verdünnt.
  • Stammlösungen einer Testverbindung (10 mM) in Dimethylsulfoxid werden hergestellt. Verdünnungen der Testverbindungen in dem obigen Tris-Puffer werden mit 0,2, 2,0, 20, 200, 2000 und 20000 nM hergestellt.
  • 100 μl einer passenden Arzneimittelverdünnung und 100 μl des verdünnten Enzyms werden in Vertiefungen einer 96-Vertiefungen-Platte, die mit 14C-Kollagen markierte Kollagenfilme enthalten, pipettiert. Die Endenzymkonzentration beträgt 0,3 μg/ml, während die Endarzneimittelkonzentration 0,1, 1,0, 10, 100, 1000 nM beträgt. Jede Arzneimittelkonzentration und Kontrolle wird dreifach analysiert. Dreifache Kontrollen werden ebenfalls für die Bedingungen, bei denen kein Enzym vorhanden ist, und für Enzym unter Abwesenheit jeder Verbindung durchgeführt.
  • Die Platten werden bei 37°C über einen derartigen Zeitraum, dass etwa 30–50% des verfügbaren Kollagens solubilisiert wird – was durch Zählen zusätzlicher Kontrollvertiefungen zu verschiedenen Zeitpunkten bestimmt wird –, inkubiert. In den meisten Fällen ist eine Inkubation von etwa 9 Stunden erforderlich. Wenn der Test ausreichend fortgeschritten ist, wird der Überstand von jeder Vertiefung entfernt und in einem Szintillationszähler gezählt. Die Hintergrundzählraten (die durch die Zählraten in den Vertiefungen ohne Enzym bestimmt wurden) werden von jeder Probe subtrahiert und die prozentuale Freisetzung wird in Bezug auf die Vertiefungen mit nur Enzym und ohne Inhibitor berechnet. Die dreifachen Werte für jeden Punkt werden gemittelt und die Daten werden als prozentuale Freisetzung gegen die Arzneimittelkonzentration als Diagramm angegeben. Die IC50-Werte werden ausgehend von dem Punkt, an dem eine 50%-ige Hemmung der Freisetzung von radioaktiv markiertem Kollagen erhalten wird, bestimmt.
  • Zur Bestimmung der Identität der aktiven Kollagenasen in konditioniertem Knorpelmedium wurden Tests unter Verwendung von Kollagen als Substrat, konditioniertem Knorpelmedium, das Kollagenaseaktivität enthielt, und Inhibitoren variierender Selektivität durchgeführt. Das konditionierte Knorpelmedium wurde während eines Zeitraums, in dem ein Kollagenabbau erfolgte, gewonnen und es ist daher für die für den Kollagenabbau verantwortlichen Kollagenasen repräsentativ. Tests wurden wie oben angegeben durchgeführt, wobei jedoch anstelle von rekombinantem MMP-13 oder rekombinantem MMP-1 konditioniertes Knorpelmedium die Enzymquelle war.
  • IL-1-induzierter Knorpelkollagenabbau von Rindernasenknorpel
  • Dieser Test verwendet Rindernasenknorpelexplantate, die üblicherweise zum Testen der Wirksamkeit von verschiedenen Verbindungen zur Hemmung von entweder IL-1-induziertem Proteoglykanabbau oder IL-1-induziertem Kollagenabbau verwendet werden. Rindernasenknorpel ist einem Gelenkknorpel sehr ähnliches Gewebe, d. h. Chondrocyten, die von einer Matrix, die primär aus Typ-II-Kollagen und Aggrecan besteht, umgeben sind. Das Gewebe wird verwendet, da es: (1) Gelenkknorpel sehr ähnlich ist, (2) problemlos erhältlich ist, (3) relativ homogen ist und (4) nach IL-I-Stimulation mit vorhersagbarer Kinetik abgebaut wird.
  • Zwei Variationen dieses Tests wurden zum Testen von Verbindungen verwendet. Beide Variationen ergeben ähnliche Daten. Die zwei Variationen werden im folgenden beschrieben:
  • Variation 1
  • Drei Pfropfen aus Rindernasenknorpel (etwa 2 mm Durchmesser × 1,5 mm Länge) werden in jede Vertiefung einer 24-Vertiefungen-Gewebekulturplatte gegeben. 1 ml serumfreies Medium wird dann zu jeder Vertiefung gegeben. Verbindungen werden als 10 mM Stammlösungen in DMSO hergestellt und dann in serumfreiem Medium in passender Weise auf Endkonzentrationen, beispielsweise 50, 500 und 5000 nM, verdünnt. Jede Konzentration wird in dreifacher Ausführung getestet.
  • Humanes rekombinantes IL-1α (5 ng/ml) (IL-1) wird in dreifache Kontrollvertiefungen und in jede Arzneimittel enthaltende Vertiefung gegeben. Dreifache Kontrollvertiefungen werden ebenfalls eingerichtet, zu denen weder Arzneimittel noch IL-1 gegeben wird. Das Medium wird entfernt und frisches Medium, das IL-1 und die entsprechenden Arzneimittelkonzentrationen enthält, wird an den Tagen 6, 12, 18 und 24 oder, falls notwendig, alle 3–4 Tage, zugesetzt. Das zum jeweiligen Zeitpunkt entfernte Medium wird bei –20°C für eine spätere Analyse aufbewahrt. Wenn der Knorpel in den Vertiefungen mit nur IL-1 fast vollständig resorbiert ist (etwa am Tag 21), wird das Experiment beendet. Das Medium wird entfernt und aufbewahrt. Aliquots (100 μl) von jeder Vertiefung zu jedem Zeitpunkt werden gepoolt, mit Papain verdaut und dann auf den Hydroxyprolingehalt analysiert. Das Hintergrund-Hydroxyprolin (Mittelwert von Vertiefungen ohne IL-1 und ohne Arzneimittel) wird von jedem Datenpunkt abgezogen, und der Mittelwert wird für jede Dreifachbestimmung berechnet. Die Daten werden dann als Prozentsatz des Mittelwerts von nur IL-1 ausgedrückt und aufgetragen. Der IC50-Wert wird aus dieser Auftragung bestimmt.
  • Variation 2
  • Die Versuchseinrichtung ist die gleiche wie oben bei Varia tion 1 angegeben, bis zum Tag 12. Am Tag 12 wird das konditionierte Medium aus jeder Vertiefung entnommen und eingefroren. Dann wird 1 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), die 0,5 μg/ml Trypsin enthält, zu jeder Vertiefung gegeben, und die Inkubation wird weitere 48 h bei 37°C fortgesetzt. Nach 48-stündiger Inkubation in Trypsin wird die PBS-Lösung entfernt. Aliquots (50 μl) der PBS/Trypsin-Lösung und der vorherigen zwei Zeitpunkte (Tag 6 und 12) werden gepoolt, hydrolysiert, und der Hydroxyprolingehalt wird bestimmt. Das Hintergrund-Hydroxyprolin (Mittelwert von Vertiefungen ohne IL-1 und ohne Arzneimittel) wird von jedem Datenpunkt abgezogen, und der Mittelwert wird für jede Dreifachbestimmung berechnet. Die Daten werden dann als Prozentsatz des Mittelwerts von IL-1 allein ausgedrückt und aufgetragen. Der IC50-Wert wird aus dieser Auftragung bestimmt. Bei dieser Variation wird der Zeitverlauf des Experiments beträchtlich verkürzt, Die Zugabe von Trypsin während 48 h nach einer IL-1-Stimulation von 12 Tagen setzt wahrscheinlich etwaiges Typ-II-Kollagen, das durch Kollagenaseaktivität geschädigt wurde, jedoch aus der Knorpelmatrix noch nicht freigesetzt wurde, frei. Bei nicht vorhandener IL-1-Stimulation ergibt eine Trypsinbehandlung nur niedrige Hintergrundmengen eines Kollagenabbaus in den Knorpelexplantaten.
  • Hemmung von humaner 92-kD-Gelatinase (MMP-9)
  • Die Hemmung von 92-kD-Gelatinase(MMP-9)-Aktivität wird unter Verwendung des Mca-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-NH2-Substrats (10 μM) unter ähnlichen Bedingungen, wie sie oben für die Hemmung von humaner Kollagenase (MMP-1) beschrieben wurde, getestet.
  • Humane rekombinante 92-kD-Gelatinase (MMP-9, Gelatinase B) wird 2 h mit 1 mM p-Aminophenyl-quecksilber(II)-acetat (aus einer frisch hergestellten 100 mM Stammlösung in 0,2 N NaOH) bei 37°C aktiviert.
  • 10 mM Dimethylsulfoxid-Stammlösungen von Inhibitoren werden reihenmäßig in Testpuffer (50 mM Tris, pH-Wert 7,5, 200 mM NaCl, 5 mM CaCl2, 20 μM ZnCl2, 0,02% Brij-35 (Vol/Vol)) unter Verwendung des im folgenden angegebenen Schemas verdünnt:
    10 mM → 120 μM → 12 μM → 1,2 μM → 0,12 μM
  • Weitere Verdünnungen werden nach Bedarf gemäß diesem Schema durchgeführt. Ein Minimum von vier Inhibitorkonzentrationen für jede Verbindung wird bei jedem Test durchgeführt. 25 μl jeder Konzentration werden dann zu dreifachen Vertiefungen einer schwarzen 96-Vertiefungen-Mikrofluoreszenzplatte mit U-förmigem Boden gegeben. Da das Endtestvolumen 100 μl beträgt, sind die Endkonzentrationen eines Inhibitors das Ergebnis einer weiteren 1 : 4-Verdünnung (d. h. 30 μM, → 3 μM → 0,3 μM → 0,03 μM und dgl.). Ein Leerwert (kein Enzym, kein Inhibitor) und eine positive Enzymkontrolle (mit Enzym, kein Inhibitor) werden ebenfalls in dreifacher Ausführung hergestellt.
  • Aktiviertes Enzym wird auf 100 ng/ml in Testpuffer verdünnt, 25 μl pro Vertiefung werden zu entsprechenden Vertiefungen der Mikroplatte gegeben. Die Endenzymkonzentration im Test beträgt 25 ng/ml (0,27 nM).
  • Eine 5 mM Dimethylsulfoxid-Stammlösung des Substrats (Mca-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-NH2) wird in Testpuffer auf 20 μM verdünnt. Der Test wird durch Zugabe von 50 μl eines verdünnten Substrats initiiert, wobei eine Endtestkonzentration von 10 μM Substrat erhalten wird. Eine Fluoreszenzablesung zum Zeitpunkt 0 (320 Anregung, 390 Emission) wird unmittelbar durchgeführt, und anschließende Ablesungen wer den alle 15 min bei Raumtemperatur mit einem PerSeptive Biosystems CytoFluor Multi-Well Plate Reader mit Verstärkung bei 90 Einheiten durchgeführt.
  • Der Mittelwert der Fluoreszenz des Enzyms und des Leerwerts werden gegen die Zeit aufgetragen. Ein früher Zeitpunkt auf dem linearen Teil dieser Kurve wird für IC50-Bestimmungen gewählt. Der Zeitpunkt 0 für jede Verbindung bei jeder Verdünnung wird von dem letzteren Zeitpunkt abgezogen, und die Daten werden dann als Prozent der Enzymkontrolle ausgedrückt (Inhibitorfluoreszenz geteilt durch die Fluoreszenz der positiven Enzymkontrolle × 100). Die Daten werden als Inhibitorkonzentration gegen Prozent der Enzymkontrolle aufgetragen. Die IC50-Werte werden als die Inhibitorkonzentration, die ein Signal ergibt, das 50% der positiven Enzymkontrolle ist, definiert.
  • Aggrecanasetest
  • Primäre Schweinechondrocyten aus Gelenkknorpel werden durch aufeinanderfolgende Trypsin- und Kollagenaseverdauung und anschließende Kollagenaseverdauung über Nacht isoliert und mit 2 × 105 Zellen pro Vertiefung in 48-Vertiefungen-Platten mit 5 μCi/ml 35S (1000 Ci/mmol) Schwefel in mit Typ-I-Kollagen beschichteten Platten ausplattiert. Die Zellen können Markierung in deren Proteoglykanmatrix (etwa 1 Woche) bei 37°C unter einer Atmosphäre von 5% CO2 einbauen.
  • Eine Nacht vor dem Initiieren des Tests werden Chondrocytenmonoschichten zweimal in DMEM/1% PSF/G gewaschen und dann über Nacht in frischem DMEM/1% FBS inkubiert.
  • Am folgenden Morgen werden die Chondrocyten einmal in DMEM/1% PSF/G gewaschen. Die letzte Waschflüssigkeit kann auf den Platten im Inkubator während der Durchführung von Verdünnungen verbleiben.
  • Medien und Verdünnungen können wie in der folgenden Tabelle beschrieben hergestellt werden.
  • Figure 00490001
  • Die Platten werden markiert und nur die inneren 24 Vertiefungen der Platte werden verwendet. Auf einer der Platten werden mehrere Spalten für IL-1 (kein Arzneimittel) und Kontrolle (kein IL-1, kein Arzneimittel) bestimmt. Diese Kontrollspalten werden periodisch zur Überwachung der 355-Proteoglykanfreisetzung gezählt. Kontrolle und IL-1-Medium werden zu den Vertiefungen gegeben (450 μl), und anschließend wird eine Verbindung zugegeben (50 μl), um den Test zu initiieren. Die Platten werden bei 37°C mit einer Atmosphäre mit 5% CO2 inkubiert.
  • Bei einer Freisetzung von 40–50% (wenn cpm von IL-1-Medium die 4–5-fache Menge vom Kontrollmedium ist), was durch Flüssigszintillationszählung (LSC) von Mediumproben getestet wird, wird der Test beendet (9–12 h). Das Medium wird von allen Vertiefungen entfernt und in Szintillationsröhrchen gegeben. Szintillat wird zugesetzt und die Radioaktivitätszählrate wird erhalten (LSC). Um Zellschichten zu solubilisieren, werden 500 μl Papain-Verdauungspuffer (0,2 M Tris, pH-Wert 7,0, 5 mM EDTA, 5 mM DTT und 1 mg/ml Papain) zu jeder Vertiefung gegeben. Platten mit Verdauungslösung werden bei 60°C über Nacht inkubiert. Die Zellschicht wird am nächsten Tag von den Platten entfernt und in Szintillationsröhrchen gegeben. Szintillat wird dann zugesetzt, und die Proben werden gezählt (LSC).
  • Der Prozentsatz der freigesetzten Zählratenmenge von der in jeder Vertiefung insgesamt vorhandenen wird bestimmt. Die Mittelwerte der Dreifachbestimmungen werden bestimmt, wobei der Kontrollhintergrund von jeder Vertiefung abgezogen wird. Der Prozentsatz der Verbindungshemmung basiert auf IL-1-Proben als 0% Hemmung (100% Gesamtzählrate).
  • Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung, die getestet wurde, besaßen einen IC50-Wert von weniger als 1 μM, vorzugsweise weniger als 50 nM in mindestens einem der oben beschriebenen Tests. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung besitzen ferner unterschiedliche Aktivität (d. h. sie sind selektiv) für eine oder mehrere Typen von Reprolysin oder MMP. Die hier verwendete Selektivität bezeichnet das Verhältnis der IC50-Hemmergebnisse nach zwei oder mehreren der obigen Protokolle. Verbindungen gemäß der Erfindung, die selektiv sind, besitzen ein Verhältnis von min destens 10. Die Verbindungen gemäß der Erfindung, die die gewünschte Wirksamkeit oder Selektivität besitzen, können durch Testen einer Verbindung (üblicherweise ein kleines Molekül, zweckmäßigerweise eine Hydroxamsäure, vorzugsweise eine Verbindung der Formel I) gemäß den im vorhergehenden beschriebenen Protokollen und Bestimmen der IC50- und Selektivitätsverhältnisse identifiziert werden.
  • Eine Gruppe bevorzugter Verbindungen (stärker bevorzugt Verbindungen der Formel I), die durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung identifiziert werden können, umfasst diejenigen Inhibitoren, die eine selektive Aktivität gegenüber MMP-13 über die von MMP-1 hinaus, (vorzugsweise einen IC50-Wert von weniger als 500 nM, stärker bevorzugt 100 nM, am stärksten bevorzugt 50 nM) für MMP-13 mit einer mindestens 10-fach, vorzugsweise 40-fach höheren Selektivität für MMP-13 als für MMP-1 besitzen.
  • HERSTELLUNG VON VERBINDUNGEN
  • Die folgenden Beispiele erläutern die Herstellung der Verbindungen der vorliegenden Erfindung. Die Schmelzpunkte sind unkorrigiert. Die NMR-Daten sind in parts per million (δ) angegeben. Handelsübliche Reagentien werden ohne weitere Reinigung verwendet. Chromatographie bezeichnet Säulenchromatographie, die unter den Bedingungen der Verwendung von Silicagel von 32–63 mm und unter Stickstoffdruck (Flashchromatographie) durchgeführt wird. Raum- oder Umgebungstemperatur bezeichnet 20–25°C. Alle nichtwässrigen Reaktionen wurden günstigerweise und zur Maximierung der Ausbeuten unter Stickstoffatmosphäre durchgeführt.
  • Beispiel 1
  • (4R)-1-[4-(4-Fluorphenoxy)benzyl]-2-oxo-imidazolidin-4-carbonsäurehydroxyamid
  • a) (4R)-3-[4-(4-Fluorphenoxy)benzyl)-2-oxo-imidazolidin-1,5-dicarbonsäure-1-benzylester-5-tert-butylester
  • Zu einer Lösung von (4R)-Oxo-imidazolidin-1,5-dicarbonsäure-1-benzylester-5-tert-butylester (650 mg, 2,0 mmol) in Aceton (10 ml) wurden pulverförmiges K2CO3 (550 mg) und 4-(4-Fluorphenoxy)benzylbromid (1,85 g, 6,6 mmol) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 6 Tage bei Raumtemperatur gerührt, und dann wurde das Lösemittel abgedampft. Der Rückstand wurde in Ethylacetat aufgenommen und mit Wasser und Kochsalzlösung gewaschen. Nach dem Trocknen über MgSO4 wurde das Lösemittel abgedampft. Die Titelverbindung (820 mg, 78%) wurde aus dem Rückstand durch Chromatographie auf Silicagel unter Elution mit Chloroform isoliert.
  • b) (4R)-1-[4-(4-Fluorphenoxy)benzyl]-2-oxo-imidazolidin-4-carbonsäure-tert-butylester
  • Eine Lösung von (4R)-3-[4-(4-Fluorphenoxy)benzyl]-2-oxo-imidazolidin-1,5-dicarbonsäure-1-benzylester-5-tert-butylester (1,1 g, 2,1 mmol) in Methanol (100 ml) wurde über 10% Pd-auf-Kohle (110 mg) bei 3 atm Druck 6 h hydriert. Nach Entfernen des Katalysators durch Filtration über ein Nylonfilter mit Poren von 0,45 μm wurde das Lösemittel abgedampft, wobei die Titelverbindung (810 mg, 100%) als gelber Feststoff erhalten wurde.
  • c) (4R)-1-[4-(4-Fluorphenoxy)benzyl]-2-oxo-imidazolidin-4-carbonsäure
  • Eine Lösung von (4R)-1-[4-(4-Fluorphenoxy)benzyl]-2-oxo-imidazolidin-4-carbonsäure-tert-butylester (810 mg, 1,56 mmol) in CH2Cl2 (8 ml) wurde mit Trifluoressigsäure (8 ml) behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde 2,5 h bei Raumtemperatur gerührt und eingeengt, wobei ein Öl zurückblieb. Die Titelverbindung, ein weißer Feststoff (297 mg, 58%), wurde durch Filtration gewonnen, nachdem das Öl mit einem Gemisch von warmem Diethylether und Hexan verrieben wurde.
  • d) (4R)-1-[4-(4-Fluorphenoxy)benzyl]-2-oxo-imidazolidin-4-carbonsäure-(2-trimethylsilanylethoxy)amid
  • Zu einer Lösung von (4R)-1-[4-(4-Fluorphenoxy)benzyl]-2-oxo-imidazolidin-4-carbonsäure (120 mg, 0,36 mmol) in Methylenchlorid (5 ml) wurden nacheinander 1-Hydroxybenztriazol (73 mg, 0,54 mmol), Diisopropylethylamin (0,13 ml, 0,75 mmol), O-(2-Trimethylsilylethyl)hydroxylaminhydrochlorid (92 mg, 0,54 mmol) und 1-[3-(Dimethylamino)propyl]-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid (104 mg, 0,54 mmol) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 16 h bei Raumtemperatur gerührt und dann mit Methylenchlorid und Wasser verdünnt. Die organische Phase wurde nacheinander mit wässriger 1 M HCl-Lösung, Wasser, wässriger gesättigter NaHCO3-Lösung und Kochsalzlösung gewaschen. Nach dem Trocknen über MgSO4 wurde die Lösung zu einem Öl eingeengt. Die Titelverbindung, ein Öl (85 mg, 53%) wurde durch Chromatographie auf Silicagel unter Elution mit Ethylacetat isoliert.
  • e) (4R)-1-[4-(4-Fluorphenoxy)benzyl]-2-oxo-imidazolidin-4-carbonsäure-hydroxyamid
  • Zu einer Lösung von (4R)-1-[4-(4-Fluorphenoxy)benzyl]-2-oxo-imidazolidin-4-carbonsäure-(2-trimethylsilanylethoxy)amid (85 mg, 0,19 mmol) in Methylenchlorid (5 ml) wurde Bortrifluorid-etherat (0,073 ml, 0,58 mmol) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 1,5 h bei Raumtemperatur gerührt und dann durch Zugabe einer wässrigen gesättigten NH4Cl-Lösung gequencht. Das Gemisch wurde mit Wasser und Ethylacetat verdünnt, und die organische Phase wurde mit Kochsalzlösung gewaschen, über MgSO4 getrocknet und zu einem weißen Feststoff eingeengt. Die Titelverbindung (31 mg, 47%) wurde durch Umkristallisieren aus einem Gemisch von Ethylacetat und Methanol isoliert.
    1H-NMR (DMSO-d6): δ 10,63 (br s, 1H), 8,93 (br, s, 1H), 7,23–7,17 (m, 4H), 7,05–7,01 (m, 2H), 6,92 (d, J = 8,7 Hz, 2H), 6,76 (s, 1H), 4,22 (d, J = 15,2 Hz, 1H), 4,15 (d, J = 15,2 Hz, 1H), 3,92–3,89 (m, 1H), 3,40 (scheinbar t, J = 9,1 Hz, 1H), 3,15–3,12 (m, 1H). MS m/z 344 (M – 1).
    Analyse berechnet für C19H16FN3O4: C, 59,13; H, 4,67; 12,17. Gefunden: C, 58,98; H, 4,83; N, 12,10.
  • Beispiel 2
  • (4R)-1-[4-(Naphthalin-1-yloxy)benzyl]-2-oxo-imidazolidin-4-carbonsäurehydroxyamid
    • MS m/z 376 (M – 1). Analyse berechnet für C21H19N3O4: C, 66,83; H, 5,07; N 11,13. Gefunden: C, 66,75; H, 5,30; N, 11,13.
  • Beispiel 3
  • (4R)-1-[4-(Naphthalin-2-yloxy)benzyl]-2-oxo-imidazolidin-4-carbonsäurehydroxyamid
    • MS m/z 376 (M – 1). Analyse berechnet für C21H19N3O4 + 0,5H2O: C, 65,28; H, 5,22; N 10,87. Gefunden: C, 65,01; H, 5,12; N, 11,28.
  • Beispiel 4
  • (4R)-1-(4-Methoxybenzyl)-2-oxo-imidazolidin-4-carbonsäurehydroxyamid
    • Fp 130–133 C. MS m/z 264 (M – 1). Analyse berechnet für C12H15N3O4: C, 54,33; H, 5,70; N 15,84. Gefunden: C, 54,24; H, 51,77; N, 15,62.
  • Beispiel 5
  • (4R)-1-[3-(4-Fluorphenoxy)benzyl]-2-oxo-imidazolidin-4-carbonsäurehydroxyamid
    • MS m/z 344 (M – 1). Analyse berechnet für C19H16N3O4: C, 59,13; H, 4,67; N 12,17. Gefunden: C, 59,24; H, 4,60; N, 12,42.
  • Beispiel 6
  • (4R)-1-Naphthalin-2-ylmethyl-2-oxo-imidazolidin-4-carbonsäurehydroxyamid
    • MS m/z 284 (M – 1). Analyse berechnet für C15H15N3O3: C, 63,15; H, 5,30; N 14,73. Gefunden: C, 62,82; H, 5,32; N, 14,49.
  • Beispiel 7
  • (4R)-1-(4'-Fluorbiphenyl-4-ylmethyl)-2-oxo-imidazolidin-4-carbonsäurehydroxyamid
    • MS m/z 328 (M – 1). Analyse berechnet für C17H16FN3O3 + 0,5H2O: C, 60,35; H, 5,06; N 12,42. Gefunden: C, 60,43; H, 4,99; N, 12,83.
  • Beispiel 8
  • (4R)-1-(4-Benzyloxybenzyl)-2-oxo-imidazolidin-4-carbonsäurehydroxyamid
    • MS m/z 340 (M – 1). Analyse berechnet für C18H19N3O4: C, 63,33; H, 5,61; N 12,31. Gefunden: C, 63,13; H, 5,62; N, 12,28.
  • Beispiel 9
  • (4R)-1-[4-(2-Chlor-4-fluorbenzyloxy)benzyl]-2-oxo-imidazolidin-4-carbonsäurehydroxyamid
    • MS m/z 392, 394 (M – 1). Analyse berechnet für C18H17ClFN3O4 + 0,5H2O: C, 53,67; H, 4,50; N, 10,43. Gefunden: C, 53,78; H, 4,51; N, 10,15.

Claims (18)

  1. Verbindung gemäß der Formel (1)
    Figure 00560001
    oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz oder Solvat derselben, worin R1 (C6-C10)Aryl, (C1-C9)Heteroaryl, (C6-C10 Aryl(C1-C6)alkyl, (C1-C9)Heteroaryl(C1-C6)alkyl, (C6-C10)Aryl(C6-C10)aryl, (C1-C9)Heteroaryl(C6-C10)aryl, (C6-C10)Aryl(C1-C9)heteroaryl, (C1-C9)Heteroaryl(C1-C9)heteroaryl, (C6-C10)Aryloxy(C6-C10)aryl, (C1-C9)Heteroaryloxy(C6-C10)aryl, (C6-C10)Aryloxy(C1-C9)heteroaryl, (C1-C9)Heteroaryloxy(C6-C9)heteroaryl, (C6-C10)Aryloxy(C1-C6)alkyl, (C1-C9)Heteroaryloxy(C1-C6)alkyl, (C6-C10)Aryl(C1-C6)alkyl(C6-C10)aryl(C1-C9)Heteroaryl(C1-C6)alkyl(C6-C10)aryl, (C6-C10)Aryl(C1-C6)alkyl(C1-C9)heteroaryl(C1-C9)Heteroaryl(C1-C6)alkyl(C1-C9)heteroaryl, (C6-C10)Aryl(C1-C6)alkoxy(C6-C10)aryl, (C1-C9)Heteroaryl(C1-C6)alkoxy(C6-C10)aryl, (C6-C10)Aryl(C1-C6)alkoxy(C1-C9 heteroaryl, (C1-C9)Heteroaryl(C1-C6)alkoxy(C1-C9)heteroaryl, (C6-C10)Aryloxy(C1-C6)alkyl(C6-C10)aryl, (C1-C9)Heteroaryloxy(C1-C6)alkyl(C6-C10)aryl, (C6-C10)Aryloxy(C1-C6)alkyl(C1-C9)heteroaryl, (C1-C9)Heteroaryloxy(C1-C6)alkyl(C1-C9)heteroaryl, (C6-C10)Aryl(C6-C10)aryl(C1-C9)alkyl, (C1-C9)Heteroaryl(C6-C10)aryl(C1-C6)alkyl, (C6-C10)Aryl(C1-C9)heteroaryl(C1- C6)alkyl, (C1-C9)Heteroaryl(C1-C9)heteroaryl(C1-C6)alkyl, (C6-C10)Aryl(C1-C6)alkoxy(C1-C6)alkyl oder (C1-C9)Heteroaryl(C1-C6)alkoxy(C1-C6)alkyl bedeutet, wobei unabhängig voneinander jedes der Ringkohlenstoffatome der (C6-C10)Aryl- und (C1-C9)Heteroaryleinheiten, das eine weitere Bindung bilden kann, optional mit einer Gruppe, die aus Fluor, Chlor, Brom, (C1-C6)Alkyl, (C1-C6)Alkoxy und Perfluor(C1-C3)alkyl und Perfluor(C1-C3)alkoxy ausgewählt ist, substituiert ist; R2 und R3 jeweils unabhängig voneinander aus Wasserstoff und (C1-C6)Alkyl ausgewählt sind oder zusammengenommen einen Spiroring der Formel
    Figure 00570001
    worin X eine Bindung, CH2, O, S, NH oder N(C1-C6)Alkyl bedeutet, n unabhängig voneinander 1 oder 2 ist und m unabhängig voneinander 1 oder 2 ist, bilden; und R4 Wasserstoff oder (C1-C6)Alkyl bedeutet.
  2. Verbindung gemäß Anspruch 1 der Formel (I')
    Figure 00570002
  3. Verbindung gemäß Anspruch 1, worin R2, R3 und R4 Was serstoff bedeuten.
  4. Verbindung gemäß Anspruch 1, worin R4 Wasserstoff bedeutet.
  5. Verbindung gemäß Anspruch 1, worin R4 (C1-C6)Alkyl bedeutet.
  6. Verbindung gemäß Anspruch 1, worin R2 und R3 Wasserstoff bedeuten.
  7. Verbindung gemäß Anspruch 1, worin R2 und R3 (C1-C6)Alkyl derart bedeuten, dass R2 gleich R3 ist.
  8. Verbindung gemäß Anspruch 1, worin R2 und R3 zusammengenommen einen Spiroring der Formel
    Figure 00580001
    worin X eine Bindung, CH2, O, S, NH oder N(C1-C6)Alkyl bedeutet, n 1 oder 2 ist und m 1 oder 2 derart ist, dass n gleich m ist, bilden.
  9. Verbindung gemäß Anspruch 1, worin R1 4-(4-Fluorphenoxy)phenyl bedeutet.
  10. Verbindung gemäß Anspruch 1, worin R1 4-(4-Chlorphenoxy)phenyl bedeutet.
  11. Verbindung gemäß Anspruch 1, worin R1 4-(Naphthalin-2-yloxy)phenyl bedeutet.
  12. Verbindung gemäß Anspruch 1, die ausgewählt ist aus der Gruppe von: (4R)-1-[4-(4-Fluorphenoxy)benzyl]-2-oxo-imidazolidin-4-carbonsäurehydroxyamid; (4R)-1-[4-(Naphthalin-1-yloxy)benzyl]-2-oxo-imidazolidin-4-carbonsäurehydroxyamid; (4R)-1-[4-(Naphthalin-2-yloxy)benzyl]-2-oxo-imidazolidin-4-carbonsäurehydroxyamid; (4R)-1-(4-Methoxybenzyl)-2-oxo-imidazolidin-4-carbonsäurehydroxyamid; (4R)-1-[3-(4-Fluorphenoxy)benzyl]-2-oxo-imidazolidin-4-carbonsäurehydroxyamid; (4R)-1-Naphthalin-2-ylmethyl-2-oxo-imidazolidin-4-carbonsäurehydroxyamid; (4R)-1-(4'-Fluorbiphenyl-4-ylmethyl)-2-oxo-imidazolidin-4-carbonsäurehydroxyamid; (4R)-1-(4-Benzyloxybenzyl)-2-oxo-imidazolidin-4-carbonsäurehydroxyamid; und (4R)-1-[4-(2-Chlor-4-fluorbenzyloxy)benzyl]-2-oxo-imidazolidin-4-carbonsäurehydroxyamid.
  13. Verbindung gemäß Anspruch 1, die ausgewählt ist aus der Gruppe von: (4R)-1-[4-(4-Chlorphenoxy)benzyl]-2-oxo-imidazolidin-4-carbonsäurehydroxyamid; (4R)-1-[4-(4-Fluorphenoxy)benzyl]-2-oxo-7-oxa-1,3-diazaspiro[4.4]nonan-4-carbonsäurehydroxyamid; (4R)-2-Oxo-1-[4-(pyridin-4-yloxy)benzyl]imidazolidin-4-carbonsäurehydroxyamid; (4R)-4-Methyl-2-oxo-1-[4-(pyridin-4-yloxy)benzyl]imidazolidin-4-carbonsäurehydroxyamid; (4R)-5,5-Dimethyl-2-oxo-1-[4-(pyridin-4-yloxy)benzyl]imidazolidin-4-carbonsäurehydroxyamid; (4R)-1-[4-(4-Fluorphenoxy)benzyl]-5,5-dimethyl-2-oxo-imidazolidin-4-carbonsäurehydroxyamid; (4R)-1-[4-(4-Chlorphenoxy)benzyl]-5,5-dimethyl-2-oxo-imidazolidin-4-carbonsäurehydroxyamid; (4R)-1-[4-(9-Fluorphenoxy)benzyl]-9-methyl-2-oxo-imidazolidin-4-carbonsäurehydroxyamid; (9R)-1-[4-(4-Chlorphenoxy)benzyl]-9-methyl-2-oxo-imidazolidin-4-carbonsäurehydroxyamid; (4R)-1-[4-(4-Fluorphenoxy)benzyl]-2-oxo-1,3-diazaspiro[4.4]nonan-4-carbonsäurehydroxyamid; (4R)-1-[4-(4-Chlorphenoxy)benzyl]-2-oxo-1,3-diazaspiro[4.4]nonan-4-carbonsäurehydroxyamid; (4R)-1-[4-(4-Fluorphenoxy)benzyl]-4,5,5-trimethyl-2-oxo-imidazolidin-4-carbonsäurehydroxyamid; (4R)-1-[4-(4-Chlorphenoxy)benzyl]-4,5,5-trimethyl-2-oxo-imidazolidin-4-carbonsäurehydroxyamid; (4R)-4-Methyl-1-[4-(naphthalin-2-yloxy)benzyl]-2-oxo-imidazolidin-4-carbonsäurehydroxyamid; (4R)-5,5-Dimethyl-1-[4-(naphthalin-2-yloxy)benzyl]-2-oxo-imidazolidin-4-carbonsäurehydroxyamid; (4R)-1-[4-(5-Fluorpyridin-2-yloxy)benzyl]-4-methyl-2-oxo-imidazolidin-4-carbonsäurehydroxyamid; (4R)-2-Oxo-1-(4-pyridin-4-ylbenzyl)imidazolidin-4-carbonsäurehydroxyamid und (4R)-2-Oxo-1-(4-pyridylmethyl)imidazolidin-4-carbonsäurehydroxyamid.
  14. Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Verbindung der Formel (I) oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz oder Solvat derselben gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13 zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Streckmittel, Verdünnungsmittel oder Träger umfasst.
  15. Verbindung der Formel (I) oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz, Solvat oder Zusammensetzung derselben gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13 bzw. 14 zur Verwendung als Medikament.
  16. Verwendung einer Verbindung der Formel (I) oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes, Solvats oder Zusammensetzung derselben gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13 bzw. 14 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Arthritis (einschließlich von Osteoarthritis und rheumatoider Arthritis), einer entzündlichen Darmerkrankung, Morbus Crohn, einem Emphysem, chronisch-obstruktiver Lungenerkrankung, Alzheimer-Erkrankung, Toxizität bei einem Organtransplantat, Kachexie, allergischen Reaktionen, einer Entzündung, allergischer Kontaktüberempfindlichkeit, Krebs, Gewebeulzeration, Restenose, einer Periodontiumerkrankung, Epidermolysis bullosa, Osteoporose, Lockerwerden künstlicher Gelenkimplantate, Atherosklerose (einschließlich von atherosklerotischer Plaqueruptur), Aortaaneurysma (einschließlich von Bauchaortaaneurysma und Hirnaortaaneurysma), kongestiver Herzinsuffizienz, Myokardinfarkt, Apoplexie Hirnischämie, Kopftrauma, einer Rückenmarkschädigung, (akuten und chronischen) neurodegenerativen Störungen, Autoimmunerkrankungen, Chorea Huntington, Parkinson-Krankheit, Migräne, Depression, peripherer Neuropathie, Schmerz, zerebraler Amyloidangiopathie, nootroper oder Wahrnehmungsverstärkung, amyotrophischer Lateralsklerose, Multipler Sklerose, Augenangiogenese, einer Korneaschädigung, Makuladegeneration, anomaler Wundheilung, Verbrennungen, Diabetes, Tumorinvasion, Tumorwachstum, Tumormetastasen, Korneanarbenbildung, Skleritis, AIDS, Sepsis oder septischem Schock.
  17. Verwendung einer Verbindung der Formel (I) oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes, Solvats oder Zusammensetzung derselben gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13 bzw. 14 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Zu stands, der durch die Hemmung von Matrixmetalloproteinasen behandelt werden kann.
  18. Verwendung einer Verbindung der Formel (I) oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes, Solvats oder Zusammensetzung derselben gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13 bzw. 14 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Zustands, der durch die Hemmung eines Säugerreprolysins behandelt werden kann.
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