DE60038726T2

DE60038726T2 - Mittel zur bestimmung und reinigung von lymphocytenpopulationen des typs tcd8+, die spezifisch für im zusammenhang mit hla präsentierte peptide sind

Info

Publication number: DE60038726T2
Application number: DE60038726T
Authority: DE
Inventors: Francois Lang; Marie Bodinier; Francois Davodeau; Marc Bonneville
Original assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 1999-09-06
Filing date: 2000-09-05
Publication date: 2009-07-02
Anticipated expiration: 2020-09-06
Also published as: DE60038726D1; CN1321167A; JP5020452B2; FR2798128B1; CA2350185A1; AU778840B2; CN101298478B; CA2350185C; WO2001018053A1; EP1127072A1; DE1127072T1; FR2798128A1; CN101298478A; ATE393784T1; JP2003510039A; AU7298100A; EP1127072B1; IL142976A0

Description

Die Erfindung betrifft Mittel zum Nachweis und zur Reinigung von CD8-positiven T-Lymphocytenpopulationen, die spezifisch für Peptide sind, welche im HLA-Zusammenhang präsentiert werden.
Der T-Lymphocyt trägt einen Rezeptor, der spezifisch für das Antigen ist, gegen das er eingesetzt wird, und der TCR genannt wird. Dieser TCR besteht aus mehreren Ketten einschließlich der Ketten α und β, die an der spezifischen Erkennung einen bestimmten antigenen Peptids, das in einem HLA-Molekül präsentiert wird, beteiligt sind. Diese Erkennung manifestiert sich in der Fähigkeit des TCR-α/β des T-Lymphocyten, mit einer bestimmten Affinität an die HLA-Peptid-Komplexe zu binden, die auf der Oberfläche der Zielzelle vorhanden sind. Umgekehrt können lösliche HLA-Peptid-Komplexe auch an TCR binden, die auf der Oberfläche der T-Lymphocyten, die spezifisch für den betrachteten HLA-Peptid-Komplex sind, vorhanden sind.
Zurzeit ist das molekular am besten untersuchte System die Erkennung von antigenen Peptiden, die in Molekülen des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) der Klasse I und insbesondere im Allel HLA-A0201 präsentiert werden, durch CD8-positive T-Lymphocyten.
Es wurde festgestellt, dass die Affinität des TCR zu dem HLA-Peptid-Komplex in diesem System sehr gering ist im Vergleich zur Affinität eines Antikörpers zu seinem Antigen. Aus diesem Grund ist der Nachweis von Lymphocyten, die reaktive TCR gegen ein spezifisches Peptid im HLA-Zusammmenhang tragen, mit Hilfe von löslichen HLA-A0201-Molekülen, die mit Peptiden beladen und markiert sind, nicht möglich. Um diese geringe Affinität zu kompensieren, haben Altman et al. (1) ein mehrwertiges Reagens hergestellt, das aus HLA-A0201-Peptid- Komplexen besteht, bei denen die schwere Kette des HLA biotinyliert ist, was eine Assoziation mit Streptavidin im Tetramer ermöglicht. Dieses HLA-Peptid-Tetramer hat eine erhöhte Avidität zu den T-Lymphocyten, die geeignete TCR tragen, und kann daher verwendet werden, um die reaktiven Populationen durch Immunfluoreszenz sichtbar zu machen.
TCR ist jedoch nicht das einzige Molekül des T-Lymphocyten, das mit dem HLA-Peptid-Komplex Wechselwirken kann. Tatsächlich wird die Bindung des TCR an den MHC-Peptid-Komplex bei der physiologischen Erkennung durch die Bindung des Corezeptors CD8 an einen konstanten Teil der MHC-Moleküle der Klasse I verstärkt. Die Beteiligung des CD8 an der Wechselwirkung ist von einem Lymphocytenklon zum anderen variabel und kann in bestimmten Fällen zu einer sehr starken Erhöhung der Bindungskapazität an einen gegebenen HLA-Peptid-Komplex führen. Diese Fähigkeit des CD8, an HLA der Klasse I zu binden, hat zur Folge, ein Hintergrundrauschen der Bindung der Tetramere von HLA der Klasse I auf den CD8-positiven T-Lymphocyten, die TCR tragen, die nicht spezifisch für den HLA-Peptid-Komplex sind, zu erzeugen. Dieses Hintergrundrauschen steigt mit der verwendeten Konzentration des Tetramers und kann bei der Immunfluoreszenz zu falsch positiven Ergebnissen führen. Um zu versuchen, diese unspezifische Markierung zu verringern, führen die meisten Arbeitsgruppen ihre Markierungen mit Tetrameren von HLA der Klasse I in Gegenwart von Anti-CD8-Antikörpern durch. Es sind jedoch nur bestimmte Anti-CD8-Antikörper wirksam, und die optimalen Verhältnisse der Konzentrationen zwischen dem Antikörper und dem Tetramer müssen bei jedem Test neu justiert werden. Aufgrund dieser Nachteile ist der Nachweis von spezifischen Subpopulationen, die in einer unspezifischen Populationen schwach repräsentiert sind (zum Beispiel in einer Größenordnung von 0,1 bis 1%), schwierig.
Außerdem wurde eine andere potentielle Anwendung der HLA-Tetramere ins Auge gefasst. Sie besteht darin, durch Sortieren (mit Durchflusscytometrie oder durch immunmagnetische Sortierung) Lymphocytenpopulationen, die gegen einen gegebenen HLA-Peptid-Komplex reaktiv sind, für Zwecke der in-vitro- Expansion und anschließende therapeutische Verwendung in Behandlungen der antiviralen oder antitumoralen passiven Immunisierung zu isolieren. Das Hintergrundrauschen der Bindung des Tetramers aufgrund der Beteiligung des CD8 kann jedoch ein ernsthaftes Hindernis für diese Anwendung bilden, da es zur Isolierung einer oft großen Fraktion von T-Lymphocyten führt, die gegenüber dem selektierenden HLA-Peptid-Komplex nicht reaktiv sind.
Salter et al. (2) haben gezeigt, dass die Bindung eines membranständigen HLA, das von mit einem CD8αα-Corezeptor transfizierten Zellen exprimiert wird, verändert wird, wenn das HLA eine Mutation in der Domäne α3 aufwies.
Die Untersuchung solcher Mutationen durch die Erfinder führte zur Bestätigung, dass lösliche mutierte Tetramere effektiv weniger an CD8 binden, unabhängig davon, ob es αα oder αβ ist und ob es an einen TCR auf der Oberfläche des T-Lymphocyten assoziiert ist oder nicht, was sich in einer Verringerung des Hintergrundrauschens manifestiert.
Man könnte also erwarten, dass der Verlust an Affinität, der sich aus der Mutation ergibt, zu einem Totalverlust des spezifischen Signals oder zu einer Beschränkung desselben auf bestimmte CD8-abhängige T-Lymphocyten-Klone führt. Der Artikel von Salter et al. zeigt in dieser Hinsicht, dass bestimmte CD8-abhängige alloreaktive Klone ihre Cytotoxizität gegenüber Zellen, die das mutierte HLA-A2 tragen, verlieren, während andere nur wenig beeinflusst werden.
Somit wäre es also möglich, dass die mutierten Tetramere nur einen Bruchteil der reaktiven Zellen (die weniger CD8-abhängigen) innerhalb einer polyklonalen Population nachweisen.
Die zahlreichen vergleichenden Markierungen von polyklonalen Populationen mit den mutierten und nativen Tetrameren, die die Erfinder in doppelter Markierung mit einem Anti-CD8-Antikörper durchgeführt haben, beweisen, dass das mutier te Tetramer im Gegenteil unerwarteterweise denselben Prozentsatz an spezifischen Zellen erkennt wie das native Tetramer.
Außerdem zeigt der Vergleich der Markierung mit dem mutierten Tetramer bei einem stark CD8-abhängigen Klon und einem schwach CD8-abhängigen Klon eine vergleichbare Wirksamkeit der Bindung des Tetramers, die mit der Intensität der Expression des TCR zusammenhängt.
Es scheint also, dass die Mutation die Bindung des Tetramers an CD8 allein sehr stark reduziert, aber seine Bindung an den TCR-CD8-Komplex weit weniger stark beeinflusst.
Die Erfindung beruht also auf der Ausnutzung der bei den mutierten oder allgemeiner veränderten Multimeren von HLA nachgewiesenen Eigenschaften und betrifft solche Multimere und ihre Komplexe mit antigenen Peptiden als neue Produkte.
Sie betrifft auch die Verwendung dieser Moleküle zum Nachweis und/oder zur Isolierung von peptidspezifischen CD8-positiven T-Lymphocytenpopulationen.
Sie betrifft außerdem ein Verfahren zum Nachweis und/oder zur Isolierung solcher Populationen mit Hilfe solcher peptidbeladener Moleküle, insbesondere für Anwendungen in der Diagnostik und Therapie.
Die Erfindung betrifft somit einen tetrameren Komplex von MHC-Klasse-I-Monomeren, die wenigstens eine Substitution einer Aminosäure in der α3-Domäne in der Zone der Wechselwirkung einer schweren Kette eines MHC-Klasse-I-Monomers mit einem CD8-Corezeptor von T-Lymphocyten aufweisen, wobei die Affinität dieses tetrameren Komplexes zu den CD8-Corezeptoren der T-Lymphocyten in Bezug auf die Affinität eines entsprechenden unsubstituierten nativen tetrameren Komplexes reduziert ist.
Die Veränderung der Wechselwirkungszone betrifft insbesondere die Domäne α3 der schweren Kette.
Es handelt sich insbesondere um eine Mutation wenigstens einer Aminosäure in der Domäne α3 im Vergleich zur entsprechenden Domäne einer nativen schweren Kette, die an den Corezeptor CD8 binden kann.
Es sei zum Beispiel die Mutation eines Alaninrestes zu einem Valinrest auf Position 245 der Domäne α3 des Moleküls HLA-A2 genannt.
Die Veränderung kann auch in einer chemischen Modifikation wenigstens einer Aminosäure und/oder in einer Deletion wenigstens einer Aminosäure bestehen, wobei dieser oder diese Typen von Veränderungen gegebenenfalls zu einer oder mehreren Mutationen noch hinzukommen.
Die Erfindung betrifft auch die Komplexe, die ausgehend von den oben definierten Multimeren und antigenen Peptiden hergestellt sind, als neue Produkte.
In diesen Komplexen liegen die Multimere insbesondere in Form von Tetrameren vor.
Gemäß der Erfindung werden diese Komplexe zum Nachweis und/oder zur Isolierung von CD8-positiven T-Lymphocyten-Populationen verwendet, die spezifisch das antigene Peptid dieser Komplexe erkennen.
Die Verwendung der oben definierten Komplexe erlaubt es, das Hintergrundrauschen der unspezifischen Bindung sehr stark zu reduzieren, ohne die spezifische Markierung zu verändern, und außerdem sich über die Notwendigkeit hinwegzusetzen, bei Immunfluoreszenzanalysen gleichzeitig einen Anti-CD8-Antikörper zu verwenden.
In einer bevorzugten Verwendung werden die Komplexe in einem Zellsortierungsverfahren, wie der immunmagnetischen Sortierung, eingesetzt.
Eine immunmagnetische Sortierungstechnik zum Isolieren der spezifischen T-Lymphocyten bei der Maus wird von Luxembourg et al. beschrieben (5).
Diese Technik beruht auf der Verwendung eines Systems von Kügelchen, die mit MHC-Peptid-Komplexen (produziert in einem Drosophila-System; mit Peptiden beladen und chemisch biotinyliert) bedeckt sind.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Nachweis und/oder zur Isolierung von peptidspezifischen Populationen von CD8-positiven T-Lymphocyten in einer polyklonalen Population. Das Nachweisverfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass es Folgendes umfasst:

– das In-Kontakt-Bringen der polyklonalen Population mit Multimeren, die mit antigenen Peptiden gemäß der obigen Definition komplexiert sind, unter Bedingungen, die eine Wechselwirkung zwischen den Komplexen aus veränderten MHC der Klasse I und Peptiden und den Rezeptoren der T-Lymphocyten mit einer Affinität zu diesen Komplexen erlauben;
– den Nachweis der Lymphocytenpopulationen, die an die Komplexe gebunden haben.

Die Sichtbarmachung erfolgt zum Beispiel durch Fluoreszenz unter Verwendung der Multimeren, die fluoreszierende Verbindungen umfassen.
Das Verfahren zur Isolierung der peptidspezifischen Lymphocytenpopulationen ausgehend von polyklonalen Populationen ist ebenfalls Gegenstand der Erfindung und kann gegebenenfalls nach dem obigen Nachweisschritt durchgeführt werden.
Bei diesem Verfahren wird die Technik der immunmagnetischen Sortierung eingesetzt, und es ist dadurch gekennzeichnet, dass es Folgendes umfasst:

– das In-Kontakt-Bringen der polyklonalen Population mit Magnetkügelchen, an die die Komplexe aus Peptid/Analoga von MHC der Klasse I gemäß der obigen Definition gebunden sind, unter Bedingungen, die eine Wechselwirkung zwischen den Komplexen und den Rezeptoren der T-Lymphocyten mit einer Affinität zu diesen Komplexen erlauben;
– die Gewinnung der gebundenen Populationen, wobei der Sortierungsschritt gewünschtenfalls wiederholt wird und/oder sich gegebenenfalls ein Schritt
– der in-vitro-Amplifikation der ausgewählten Populationen

Die Erhöhung der Differenz zwischen Hintergrundrauschen und spezifischer Markierung mit den veränderten Multimeren, wie sie oben definiert sind, erlaubt eine bessere Diskriminierung der spezifischen Lymphocytenpopulationen innerhalb einer polykionalen Population, so dass die immunmagnetische Sortierung mit diesen Multimeren sehr wirksam ist.
Die MHC-Moleküle umfassen zum Beispiel ein Motiv der enzymatischen Biotinylierung auf der schweren Kette. Die Kügelchen, an die die Komplexe gebunden sind, sind mit Streptavidin gekoppelt.
Die polykionalen Populationen stammen aus Proben, die Patienten entnommen wurden, wie Synovialflüssigkeiten oder mononukleäre Zellen des peripheren Bluts.
Der Schritt der Amplifikation der ausgewählten Populationen erfolgt vorteilhafterweise durch polyklonale Stimulation unter Bedingungen, die das gegenseitige Verhältnis der amplifizierten Populationen nicht beeinflussen. Es wird zum Beispiel auf PHA, IL2 oder bestrahlte PBL zurückgegriffen.
Die Erfindung betrifft auch ausgewählte und gegebenenfalls amplifizierte T-Lymphocyten-Populationen, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie ausschließlich aus T-Lymphocyten bestehen, die gegenüber dem Peptid eines gegebenen Komplexes reaktiv sind.
Solche peptidspezifischen Populationen sind von großem Interesse in der Therapie und insbesondere für Anwendungen, die auf ihrer erneuten Verabreichung gemäß der passiven Immuntherapie beruhen.
Die Erfindung betrifft also pharmazeutische Zusammensetzungen, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie ausgehend von einer peptidspezifischen T-Lymphocyten-Population, wie sie oben definiert ist, in Verbindung mit einem pharmazeutischen Träger hergestellt werden.
Solche Zusammensetzungen sind vorteilhafterweise durch Injektion verabreichbar.
So ist es möglich, durch Verabreichung von T-Zellen, die gegen ein gegebenen Antigen gerichtet sind und die Immunantwort aktivierende oder hemmende Eigenschaften aufweisen, eine antivirale oder antitumorale Immunität nach Injektion von T-Lymphocyten, die jeweils einen Komplex aus MHC-Molekül der Klasse I und definiertem viralen oder tumoralen Peptid erkennen, wiederherzustellen oder ein Ungleichgewicht des Immunsystems (zum Beispiel Fälle von Autoimmunität) zu korrigieren.
Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung gehen aus den folgenden Beispielen hervor, die nur zur Veranschaulichung angegeben werden und in denen auf die 1 bis 7 Bezug genommen wird; dabei zeigen:
die 1 und 2 die (mittleren) Fluoreszenzintensitäten in Abhängigkeit von den Konzentrationen der nativen Tetramere (1A, 2A) und der entsprechenden mutierten Tetramere (1B, 2B) bei Tetrameren, die mit Peptid beladen sind, das aus BMLF1 (1) oder aus pp65 (2) hervorgegangen ist;
die 3 die mittleren Fluoreszenzintensitäten in Abhängigkeit von den Konzentrationen der nativen und mutierten Tetramere bei spezifischen Klonen;
die 4A den Prozentsatz der Lyse von 2 spezifischen Klonen einer HLA-A0201-B-Linie, die mit einem BMLF1-Peptid beladen sind, mit oder ohne Anti-CD8-Antikörper, und die 4A und 4B zeigen die Ergebnisse der Markierungen dieser Klone;
die 5 die Ergebnisse von einfachen (mit Phycoerythrin, PE) und doppelten (PE und markierte Anti-CD8-Antikörper) Markierungen von nativen und mutierten Tetrameren bei den Lymphocyten von 2 Patienten; und
die 6 und 7 die Ergebnisse von immunmagnetischen Sortierungen, die mit nativen Tetrameren und mit mutierten Tetrameren durchgeführt wurden.
Beispiel 1: Herstellung eines HLA-A0201-Tetramers, das in der Zone der Wechselwirkung mit dem Corezeptor CD8 mutiert ist.
Es wurde ein Plasmid zur Expression in Bakterien verwendet, das cDNA enthielt, die für die schwere Kette des HLA0201 codiert und um eine Sequenz verlängert ist, die für ein Motiv der enzymatischen Biotinylierung codiert (Konstruktion nach Altman et al. (1)). Die Zone, die für die Domäne α3 codiert, wurde mit spezifischen Primern amplifiziert:
SEQ ID Nr. 1:
5' CCTTCCAGAAGTGGGTGGCTGTGGTGGTGCC 3'
SEQ ID Nr. 2:
5' GGCACCACCACAGCCACCCACTTCTGGAAGG 3'
In die Amplifikationsfragmente wurde eine Mutation einer Base eingeführt, um das Alanin-Codon in ein Valin-Codon zu transformieren, wobei man den Kit QuickChange Site-Directed Mutagenesis R von Stratagene verwendete.
Das mutierte Fragment wurde wieder in das Expressionsplasmid eingeführt, und die Anwesenheit der Mutation wurde durch Sequenzierung kontrolliert.
Die mutierte schwere Kette von HLA-A0201 wurde in einem bakteriellen Einschlusskörper produziert, und das mit Peptid beladene HLA-Monomer und dann das entsprechende mutierte Tetramer konnten nach einer Renaturierungsvorschrift erhalten werden, die schon früher von Garboczi et al. beschrieben wurde (3).
Beispiel 2: Vergleichende Studie der Wirksamkeit und der Spezifität der Immunfluoreszenzmarkierung zwischen einem nativen HLA-A0201-Tetramer und dem mutierten HLA-A0201-Tetramer, die mit verschiedenen Peptiden beladen sind.
a) Markierung von Lymphocytenklonen
Native HLA-A0201-Tetramere und entsprechende mutierte Tetramere wurden entweder mit einem Peptid, das aus dem Protein BMLF1 des Virus EBV stammt, oder mit einem Peptid, das aus dem Protein pp65 des CMV stammt, beladen.
Die nativen Tetramere werden gemäß der Technik von Beispiel 1 erhalten, aber ohne Mutation.
Spezifische und unspezifische Klone wurden markiert und in steigenden Konzentrationen verwendet.
1 gibt die mittleren Fluoreszenzintensitäten (MFI) an, die mit den nativen HLA-A2/BMLF1-Tetrameren (1A) und mit den entsprechenden mutierten Tetrameren (1B) erhalten wurden.
Es ist festzustellen, dass das native HLA-A2/BM-Tetramer ein Hintergrundrauschen der Bindung an bestimmte unspezifische Klone zeigt, das mit der verwendeten Dosis des Tetramers zunimmt.
Dieses Hintergrundrauschen scheint nicht ausschließlich mit der HLA-Restriktion des betrachteten Klons verbunden zu sein, sondern hängt auch von dem geladenen Peptid ab, da zwei HLA-A0201-restringierte Anti-IEl-Klone ein starkes Hintergrundrauschen ergeben, während der ebenfalls HLA-A0201-restringierte Anti-Melan-A-Klon ein mäßiges Hintergrundrauschen ergibt.
Bei dem mutierten Tetramer sind die mittleren Fluoreszenzintensitäten (MFI), die bei spezifischen Klonen (BM/A2) erhalten wurden, geringer als diejenigen, die mit dem nativen Tetramer erhalten wurden, aber das Hintergrundrauschen bei den unspezifischen Klonen ist fast null, und zwar unabhängig von der verwendeten Konzentration des Tetramers.
Man wird bemerken, dass dieser Unterschied des Hintergrundrauschens zwischen dem nativen Tetramer und dem mutierten Tetramer keine Besonderheit des A2/BM-Tetramers ist, da man ihn auch bei dem HLA-A2/pp65-Tetramer beobachtet (siehe 2).
In dieser 2 wird die mittlere Fluoreszenzintensität im logarithmischen Maßstab angegeben, um das schwache Hintergrundrauschen der Markierung sichtbar zu machen, das mit dem mutierten Tetramer erhalten wird. Man stellt fest, dass die Differenz zwischen der spezifischen Markierung und der unspezifischen Markierung bei dem mutierten A2/pp65-Tetramer in der Größenordnung von 2 Zehnerpotenzen (10²) liegt, während er bei dem nativen Tetramer nur eine Zehnerpotenz beträgt. Die beiden bemerkenswerten Ausnahmen sind die beiden Anti-EBV-CD4-Klone, bei denen das Hintergrundrauschen bei dem nativen Tetramer sehr schwach ist. Diese Beobachtung verstärkt die Hypothese, gemäß der das bei dem nativen Tetramer erhaltene Hintergrundrauschen der Markierung auf einen bestimmten Prozentsatz an unspezifischer Bindung des Tetramers an das CD8 zurückzuführen ist.
In 3 sind die Unterschiede der Markierungen gezeigt, die mit den mutierten und nativen Tetrameren, welche mit pp65 beladen waren, bei spezifischen Klonen erhalten wurden. Der Unterschied zwischen des Sättigungskurven, die mit dem mutierten Tetramer und dem nativen Tetramer erhalten wurden, zeigt, dass es auf den Klonen eine größere Zahl von Bindungsstellen für das native Tetramer als für das mutierte Tetramer gibt: es ist also sehr wahrscheinlich, dass im Falle des nativen Tetramers bestimmte Valenzen nur mit dem CD8 Wechselwirken, zumal dieses Molekül auf der Oberfläche des T-Lymphocyten in einer viel größeren Dichte exprimiert wird als der TCR.
Weitere Experimente wurden durchgeführt, um zu testen, ob die spezifische Markierung mit dem mutierten Tetramer signifikant durch den Grad der CD8-Abhängigkeit von spezifischen Klonen beeinflusst wird. Tatsächlich ist allgemein bekannt, dass bestimmte Klone unter den CD8-positiven T-Klonen das CD8 dringend benötigen, um die spezifische Wechselwirkung zwischen ihrem TCR und dem HLAA-Peptid-Komplex zu verstärken, während andere Klone darauf verzichten können.
Der Grad der CD8-Abhängigkeit wurde gemäß dem Cytotoxizitätstest von Couedel et al. (4) mit oder ohne Anti-CD8-Antikörper abgeschätzt und gilt als umgekehrt proportional zur Affinität des TCR zu dem HLA-Peptid-Komplex.
In 4A ist ein Cytotoxizitätstest gegen eine HLA-A0201 Linie, die mit dem Peptid BMLF1 (10 μM) beladen ist, bei zwei spezifischen Klonen gezeigt. Der Klon A2.10 ist sehr stark CD8-abhängig, da seine Cytotoxizität durch den Anti-CD8-Antikörper außer Kraft gesetzt wird, während der Klon A4.5 relativ wenig CD8-abhängig ist.
Eine Markierung mit dem mutierten Tetramer und eine Markierung mit einem Anti-CD3-Antikörper wurden durchgeführt, um die Zahl von auf der Oberfläche exprimierten TCR abzuschätzen. Die Ergebnisse sind in den 4B (Markierung CD3) und 4C (Markierung des mutierten Tetramers BMFL1/A2) angegeben.
Es ist festzustellen, dass das Verhältnis von Tetramer-Markierung/CD3-Markierung bei den beiden Klonen gut vergleichbar ist, was darauf hinweist, dass die Markierung mit dem mutierten Tetramer durch den Grad der CD8-Abhängigkeit (und damit durch die Affinität des TCR) nur wenig beeinflusst wird.
Somit beeinflusst die durch die Mutation des HLA-Moleküls induzierte Verringerung der Affinität zu CD8 die spezifische Markierung des Tetramers nicht signifikant.
b) Nachweis von spezifischen Zellen in einer polyklonalen Population
Um die Nachweisbarkeit eines geringen Prozentsatzes an spezifischen Zellen in einer polyklonalen Population durch das native und das mutierte Tetramer miteinander zu vergleichen, wurden periphere Lymphocyten von zwei HLA-A0201-Patienten (im Folgenden durch A und B bezeichnet) markiert. Es handelt sich um Patienten, bei denen zuvor eine Antwort gegen das Peptid pp65 des CMV nachgewiesen worden war. Diese Lymphocyten wurden zuvor in vitro polyklonal amplifiziert und eingefroren.
Die für die Patienten A und B erhaltenen Ergebnisse sind in 5 angegeben, wobei 5A dem Patienten A entspricht und die 5B dem Patienten B entspricht. Es handelt sich um die Ergebnisse einer einfachen Markierung der Tetramere HLA-A0201/pp65 mit 20 μg/ml Phycoerythrin und der entsprechenden doppelten Markierungen (Tetramere, die mit PE und FITC-markierten Anti-CD8-Antikörpern markiert waren). In dieser Figur sind auch die mittleren Fluoreszenzintensitäten (log) angegeben.
Es ist zunächst festzustellen, dass die Diskriminierungsfähigkeit des nativen Tetramers bei einfacher Markierung in Abhängigkeit vom Prozentsatz an spezifischen Zellen in der Ausgangspopulation variabel ist. Tatsächlich ist das Maximum von positiven Zellen bei Patient A, das 5,60% entspricht, leicht identifizierbar, während dieses Maximum bei Patient B durch die unspezifische Markierung kontaminiert ist, was die Bestimmung des Prozentsatzes an positiven Zellen erschwert. Gemäß der Literatur reduziert die doppelte Markierung des nativen und Anti-CD8-Tetramers das Hintergrundrauschen, was es somit erlaubt, die positive Subpopulation eindeutig zu identifizieren und ihren Prozentsatz genau abzuschätzen (0,84% in diesem Fall). Dies beweist also, dass die genaue Abschätzung des Prozentsatzes an positiven Zellen mit dem nativen Tetramer den Rückgriff auf eine doppelte Markierung mit dem Anti-CD8 impliziert.
Umgekehrt erlaubt es die einfache Markierung mit dem mutierten Tetramer, bei den beiden Patienten eindeutig ein Maximum von positiven Zellen zu identifizieren. Die erhaltenen Prozentsätze der positiven Zellen sind fast identisch mit denjenigen, die bei doppelter Markierung mit dem nativen Tetramer erhalten wurden. Dies beweist, dass alle spezifischen Zellen, die mit dem nativen Tetramer nachweisbar sind, auch mit dem mutierten Tetramer nachweisbar sind, und bestätigt also die Ergebnisse, die mit den stark abhängigen und wenig abhängigen CD8-Klonen erhalten wurden, nämlich dass die Mutation die spezifische Erkennung nicht signifikant beeinflusst.
Außerdem zeigen diese Ergebnisse, dass die doppelte Markierung mit dem mutierten Tetramer gegenüber der einfachen Markierung keine neuen Elemente beiträgt. Schließlich ist festzustellen, dass die mittleren Fluoreszenzintensitäten, die bei der doppelten Markierung mit dem nativen Tetramer mit dem Anti-CD8-Antikörper erhalten wurden (216 und 193 für die Patienten A und B), signifikant geringer sind als diejenigen, die bei doppelter Markierung mit dem mutierten Tetramer erhalten wurden (366 und 370 für die Patienten A und B). Die nach einfacher Markierung der Gesamtpopulation mit Anti-CD8 erhaltenen mittleren Fluoreszenzintensitäten betrugen 340 bzw. 355 für die Patienten A bzw. B. Dies beweist die Bindungskonkurrenz zwischen dem Anti-CD8-Antikörper und dem nativen Tetramer, eine Konkurrenz, die mit dem mutierten Tetramer nicht entsteht.
Die Verwendung des mutierten Tetramers erlaubt es also, auf die doppelte Markierung mit Anti-CD8 zu verzichten, um den Prozentsatz an spezifischen Zellen in einer polyklonalen Population abzuschätzen.
Beispiel 3: Vergleichende Studie der Wirksamkeit und der Spezifität von immunmagnetischen Sortierungen, die mit dem nativen HLA-A0201-Tetramer und dem mutierten HLA-A0201-Tetramer, die mit dem Peptid p65 beladen sind, durchgeführt wurden
Biotinylierte HLA-A0201-Monomere, die mit dem Peptid pp65 beladen wurden, wurden an magnetische Kügelchen gebunden, die an Streptavidin gekoppelt waren (Dynabeads M-280 Streptavidin, DYNAL). Die Lymphocytenpopulationen, die in der Studie verwendet wurden, stammen aus Synovialflüssigkeiten oder dem PBL von Patienten, die unter rheumatoider Arthritis leiden, oder PBL, die von gesunden, in Bezug auf CMV seropositiven Spendern stammen.
In 6 sind die Ergebnisse einer einfachen Markierung mit dem nativen Tetramer und dem mutierten Tetramer bei diesen polyklonalen Populationen angegeben. Mit dem mutierten Tetramer ist es möglich, einen geringen Prozentsatz von positiven Zellen bei den beiden Probenahmen nachzuweisen (0,22% und 0,14%), wobei diese positiven Zellen mit dem nativen Tetramer praktisch nicht identifizierbar sind.
Diese Populationen wurden mit Kügelchen sortiert, die entweder mit dem nativen Tetramer oder mit dem mutierten Tetramer beladen waren, und dann wurden die ausgewählten Populationen in vitro durch eine polyklonale Stimulation (PHA, IL2, bestrahlte PBL) amplifiziert, wobei diese Stimulation das gegenseitige Verhältnis der amplifizierten Populationen nicht beeinflusst.
Dann wurde eine Markierung mit diesen sortierten und amplifizierten Populationen mit den beiden Tetrameren durchgeführt.
Wie in 6 gezeigt ist, sind die aus der Sortierung mit dem nativen Tetramer hervorgegangenen Zellen mit demselben Tetramer positiv markiert, aber umgekehrt ist nur ein sehr geringer Prozentsatz dieser Zellen mit dem mutierten Tetramer positiv (0,7% bzw. 2,88%).
Die Ergebnisse sind nach einer Sortierung mit dem mutierten Tetramer bemerkenswert unterschiedlich, da die sortierten Populationen mit den beiden Tetrameren stark positiv reagieren.
Der mit dem mutierten Tetramer erhaltene Anreicherungsfaktor an positiven Zellen beträgt 421 für die Probenahme 1 (92,64% vs. 0,22%) und 693 für die Probenahme 2 (97,01% vs. 0,14%).
Diese Ergebnisse zeigen, dass es möglich ist, eine reine positive Population mit mehr als 90% ausgehend von einer Probe, in der diese Population 0,1 bis 0,2% ausmacht, zu erhalten, indem man eine Sortierung mit dem mutierten Tetramer durchführt.
Die Allgemeingültigkeit dieser Beobachtung wird durch die folgende Tabelle veranschaulicht, die die Ergebnisse von Sortierungen beschreibt, die mit dem nativen Tetramer und dem mutierten Tetramer ausgehend von PBL und Lymphocyten aus der Synovialflüssigkeit von Patienten und gesunden Spendern durchgeführt wurden.
Indem man wiederholte Sortierungen mit dem mutierten Tetramer durchführt, ist es möglich, ausgehend von noch weniger häufigen Subpopulationen reine spezifische Populationen zu erhalten (vgl. PBL5 in der Tabelle). Umgekehrt ist dieses Ergebnis mit dem nativen Tetramer viel schwieriger zu erhalten; es scheint tatsächlich, dass die durch eine erste Sortierung mit dem nativen Tetramer isolierten unspezifischen Zellen eine ausreichende Affinität haben, um bei späteren Sortierungen erneut selektiert zu werden. Man gelangt also zu sehr unzureichenden Anreicherungsfaktoren, indem man eine zweite Sortierung vornimmt (vgl. PBL3 und SFL4).
Eine weitere Studie betraf die Reaktivität der sortierten Populationen, um zu bestätigen, dass die anhand ihrer Fähigkeit zur Bindung des mutierten A2-Tetramers/pp65 ausgewählten Zellen in einem physiologischen Kontext sehr wohl reaktiv gegenüber diesem HLA-Peptid-Komplex sind.
Zu diesem Zweck wurde die Aktivierung der sortierten Lymphocytenpopulationen untersucht, die durch die Induktion an der Oberfläche der α-Kette des Rezeptors mit IL2 (CD25) objektiviert wurden, nachdem man sie mit T2-Zellen (A0201+), die mit dem Peptid pp65 beladen waren, in Kontakt gebracht hatte.
Wie 7 zeigt, exprimieren die mit Hilfe des nativen Tetramers sortierten Populationen nach Kontakt mit den T2-Zellen, die mit Peptiden beladen sind, kein CD25.
Umgekehrt wird die Mehrzahl der Zellen, die mit dem mutierten Tetramer sortiert wurden, in Gegenwart von T2-Zellen, die mit dem Peptid pp65 beladen waren, aktiviert, und der Prozentsatz an CD25-positiven Zellen entspricht weitgehend dem Prozentsatz der Zellen, die mit dem mutierten Tetramer markiert waren (90,63% aktivierte Zellen vs. 92,64% markierte Zellen und 97,20% vs. 97,01% bei den Patienten 1 bzw. 2).
Diese Ergebnisse beweisen, dass die markierten und mit dem mutierten Tetramer sortierten Zellen ausschließlich reaktive Zellen sind, während die mit dem nativen Tetramer sortierten Zellen unreaktiv sind.
Die Tatsache, dass man nach der Sortierung mit dem nativen Tetramer keine reaktive Zelle wiederfindet, während man einige positive Zellen in dieser Population unterscheiden konnte, ist wahrscheinlich darauf zurückzuführen, dass der Prozentsatz dieser Zellen zu gering ist, um in einem funktionellen Test nachweisbar zu sein.
Die Gesamtheit dieser Ergebnisse beweist die manifeste Überlegenheit des mutierten Tetramers gegenüber dem nativen Tetramer bei der Selektion der Populationen, die in der Ausgangspopulation nur schwach repräsentiert sind, durch immunmagnetische Sortierung.
Wenn die spezifischen Populationen in der Ausgangsprobe zahlreicher sind, wird es also möglich, reaktive Zellen mit dem nativen Tetramer zu isolieren, aber der Grad der Reinheit der erhaltenen Populationen ist viel geringer als diejenigen, die man parallel mit dem mutierten Tetramer erhält (Tabelle).
Literatur

1) Altman J. D. et al., 1936, Science 274: 94–6 und US-Patent 5,635,363
2) Salter, R. D. et al., 1990, Nature 345: 41–46
3) Garboczi D. N. et al., 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89: 3429–33
4) Couedel, C., M. et al., 1999, J. Immunol 162-6351-8.
5) Luxembourg A. T. et al, Nature Biotechnology, Band 16, März 1998, 281–285.

Sequenzprotokoll

Claims

Tetramerer Komplex von MHC-Klasse-I-Monomeren, die wenigstens eine Substitution einer Aminosäure in der α3-Domäne in der Zone der Wechselwirkung einer schweren Kette eines MHC-Klasse-I-Monomers mit einem CD8-Corezeptor von T-Lymphocyten aufweisen, wobei die Affinität dieses tetrameren Komplexes zu den CD8-Corezeptoren von T-Lymphocyten in Bezug auf die Affinität eines entsprechenden unsubstituierten nativen tetrameren Komplexes reduziert ist.
Tetramerer Komplex gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Substitution in einer α3-Domäne der schweren Kette befindet.
Tetramerer Komplex gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die MHC-Monomere in Form eines Komplexes mit einem MHC-bindenden Peptid vorliegen.
Verwendung eines tetrameren Komplexes gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 zum Nachweisen und/oder Isolieren der peptidspezifischen Populationen von CD8-positiven T-Lymphocyten.
Verwendung eines tetrameren Komplexes gemäß Anspruch 4 in einem Zellsortierungsverfahren.
Verwendung eines tetrameren Komplexes gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Zellsortierungsverfahren ein immunmagnetisches Sortierungsverfahren ist.
Verfahren zum Nachweisen der peptidspezifischen Populationen von CD8-positiven T-Lymphocyten in einer polyklonalen Population, dadurch gekennzeichnet, dass es Folgendes umfasst: – das In-Kontakt-Bringen der polyklonalen Population mit den tetrameren Komplexen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 unter Bedingungen, die eine Wechselwirkung zwischen den Komplexen aus rekombinanten MHC-Klasse-I-Monomeren und Peptid und den Rezeptoren von T-Lymphocyten mit einer Affinität zu diesen Komplexen erlauben; und – den Nachweis der T-Lymphocyten mit einer Affinität zu diesen Komplexen, so dass die peptidspezifische CD8-positive Population nachgewiesen wird.
Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Komplexe aus tetrameren Klasse-I-MHC und Peptid eine fluoreszierende Struktureinheit umfassen und dass der Nachweis den Nachweis der Fluoreszenz der Komplexe umfasst.
Verfahren zum Isolieren der peptidspezifischen Populationen von CD8-positiven T-Lymphocyten ausgehend von einer polyklonalen Population, dadurch gekennzeichnet, dass es Folgendes umfasst: – das In-Kontakt-Bringen der polyklonalen Population mit Magnetkügelchen, an die die tetrameren Komplexe gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 gebunden sind, unter Bedingungen, die eine Wechselwirkung zwischen den Komplexen aus rekombinantem MHC-Klasse-I-Monomer und Peptid und den Rezeptoren von T-Lymphocyten mit einer Affinität zu diesen Komplexen erlauben; und – die Gewinnung der gebundenen T-Lymphocyten, so dass die peptidspezifische CD8-positive Population isoliert wird.