DE60037905T2 - Pyrazin-basierte hemmer der glycogen-synthase-kinase 3 - Google Patents

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Diese Erfindung betrifft Pyrazin-Verbindungen, die die Aktivität von Glycogen-Synthase-Kinase 3 (GSK3) inhibieren, pharmazeutische Zusammensetzungen, die diese Verbindungen enthalten, sowie die Verwendung der Verbindungen und Zusammensetzungen, allein oder in Kombination mit anderen pharmazeutisch wirksamen Mitteln. Die Verbindungen und Zusammensetzungen, die von der vorliegenden Erfindung bereitgestellt werden, sind bei der Behandlung von Störungen nützlich, die von der GSK3-Aktivität vermittelt werden, wie beispielsweise Diabetes, Alzheimer-Erkrankung, und andere neurodegenerative Störungen, Fettleibigkeit, atheriosklerotische Herzkreislauf-Erkrankung, essentieller Bluthochdruck, polyzystisches Ovarialsyndrom, Syndrom X, Ischämie, insbesondere cerebrale Ischämie, traumatische Hirnverletzung, bipolare Störung, Immunschwäche und Krebs.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Bicyclische Verbindungen, die in struktureller Hinsicht mit den Verbindungen gemäß der nachstehenden Formel (I) verwandt sind, werden in Benincori et al. (Journal of the Chemical Society, Perkin Trans I, 1991, S. 2139–45) und in WO 99/03838 offenbart. Der Stand der Technik gibt jedoch keinen Hinweis darauf, dass diese Verbindungen zur Inhibierung der Glycogen-Synthase-Kinase 3 verwendet werden können.
  • WO 98/16528 offenbart Inhibitoren der Glycogen-Synthase-Kinase 3, die sich beträchtlich von den Verbindungen gemäß der nachstehenden Formel (I) unterscheiden.
  • Die Glycogen-Synthase-Kinase 3 (GSK3) ist eine Serin/Threonin-Kinase, für die zwei Isoformen (α und β) identifiziert wurden. Woodgett, Trends Biochem. Sci., 16: 177–81 (1991). Beide GSK3-Isoformen sind in ruhenden Zellen konstitutiv aktiv. GSK3 wurde ursprünglich als eine Kinase identifiziert, die die Glycogen-Synthase durch direkte Phosphorylierung hemmt. Bei der Aktivierung von Insulin wird GSK3 inaktiviert, wodurch die Aktivierung der Glycogen-Synthase und möglicherweise andere Insulin-abhängige Prozesse ermöglicht werden, wie beispielsweise der Glucosetransport. Es ist anschließend gezeigt worden, dass die GSK3-Aktivität auch durch andere Wachstumsfaktoren inaktiviert wird, die – wie Insulin – Signale über Rezeptor-Tyrosin-Kinasen (RTKs) übertragen. Beispiele für solche signalübertragenen Moleküle umfassen IGF-1 und EGF. Saito et al., Biochem. J, 303: 27–31 (1994); Welsh et al., Biochem. J. 294: 625–29 (1993); und Cross et al., Biochem. J., 303: 21–26 (1994).
  • Mittel, welche die GSK3-Aktivität hemmen, sind bei der Behandlung von Störungen nützlich, die durch eine GSK3-Aktivität vermittelt werden. Darüber hinaus ahmt die Inhibierung von GSK3 die Aktivierung von Wachstumsfaktor-Signalübertragungswegen nach, und folglich sind GSK3-Inhibitoren bei der Behandlung von Erkrankungen nützlich, bei denen solche Übertragungswege im unzureichenden Maße aktiv sind. Beispiele für Krankheiten, die mit GSK3-Inhibitoren behandelt werden können, werden nachfolgend beschrieben.
  • Diabetes
  • Typ 2 Diabetes ist eine zunehmend häufige Erkrankung im Alter. Sie ist zunächst durch eine verringerte Sensitivität gegenüber Insulin und eine kompensatorische Erhöhung der Konzentrationen von zirkulierendem Insulin gekennzeichnet, wobei letzteres erforderlich ist, um normale Blutglucosespiegel beizubehalten. Erhöhte Insulinspiegel werden durch eine gestei gerte Sekretion von Pankreas-Betazellen verursacht, und die resultierende Hyperinsulinämie ist mit kardiovaskulären Komplikationen der Diabetes assoziiert. Wenn sich die Insulinresistenz verschlimmert, nimmt der Bedarf an den Pankreas-Betazellen kontinuierlich zu, bis die Pankreas nicht länger adäquate Insulinspiegel bereitstellen kann, was zu erhöhten Glucosespiegeln im Blut führt. Letztlich tritt eine offenkundige Hyperglykämie und eine Hyperlipidämie auf, was zu den verheerenden langfristigen Komplikationen führt, die mit Diabetes assoziiert sind, einschließlich kardiovaskulärer Erkrankung, Nierenversagen und Erblindung. Die exakten Mechanismen, die Typ 2 Diabetes verursachen, sind unbekannt; sie führen jedoch zu einem beeinträchtigten Glucosetransport im Skelettmuskel und zu einer erhöhten hepatischen Glucoseproduktion, zusätzlich zu einer und inadäquaten Insulinantwort. Veränderungen hinsichtlich der Ernährung sind oftmals wirkungslos, und daher braucht der Großteil der Patienten letztlich eine pharmazeutische Intervention, um das Fortschreiten der Komplikationen der Erkrankung zu verhindern und/oder zu verlangsamen. Zahlreiche Patienten können mit einem oder mit mehreren der zahlreich verfügbaren oralen antidiabetischen Mitteln behandelt werden (einschließlich Sulfonylharnstoffe), um die Insulinsekretion zu erhöhen. Beispiele für Sulfonylharnstoff-Wirkstoffe umfassen Metformin zur Unterdrückung der hepatischen Glucoseproduktion und Troglitazon, eine Insulin-sensitivierende Medikation. Trotz der Verwendung dieser Mittel sind 30 bis 40% der Diabetiker bei Verwendung dieser Medikationen nicht ausreichend kontrolliert, und sie benötigen subkutane Insulininjektionen. Darüber hinaus ist jede dieser Therapien mit Nebenwirkungen verbunden. Beispielsweise können Sulfonylharnstoffe eine Hypoglykämie verursachen, und Troglitazon kann eine schwere Hepatoxizität verursachen. Gegenwärtig gibt es einen Bedarf für neue und verbesserte Wirkstoffe für die Behandlung von prädiabetischen und diabetischen Patienten.
  • Wie oben beschrieben stimuliert die GSK3-Inhibierung Insulin-abhängige Prozesse und ist somit bei der Behandlung von Diabetes vom Typ 2 nützlich. Kürzlich unter Verwendung von Lithiumsalzen erhaltene Daten belegen diese Annahme. Es ist kürzlich berichtet worden, dass das Lithiumion die GSK3-Aktivität inhibiert. Klein et al., PNAS 93: 8455–9 (1996). Seit 1924 ist berichtet worden, dass Lithium antidiabetische Wirkungen aufweist, einschließlich der Fähigkeit, die Plasmaglucosespiegel zu verringern, die Aufnahme von Glycogen zu erhöhen, Insulin zu potenzieren, die Aktivität der Glucose-Synthase hochzuregulieren und die Glycogen-Synthese in der Haut, im Muskel und in Fettzellen zu stimulieren. Lithium wurde jedoch nicht im großen Umfang zur Verwendung bei der Inhibierung der GSK3-Aktivität akzeptiert, möglicherweise weil es dokumentierte Wirkungen auf andere molekulare Zielstrukturen als GSK3 gibt. Das Purin-Analog 5-Iodtubercidin, auch ein GSK3-Inhibitor, stimuliert ebenfalls die Glycogen-Synthese und antagonisiert die Inaktivierung der Glycogen-Synthase durch Glucagon und Vasopressin in Leberzellen der Ratte. Fluckiger-Isler et al., Biochem J 292: 85–91 (1993); und Massillon et al., Biochem J 299: 123–8 (1994). Es ist jedoch auch gezeigt worden, dass diese Verbindung auch andere Serin/Threonin- und Tyrosin-Kinasen inhibiert. Massillon et al., Biochem J 299: 123–8 (1994).
  • Alzheimer-Erkrankung
  • GSK3 ist ferner an den biologischen Regulationswegen beteiligt, welche die Alzheimer-Erkrankung (Alzheimer's disease, AD) betreffen. Die charakteristischen pathologischen Merkmale von AD sind extrazelluläre Plaques einer abnormal prozessierten Form des Amyloidvorläuferproteins (APP) dem sogenannten β-Amyloidpeptid (β-AP) und die Entwicklung eines intrazellulären, neurofibrillären Durcheinander, das gepaarte helikale Filamente (paired helical filaments, PHF) enthält, die weitestgehend aus hyperphosphoryliertem Tau-Protein bestehen. GSK3 ist eine von mehreren Kinasen, von denen herausgefunden wurde, dass sie das Tau-Protein in vitro an den abnormalen Stellen phosphorylieren, die charakteristisch für PHF-Tau sind, und es handelt sich um die einzige Kinase, von der gezeigt wurde, dass sie dies auch in lebendigen Zellen und Tieren vollzieht. Lovestone et al., Current Biology 4: 1077–86 (1994); und Brownlees et al., Neuroreport 8: 3251–3255 (1997). Des Weiteren blockiert der GSK3-Kinase-Inhibitor LiCl die Tau-Hyperphosphorylierung in Zellen. Stambolic et al., Current Biology 6: 1664–8 (1996). Somit kann die GSK3-Aktivität zur Erzeugung des neurophibrillären Durcheinanders beitragen und somit die zum Fortschreiten der Erkrankung. Es ist kürzlich gezeigt worden, dass GSK3β mit einem weiteren Schlüsselprotein der Pathogenese von AD in Verbindung steht, Presenillin 1 (PS1). Takashima et al., PNAS 95: 9637–9641 (1998). Mutationen im PS1-Gen führen zu einer erhöhten Produktion von β-AP, wobei die Autoren jedoch auch zeigen, dass das mutierte PS1-Protein stärker an GSK3β bindet und die Phosphorylierung von Tau, das in der gleichen Region von PS1 gebunden ist, potenziert.
  • Interessanterweise ist es auch gezeigt worden, dass ein weiteres GSK3-Substrat, β-Catenin, an PS1 bindet. Zhong et al., Nature 395: 698–702 (1998). Zytosolisches β-Catenin wird bei Phosphorylierung durch GSK3 dem Abbau zugeführt, und eine verringerte Aktivität von β-Catenin ist mit einer erhöhten Sensitivität von neuronalen Zellen für eine β-AP-induzierte neuronale Apoptose assoziiert. Somit kann eine gesteigerte Assoziation von GSK3β mit mutiertem PS1 für die verringerten β-Catenin-Spiegel verantwortlich sein, die in den Gehirnen von AD-Patienten mit mutiertem PS1 beobachtet wurden, und sie kann für die krankheitsbedingte Steigerung des neuronalen Zelltods verantwortlich sein. Im Einklang mit diesen Beobachtungen ist gezeigt worden, dass eine Injektion von GSK3-Antisense (jedoch nicht Sense) die pathologischen Wirkungen von β-AP auf Neuronen in vitro blockiert, was zu einer 24-stündigen Verschiebung beim Beginn des Zelltods führt und zu einem erhöhten Zellüberleben bei 1 Stunde von 12 auf 35%. Takashima et al., PNAS 90: 7789–93. (1993). In diesen letztgenannten Untersuchungen geht den Wirkungen auf den Zelltod (innerhalb von 3 bis 6 Stunden nach β-AP-Verabreichung) eine Verdopplung der intrazellulären GSK3-Aktivität vor, was darauf verweist, dass zusätzlich zu genetischen Mechanismen, welche die Nähe von GSK3 zu den Substraten erhöhen, β-AP tatsächlich die Aktivität von GSK3 erhöhen kann. Ein weiterer Beweis für die Rolle von GSK3 bei der AD wird durch die Beobachtung bereitgestellt, dass die Proteinexpressionsspiegel (in diesem Fall jedoch nicht die spezifische Aktivität) von GSK3 in post-synaptosomalem Überständen von AD vs. normalem Hirngewebe um 50% erhöht sind. Pei et al., J Neuropathol Exp 56: 70–78 (1997). Es wird daher angenommen, dass spezifische Inhibitoren von GSK3 dahingehend wirken, dass sie das Fortschreiten der Alzheimer-Erkrankung verlangsamen.
  • Andere Erkrankungen des ZNS
  • Zusätzlich zu den oben beschriebenen Wirkungen von Lithium gibt es eine lange Geschichte zur Verwendung von Lithium zur Behandlung der bipolaren Störung (manisch-depressives Syndrom). Diese klinische Antwort auf Lithium könnte eine Beteiligung der GSK3-Aktivität an der Ethiologie der bipolaren Störung widerspiegeln, wobei in diesem Fall GSK3-Inhibitoren für diese Indikation relevant sein könnten. In Einklang mit dieser Annahme ist kürzlich gezeigt worden, dass Valproat, ein weiterer Wirkstoff, der gewöhnlich bei der Behandlung der bipolaren Störung verwendet wird, ebenfalls ein GSK3-Inhibitor ist. Chen et al., J. Neurochemistry 72: 1327–1330 (1999). Ein Mechanismus, durch den Lithium und andere GSK3-Inhibitoren bei der Behandlung der bipolaren Störung wirken könnten, besteht darin, das Überleben von Neuronen zu erhöhen, die abnormal hohen Anregungsniveaus ausgesetzt sind, welche von dem Neurotransmitter Glutamat induziert werden. Nonaka et al., PNAS 95: 2642– 2647 (1998). Es wird angenommen, dass auch die Glutamat-induzierte, neuronale Exzitoxizität ein Hauptgrund für die Neurodegeneration ist, die mit einem akuten Schaden assoziiert ist, wie beispielsweise mit einer cerebralen Ischämie, einer traumatischen Hirnverletzung oder einer bakteriellen Infektion. Es wird des Weiteren angenommen, dass eine exzessive Glutamat-Signalübertragung ein Faktor bei der chronischen, neuronalen Schädigung ist, die in Krankheiten wie Alzheimer, Huntingdon, Parkinson, AIDS-assoziierter Demenz, amylotropher Leteralsklerose (AML) und Multiple Sklerose (MS) beobachtet werden. Thomas, J. Am. Geriatr. Soc. 43: 1279–89 (1995). Somit nimmt man an, dass GSK3-Inhibitoren bei der Behandlung von diesen und anderen neurodegenerativen Erkrankungen nützlich sind.
  • Immunpotenzierung
  • GSK3 phosphoryliert den Transkriptionsfaktor NF-AT und fördert dessen Export aus dem Nukleus, im Gegensatz zur Wirkung von Calcineurin. Reals et al., Science 275: 1930–33 (1997). Somit blockiert GSK3 eine Genaktivierung bei der frühen Immunantwort über NF-AT, und die GSK3-Inhibitoren könnten dazu neigen, die Aktivierung der Immunantworten zu verlängern oder zu ermöglichen. Somit wird angenommen, dass die GSK3-Inhibitoren die immunstimulatorischen Wirkungen von bestimmten Zytokinen verlängern und potenzieren, und eine solche Wirkung könnte das Potential dieser Zytokine bei der Tumor-Immuntherapie oder sogar für die Immuntherapie allgemein verstärken.
  • Weitere Störungen
  • Lithium hat weitere biologische Wirkungen. Es ist ein wirkungsvoller Stimulator der Hämatopoese, sowohl in vitro als auch in vivo. Hammond et al., Blood 55: 26–28 (1980). In Hunden eliminiert Lithiumcarbonat die wiederkehrende Neutropenie und normalisiert andere Zellzahlen im Blut. Doukas et al. Exp Hematol 14: 215–221 (1986). Wenn diese Wirkungen des Lithiums durch die Inhibierung von GSK3 vermittelt werden, dann könnten GSK3-spezifische Inhibitoren sogar breitere therapeutische Anwendungen aufweisen.
  • Da Inhibitoren von GSK3 bei der Behandlung von zahlreichen Erkrankungen nützlich sind, wäre die Infizierung von neuen Inhibitoren von GSK3 im hohen Maße wünschenswert.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Es ist nunmehr überraschenderweise entdeckt worden, dass die Aktivität der Glycogen-Synthase-Kinase 3 (GSK3) in vitro oder in vivo durch bestimmte auf Pyrazin basierende Derivate, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung bereitgestellt werden, inhibiert werden kann. Es ist herausgefunden worden, dass die Pyrazinderivate der vorliegenden Erfindung eine Spezifität für GSK3 aufweisen. Somit stellt die vorliegende Erfindung neue Verbindungen, Zusammensetzungen und Verfahren zur Inhibierung der Aktivität von GSK3 in vitro und für die Behandlung von GSK3-vermittelten Störungen in vivo bereit. Gemäß einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung neue Verbindungen mit GSK3-Inhibierungsaktivität der folgenden Formel (I):
    Figure 00080001
    in der:
    X und Y Stickstoff sind,
    A1 und A2 gegebenenfalls substituiertes Aryl oder Heteroaryl sind,
    R1, R2, R3 und R4 unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Hydroxyl und gegebenenfalls substituiertem Niederalkyl, Cycloniederalkyl, Alkylaminoalkyl, Niederalkoxy, Amino, Alkylamino, Alkylcarbonyl, Arylcarbonyl, Aralkylcarbonyl, Heteroarylcarbonyl, Heteroaralkylcarbonyl, Aryl und Heteroaryl,
    R'2 und R'3 unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff und gegebenenfalls substituiertem Niederalkyl,
    R5 und R6 unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Hydroxy, Halogen, Carboxyl, Nitro, Amino, Amido, Amidino, Imido, Imidino, Cyano und substituiertem oder unsubstituiertem Niederalkyl, Niederalkoxy, Alkylcarbonyl, Arylcarbonyl, Aralkylcarbonyl, Heteroarylcarbonyl, Heteroaralkylcarbonyl, Alkylcarbonyloxy, Arylcarbonyloxy, Aralkylcarbonyloxy, Alkylaminocarbonyloxy, Arylaminocarbonyloxy, Formyl, Niederalkylcarbonyl, Niederalkoxycarbonyl, Aminocarbonyl, Aminoaryl, Alkylsulfonyl, Sulfonylamino, Sulfonamido, Aminoalkoxy, Alkylamino, Arylamino, Aralkylamino, Heteroarylamino, Heteroaralkylamino, Alkylcarbonylamino, Alkylaminocarbonylamino, Arylaminocarbonylamino, Aralkylcarbonylamino, Heteroaralkylcarbonylamino, Aminocarbonylamino, Arylcarbonylamino, Heteroarylcarbonylamino, Amidino, Cycloalkyl, Cycloamido, Cyclothioamido, Cycloamidino, Heterocycloamidino, Cycloimido, Heterocycloimido, Cyanoguanidyl, Guanidinyl, Aryl, Biaryl, Heteroaryl, Heterobiaryl, Heterocyclyl, Heterocycloalkyl, Arylsulfonyl und Arylsulfonamido,
    und pharmazeutisch annehmbare Salze davon bereit.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren, Verbindungen und Zusammensetzungen können alleine oder in Kombination mit anderen pharmakologisch wirksamen Mitteln bei der Behandlung von Störungen, die durch die GSK3-Aktivität vermittelt werden, wie bei der Behandlung von Diabetes, Alzheimer-Erkrankung und anderen neurodegenerativen Störungen, Fettleibigkeit, atheriosklerotischer Herzkreislauf-Erkrankung, essentiellen Bluthochdruck, polyzystischen Ovarialsyndrom, Syndrom X, Ischämie, insbesondere cerebraler Ischämie, traumatischer Hirnverletzung, bipolarer Störung, Immunschwäche oder Krebs, verwendet werden.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Erfindungsgemäß werden Verbindungen, Zusammensetzungen und Verfahren für die entweder in vitro- oder in vivo-Inhibierung der Aktivität von Glycogen-Synthase-Kinase 3 (GSK3) bereitgestellt. Gemäß einem Aspekt liefert die vorliegende Erfindung neue Verbindungen mit GSK3-Inhibierungsaktivität der folgenden Formel (I):
    Figure 00100001
    in der:
    X und Y Stickstoff sind,
    A1 und A2 gegebenenfalls substituiertes Aryl oder Heteroaryl sind,
    R1, R2, R3 und R4 unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Hydroxyl und gegebenenfalls substituiertem Niederalkyl, Cycloniederalkyl, Alkylaminoalkyl, Niederalkoxy, Amino, Alkylamino, Alkylcarbonyl, Arylcarbonyl, Aralkylcarbonyl, Heteroarylcarbonyl, Heteroaralkylcarbonyl, Aryl und Heteroaryl,
    R'2 und R'3 unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff und gegebenenfalls substituiertem Niederalkyl,
    R5 und R6 unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Hydroxy, Halogen, Carboxyl, Nitro, Amino, Amido, Amidino, Imido, Imidino, Cyano und substituiertem oder unsubstituiertem Niederalkyl, Niederalkoxy, Alkylcarbonyl, Arylcarbonyl, Aralkylcarbonyl, Heteroarylcarbonyl, Heteroaralkylcarbonyl, Alkylcarbonyloxy, Arylcarbonyloxy, Aralkylcarbonyloxy, Alkylaminocarbonyloxy, Arylaminocarbonyloxy, Formyl, Niederalkylcarbonyl, Niederalkoxycarbonyl, Aminocarbonyl, Aminoaryl, Alkylsulfonyl, Sulfonylamino, Sulfonamido, Aminoalkoxy, Alkylamino, Arylamino, Aralkylamino, Heteroarylamino, Heteroaralkylamino, Alkylcarbonylamino, Alkylaminocarbonylamino, Aminocarbonylamino, Arylaminocarbonylamino, Aralkylcarbonylamino, Heteroaralkylcarbonylamino, Arylcarbonylamino, Heteroarylcarbonylamino, Amidino, Cycloalkyl, Cycloamido, Cyclothioamido, Cycloamidino, Heterocycloamidino, Cycloimido, Heterocycloimido, Guanidinyl, Cyanoguanidyl, Aryl, Biaryl, Heteroaryl, Heterobiaryl, Heterocyclyl, Heterocycloalkyl, Arylsulfonyl und Arylsulfonamido,
    und pharmazeutisch annehmbare Salze davon.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist mindestens einer von X und Y Stickstoff. Repräsentative Verbin dungen dieser Gruppe schließen solche Verbindungen ein, bei denen einer von X und Y Stickstoff ist und der andere von X und Y Sauerstoff oder gegebenenfalls substituierter Kohlenstoff ist. Vorzugsweise sind sowohl X als auch Y Stickstoff.
  • Die Konstituenten A1 und A2 können unabhängig ein aromatischer Ring mit 3 bis 10 Kohlenstoffringatomen und gegebenenfalls einem oder mehreren Ringheteroatomen sein. Somit können A1 und/oder A2 in einer Ausführungsform gegebenenfalls substituiertes carbocyclisches Aryl sein. Alternativ sind A1 und/oder A2 gegebenenfalls substituiertes Heteroaryl wie z. B. substituiertes oder unsubstituiertes Pyridyl, Pyrimidinyl, Thiazolyl, Indolyl, Imidazolyl, Oxadiazolyl, Tetrazolyl, Pyrazinyl, Triazolyl, Thiophenyl, Furanyl, Chinolinyl, Purinyl, Naphthyl, Benzothiazolyl, Benzopyridyl und Benzimidazolyl, die mit mindestens einer und nicht mehr als 3 Substitutionsgruppen substituiert sein können. Repräsentative Substitutionsgruppen können unabhängig ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus z. B. Nitro, Amino, Cyano, Halogen, Thioamido, Amidino, Oxamidino, Alkoxyamidino, Imidino, Guanidino, Sulfonamido, Carboxyl, Formyl, Niederalkyl, halogeniertem Niederalkyl (Halogenniederalkyl), Niederalkoxy, halogeniertem Niederalkoxy (Halogenniederalkoxy), Niederalkoxyalkyl, Niederalkylaminoniederalkoxy, Niederalkylcarbonyl, Niederaralkylcarbonyl, Niederheteroaralkylcarbonyl, Alkylthio, Aminoalkyl und Cyanoalkyl.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung haben A1 und/oder A2 die Formel:
    Figure 00120001
    wobei R8 und R9 unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Nitro, Amino, Cyano, Halogen, Thioamido, Amidino, Oxamidino, Alkoxyamidino, Imidino, Guanidinyl, Sulfonamido, Carboxyl, Formyl, Niederalkyl, halogeniertem Niederalkyl, Niederalkoxy, halogeniertem Niederalkoxy, Niederalkoxyalkyl, Niederalkylaminoniederalkoxy, Niederalkylcarbonyl, Niederaralkylcarbonyl, Niederheteroaralkylcarbonyl, Alkylthio, Aryl und Aralkyl. Am meisten bevorzugt ist A ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Nitropyridyl, Aminonitropyridyl, Cyanopyridyl, Cyanothiazolyl, Aminocyanopyridyl, Trifluormethylpyridyl, Methoxypyridyl, Methoxynitropyridyl, Methoxycyanopyridyl und Nitrothiazolyl.
  • In anderen Ausführungsformen der Erfindung kann mindestens einer von R1, R2, R3 und R4 Wasserstoff oder unsubstituiertes oder substituiertes Niederalkyl ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus halogeniertem Niederalkyl, Heterocycloaminoalkyl und Niederalkylaminoniederalkyl oder Niedralkylaminoniederalkyl sein. Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung schließen Verbindungen ein, in denen R1, R2 und R3 Wasserstoff sind und R4 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Methyl, Ethyl, Aminoethyl, Dimethylaminoethyl, Pyridylethyl, Piperidinyl, Pyrrolidinylethyl, Piperazinylethyl und Morpholinylethyl.
  • Andere bevorzugte Verbindungen der Erfindung schließen Verbindungen der Formel (I) ein, in denen mindestens einer von R5 und R6 ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus substituiertem und unsubstituiertem Aryl, Heteroaryl und Biaryl. In bevorzugten Ausführungsformen ist mindestens einer von R5 und R6 ein substituierter oder unsubstituierter Rest der Formel:
    Figure 00140001
    wobei R10, R11, R12, R13 und R14 unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Nitro, Amino, Cyano, Halogen, Thioamido, Carboxyl, Hydroxy und gegebenenfalls substituierten Niederalkyl, Niederalkoxy, Niederalkoxyalkyl, Halogenniederalkyl, Halogenniederalkoxy, Aminoalkyl, Alkylamino, Alkylthio, Alkylcarbonylamino, Aralkylcarbonylamino, Heteroaralkylcarbonylamino, Arylcarbonylamino, Heteroarylcarbonylamino, Aminocarbonyl, Niederalkylaminocarbonyl, Aminoaralkyl, Niederalkylaminoalkyl, Aryl, Heteroaryl, Cycloheteroalkyl, Aralkyl, Alkylcarbonyloxy, Arylcarbonyloxy, Aralkylcarbonyloxy, Arylcarbonyloxyalkyl, Alkylcarbonyloxyalkyl, Heteroarylcarbonyloxyalkyl, Aralkylcarbonyloxyalkyl und Heteroaralkcarbonyloxyalkyl. Besonders bevorzugt sind Verbindungen, bei denen R10, R11, R13 und R14 Wasserstoff sind und R12 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Niederalkyl, Hydroxy, Niederalkoxy, Halogenniederalkyl, Aminocarbonyl, Alkylaminocarbonyl, Morpholino, Piperidino und Cyano; R11, R13 und R14 Wasserstoff sind und R10 und R12 unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Niederalkyl, Hydroxy, Niederalkoxy, Halogenniederalkyl, Morpholino, Piperidino und Cyano; R10, R11, R13 und R14 Wasserstoff sind und R12 Heteroaryl ist; R10, R11, R13 und R14 Wasserstoff sind und R12 ein Heterocycloalkyl ist; und bei denen zumindest einer von R10, R11, R12, R13 und R14 Halogen ist und der Rest von R10, R11, R12, R13 und R14 Wasserstoff ist. Vorzugsweise ist mindestens einer von R5 und R7 ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Chlorphenyl, Dichlorphenyl, Fluorphenyl, Difluorphenyl, Bromphenyl, Dichlorfluorphenyl, Trifluormethylphenyl, Chlorfluorphenyl, Bromchlorphenyl, Bromfluorphenyl, Ethylphenyl, Methylchlorphenyl, Ethylchlorphenyl, Imidazolylphenyl, Cyanophenyl, Morpholinophenyl und Cyanochlorphenyl.
  • In repräsentativen Ausführungsformen der Erfindung können R5 und R6 substituiertes Alkyl, wie Aralkyl, Hydroxyalkyl, Aminoalkyl, Aminoaralkyl, Carbonylaminoalkyl, Alkylcarbonylaminoalkyl, Arylcarbonylaminoalkyl, Aralkylcarbonylaminoalkyl, Aminoalkoxyalkyl und Arylaminoalkyl; substituiertes Amino wie Alkylamino, Alkylcarbonylamino, Alkoxycarbonylamino, Arylalkylamino, Arylcarbonylamino, Alkylthiocarbonylamino, Arylsulfonylamino, Heteroarylamino Alkylcarbonylamino, Arylcarbonyamino, Heteroarylcarbonylamino, Aralkylcarbonylamino und Heteroaralkylcarbonylamino; oder substituiertes Carbonyl wie unsubstituiertes oder substituiertes Aminocarbonyl, Alkyloxycarbonyl, Aryloxycarbonyl, Aralkyloxycarbonyl und Alkylaminoalkyloxycarbonyl sein. In anderen Ausführungsformen kann R6 ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Amidino, Guanidino, Cycloimido, Heterocycloimido, Cycloamido, Heterocycloamido, Cyclothioamido und Heterocycloniederalkyl. In noch einer anderen Ausführungsform kann R6 Aryl oder Heteroaryl sein, wie z. B. substituiertes oder unsubstituiertes Pyridyl, Pyrimidinyl, Pyrrolidinyl, Thiazolyl, Indolyl, Imidazolyl, Oxadiazolyl, Oxazolidinyl, Oxazolidinonyl, Tetrazolyl, Pyrazinyl, Triazolyl, Thienyl, Furanyl, Chinolinyl, Pyrrolyopyridyl, Pyrazolonyl, Pyridazinyl, Benzothiazolyl, Benzopyridyl, Benzotriazolyl und Benzimidazolyl. Wie hierin verwendet, schließen repräsentative Heterocyclylgruppen solche ein, die nachfolgend gezeigt sind (bei denen der Verbindungspunkt der Substitutionsgruppe und den anderen nachfolgend gezeigten Substitutionsgruppen durch die obere linke Bindung vorliegt). Diese Heterocyclylgruppen können weiterhin substituiert sein und an verschiedenen Positionen gebunden sein, wie es Fachleuten im Bereich der organischen und medizinischen Chemie im Zusammenhang mit der Offenbarung hier offensichtlich ist.
  • Figure 00160001
  • Repräsentative Heteroarylgruppen schließen solche ein, die nachfolgend gezeigt sind. Diese Heteroarylgruppen können ferner substituiert sein und an verschiedenen Positionen gebunden sein, wie es Fachleuten im Bereich der organischen und medizinischen Chemie in Zusammenhang mit der Offenbarung hierin offensichtlich ist.
  • Figure 00170001
  • Repräsentative Cycloimido- und Heterocycloimidogruppen schließen solche ein, die nachfolgend gezeigt sind. Diese Cycloimido- und Heterocycloimidogruppen können ferner substituiert sein und an verschiedenen Positionen gebunden sein, wie es Fachleuten im Bereich der organischen und medizinischen Chemie in Zusammenhang mit der Offenbarung hierin offensichtlich ist.
  • Figure 00180001
  • Repräsentative substituierte Amidino- und Heterocycloamidogruppen schließen solche ein, die nachfolgend gezeigt sind. Diese Amidino- und Heterocycloamidinogruppen können ferner substituiert sein, wie es für Fachleute im Bereich der organischen und medizinischen Chemie im Zusammenhang mit der Offenbarung hierin offensichtlich ist.
  • Figure 00180002
  • Repräsentative substituierte Alkylcarbonylamino-, Alkyloxycarbonylamino-, Aminoalkyloxycarbonylamino- und Arylcarbonylaminogruppen schließen solche ein, die nachfolgend gezeigt sind. Diese Gruppen können ferner substituiert sein, wie es für Fachleute im Bereich der organischen und medizinischen Chemie in Zusammenhang mit der Offenbarung hierin offensichtlich ist.
  • Figure 00190001
  • Repräsentative substituierte Aminocarbonylgruppen schließen solche ein, die nachfolgend gezeigt sind. Diese Gruppen können ferner substituiert sein, wie es für Fachleute im Bereich der organischen und medizinischen Chemie in Zusammenhang mit der Offenbarung hierin offensichtlich ist.
  • Figure 00190002
  • Repräsentative substituierte Alkoxycarbonylgruppen schließen solche ein, die nachfolgend gezeigt sind. Diese Alkoxycarbonylgruppen können ferner substituiert sein, wie es für Fachleute im Bereich der organischen und medizinischen Chemie in Zusammenhang mit der Offenbarung hierin offensichtlich ist.
  • Figure 00200001
  • Bevorzugte repräsentative Verbindungen dieser Gruppe schließen {2-[(3-Amino-4-nitrophenyl)amino]ethyl}[6-(2,4-dichlorphenyl)-5-nitropyrazin-2-yl]amin, [6-(2,4-Dichlorphenyl)-5-nitropyrazin-2-yl]{2-[(4-nitrophenyl)amino]ethyl}amin, 4-[(2-{[6-(2,4-Dichlorphenyl)-5-nitropyrazin-2-yl]amino}ethyl)amino]benzolcarbonitril, [6-(2,4-Dichlorphenyl)-5-nitropyrazin-2-yl]methyl{2-[(4-nitrophenyl)amino]ethyl}amin, N-[5-({2-[(6-Amino-5-nitro(2-pyridyl))amino]ethyl}amino)-3-(2,4-dichlorphenyl)pyrazin-2-yl]acetamid, N-(2-{[6-(2,4-Dichlorphenyl)-5-nitropyrazin-2-yl]amino}ethyl)(tert-butoxy)-carboxamid, [5-Amino-6-(2,4-dichlorphenyl)pyrazin-2-yl]{2-[(6-amino-5-nitro(2-pyridyl))amino]ethyl}amin und N-[5-({2-[(6-Amino-5-nitro(2-pyridyl))amino]ethyl}amino)-3-(2,4-dichlorphenyl)pyrazin-2-yl]-2-(methylamino)acetamid ein.
  • In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung Zusammensetzungen bereit, die eine Menge der Verbindung von Formel (I) umfasst, die wirksam ist, um die GSK3-Aktivität in einem menschlichen oder in einem tierischen Subjekt zu modulieren, wenn sie zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger in dieses verabreicht wird.
  • In noch weiteren Ausführungsformen stellt die Erfindung die Verwendung einer Verbindung nach Formel (I) zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Inhibierung der GSK3-Aktivität in einem menschlichen oder in einem tierischen Subjekt bereit, bei dem man eine GSK3-inhibitorische Menge einer Verbindung nach Struktur (I) in das menschliche oder tierische Subjekt verabreicht.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ferner die Verwendung einer Verbindung nach Formel (I) zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von menschlichen oder tierischen Subjekten bereit, die an einer durch GSK3 vermittelten Erkrankung in einem menschlichen oder tierischen Subjekt leiden, bei man eine wirksame Menge der obigen Verbindung nach Formel (I) entweder allein oder in Kombination mit anderen therapeutisch wirksamen Mitteln in das menschliche oder tierische Subjekt verabreicht.
  • In noch weiteren Ausführungsformen stellt die vorliegende Erfindung Verbindungen nach Formel I (wie oben beschrieben) zur Verwendung als Pharmazeutikum bereit, sowie Verfahren zur Verwendung dieser Verbindungen bei der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von Diabetes, Alzheimer-Erkrankung und anderen neurodegenerativen Erkrankungen, Fettleibigkeit, atheriosklerotischer Herzkreislauf-Erkrankung, essentiellem Bluthochdruck, polyzystischem Ovarialsyndrom, Syndrom X, Ischämie, insbesondere cerebraler Ischämie, traumatischer Hirnverletzung, bipolarer Störung, Immundefizienz oder Krebs.
  • Wie oben und an anderer Stelle vorliegend verwendet, weisen die nachfolgenden Begriffe die nachstehend definierten Bedeutungen auf:
    "Glycogen-Synthase-Kinase 3" und "GSK3" werden vorliegend austauschbar verwendet und betreffen ein beliebiges Protein mit mehr als 60% Sequenzhomologie zu den Aminosäuren zwischen den Positionen 56 und 340 der Aminosäuresequenz des humanen GSK3-beta (Genbank Zugriffsnummer L33801). Um die prozentuale Homologie von zwei Aminosäuresequenzen oder zwei Nukleinsäuren zu bestimmen, werden die Sequenzen zum Zwecke eines optimalen Vergleichs übergestellt (z. B. können Lücken in die Sequenz eines Polypeptids oder einer Nukleinsäure eingebracht werden, um ein optimales Alignment mit dem anderen Polypeptid oder mit der anderen Nukleinsäure zu erreichen). Die Aminosäurereste oder Nukleotide an entsprechenden Aminosäurepositionen oder Nukleotidspositionen werden anschließend verglichen. Wenn eine Position in einer Sequenz durch denselben Aminosäurerest oder durch dasselbe Nukleotid besetzt ist wie in der entsprechenden Position in der anderen Sequenz, dann sind die Moleküle an dieser Position homolog (d. h. wie vorliegend verwendet entspricht eine Aminosäure- oder Nuleinsäure-"Homologie" einer Aminosäure- oder Nukleinsäure-"Identität"). Die prozentuale Homologie zwischen den zwei Sequenzen ist eine Funktion der Anzahl von identischen Positionen, die den Sequenzen gemein ist (d. h. Homologie = # der identischen Positionen/Gesamt # der Positionen × 100). GSK3 wurde ursprünglich durch seine Phosphorylierung der Glycogen-Synthase identifiziert, wie in Woodgett et al., Trends Biochem. Sci., 16: 177–81 (1991) beschrieben wurde. Durch Modulieren der GSK3-Kinase-Aktivität können stromabwärts gelegene Aktivitäten der GSK3-Aktivität inhibiert werden, oder alternativ stimuliert werden. Beispielsweise könnte die Glycogen-Synthase aktiviert werden, wenn die GSK3-Aktivität inhibiert wird, was zu einer erhöhten Glycogenproduktion führt. Von der GSK3 ist ferner bekannt, dass sie in einer Vielzahl von weiteren Zusammenhängen als Kinase wirkt, einschließlich z. B. bei der Phosphorylierung von c-jun, β-Catenin und Tau-Protein. Es ist klar, dass die Inhibierung der GSK3-Kinase-Aktivität zu einer Vielzahl von biologischen Wirkungen in einer Vielzahl von Zusammenhängen führen kann. Diese Erfindung ist jedoch nicht durch irgendwelche Theorien hinsichtlich des Mechanismus beschränkt, durch den die Erfindung funktioniert.
  • Wie vorliegend verwendet betrifft "GSK3-Inhibitor" eine Verbindung, die einen IC50 in Bezug auf GSK3 von nicht mehr als etwa 100 μM aufweist und üblicherweise nicht mehr als etwa 50 μM, wie in einem zellfreien Assay für die GSK3-inhibitorische Aktivität gemessen wird, der allgemein an anderer Stelle beschrieben wird. "IC50" ist die Konzentration des Inhibitors, welche die Aktivität eines Enzyms (z. B. GSK3) auf das halbmaximale Niveau verringert. Es ist entdeckt worden, dass repräsentative Verbindungen der vorliegenden Erfindung eine inhibitorische Aktivität gegenüber GSK3 ausüben. Erfindungsgemäße Verbindungen weisen vorzugsweise einen IC50 in Bezug auf GSK3 von nicht mehr als etwa 10 μM, stärker bevorzugt nicht mehr als etwa 5 μM und noch stärker bevorzugt nicht mehr als etwa 1 μM und am stärksten bevorzugt nicht mehr als etwa 200 nM auf, wie in einem zellfreien GSK3-Kinase-Assay gemessen wird.
  • "Gegebenenfalls substituiert" bezeichnet den Austausch von Wasserstoff mit einem einwertigen oder zweiwertigen Rest. Geeignete Substitutionsgruppen schließen Hydroxyl, Nitro, Amino, Imino, Cyano, Halogen, Thio, Thioamido, Amidino, Oxo, Oxamidino, Metoxamidino, Imidino, Guanidino, Sulfonamido, Carboxyl, Formyl, Niederalkyl, halogeniertem Niederalkyl, Niederalkoxy, halogeniertem Niederalkoxy, Niederalkoxyalkyl, Alkylcarbonyl, Arylcarbonyl, Aralkylcarbonyl, Heteroarylcarbonyl, Heretoalkylcarbonyl, Alkylthio, Aminoalkyl und Cyanoalkyl ein.
  • Die Substitutionsgruppe kann selbst substituiert sein. Die substituierte Gruppe an der Substitutionsgruppe kann Carboxyl, Halogen, Nitro, Amino, Cyano, Hydroxyl, Niederalkyl, Niederalkoxy, Aminocarbonyl, -SR, Thioamido, -SO3H, -SO2R oder Cycloalkyl sein, wobei R typischerweise Wasserstoff, Hydroxyl oder Niederalkyl ist.
  • Wenn der substituierte Substituent eine geradkettige Gruppe einschließt, kann die Substitution entweder innerhalb der Kette (z. B. 2-Hydroxypropyl, 2-Aminobutyl und dergleichen) oder an dem Kettenende (z. B. 2-Hydroxyethyl, 3-Cyanopropyl und dergleichen) auftreten. Substituierte Substituenten können geradkettige, verzweigte oder cyclische Anordnungen von kovalent gebundenen Kohlenstoff- oder Heteroatomen sein.
  • "Niederalkyl" bezeichnet hier verzweigte oder geradkettige Alkylgruppen, die 1 bis 10 Kohlenstoffatome enthalten, die unsubstituiert oder substituiert sind, z. B. mit einer oder mehreren Halogen-, Hydroxyl- oder anderen Gruppen, und z. B. Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, n-Butyl, t-Butyl, Neopentyl, Trifluormethyl und Pentafluorethyl einschließen.
  • "Alkylenyl" bezeichnet einen zweiwertigen geradkettigen oder verzweigten gesättigten aliphatischen Rest mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen. Typische Alkylenylgruppen, die in erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet werden, sind Niederalkylenylgruppen, die 1 bis etwa 6 Kohlenstoffatome in ihrer Hauptkette aufweisen. "Alkenyl" bezeichnet hier geradkettige, verzweigte oder cyclische Reste mit einer oder mehreren Doppelbindungen und 2 bis 20 Kohlenstoffatomen. "Alkinyl" bezieht sich hier auf geradkettige, verzweigte oder cyclische Reste mit einer oder mehreren Dreifachbindungen und 2 bis 20 Kohlenstoffatomen.
  • "Niederalkoxy" bezeichnet hier RO-, wobei R Niederalkyl ist. Repräsentative Beispiele für Niederalkoxygruppen schließen Methoxy, Ethoxy, t-Butoxy und Trifluormethoxy ein.
  • "Cycloalkyl" bezeichnet einen mono- oder polycyclischen, heterocyclischen oder carbocyclischen Alkylsubstituenten. Typische Cycloalkylsubstituenten weisen 3 bis 8 Hauptketten (d. h. Ring-)Atome auf, wobei jedes Hauptkettenatom entweder Kohlenstoff- oder ein Heteroatom ist. Der Begriff "Heterocycloalkyl" bezeichnet hier Cycloalkylsubstituenten, die 1 bis 5 und typischerweise 1 bis 4 Heteroatome in der Ringstruktur aufweisen. Geeignete Heteroatome, die in den erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet werden, sind Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel. Repräsentative Heterocycloalkylreste schließen Morpholino, Piperazinyl und Piperadinyl ein. Carbocycloalkylgruppen sind Cycloalkylgruppen, in denen alle Ringatome Kohlenstoff sind. Im Zusammenhang mit Cycloalkylsubstituenten bezeichnet der Begriff "polycyclisch" hier kondensierte und nicht-kondensierte alkylcyclische Strukturen.
  • "Halogen" bezeichnet hier einen Halogenrest wie Fluor, Chlor, Brom oder Iod. "Halogenalkyl" bezeichnet einen mit einem oder mehreren Halogenatomen substituierten Alkylrest. Der Begriff "halogeniertes Niederalkyl" ("Halogenniederalkyl") bezeichnet einen Niederalkylrest, der mit einem oder mehreren Halogenatomen substituiert ist. Der Begriff "Halogenalkoxy" bezeichnet einen Alkoxyrest, der mit einem oder mehreren Halogenatomen substituiert ist. Der Begriff "halogeniertes Niederalkoxy" ("Halogenniederalkoxy") bezeichnet einen Niederalkoxyrest, der mit einem oder mehreren Halogenatomen substituiert ist.
  • "Aryl" bezeichnet monocyclische und polycyclische aromatische Gruppen mit 3 bis 14 Hauptkettenkohlenstoff- oder -heteroatomen und schließt sowohl carbocyclische Arylgruppen als auch heterocyclische Arylgruppen sein. Carbocyclische Arylgruppen sind Arylgruppen, in denen alle Ringatome in dem aromatischen Ring Kohlenstoff sind. Der Begriff "Heteroaryl" bezeichnet hier Arylgruppen mit 1 bis 4 Heteroatomen als Ringatome in einem aromatischen Ring, wobei der Rest der Ringatome Kohlenstoffatome sind. Im Zusammenhang mit Arylsubstituenten bezeichnet der Begriff "polycyclisch" hier kondensierte und nicht-kondensierte cyclische Strukturen, in denen mindestens eine cyclische Struktur aromatisch ist, wie z. B. Benzodioxozolo (das eine heterocyclische Struktur kondensiert an eine Phenylgruppe aufweist, d. h.
    Figure 00260001
    oder Naphthyl. Beispielhafte Arylreste, die als Substituenten in den erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet werden, sind Phenyl, Pyridyl, Pyrimidinyl, Thiazolyl, Indolyl, Imidazolyl, Oxadiazolyl, Tetrazolyl, Pyrazinyl, Triazolyl, Thiophenyl, Furanyl, Chinolinyl, Purinyl, Naphthyl, Benzothiazolyl, Benzopyridyl und Benzimidazolyl.
  • "Aralkyl" bezeichnet eine Alkylgruppe, die mit einer Arylgruppe substituierte ist. In der Regel weisen Aralkylgruppen, die in erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet werden, 1 bis 6 Kohlenstoffatome auf, die in dem Alkylteil der Aralkylgruppe eingebracht sind. Geeignete Aralkylgruppen, die in den erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet werden, schließen beispielsweise Benzyl und Picolyl ein.
  • "Amino" bezeichnet hier die Gruppe -NH2. Der Begriff "Alkylamino" bezeichnet hier die Gruppe -NRR', wobei R und R' jeweils unabhängig ausgewählt sind aus Wasserstoff oder einem Niederalkyl. Der Begriff "Arylamino" bezeichnet hier die Gruppe -NRR', wobei R Aryl und R' Wasserstoff, ein Niederalkyl oder ein Aryl ist. Der Begriff "Aralkylamino" bezeichnet hier die Gruppe -NRR', wobei R ein Niederaralkyl und R' Wasserstoff, Niederalkyl, ein Aryl oder ein Aralkyl ist.
  • Der Begriff "Arylcycloalkylamino" bezeichnet hier die Gruppe Aryl-Cycloalkyl-NH-, wobei Cycloalkyl eine zweiwertige Cycloalkylgruppe ist. In der Regel weist Cycloalkyl 3 bis 6 Hauptkettenatome auf, von denen gegebenenfalls 1 bis etwa 4 Heteroatome sind. Der Begriff "Aminoalkyl" bezeichnet eine Alkylgruppe, die terminal mit einer Aminogruppe substituiert ist.
  • Der Begriff "Alkoxyalkyl" bezeichnet die Gruppe -Alk1-O-Alk2, wobei Alk1 Alkylenyl oder Alkenyl und Alk2 Alkyl oder Alkenyl ist. Der Begriff "Niederalkoxyalkyl" bezeichnet ein Alkoxyalkyl, wobei Alk1 Niederalkylenyl oder Niederalkenyl und Alk2 Niederalkyl oder Niederalkenyl ist. Der Begriff "Aryloxyalkyl" bezeichnet die Gruppe -Alkylenyl-O-Aryl. Der Begriff "Aralkoxyalkyl" bezeichnet die Gruppe -Alkylenyl-O-Aralkyl, wobei Aralkyl ein Niederaralkyl ist.
  • Der Begriff "Alkoxyalkylamino" bezeichnet hier die Gruppe -NR(Alkoxylalkyl), wobei R typischerweise Wasserstoff, Niederaralkyl oder Niederalkyl ist. Der Begriff "Aminoniederalkoxyalkyl" bezeichnet hier ein Aminoalkoxyalkyl, bei dem das Alkoxyalkyl ein Niederalkoxyalkyl ist.
  • Der Begriff "Aminocarbonyl" bezeichnet hier die Gruppe -C(O)-NH2. "Substituiertes Aminocarbonyl" bezeichnet hier die Gruppe -C(O)-NRR', wobei R Niederalkyl und R' Wasserstoff oder ein Niederalkyl ist. Der Begriff "Arylaminocarbonyl" bezeichnet hier die Gruppe -C(O)-NRR', wobei R ein Aryl und R' Wasserstoff, Niederalkyl oder Aryl ist. "Aralkylaminocarbonyl" bezeichnet hier die Gruppe -C(O)-NRR', wobei R Niederaralkyl und R' Wasserstoff, Niederalkyl, Aryl oder Niederaralkyl ist.
  • "Aminosulfonyl" bezeichnet hier die Gruppe -S(O)2-NH2. "Substituiertes Aminosulfonyl" bezeichnet hier die Gruppe -S(O)2-NRR', wobei R Niederalkyl und R' Wasserstoff oder ein Niederalkyl ist. Der Begriff "Aralkylaminosulfonlyaryl" bezeichnet hier die Gruppe -Aryl-S(O)2-NH-aralkyl, wobei das Aralkyl ein Niederaralkyl ist.
  • "Carbonyl" bezeichnet die zweiwertige Gruppe -C(O)-.
  • "Carbonyloxy" bezeichnet im Allgemeinen die Gruppe -C(O)-O-. Solche Gruppen schließen Ester, -C(O)-O-R, ein, bei denen R Niederalkyl, Cycloalkyl, Aryl oder Niederaralkyl ist. Der Begriff "Carbonyloxycycloalkyl" bezeichnet im Allgemeinen hier sowohl ein "Carbonyloxycarbocycloalkyl" als auch ein "Carbonyloxyheterocycloalkyl", d. h. dass R ein Carbocycloalkyl bzw. ein Heterocycloalkyl ist. Der Begriff "Arylcarbonyloxy" bezeichnet hier die Gruppe -C(O)-O-Aryl, wobei Aryl ein monocyclisches oder polycyclisches Carbocycloaryl oder Heterocycloaryl ist. Der Begriff "Aralkylcarbonyloxy" bezeichnet hier die Gruppe -C(O)-O-Aralkyl, wobei das Aralkyl ein Niederaralkyl ist.
  • Der Begriff "Sulfonyl" bezeichnet hier die Gruppe -SO2-. "Alkylsulfonyl" bezeichnet ein substituiertes Sulfonyl der Struktur -SO2R-, in der R Alkyl ist. Alkylsulfonylgruppen, die in erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet werden, sind in der Regel Niederalkylsulfonylgruppen mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen in der Hauptkettenstruktur. Somit schließen typische Alkylsulfonylgruppen, die in erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet werden, Methylsulfonyl (d. h., R ist Methyl), Ethylsulfonyl (d. h., R ist Ethyl) und Propylsulfonyl (d. h., R ist Propyl) ein. Der Begriff "Arylsulfonyl" bezeichnet hier die Gruppe -SO2-Aryl. Der Begriff "Aralkylsulfonyl" bezeichnet hier die Gruppe -SO2-Aralkyl, wobei das Aralkyl Niederaralkyl ist. Der Begriff "Sulfonamido" bezeichnet hier -SO2NH2.
  • Der Begriff "Carbonylamino" bezeichnet hier die zweiwertige Gruppe -NH-C(O)-, in der das Wasserstoffatom des Amidstickstoffs der Carbonylaminogruppe durch eine Niederalkyl-, Aryl- oder Niederaralkylgruppe ersetzt sein kann. Solche Gruppen schließen Reste wie Carbamatester (-NH-C(O)-O-R) und Amide -NH-C(O)-NR'-R ein, wobei R und R' geradkettig oder verzweigtes Niederalkyl, Cycloalkyl oder Aryl oder Niederaralkyl sind. Der Begriff "Niederalkylcarbonylamino" bezeichnet Alkylcarbonylamino, wobei R ein Niederalkyl mit 1 bis etwa 6 Kohlenstoffatomen in der Hauptkettenstruktur ist. Der Begriff "Arylcarbonylamino" bezeichnet die Gruppe -NH-C(O)-R, wobei R ein Aryl ist. Gleichermaßen bezeichnet der Begriff "Aralkylcarbonylamino" Carbonylamino, wobei R ein Niederaralkyl ist.
  • Der Begriff "Guanidino" oder "Guanidyl" bezeichnet hier Reste, die von Guanidin, H2N-C(=NH)-NH2, abgeleitet sind. Solche Reste umfassen diejenigen, die an dem Stickstoffatom gebunden sind, das die formale Doppelbindung trägt (die "2"-Position von Guanidin, z. B. Diaminomethylenamino, (H2N)2C=NH-) und diejenigen, die an einem der Stickstoffatome gebunden sind, die formal eine Einfachbindung tragen (die "1"- und/oder "3"-Positionen von Guanidin, z. B. H2N-C(=NH-NH-). Die Wasserstoffatome irgendeines Stickstoffs können durch einen geeigneten Substituenten wie Niederalkyl, Aryl oder Niederaralkyl ersetzt sein.
  • Der Begriff "Amidino" bezeichnet hier die Reste R-C(=N)-NR'- (der Rest befindet sich am "N1"-Stickstoff) und R(NR')C=N- (der Rest befindet sich an dem "N2"-Stickstoff), wobei R und R' Wasserstoff, Niederalkyl, Aryl oder Niederaralkyl sein können.
  • Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können problemlos unter Verwendung der vorliegend beschriebenen Verfahren synthetisiert werden, oder durch andere Verfahren, die im Stand der Technik hinreichend bekannt sind.
  • Die GSK3-Inhibitorverbindungen der vorliegenden Erfindung können unter Verwendung bekannter Verfahren gereinigt werden, wie beispielsweise durch Chromatographie, Kristallisierung und Ähnliches.
  • Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung weisen vorzugsweise eine inhibitorische Aktivität auf, die im Vergleich mit mindestens einer weiteren Art von Kinase im Wesentlichen verhältnismäßig selektiv in Bezug auf GSK3 ist. Wie vorliegend verwendet bezeichnet der Begriff "selektiv" eine verhältnismäßig größere Potenz für die Inhibierung gegenüber GSK3 im Vergleich zu mindestens einer weiteren Art von Kinase. Vorzugsweise sind die GSK3-Inhibitoren der vorliegenden Erfindung im Vergleich mit mindestens zwei weiteren Arten von Kinasen selektiv in Bezug auf GSK3. Kinase-Aktivitäts-Assays für Kinasen, bei denen es sich nicht um GSK3 handelt, sind allgemein bekannt. Siehe beispielsweise Havlicek et al., J. Med. Chem., 40: 408–12 (1997), das vorliegend durch Bezugnahme eingeschlossen ist. Die GSK3-Selektivität kann wie folgt quantifiziert werden: GSK3-Selektivität = IC50(andere Kinase) ÷ IC50(GSK3), wobei ein GSK3-Inhibitor selektiv für GSK3 ist, wenn der IC50(andere Kinase) > IC50(GSK3) ist. Ein Inhibitor, der selektiv für GSK3 ist, zeigt somit eine GSK3-Selektivität von mehr als 1-fach in Bezug auf die Inhibierung einer Kinase, bei der es sich nicht um GSK3 handelt. Wie vorliegend verwendet bezieht sich der Begriff "andere Kinase" auf eine Kinase, bei der es sich nicht um GSK3 handelt. Solche Selektivitäten werden üblicherweise in einem zellfreien Assay, der in Beispiel 20 beschrieben wird, gemessen.
  • Üblicherweise weisen die GSK3-Inhibitoren der vorliegenden Erfindung im Vergleich zu einer anderen Kinase die mindestens 2-fache Selektivität von (d. h., IC50(andere Kinase) ÷ IC50(GSK3)) für GSK3 auf, wobei sie typischerweise die mindestens 5-fache Selektivität aufweisen. Üblicherweise weisen die GSK3-Inhibitoren der vorliegenden Erfindung im Vergleich zu mindestens einer weiteren Kinase die mindestens 10-fache, vorzugsweise die mindestens etwa 100-fache, und stärker bevorzugt die mindestens etwa 1000-fache Selektivität für GSK3 auf.
  • Die GSK3-inhibitorische Aktivität kann problemlos unter Verwendung der vorliegend beschriebenen Assays nachgewiesen werden sowie auch unter Verwendung von Assays, die dem Fachmann aus dem Stand der Technik bekannt sind. Beispielhafte Verfahren zur Identifizierung spezifischer Inhibitoren von GSK3 umfassen sowohl zellfreie als auch auf Zellen basierende GSK3-Kinase-Assays. Ein zellfreier GSK3-Kinase-Assay weist Inhibitoren nach, die durch direkte Interaktion mit dem Polypeptid GSK3 wirken, während ein auf Zellen basierender GSK3-Kinase-Assay Inhibitoren identifizieren kann, die entweder durch die direkte Interaktion mit GSK3 selbst oder durch Stören der GSK3-Expression oder der post-translationalen Prozessierung wirken, die erforderlich ist, um reifes aktives GSK3 herzustellen.
  • Im Allgemeinen kann ein zellfreier GSK3-Kinase-Assay problemlos durchgeführt werden, indem man: (1) GSK3 mit einem Peptidsubstrat, radiomarkiertem ATP (wie beispielsweise γ33P- oder γ32P-ATP, beides erhältlich von Amersham, Arlington Heights, Illinois), Magnesiumionen und wahlweise mit einem oder mehreren Kandidateninhibitoren inkubiert; (2) die Mischung für einen Zeitraum inkubiert, der den Einbau von radiomarkiertem Phosphat in das Peptidsubstrat mittels GSK3-Aktivität ermöglicht; (3) die gesamte oder einen Teil der Enzymreaktionsmischung in einen getrennten Behälter überführt, üblicherweise in die Vertiefung einer Mikrotiterplatte, die eine gleichartige Menge eines Einfang-Liganden (capture ligand) enthält, welcher in der Lage ist, an einen Anker-Liganden des Peptidsubstrats zu binden; (4) wäscht, um nicht reagiertes, radiomarkiertes ATP zu entfernen; und anschließend (5) die Menge von 33P oder 32P, die in jeder Vertiefung verblieben ist, quantifiziert. Diese Menge stellt die Menge an radiomarkiertem Phosphat dar, die in das Peptidsubstrat eingebaut worden ist. Die Inhibierung lässt sich als Verringerung beim Einbau von radiomarkiertem Phosphat in das Peptidsubstrat beobachten.
  • Geeignete Peptidsubstrate zur Verwendung in den zellfreien Assays können beliebige Peptide, Polypeptide oder synthetische Peptidderivate sein, die durch die GSK3 in Gegenwart einer geeigneten Menge ATP phosphoryliert werden können. Geeignete Peptidsubstrate können auf Teilen von Sequenzen von verschiedenen natürlichen Proteinsubstraten von GSK3 basieren, und sie können ferner N-terminale oder C-terminale Modifikationen oder Extensionen umfassen, einschließlich Abstandssequenzen (spacer sequences) und Anker-Liganden. Somit kann das Peptidsubstrat innerhalb eines größeren Polypeptids liegen, oder es kann ein isoliertes Peptid sein, das für die Phosphorylierung durch GSK3 erstellt worden ist.
  • Beispielsweise kann ein Peptidsubstrat auf Basis einer Subsequenz des DNA-Bindungsproteins CREB erstellt werden, wie beispielsweise die SGSG-verknüpfte CREB-Peptidsequenz innerhalb des CREB-DNA-Bindungsproteins, welche in Wang et al., Anal. Biochem., 220: 397–402 (1994) beschrieben ist, wobei die Veröffentlichung vorliegend durch Bezugnahme eingeschlossen ist. In dem von Wang et al. beschriebenen Assay wird das C-terminale Serin in dem SXXXS-Motiv des CREB-Peptids enzymatisch durch eine cAMP-abhängige Proteinkinase (PKA) präphosphoryliert, ein Schritt, der erforderlich ist, um das N-terminale Serin in dem Motiv durch GSK3 phosphorylierbar zu machen. Als Alternative kann ein modifiziertes CREB-Peptidsubstrat verwendet werden, das dasselbe SXXXS-Motiv aufweist und ferner einen N-terminalen Anker-Liganden enthält, welches jedoch mit einem C-terminal prä-phosphorylierten Serin synthetisiert wird (ein solches Substrat ist kommerziell von Chiron Technologies PTY Ltd., Clayton, Australien verfügbar). Die Phosphorylierung des zweiten Serins in dem SXXXS-Motiv während der Peptidsynthese beseitigt die Notwendigkeit einer enzymati schen Phosphorylierung dieses Rests mit PKA in einem separaten Schritt, und der Einbau eines Anker-Liganden ermöglicht das Einfangen des Peptidsubstrats nach seiner Reaktion mit GSK3.
  • Im Allgemeinen kann das für einen Kinase-Aktivitäts-Assay verwendete Peptidsubstrat eine oder mehrere Stellen enthalten, die von GSK3 phosphorylierbar sind und eine oder mehrere weitere Stellen, die durch andere Kinasen phosphorylierbar sind, jedoch nicht durch GSK3. Diese anderen Stellen können daher prä-phosphoryliert werden, um ein Motiv zu erzeugen, dass durch GSK3 phosphorylierbar ist. Der Begriff "prä-phosphoryliert" bezieht sich vorliegend auf die Phosphorylierung eines Substratpeptids mit nicht-radiomarkierten Phosphat vor der Durchführung eines Kinase-Assays unter Verwendung dieses Substratpeptids. Eine solche Prä-Phosphorylierung kann praktischerweise während der Synthese des Peptidsubstrats durchgeführt werden.
  • Das SGSG-verknüpfte CREB-Peptid kann an einen Anker-Liganden geknüpft werden, wie beispielsweise an Biotin, wobei das Serin in der Nähe des C-Terminus zwischen P und Y präphosphoryliert wird. Wie vorliegend verwendet, bezeichnet der Begriff "Anker-Ligand" (anchor ligand) einen Liganden; der an eine Peptidsubstrat angeheftet werden kann, um das Einfangen des Peptidsubstrats mit einem Einfang-Liganden zu ermöglichen, und der so funktioniert, dass er das Peptidsubstrat während der Waschschritte an einer Stelle hält, und somit die Entfernung von nicht-reagiertem, radiomarkiertem ATP ermöglicht. Ein beispielhafter Anker-Ligand ist Biotin. Der Begriff "Einfang-Ligand" (capture ligand) bezeichnet vorliegend ein Molekül, das einen Anker-Liganden mit hoher Affinität binden kann und das an eine feste Struktur angeheftet ist. Beispiele für gebundene Einfang-Liganden umfassen beispielsweise Avidin- oder Streptavidin-beschichtete Mikrotiterplattenvertiefungen oder Agarosekügelchen (agarose beads). Kügelchen, die Einfang- Liganden tragen, können ferner mit einem Szintillant kombiniert werden, um ein Mittel zum Nachweis von eingefangenem, radiomarkiertem Substratpeptid bereitzustellen, oder das Szintillant kann dem eingefangenen Peptid in einem späteren Schritt zugesetzt werden.
  • Das eingefangene, radiomarkierte Peptidsubstrat kann in einem Szintillationszähler unter Verwendung bekannter Verfahren quantifiziert werden. Das in dem Szintillationszähler nachgewiesene Signal wird proportional zur GSK3-Aktivität sein, wenn die Enzymreaktion unter Bedingungen durchgeführt wurde, bei denen lediglich ein begrenzter Anteil (weniger als 20%) des Peptidsubstrats phosphoryliert ist. Wenn ein Inhibitor während der Reaktion vorhanden ist, wird die GSK3-Aktivität verringert sein, und ein geringerer Teil von radiomarkiertem Phosphat wird somit in das Peptidsubstrat eingebaut werden. Dementsprechend wird ein geringeres Szintillationssignal nachgewiesen werden. Die GSK3-inhibitorische Aktivität wird somit als Verringerung des Szintillationssignals im Vergleich zu dem Signal, das in einer Negativkontrolle beobachtet wird, bei der kein Inhibitor während der Reaktion vorhanden ist, nachgewiesen werden. Dieser Assay ist ausführlicher in dem nachstehenden Beispiel 265 beschrieben.
  • Ein auf Zellen basierender GSK3-Kinase-Aktivitäts-Assay verwendet üblicherweise eine Zelle, die sowohl GSK3 als auch ein GSK3-Substrat exprimieren kann, wie beispielsweise eine Zelle, die mit Genen transformiert ist, welche für GSK3 und sein Substrat kodieren, einschließlich regulatorischer Kontrollsequenzen für die Expression der Gene. Bei der Durchführung eines auf Zellen basierenden Assays wird die Zelle, welche in der Lage ist, die Gene zu exprimieren, in Gegenwart einer Verbindung der vorliegenden Erfindung inkubiert. Die Zelle wird lysiert, und es wird der Anteil des Substrats in phosphorylierter Form bestimmt, z. B. durch Beobachten seiner Mobili tät relativ zur nicht phosphorylierten Form in einer SDS-PAGE, oder durch Bestimmung der Substratmenge, die von einem Antikörper erkannt wird, der spezifisch für die phosphorylierte Form des Substrats ist. Das Ausmaß der Phosphorylierung des Substrats ist ein Anzeichen für die inhibitorische Aktivität der Verbindung, d. h. die Inhibierung wird als Verringerung in der Phosphorylierung im Vergleich zu dem Assay nachgewiesen, der ohne vorhandenen Inhibitor durchgeführt wird. Die GSK3-inhibitorische Aktivität, die in einem auf Zellen basierenden Assay nachgewiesen wird, kann beispielsweise auf die Inhibierung der Expression von GSK3 oder auf die Inhibierung der Kinase-Aktivität von GSK3 zurückzuführen sein.
  • Somit können ein auf Zellen basierender Assays auch verwendet werden, um spezifisch die Aktivitäten nachzuweisen, welche durch die GSK3-Inhibierung verursacht werden, wie beispielsweise die Inhibierung von der Tau-Protein-Phosphorylierung, die Potenzierung der Insulin-Signalübertragung und Ähnliches. Um beispielsweise die Fähigkeit eines GSK3-Inhibitors zu überprüfen, eine Alzheimer-ähnliche Phosphorylierung des mit Mikrotubuli assoziierten Proteins Tau zu inhibieren, könnten Zellen mit humanen GSK3β und humanem Tau-Protein co-transfiziert werden und anschließend mit einem oder mit mehreren Kandidaten-Inhibitoren inkubiert werden. Verschiedene Säugetierzelllinien und Expressionsvektoren können für diese Art von Assay verwendet werden. Beispielsweise können COS-Zellen sowohl mit einem humanen GSK3β-Expressionsplasmid gemäß dem in Stambolic et al., 1996, Current Biology 6: 1664–68 beschriebenen Protokoll als auch mit einem Expressionsplasmid, wie beispielsweise pSG5, das eine für das humane Tau-Protein kodierende Sequenz unter einem frühen SV40-Promotor enthält, transfiziert werden. Siehe auch Goedert et al., EMBO J., 8: 393–399 (1989). Eine Alzheimer-ähnliche Phosphorylierung von Tau kann problemlos mit einem spezifischen Antikörper nachgewiesen werden, nachdem die Zellen lysiert wurden, wie beispielsweise mit AT8, der von Polymedco Inc. (Cortlandt Manor, New York) erhalten werden kann. Dieser Assay wird in den nachfolgenden Beispielen ausführlicher beschrieben.
  • In ähnlicher Weise kann die Fähigkeit von GSK3-Inhibitorverbindungen zur Potenzierung der Insulinsignalübertragung durch Aktivierung der Glycogen-Synthase problemlos unter Verwendung eines auf Zellen basierenden Glycogen-Synthase-Aktivitäts-Assays festgestellt werden. Dieser Assay verwendet Zellen, die auf eine Insulinstimulation durch eine steigende Aktivität der Glycogen-Synthase reagieren, wie beispielsweise die CHO-HIRC-Zelllinie, die den Wildtyp-Insulinrezeptor überexprimiert (~100000 Bindungsstellen/Zelle). Die CHO-HIRC-Zelllinie kann wie in Moller et al., J. Biol. Chem., 265: 14979–14985 (1990) und Moller et al., Mol. Endocrinol., 4: 1183–1191 (1990) hergestellt werden. Der Assay kann durch Inkubieren von CHO-HIRC-Zellen, die kein Serum enthalten (serum-starved), in Gegenwart von verschiedenen Konzentrationen der erfindungsgemäßen Verbindungen im Medium durchgeführt werden, gefolgt von einer Zelllyse am Ende der Inkubationszeit. Die Aktivität der Glycogen-Synthase im Lysat kann wie bei Thomas et al., Anal. Biochem., 25: 486–499 (1968) nachgewiesen werden. Die Aktivität der Glycogen-Synthase wird für jede Probe als prozentualer Wert der maximalen Glycogen-Synthase-Aktivität berechnet, wie es in Thomas et al., siehe oben, beschrieben ist, und sie wird als Funktion der Konzentration des Kandidaten-GSK3-Inhibitors aufgetragen. Die Konzentration des Kandidaten-GSK3-Inhibitors, welche die Aktivität der Glycogen-Synthase auf die Hälfte ihres maximalen Niveaus anhebt (d. h. der EC50) kann durch Anpassen einer sigmoidalen Kurve mit vier Parametern unter Verwendung von Routineverfahren zur Kurvenanpassung, die im Stand der Technik hinreichend bekannt sind, berechnet werden. Dies wird ausführlicher im nachfolgenden Beispiel 266 gezeigt.
  • GSK3-Inhibitoren können problemlos mittels Screening auf eine in vivo-Aktivität untersucht werden, beispielsweise unter Verwendung von Verfahren, die dem Fachmann hinreichend bekannt sind. Beispielsweise können Kandidatenverbindungen mit einer potentiellen therapeutischen Aktivität bei der Behandlung von Diabetes vom Typ 2 problemlos durch Nachweisen einer Fähigkeit zur Verbesserung der Glucosetoleranz in Tiermodellen von Typ 2 Diabetes identifiziert werden. Die Kandidatenverbindung kann auf eine von mehreren möglichen Arten vor Verabreichen eines Glucosebolus, entweder in diabetische Mäuse (z. B. KK, db/db, ob/ob) oder in diabetische Ratten (z. B. Zucker Fa/Fa oder GK) dosiert werden. Nach Verabreichung der Kandidatenverbindung und Glucose werden in vorbestimmten Zeitintervallen Blutproben entnommen und auf Serumglucose und Insulinspiegel untersucht. Eine verbesserte Beseitigung von Glucose in Abwesenheit von erhöhten Sekretionsspiegeln von endogenem Insulin kann als Insulinsensitivierung angesehen werden und kann für die Verbindungswirksamkeit indikativ sein. Eine ausführliche Beschreibung dieses Assays wird in den nachstehenden Beispielen angegeben.
  • Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in Form von Salzen verwendet werden, die von anorganischen oder organischen Säuren abgeleitet sind. Diese Salze schließen die Folgenden ein, ohne auf diese eingeschränkt zu sein: Acetat, Adipat, Alginat, Citrat, Aspartat, Benzoat, Benzolsulfonat, Hydrogensulfat, Butyrat, Camphorat, Camphersulfonat, Digluconat, Cyclopentanpropionat, Dodecylsulfat, Ethansulfonat, Glucoheptanoat, Glycerophosphat, Hemisulfat, Heptanoat, Hexanoat, Fumarat, Hydrochlorid, Hydrobromid, Hydroiodid, 2-Hydroxyethansulfonat, Lactat, Maleat, Methansulfonat, Nikotinat, 2-Napthalensulfonat, Oxalat, Pamoat, Pektinat, Sulfat, 3-Phenylpropionat, Picrat, Pivalat, Propionat, Succinat, Tartrat, Thiocyanat, p-Toluolsulfonat und Undecanoat. Die basischen Stickstoff-haltigen Gruppen können auch mit solchen Mit teln wie Niederalkylhalogeniden wie Methyl-, Ethyl-, Propyl- und Butylchlorid, -bromide und -iodide; Dialkylsulfate wie Dimethyl-, Diethyl-, Dibutyl- und Diamylsulfate; Lankgettenhalogenide wie Decyl-, Lauryl-, Myristyl- und Stearylchloride, -bromide und -iodide; Aralkylhalogenide wie Benzyl- und Phenethylbromide und andere quaternisiert werden. Dadurch werden wasser- oder öllösliche oder dispergierbare Produkte erhalten.
  • Beispiele für Säuren, die verwendet werden können, um pharmazeutisch annehmbare Additionssalze zu bilden, schließen anorganische Säuren wie Salzsäure, Schwefelsäure und Phosphorsäure sowie organische Säuren wie Oxalsäure, Maleinsäure, Bernsteinsäure und Zitronensäure ein. Basische Additionssalze können in situ währen der letzten Isolierung und Reinigung der Verbindungen von Formel (I) oder getrennt durch Reaktion von Carbonsäureresten mit einer geeigneten Base wie das Hydroxid, Carbonat oder Hydrogencarbonat eines pharmazeutisch annehmbaren Metallkations oder mit Ammoniak oder einem organischen primären, sekundären oder tertiären Amin hergestellt werden. Pharmazeutisch annehmbare Salze schließen Kationen auf Basis der Alkali- und Erdalkalimetalle wie Natrium, Lithium, Kalium, Calcium, Magnesium und Aluminiumsalzen sowie nicht-toxische Ammonium-, quaternäre Ammonium- und Aminkationen einschließlich Ammonium, Tetramethylammonium, Tetraethylammonium, Methylamin, Dimethylamin, Trimethylamin, Triethylamin und Ethylamin ein. Andere repräsentative organischen Amine, die zur Bildung von Baseadditionssalzen geeignet sind, schließen Diethylamin, Ethylendiamin, Ethanolamin, Diethanolamin und Piperazin ein.
  • Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auf eine Vielzahl von Arten verabreicht werden, einschließlich enteraler, parenteraler und topischer Verabreichungsarten. Beispielsweise umfassen geeignete Verabreichungsarten eine orale, subkutane, transdermale, transmukosale, iontophoretische, intravenöse, intramuskuläre, intraperitoneale, intranasale, subdurale und rektale Verabreichung.
  • Gemäß weiterer Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird eine Zusammensetzung bereitgestellt, die eine erfindungsgemäße GSK3-Inhibitorverbindung umfasst, zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Hilfsstoff.
  • Geeignete pharmazeutisch akzeptable Hilfsstoffe umfassen prozessierende Mittel und Wirkstoff-Verabreichungsmodifikationsmittel und Verstärker, wie beispielsweise Calciumphosphat, Magnesiumstearat, Talk, Monosaccharide, Disaccharide, Stärke, Gelatine, Cellulose, Methylcellulose, Natriumcarboxymethylcellulose, Dextrose, Hydroxypropyl-β-cyclodextrin, Polyvinylpyrrolidinon, niedrigschmelzende Wachse, Ionenaustauschharze und Ähnliches, sowie Kombinationen aus zwei oder mehreren der oben genannten Substanzen. Andere geeignete pharmazeutische akzeptable Hilfsmittel sind in "Remingtons's Pharmaceutical Sciences," Mack Pub. Co., New Jersey (1991) beschrieben.
  • Die pharmazeutischen Zusammensetzungen, welche die GSK3-Inhibitorverbindungen der vorliegenden Erfindung umfassen, können in einer beliebiger Form vorliegen, die für die beabsichtigte Methode der Verabreichung geeignet ist, einschließlich beispielsweise einer Lösung, einer Suspension oder einer Emulsion. Bei der Herstellung von Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen werden typischerweise flüssige Träger verwendet. Die flüssigen Träger, die zur Verwendung bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung vorgeschlagen werden, umfassen beispielsweise Wasser, Salzlösung, pharmazeutisch akzeptable(s) organische(s) Lösungsmittel, pharmazeutisch akzeptable Öle oder Fette sowie Mischungen aus zwei oder mehreren der oben genannten Substanzen. Der flüssige Träger kann weitere geeignete pharmazeutisch akzeptable Additive, wie beispielsweise Löslichkeitsvermittler, Emulgatoren, Nährstoffe, Puffer, Konservierungsmittel, suspendierende Mittel, Verdickungsmittel, Viskositätsregulatoren und Stabilisatoren umfassen. Geeignete organische Lösungsmittel umfassen monohydrische Alkohole, wie beispielsweise Ethanol, oder polyhydrische Alkohole, wie beispielsweise Glykole. Geeignete Öle umfassen beispielsweise Sojabohnenöl, Kokosnussöl, Olivenöl, Distelöl und Baumwollsamenöl. Für die parenterale Verabreichung kann der Träger ferner ein ölartiger Ester, wie beispielsweise Ethyloleat und Isopropylmyristat sein. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können ferner in der Form von Mikropartikeln, Mikrokapseln, liposomalen Verkapselungen und Ähnlichem vorliegen, sowie in einer Kombination aus zwei oder mehreren der oben genannten Formen.
  • Die erfindungsgemäßen Verbindungen können oral, parenteral, sublingual, durch Inhalationsspray, rektal oder topisch in Einheitsdosisformulierungen verabreicht werden, die herkömmliche nicht-toxische, pharmazeutisch akzeptable Träger, Adjuvantien und Vehikel enthalten, sofern dies gewünscht ist. Die topische Verabreichung kann ferner die Verwendung einer transdermalen Verabreichung umfassen, wie beispielsweise durch transdermale Pflaster oder durch Ionophorese-Vorrichtungen. Der Begriff parenteral umfasst wie vorliegend verwendet subkutane Injektionen, eine intravenöse, intramuskuläre, intrasternale Injektion oder Infusionsverfahren.
  • Injizierbare Zubereitungen, wie beispielsweise sterile injizierbare wässrige oder ölige Suspensionen, können nach im Stand der Technik bekannten Verfahren unter Verwendung geeigneter Dispersions- oder Befeuchtungsmittel und Suspensionsmitteln formuliert werden. Die sterile injizierbare Zubereitung kann ferner eine sterile injizierbare Lösung oder eine Suspension in einem nicht-toxischen, parenteral akzeptablen Verdünnungs- oder Lösungsmittel sein, beispielsweise eine Lösung in 1,3-Propandiol. Unter den akzeptablen Vehikeln und Lösungsmit teln, die verwendet werden können, sind Wasser, Ringer-Lösung und isotonische Natriumchloridlösung. Darüber hinaus werden üblicherweise nichtflüchtige Öle als Lösungs- oder Suspensionsmedium verwendet. Für diesen Zweck kann jedes verträgliche feste Öl verwendet werden, einschließlich synthetischer Mono- oder Diglyceride. Darüber hinaus können Fettsäuren, wie beispielsweise Ölsäure, bei der Herstellung von injizierbaren Mitteln Verwendung finden. Suppositorien für die rektale Verabreichung eines Wirkstoffs können durch Mischen des Wirkstoffs mit einem geeigneten nicht-reizenden Hilfsmittel, wie beispielsweise Kakaobutter oder Polyethylenglykol, hergestellt werden, die bei gewöhnlichen Temperaturen fest sind, bei rektaler Temperatur jedoch flüssig sind und daher im Rektum schmelzen und den Wirkstoff freisetzen.
  • Feste Dosierungsformen für die orale Verabreichung umfassen Kapseln, Tabletten, Pillen, Puder und Granula. In solchen festen Dosierungsformen kann die aktive Verbindung mit mindestens einem inerten Verdünnungsmittel, wie beispielsweise mit Sucrose, Lactose oder Stärke, vermischt sein. Solche Dosierungsformen können darüber hinaus wie in der normalen Praxis zusätzliche Substanzen umfassen, bei denen es sich nicht um Verdünnungsmittel handelt, z. B. Schmierstoffe wie beispielsweise Magnesiumstearat. Im Fall von Kapseln, Tabletten und Pillen können die Dosierungsform ferner Puffer umfassen. Tabletten und Pillen können darüber hinaus mit magensaftresistenten Beschichtungen hergestellt werden.
  • Flüssige Dosierungsformen für die orale Verabreichung können pharmazeutisch akzeptable Emulsionen, Lösungen, Suspensionen, Sirups und Elixiere umfassen, die inerte Verdünnungsmittel enthalten, die üblicherweise im Stand der Technik verwendet werden, wie beispielsweise Wasser. Solche Zusammensetzungen können ferner Adjuvantien umfassen, wie beispielsweise Be feuchtungsmittel, Emulgatoren oder Suspensionsmittel, Cyclodextrine und Süßstoffe, Geschmacksstoffe und Duftstoffe.
  • Gemäß noch weiteren Ausführungsformen stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Verbindung der Formel (I) zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Inhibierung der GSK3-Aktivität in einem menschlichen oder tierischen Subjekt bereit, wobei das Verfahren Schritte umfasst, bei denen man eine Menge einer GSK3-Inhibitorverbindung mit der Struktur (I), (IV) oder (V) (oder einer Zusammensetzung, die diese Verbindung umfasst) an ein Subjekt verabreicht, wobei die Menge wirksam bei der Inhibierung der GSK3-Aktivität in dem Subjekt ist. Andere Ausführungsformen stellen die Verwendung einer Verbindung der Formel (I) zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung einer Zelle oder einer GSK3-vermittelten Störung in einem menschlichen oder tierischen Subjekt bereit, bei dem man eine Menge einer Verbindung oder einer Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung an die Zelle oder an das menschliche oder tierische Subjekt verabreicht, wobei die Menge wirksam ist, die GSK3-Aktivität in der Zelle oder in dem Subjekt zu inhibieren. Vorzugsweise wird das Subjekt ein menschliches oder ein nicht-menschliches, tierisches Subjekt sein. Die Inhibierung der GSK3-Aktivität umfasst die nachweisbare Suppression der GSK3-Aktivität, entweder im Vergleich zu einer Kontrolle oder im Vergleich zu der erwarteten GSK3-Aktivität.
  • Wirksame Mengen der erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen im Allgemeinen eine beliebige Menge, die ausreicht, um die GSK3-Aktivität in irgendeinem der vorliegend beschriebenen Assays nachweisbar zu inhibieren, oder in anderen GSK3-Kinase-Aktivität-Assays, die dem Fachmann aus dem Stand der Technik bekannt sind, oder durch Nachweis der Abschwächung der Symptome in einem Subjekt, das von einer GSK3-vermittelten Störung betroffen ist.
  • GSK3-vermittelte Störungen, die gemäß der vorliegenden Erfindung behandelt werden können, umfassen eine beliebige biologische oder medizinische Störung, die mit der GSK3-Aktivität in Zusammenhang steht, oder bei der die Inhibierung von GSK3 die Signalübertragung über einen Übertragungsweg, der bezeichnenderweise bei der zu behandelnden Krankheit defekt ist, potenziert. Der Zustand oder die Störung kann entweder durch eine abnormale GSK3-Aktivität verursacht oder durch diese gekennzeichnet sein. Repräsentative GSK3-vermittelte Störungen umfassen beispielsweise Typ 2 Diabetes, Alzheimer-Erkrankung und andere neurogenerative Erkrankungen, Fettleibigkeit, atheriosklerotische Herzkreislauf-Erkrankung, essentieller Bluthochdruck, polyzystisches Ovarialsyndrom, Syndrom X, Ischämie, insbesondere cerebrale Ischämie, traumatische Hirnverletzung, bipolare Störung, Immundefizienz, Krebs und andere.
  • Die erfolgreiche Behandlung eines Subjekts gemäß der vorliegenden Erfindung kann zur Induktion einer Verringerung oder Linderung der Symptome in einem Subjekt führen, das von einer medizinischen oder biologischen Störung betroffen ist; beispielsweise kann das weitere Fortschreiten der Störung aufgehalten werden, oder die Störung kann verhindert werden. So kann beispielsweise die Behandlung von Diabetes zu einer Verringerung der Glucose- oder HbA1c-Spiegel im Patienten führen. In ähnlicher Weise kann die Behandlung der Alzheimer-Erkrankung zu einer Verringerung der Geschwindigkeit des Fortschreitens der Erkrankung führen, die sich beispielsweise durch Messung einer Verringerung der Geschwindigkeit der Demenzverstärkung messen läßt.
  • Die Menge des Wirkstoffs, die mit dem Trägermaterial kombiniert werden kann, um eine Einzeldosierungsform herzustellen, wird in Abhängigkeit von dem zu behandelnden Individuum und dem jeweiligen Verabreichungsverfahren variieren. Es ist je doch verständlich, dass die spezifische Dosismenge für einen beliebigen bestimmten Patienten von einer Vielzahl von Faktoren abhängen wird, einschließlich der Aktivität der spezifischen verwendeten Verbindung, des Alters, des Körpergewichts, des allgemeinen Gesundheitszustands, des Geschlechts, der Ernährung, des Zeitpunkts der Verabreichung, der Art der Verabreichung, der Geschwindigkeit der Ausscheidung, der Kombination von Wirkstoffen und der Schwere der jeweiligen Erkrankung, die therapiert wird. Die therapeutisch wirksame Menge für eine bestimmte Situation kann problemlos durch Routineexperimente bestimmt werden, und sie liegt im Bereich des Abschätzungsvermögens des durchschnittlichen Arztes.
  • Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird eine therapeutisch wirksame Dosis im Allgemeinen von etwa 0,1 mg/kg/Tag bis etwa 100 mg/kg/Tag betragen, vorzugsweise von etwa 1 mg/kg/Tag bis etwa 20 mg/kg/Tag, und am stärksten bevorzugt von etwa 2 mg/kg/Tag bis etwa 10 mg/kg/Tag einer erfindungsgemäßen GSK3-Inhibitorverbindung, die in einer oder in mehreren Dosen verabreicht werden kann.
  • Die erfindungsgemäßen Verbindungen können ferner in Form von Liposomen verabreicht werden. Wie im Stand der Technik bekannt ist, werden Liposomen im Allgemeinen von Phospholipiden oder anderen Lipidsubstanzen abgeleitet. Liposomen werden durch mono- oder multilamellare, hydrierte, flüssige Kristalle gebildet, die in einem flüssigen Medium dispergiert werden. Jedes nicht-toxische, physiologisch akzeptable und metabolisierbare Lipid, das in der Lage ist, Liposomen zu bilden, kann verwendet werden. Die vorliegenden Zusammensetzungen in Liposomenform können neben einer erfindungsgemäßen Verbindung Stabilisatoren, Konservierungsstoffe, Verdünnungsstoffe und Ähnliches enthalten. Die bevorzugten Lipide sind die Phospholipide und die Phosphatidylcholine (Lecithine), sowohl die natürlichen als auch die synthetischen. Verfahren zur Bildung von Liposomen sind im Stand der Technik bekannt. Siehe beispielsweise Prescott, Hrsg., Methods in Cell Biology, Band XIV, Academic Press, New York, N. W., S. 33 et seq (1976).
  • Obwohl die erfindungsgemäßen Verbindungen als alleinige pharmazeutisch wirksame Mittel verabreicht werden können, können sie darüber hinaus in Kombination mit einem oder mit mehreren Mitteln verwendet werden, die bei der Behandlung von Störungen Anwendung finden. Beispielhafte Mittel, die in Kombination mit den erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung der Typ 2 Diabetes nützlich sind, umfassen Insulin, Troglitazon, Rosiglitazon, Pioglitazon, Glipizid, Metformin, Acarbose und Ähnliches. Beispielhafte Mittel die in Kombination mit den erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung der Alzheimer-Erkrankung nützlich sind umfassen Donepezil und Tacrin. Repräsentative Mittel, die in Verbindungen mit den erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung der bipolaren Störung nützlich sind, umfassen Lithiumsalze, Valproat und Carbamazepin. Ein beispielhaftes Mittel, das in Kombination mit den erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung des Schlaganfalls nützlich ist, ist beispielsweise der Gewebe-Plasminogenaktivator.
  • Wenn zusätzliche Wirkstoffe in Kombination mit den erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet werden, können die zusätzlichen Wirkstoffe im Allgemeinen in therapeutischen Mengen verwendet werden, wie sie in PHYSICIAN'S DESK REFERENCE (PDR) 53. Auflage (1999) beschrieben sind, oder solche geeigneten therapeutisch nützlichen Mengen wären dem Durchschnittsfachmann bekannt.
  • Die erfindungsgemäßen Verbindungen und andere therapeutisch Wirkstoffe können in den empfohlenen maximalen klinischen Dosierungen oder in geringeren Dosen verabreicht werden. Die Dosierungsmengen der aktiven Verbindungen in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können variiert werden, um eine er wünschte therapeutische Reaktion in Abhängigkeit von der Verabreichungsart, der Schwere der Erkrankung und des Ansprechens des Patienten zu erhalten. Die Kombination kann in Form von einzelnen Zusammensetzungen oder als beide Mittel umfassende Einzeldosierungsform verabreicht werden. Bei Verabreichung als Kombination können die therapeutischen Mittel als einzelne Zusammensetzungen formuliert werden, die zur selben Zeit oder zu unterschiedlichen Zeiten verabreicht werden, oder die therapeutischen Mittel können als einzelne Zusammensetzungen verabreicht werden.
  • Das Voranstehende sowie weitere Aspekte der Erfindung werden im Zusammenhang mit den nachfolgenden repräsentativen Beispielen besser verstanden werden.
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1
  • Charakterisierungs- und Reinigungsverfahren
  • Erfindungsgemäße Verbindungen wurden unter Verwendung eines Waters Millennium Chromatographiesystems mit einem 2690 Trennmoduls (Milford, Massachusetts) durch Hochleitungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) charakterisiert. Die analytischen Säulen waren Alltima C-18 mit umgekehrter Phase, 4,6 × 250 mm von Alltech (Deerfield, Illinios). Es wurde eine Gradientenelution verwendet, wobei typischerweise mit 5% Acetonitril/95% Wasser begonnen wurde und über einen Zeitraum von 40 Minuten auf 100% Acetonitril fortgeschritten wurde. Alle Lösungsmittel enthielten 0,1% Trifluoressigsäure (TFA). Verbindungen wurden durch Absorption von ultraviolettem Licht (UV) bei entweder 220 oder 254 nm detektiert. HPLC-Lösungsmittel stammten von Burdick und Jackson (Muskegan, Michigan) oder Fisher Scienti fic (Pittsburgh, Pennsylvania). In einigen Fällen wurde die Reinheit durch Dünnschichtchromatographie (TLC) unter Verwendung von Glas- oder Kunststoff-gestützten Kieselsäuregelplatten wie z. B. flexiblen Baker-Flex-Kieselsäuregel 1B2-F-Platten. TLC-Ergebnisse wurden sichtbar unter ultraviolettem Licht oder unter Verwendung von wohl bekannten Ioddampf- und anderen verschiedenen Färbetechniken leicht detektiert.
  • Massenpektrometrische Analyse wurde auf einem Fisons VG Elektrospraymassenspektrometer durchgeführt. Alle Massen werden als solche des protonierten Molekülions angegeben.
  • Kernmagnetische Resonanzanalyse (NMR) wurde mit einem Varian 300 MHz NMR (Palo Alto, Kalifornien) durchgeführt. Die spektrale Referenz war entweder TMS oder die bekannte chemische Verschiebung des Lösungsmittels. Einige Verbindungsproben wurden bei erhöhten Temperaturen (d. h. 75°C) gemessen, um die erhöhte Probenlöslichkeit zu fördern.
  • Die Reinheit von einigen erfindungsgemäßen Verbindungen wurde durch Elementaranalyse (Desert Analytics, Tucson, Arizona) bestimmt.
  • Schmelzpunkte wurden auf einer Laboratory Devices Mel-Temp-Apparatur (Holliston, Massachusetts) bestimmt.
  • Präparative Trennungen wurden entweder unter Verwendung eines Flash 40-Chromatographiesystems und KP-Sil, 60A (Biotage, Charlottesville, Virginia), einer Chromatotron-Zirkularchromatographievorrichtung (Harrison Research, Palo Alto, Kalifornien) oder durch HPLC unter Verwendung einer C-18-Säule mit umgekehrter Phase durchgeführt. Typische verwendete Lösungsmittel waren Dichloromethan, Methanol, Ethylacetat und Triethylamin.
  • Beispiel 2
  • Synthese von 3,5-Dibrompyrazin-2-ylamin
    Figure 00480001
  • 11,2 ml Brom in 38 ml Essigsäure wurden unter Rühren langsam bei 15°C zu einer Lösung von 2-Aminopyrazin (9,5 g, 100 mmol) und Natriumacetattrihydrat (32,6 g) in 150 ml Essigsäure gegeben. Die Zugabe benötigte etwa 1 bis 2 Stunden und wurde im Dunkeln durchgeführt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wurde im Vakuum konzentriert, und der braune viskose Rückstand wurde unter Rühren in Eiswasser (150 ml) gegossen. Wässriges 20% Natriumhydroxid wurde zugegeben, um einen pH von 8 zu erhalten, und es wurde mit Ethylacetat (4 × 75 ml) extrahiert. Die kombinierten organischen Phasen wurden mit Wasser (2 × 50 ml) und Salzlösung (1 × 50 ml) gewaschen, getrocknet und konzentriert. Das Rohprodukt wurden durch Säulenchromatographie (Hexane und Ethylacetat 2:1) gereinigt, um die gewünschte Verbindung zu liefern.
    HPLC: 8,7 min (98% Reinheit)
    MS: MH+ = 251,8 C4H3Br2N3 = 250,8 g/mol
  • Beispiel 3
  • Synthese von 3-(2,4-Dichlorphenyl)-5-brompyrazin-2-ylamin
    Figure 00480002
  • Zu einer Lösung von Dibrompyrazinylamin (1 g, 3,95 mmol) in Benzol (25 ml) wurden Pd(PPh3)4 (230 mg, 0,02 mmol), Natriumcarbonat (840 mg, 7,9 mmol) in 4 ml Wasser und Dichlorphenylborsäure (830 mg, 4,3 mmol) in 1 ml Ethanol gegeben. Die Mischung wurde über Nacht unter kräftigem Rühren unter Rückfluss erhitzt. Die Lösung wurde konzentriert und in Ethylacetat (50 ml) und Wasser (20 ml) aufgenommen. Die organische Phase wurde getrennt, und die wässrige Phase wurde mit Ethylacetat (2 × 50 ml) extrahiert. Die kombinierten organischen Phasen wurden mit Wasser (1 × 25 ml) und Salzlösung (1 × 30 ml) gewaschen, getrocknet und konzentriert. Das Rohprodukt wurden durch Säulenchromatographie (Hexane und Ethylacetat 4:1) gereinigt, um die gewünschte Verbindung als einziges Isomer zu liefern.
    HPLC: 13,6 min (98% Reinheit)
    MS: MH+ = 317,9 C10H6BrCl2N3 = 316,9 g/mol
  • Beispiel 4
  • Synthese von (1Z)-1-Aza-1[3-(2,4-dichlorphenyl)-5-brompyrazin-2-yl]-2-methyl-2-thiaprop-1-en
    Figure 00490001
  • Zu einer Lösung von Dimethylsulfoxid (1,6 ml, 22,3 mmol) in trockenem Methylenchlorid (16 ml) wurde bei –78°C unter Stickstoff tropfenweise Trifluormethansulfonanhydrid (3,6 ml, 20,8 mmol) zugegeben, um einen weißen Niederschlag zu liefern. Zu diesem wurde eine Lösung von Bromaminpyrazin (4,7 g, 14,9 mmol) in Methylenchlorid (30 ml) und Dimethylsulfoxid (15 ml) zugegeben, und die resultierende Lösung wurde auf Raumtemperatur erwärmt und 1 Stunde gerührt. Die Reaktionsmi schung wurde mit 1 N Natriumhydroxid gequencht und 15 Minuten bei 0°C gerührt. Die Lösung wurde mit Methylenchlorid (3 × 30 ml) extrahiert, und die organischen Phasen wurden mit Wasser (2 × 30 ml), Salzlösung (30 ml) gewaschen, getrocknet und konzentriert.
  • Beispiel 5
  • Synthese von 3-(2,4-Dichlorphenyl)-5-brom-2-nitropyrazin
    Figure 00500001
  • Zu einer Lösung von Sulfilimin in Methylenchlorid (15 ml) wurde bei 0°C eine Lösung von m-Chlorperbenzoesäure (5,1 g, 29,8 mmol) in 15 ml Methylenchlorid gegeben. Die Mischung wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, und danach wurden unter Rühren für weitere 10 Minuten 2 ml Dimethylsulfid zugegeben. Die Lösung wurde schnell filtriert, um eine klare Lösung des Nitrosoderivats zu erhalten. Diese Lösung wurde auf 0°C gekühlt, Ozon wurde 20 Minuten durchperlen gelassen, und die resultierende Lösung wurde mit gesättigtem Natriumhydrogencarbonat, Wasser und Salzlösung gewaschen, getrocknet, konzentriert und unter Verwendung von Säulenchromatographie gereinigt, um die Nitroverbindung zu liefern.
    HPLC: 15,2 min (88% Reinheit)
    MS: MH+ = 347,7 C10H4BrCl12N3O2 = 346,9 g/mol
  • Beispiel 6
  • Synthesis von {2-[(3-Amino-4-nitropyridyl)amino]ethyl}[6-(2,4-dichlorphenyl)-5-nitropyrazin-2-yl]amin
    Figure 00510001
  • Zu einer Lösung von 3-(2,4-Dichlorphenyl)-5-brom-2-nitropyrazin (20 mg, 0,057 mmol) in DMF (1 ml) wurden (2-Aminoethyl)(6-amino-5-nitro(2-pyridyl))amin (12,3 mg, 0,06 mmol) und Diisopropylethylamin (40 μl, 0,228 mmol) gegeben. Die Reaktionsmischung wurde 12 Stunden bei 80°C gerührt. Die Rohmischung wurde im Vakuum konzentriert und einer Säulenchromatographie (5% Methanol in Methylenchlorid) unterworfen, um die Titelverbindung als hellgelben Feststoff zu liefern.
    HPLC: 13,0 min (99% Reinheit)
    MS: MH+ = 465,2 Cl17H14Cl2N8O4 = 464,0 g/mol
  • Beispiel 7
  • Synthese von [6-(2,4-Dichlorphenyl)-5-nitropyrazin-2-yl]{2-[(4-nitropyridyl)amino]ethyl}amin
    Figure 00510002
  • Zu einer Lösung von 3-(2,4-Dichlorphenyl)-5-brom-2-nitropyrazin (20 mg, 0,057 mmol) in DMF (1 ml) wurden (2-Aminoethyl)(5-nitro(2-pyridyl))amin (11,3 mg, 0,06 mmol) und Diisopropylethylamin (40 μl, 0,228 mmol) gegeben. Die Reaktionsmischung wurde 12 Stunden bei 80°C gerührt. Die Rohmischung wurde im Vakuum konzentriert und einer Säulenchro matographie (5% Methanol in Methylenchlorid) unterworfen, um die Titelverbindung als hellgelben Feststoff zu liefern.
    HPLC: 14,0 min (99% Reinheit)
    MS: MH+ = 450,9 C17H13Cl2N7O4 = 449,0 g/mol
  • Beispiel 8
  • Synthese von 4-[(2-{[6-(2,4-Dichlorphenyl)-5-nitropyrazin-2-yl]amino}ethyl)amino]pyridylcarbonitril
    Figure 00520001
  • Zu einer Lösung von 3-(2,4-Dichlorphenyl)-5-brom-2-nitropyrazin (20 mg, 0,057 mmol) in DMF (1 ml) wurden 6-[(2-Aminoethyl)amino]pyridin-3-carbonitril (10,0 mg, 0,06 mmol) und Diisopropylethylamin (40 μl, 0,228 mmol) gegeben. Die Reaktionsmischung wurde 12 Stunden bei 80°C gerührt. Die Rohmischung wurde im Vakuum konzentriert und einer Säulenchromatographie (5% Methanol in Methylenchlorid) unterworfen, um die Titelverbindung als hellgelben Feststoff zu liefern.
    HPLC: 12,9 min (90% Reinheit)
    MS: MH+ = 430,2 C18H13Cl2N7O2 = 429,0 g/mol
  • Beispiel 9
  • Synthese von [6-(2,4-Dichlorphenyl)-5-nitropyrazin-2-yl]methyl{2-[(4-nitropyridyl)amino]ethyl}amin
    Figure 00520002
  • Zu einer Lösung von 3-(2,4-Dichlorphenyl)-5-Brom-2-nitropyrazin (20 mg, 0,057 mmol) in DMF (1 ml) wurden (2-Aminoethyl)methyl(5-nitro(2-pyridyl))amin (12,0 mg, 0,06 mmol) und Diisopropylethylamin (40 μl, 0,228 mmol) gegeben. Die Reaktionsmischung wurde 12 Stunden bei 80°C gerührt. Die Rohmischung wurde im Vakuum konzentriert und einer Säulenchromatographie (5% Methanol in Methylenchlorid) unterworfen, um die Titelverbindung als hellgelben Feststoff zu liefern.
    HPLC: 14,3 min (95% Reinheit)
    MS: MH+ = 464,2 C18H15Cl2N7O4 = 463,0 g/mol
  • Beispiel 10
  • Synthese von N-Acetyl-N-[3-(2,4-dichlorphenyl)-6-brompyrazin-2-yl]acetamid
  • Eine Lösung von 3-(2,4-Dichlorphenyl)-5-brompyrazin-2-ylamin (200 mg, 0,63 mmol) in Essigsäureanhydrid (3 ml) wurde 2 Tage unter Rückfluss erhitzt. Die Mischung wurde im Vakuum konzentriert, um die Titelverbindung zu liefern.
  • Beispiel 11
  • Synthese von N-[5-({2-[(6-Animo-5-nitro(2-pyridyl))amino]ethyl}amino)-3-(2,4-dichlorphenyl)pyrazin-2-yl]acetamid
    Figure 00530001
  • Zu einer Lösung von N-Acetyl-N-[3-(2,4-dichlorphenyl)-6-brompyrazin-2-yl]acetamid (57 mg, 0,14 mmol) in DMF (2 ml) wurden (2-Aminoethyl)(6-amino-5-nitro(2-pyridyl))amin (28 mg, 0,141 mmol), Natrium-tert-butoxid (20 mg, 0,21 mmol), BINAP (38 mg, 0,06 mmol) und Palladiumacetat (10 mg, 0,04 mmol) zu gegeben. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei 80°C gerührt. Die Lösung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und in Ethylacetat und Wasser aufgenommen. Die Phasen wurden getrennt, und die organische Phase wurde mit Wasser und Salzlösung gewaschen, getrocknet, konzentriert und gereinigt, um die Titelverbindung zu liefern.
    HPLC: 3,3 min (98% Reinheit)
    MS: MH+ 476,1 C19H18C2N8O3 = 477,3 g/mol
  • Beispiel 12
  • Synthese von N-(2-{[6-(2,4-Dichlorphenyl)-5-nitropyrazin-2- yl]amino}ethyl)(tert-butoxy)carboxamid
    Figure 00540001
  • Zu einer Lösung von 3-(2,4-Dichlorphenyl)-5-brom-2-nitropyrazin (1,4 g, 4,0 mmol) in DMF (10 ml) wurden Bocethylendiamin (960 mg, 6,0 mmol) und DIPEA (1,5 ml) zugegeben. Die Lösung wurde über Nacht bei 80°C gerührt. Die Lösung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, und in Ethylacetat und Wasser aufgenommen. Die Phasen wurden getrennt, und die organische Phase wurde mit Wasser und Salzlösung gewaschen, getrocknet, konzentriert und gereinigt, um die Titelverbindung zu liefern.
    HPLC: 12,9 min (95% Reinheit)
    MS: MH+ = 428,0 C17H19Cl2N5O4 = 427,0 g/mol
  • Beispiel 13
  • Synthese von [5-Amino-6-(2,4-dichlorphenyl)pyrazin-2-yl](2-aminoethyl)amin
    Figure 00550001
  • Zu einer Lösung von N-(2-{[6-(2,4-Dichlorphenyl)-5-nitropyrazin-2-yl]amino}ethyl)(tert-butoxy)carboxamid (170 mg, 0,39 mmol) in Ethanol (2 ml) wurden 5% Palladium in Kohlenstoff und Hydrazin (250 mg, 7,9 mmol) zugegeben und bei 70°C gerührt. Die Lösung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, mit Ethanol verdünnt, abfiltriert, um das Palladium in Kohlenstoff zu entfernen, und im Vakuum konzentriert. Das korrespondierende Amin wird in 10% TFA in Methylenchlorid (2 ml) aufgenommen und 6 Stunden bei 35°C gerührt. Die Lösung wurde im Vakuum konzentriert, um die gewünschte Verbindung zu liefern.
    HPLC: 6,0 min (99% Reinheit)
    MS: MH+ = 298,0 C12H13Cl2N5 = 297,0 g/mol
  • Beispiel 14
  • Synthese von [5-Amino-6-(2,4-dichlorphenyl)pyrazin-2-yl]{2-[(6-amino-5-nitro(2-pyridyl))amino]ethyl}amin
    Figure 00550002
  • Die Verbindung wurde gemäß dem in Beispiel 6 beschriebenen Verfahren aus [5-Amino-6-(2,4-dichlorphenyl)pyrazin-2-yl](2-aminoethyl)amin und 6-Chlor-3-nitro-2-pyridylamin hergestellt.
    HPLC: 8,9 min (98% Reinheit)
    MS: MH+ = 435,2 C17H16C12N8O2 = 434,0 g/mol
  • Beispiel 15
  • Synthese von N-[5-({2-[(6-Amino-5-nitro(2-pyridyl))amino]ethyl}amino)-3-(2,4-dichlorphenyl)pyrazin-2-yl]-2-(methylamino)acetamid
    Figure 00560001
  • Zu einer Lösung von [5-Amino-6-(2,4-dichlorphenyl)pyrazin-2-yl]{2-[(6-amino-5-nitro(2-pyridyl))amino]ethyl}amine (30 mg, 0,068 mmol) in THF (2 ml) wurden Sarkosin (26 mg, 0,138 mmol), HBTU (104,5 mg, 0,2756 mmol) und DIPEA (60 μl) zugegeben und über Nacht bei 80°C gerührt. Die Mischung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, konzentriert und in Ethylacetat und Wasser aufgenommen. Die Phasen wurden getrennt, und die organische Phase wurde mit Wasser und Salzlösung gewaschen, getrocknet, konzentriert und gereinigt, um die Titelverbindung zu ergeben.
    HPLC: 7,2 min (98% Reinheit)
    MS: MH+ = 506,3 C20H18C12N8O3 = 505,1 g/mol
  • Beispiel 16
  • Screening nach GSK3-inhibitorischer Aktivität unter Verwendung eines zellfreien Assays
  • Die erfindungsgemäßen Pyrimidin- und Pyridinverbindungen wurden in DMSO gelöst und anschließend auf eine Inhibierung von humanem GSK3β (die Nukleotidsequenz für humanes GSK3β erscheint in GenBank unter der Zugriffsnummer L33801) untersucht. Die Expression von GSK3β ist beispielsweise in Hughes et al., Eur. J. Biochem., 203: 305–11 (1992) beschrieben.
  • Ein Aliquot aus 300 μl Substratpuffer (30 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 2 mM DTT, 3 μg/ml GSK3β und 0,5 mM biotinyliertes, prä-phosphoryliertes, SGSG-verknüpftes CREB-Peptid (Chiron Technologies PTY Ltd., Clayton, Australien) wurde in die Vertiefungen einer Polypropylen-Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen verteilt. 3,5 μl/Vertiefung DMSO, das variierende Konzentrationen von jeder der zu untersuchenden Verbindungen oder Staurosporin (ein bekannter Kinase-Inhibitor, der als Positivkontrolle verwendet wurde), oder eine Negativkontrolle (d. h. nur DMSO) enthielt, wurden zugesetzt, und es wurde gründlich gemischt. Die Reaktionen wurden anschließend durch Zugabe von 50 μl/Vertiefung 1 μM unmarkiertem ATP und 1–2 × 107 cpm γ33P-markiertem ATP gestartet, und es wurde den Reaktionen erlaubt, für etwa 3 Stunden bei Raumtemperatur abzulaufen.
  • Während die Reaktion ablief, wurden mit Streptavidin beschichtete Labsystems "Combiplate 8"-Captureplatten (Labsystems, Helsinki, Finnland) durch Inkubation mit 300 μl/Vertiefung PBS, das 1% bovines Serumalbumin enthielt, für mindestens 1 Stunde bei Raumtemperatur blockiert. Die Blockierungslösung wurde anschließend durch Absaugen entfernt, und die Captureplatten wurden mit 100 μl/Vertiefung Stoppreagenz (50 μM ATP/20 mM EDTA) gefüllt.
  • Nach Abschluss der dreistündigen Enzymreaktion wurden 100 μl Aliquots von jeder Reaktionsmischung in Dreifachansätzen in drei Vertiefungen überführt, die Stopplösung enthielten, jeweils eine Vertiefung in jeder der drei Caputureplatten, und die Inhalte der Vertiefungen wurden gut gemischt. Nach 1 Stunde bei Raumtemperatur wurden die Vertiefungen der Captureplatten durch Absaugen geleert und 5-mal unter Verwendung von PBS und einem 12-Kanal-Corning 430474 ELISA-Plattenwaschgerät gewaschen. Schließlich wurden 200 μl Microscint-20-Szintillationsflüssigkeit zu jeder Vertiefung der Platte zugesetzt. Die Platten wurden mit Plattenversieglern beschichtet und 30 Minuten auf einen Schüttler gestellt. Jede Captureplatte wurde in einem Packard TopCount-Szintillationszähler (Meridian, Connecticut) ausgezählt, und die Ergebnisse wurden als Funktion der Konzentration der Verbindung aufgetragen.
  • Die erfindungsgemäßen Verbindungen wurden anschließend mit diesem Assay auf eine inhibitorische Aktivität in Bezug auf GSK3 untersucht. Die Verbindungen der Beispiele 3–14 zeigten in diesem zellfreien Assay IC50-Werte von 1 μM oder weniger in Bezug auf GSK3.
  • Diese Ergebnisse zeigen somit, dass die erfindungsgemäßen Verbindungen eine inhibitorische Aktivität in Bezug auf GSK3 aufweisen.
  • Beispiel 17
  • Screening nach GSK3-inhibitorischer Aktivität unter Verwendung eines auf Zellen-basierenden Glycogen-Synthase-Assays
  • CHO-HIRC-Zellen werden in 10 cm-Gewebekulturplatten in Ham F12-Medium/10% dialysiertes, fetales, bovines Serum gehalten. Die Zellen von einer konfluenten 10 cm-Platte werden geerntet und in einem Endvolumen von 2 ml Medium in die 6 Vertiefungen einer Gewebekulturplatte mit 6 Vertiefungen verteilt. Die Zellen werden bei 37°C für 24 Stunden angezüchtet. Die Zellen werden anschließend dreimal in Ham F12-Medium gewaschen, das kein fetales bovines Serum enthält, und anschließend werden die Zellen für weitere 24 Stunden bei 37°C in 2 ml serumfreiem Medium angezüchtet.
  • Am Ende dieses Zeitraums werden 20 μl der Verbindung gelöst in DMSO zu jeder Vertiefung zugesetzt, und es wird bei 37°C inkubiert. Nach 20 Minuten wird das Medium entfernt, und die Zellen werden einmal in PBS bei Raumtemperatur gewaschen und anschließend schnell in den Platten in Flüssigstickstoff eingefroren. Die Zellen werden anschließend auf Eis in Gegenwart von 140 μl Lysepuffer (50 mM Tris pH 7,8; 1 mM EDTA, 100 mM NaF, 25 μg/ml Leupeptin, 1 mM DTT, 1 mM PMSF) pro Vertiefung aufgetaut. Die Zellen werden von den Platten gekratzt und in Eppendorf-Röhrchen auf Trockeneis eingefroren. Die Lysate werden anschließend aufgetaut und auf Trockeneis erneut eingefroren.
  • Nach dem erneuten Auftauen werden die Lysate bei 14000 g für 15 Minuten zentrifugiert. Die Überstände werden entfernt und auf Eis gelagert. Jeder Überstand (45 μl) wird zu 45 μl Reaktionspuffer (65 mM Tris pH 7,8; 26 mM EDTA, 32,5 mM KF, 9,3 mM UDP-Glucose; 11 mg/ml Glycogen; 500 nCi/ml 14C-UDP-Glucose) zugesetzt, und weitere 45 μl werden zu 45 μl Reaktionspuffer/20 mM Glucose-6-phosphat gegeben. Die Reaktionen werden bei 30°C für 30 Minuten inkubiert und anschließend auf ein 2 cm-Rechteck aus 31 ET-Chromatographpapier (Whatman) aufgetragen. Die Filterpapiere werden zweimal für 20 Minuten in 66% Ethanol gewaschen, kurz in Aceton gespült und für 1 Stunde bei Raumtemperatur getrocknet.
  • Die Filter werden zu 5 ml Flüssigszintillant gegeben und in einem Flüssigszintillationszähler ausgezählt. Der prozentuale Anteil der gesamten Glycogen-Synthase, die in jedem Lysat aktiv ist, wird als 100 × (cpm minus Glucose-6-phosphat)/(cpm plus Glucose-6-phosphat) ausgedrückt. Diese Werte werden in Doppelansätzen für 5 verschiedene Konzentrationen der Verbindung sowie für DMSO alleine bestimmt, und die Werte werden anschließend gegen den Logarithmus der Konzentration aufgetragen. Die Konzentration der Verbindung, die die Glycogen-Synthase-Aktivität auf 50% des maximalen Niveaus stimuliert, wird durch Anpassen einer sigmoidalen Kurve an die aufgetrage nen Daten bestimmt. Das maximale Niveau ist als das Niveau definiert, an das sich die Glycogen-Synthase-Aktivität asymtotisch annähert, wenn die Konzentration der Testverbindung wesentlich über den EC50-Wert steigt.
  • Beispiel 18
  • Screening nach Inhibition der Tau-Protein-Phosphorylierung
  • A. Transiente Transfektion von COS-Zellen mit GSK3-Expressionsplasmid und Tau-Expression
  • Plasmid-Konstruktion
  • COS-Zellen werden in T25-Gewebekulturflaschen in High-Glucose-MEM-Medium/5% fetalem Kälberserum gehalten. Die Zellen von einer konfluenten T25-Flasche werden geerntet und 80000 Zellen/Vertiefung werden in Corning-Gewebekulturplatten mit 6 Vertiefungen in einem Endvolumen von 2 ml Medium/Vertiefung ausgesät. Die Zellen werden bei 37°C für 48 Stunden angezüchtet. Die Zellen werden anschließend zweimal mit Opti-MEM gewaschen, das kein fetales bovines Serum enthält; schließlich werden die Zellen in 1 ml Opti-MEM gelassen.
  • Das Polynukleotid, das für das Tau-Protein kodiert, wird unter einen frühen SV40-Promotor in das Plasmid pSG5 subkloniert, um ein Tau-Expressionsplasmid zu erzeugen. Die Klonierung der für das Tau-Protein kodierenden cDNA ist allgemein in Goedert et al., EMBO Journal, 8(2): 393–399 (1989) beschrieben, das vorliegend durch Bezugnahme eingeschlossen ist. Ein GSK3-Expressionsplasmid wird durch Subklonierung des für GSK3β kodierenden Polynukleotids in pCG (ein ApEVRF-Derivat) hergestellt, wie es in Giese et al., Genes & Development, 9: 995–1008 (1995) und Matthias et al., Nucleic Acid Research, 17: 6418 (1989) beschrieben ist.
  • Die folgenden Lösungen werden in 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen hergestellt: Lösung A: für jede Transfektion werden 2 μg DNA (Tau-Expressionsplasmid) und 0,7 μg DNA (GSK3-Expressionsplasmid) in 100 ml Opti-MEM (Gibco BRL) verdünnt; Lösung B: für jede Transfektion werden 8 μl Lipofektaminreagenz in 100 μl Opti-MEM verdünnt. Die zwei Lösungen werden vereinigt, vorsichtig gemischt und bei Raumtemperatur für 45 Minuten inkubiert, um die Bildung von DNA-Liposomenkomplexen zu ermöglichen. Für jede Transfektion werden 0,8 μl Opti-MEM zu dem Röhrchen zugesetzt, das die Komplexe enthält. Die verdünnte Lösung wird vorsichtig gemischt und auf die gespülten Zellen geschichtet. Die Zellen werden mit der komplexierten DNA/Lipofektamin für 6 Stunden bei 37°C in einem CO2-Inkubator inkubiert. Nach der Inkubation wird 1 ml Wachstumsmedium (High-Glucose-MEM) mit 20% FBS zu jeder Vertiefung gegeben, und es wird über Nacht bei 37°C inkubiert. Das Medium wird 18 Stunden nach Start der Transfektion durch frisches Komplettmedium ersetzt, und den Zellen wird es ermöglicht, bei 37°C für weitere 48 Stunden zu wachsen.
  • B. Tau-Phosphorylierungsinhibierungsassay
  • 2 Stunden vor der Ernte werden 2 μl der Testverbindung (GSK3-Inhibitor) gelöst in DMSO zu jeder Vertiefung gegeben, und es wird bei 37°C inkubiert. Nach 2 Stunden wird das Medium entfernt, und die Zellen werden schnell auf den Platten auf Trockeneis eingefroren und bei –70°C gelagert. Die Zellen werden auf Eis in Gegenwart von 200 μl Lysepuffer (1% Triton® X-100, 20 mM Tris pH 7,5, 137 mM NaCl, 15% Glycerol, 25 μg/ml Leupeptin, 1 μg/ml Pepstatin-A, 1 μM PMSF, 21 μg/ml Aprotinin, 50 mM NaF, 50 μM β-Glycerophosphat, 15 mM Natriumpyrophosphat, 1 mM Natriumorthovanadat) auf Eis aufgetaut. Die Inhalte jeder Vertiefung werden bei 14000 g, 4°C für 5 Minuten zentrifugiert, und die Überstände werden in saubere Röhrchen über führt. An diesem Punkt können die Lysate bei –20°C gelagert werden.
  • C. ELISA zum Nachweis von phosphoryliertem Tau in Zelllysaten
  • Immulon-4-Streifen (Dynatech) werden mit monoklonalem Antiphosphoryliertem Tau (AT8, Polymedco, Inc.) bei 5 μg/ml in PBS, das Ca++ und Mg++ enthält (100 μg/Vertiefung), beschichtet. Nach einer Inkubation über Nacht bei 4°C werden die Streifen zweimal mit Waschpuffer gewaschen (PBS mit 0,05% Tween® 20) und bei Raumtemperatur für 1 Stunde mit PBS blockiert, das 1% BSA, 5% normales Mausserum und 0,05% Tween® 20 enthält. Die Streifen werden 5-mal mit Waschpuffer gewaschen. Lysat (100 μl), das 1:10 in PBS verdünnt ist, welches 1% BSA, 0,1% NaN3 enthält, wird in jede Vertiefung zugegeben, und es wird bei Raumtemperatur für 1 Stunde inkubiert. Nach dem Waschen werden 100 μl von 0,5 μg/ml biotinyliertem, monoklonalen Anti(nicht-phosphoryliertes) Tau-Antikörper (HT7, Polymedco, Inc.) in PBS-BSA in jede Vertiefung gegeben. Die Streifen werden 5-mal gewaschen, und HRP-konjugiertes Streptavidin wird zugesetzt; es wird bei Raumtemperatur für 30 Minuten inkubiert und ausführlich mit Waschpuffer gewaschen. Es wird TMB-Substrat (Pierce) für die Farbentwicklung verwendet, und die Reaktion wird durch Zusatz eines gleichen Volumens 0,8 M schwefliger Säure gestoppt. Die Streifen werden auf einem ELISA-Plattenlesegeräts unter Verwendung eines 450 nm-Filters ausgelesen. Die Konzentration der Verbindung, welche die Tau-Phosphorylierung auf 50% ihres maximalen Niveaus inhibiert (d. h. IC50), wird durch Anpassen einer sigmoidalen Kurve an die aufgetragenen Daten bestimmt.
  • Beispiel 19
  • Untersuchung des Potentials der GSK3-Inhibitoren beim Schutz primärer Hippocampus-Zellen vor Glutamat-Exzitotoxizität
  • Hippokampi wurden aus embryonischen Ratten entnommen, die 18–19 Tage alt waren. Das Gewebe wurde in Hibernate-TM-Medien (Gibco BRL) gesammelt und in Stücke von ungefähr 1 mm Größe zerkleinert. Das Gewebe wurde unter Verwendung des Papain-Dissoziations-Systems (Worthington Biochemical Corporation) dissoziiert. Nach der Isolierung wurden die Zellen in serumfreien Medien resuspendiert, die aus Neurobasal-TM (Gibco BRL), 2% B27 Supplement (Gibco BRL), L-Glutamin und Antibiotika bestanden. Die Zellen wurden in 35 mm-Gewebekulturschalen, die mit poly-L-Lysin beschichtet waren, bei einer Konzentration von 7,5 × 104 Zellen/Platte ausplattiert.
  • Nach 10–14 Tagen bei 37°C in 5% CO2 wurden die Zellen gewaschen und mit frischen Medien gefüttert. Am nächsten Tag wurden repräsentative erfindungsgemäße Verbindungen zu den Kulturmedien in einer Endkonzentration von zwischen 1 nM und 100 μM gegeben. 4 bis 8 Stunden nach Zugabe der Verbindung wurden die konditionierten Medien von den Zellen getrennt und bei 37°C gelagert. Die Kulturen wurden zweimal mit HEPES-gepufferter Salzlösung (HEPES-buffered balanced salt solution; HBSS) gespült, die 10 μM Glycin enthielt. Grabb und Choi, J. Neuroscience 19: 1657–62 (1999). Die Kulturen wurden anschließend für 5 Minuten bei Raumtemperatur mit 200 μM Glutaminsäure in derselben HBSS in Kontakt gebracht. Nach dem Inkontaktbringen wurden die Kulturen 3-mal mit dem Puffer gespült und anschließend in ihre ursprünglichen, konditioniertem Medien zurückgegeben, welche die Verbindungen enthielten. 20 bis 24 Stunden nach Inkontaktbringen mit der Glutaminsäure wurden die Kulturen in HBSS gespült und für 10 Minuten Trypan-Blau ausgesetzt. Dieser Farbstoff wird von toten Zellen aufgenom men. Die Kulturen wurden gespült und für 30 Minuten in 4% Paraformaldehyd fixiert. Die Anzahl der lebenden und toten (blaue Kerne) großen Neuronen wurde mittels Phasenkontrastmikroskopie gezählt (mindestens 200 Zellen von jeder Kultur) und photographiert. Unter Verwendung dieses Verfahrens ist gezeigt worden, dass die erfindungsgemäßen Verbindungen in der Lage sind, das Potential von Glutamat bei der Induktion des neuronalen Zelltods signifikant zu verringern.
  • Beispiel 20
  • Bewertung der Wirksamkeit in diabetischen Nagetieren (Der Glucose-Toleranz-Test)
  • Verbindungsformulierung für die orale Verabreichung:
  • Die Testverbindungen wurden üblicherweise für die orale Fütterung als Lösungen in Wasser oder als Suspension in 1% Carboxymethylcellulose/0,1% Tween-80 (beides von Sigma Chem., MO) am Tag vor der Verabreichung formuliert. Einige frühe Verbindungen wurden als Lösungen in 15% Captisol (ein modifiziertes Cyclodextrin von CyDex Co., IL) formuliert, nach Verfahren, die dem Nachstehenden ähneln. Für wässrige Lösungen wird ein trockenes und lyophilisiertes Pulver der Testverbindung in destilliertem Wasser solubilisiert und durch Vortexen und Beschallen gut vermischt. Sofern dies erforderlich ist, wird die Testlösung hinsichtlich des pH-Werts mit 1 N NaOH oder mit 1 N HCl angepasst, und sie wird letztlich durch eine Spritze, die mit einer 0,2 μm-Celluloseacetatmembran ausgestattet ist (Millipore Co., MA), steril filtriert. Für orale Suspensionen wird das Pulver der Testverbindung mit einer frischen Suspension von 1% Carboxymethylcellulose/0,1% Tween-80 gemischt und ausgiebig beschallt, der pH-Wert wird sofern erforderlich wie oben beschrieben angepasst, und es wird gevortext, bis die Partikelgröße homogen und < 10 μm groß ist.
  • Glucose-Toleranz-Test in der diabetischen Maus:
  • Fettsüchtige db/db-Mäuse (weiblich, C57BlKs/J) wurden von Jackson Labs (Bar Harbor, ME) im Alter von 8 Wochen erhalten und für die Untersuchung der Wirksamkeit 1–2 Wochen später verwendet. Am Morgen des Tests wurde das Futter früh morgens entfernt (7–8 Stunden vor dem Glucosebolus). Es wurde eine lokale Anästhesie (EMLA creme, Astra Pharm., MA) am Ende des Schwanzes durchgeführt, und 50–100 μl Blutproben wurden von Einschnitten der Schwanzspitze entnommen und in Eppendorf-Röhrchen gesammelt, die 5 μl 500 U/ml Natriumheparin (Elkins-Sinn, NJ) enthielten, mit anschließender Isolation des Plasmas. Die Proben wurden in verschiedenen Intervallen über den Tag hinweg an insgesamt 6–8 Zeitpunkten erhalten. Die Mäuse wurden nach dem Zufallsprinzip in Behandlungsgruppen eingeteilt, und die erste orale Dosis der Testverbindung (0,2 ml Volumen) wurde 4,5 Stunden vor der Glucoseverabreichung und 0,5 Stunden vor der Verabreichung von 0,2 ml 50% Dextrose (Abbott Lab., IL) mittels oraler Fütterung (oGTT) oder intraperitonealer Injektion verabreicht. Nach der letzten Blutprobe etwa 2 Stunden nach der Glucoseverabreichung wurden die Tiere wieder gefüttert.
  • Regulation der basalen Glykämie und Insulinämie:
  • Die Testverbindungen wurden üblicherweise oral an db/db-Mäuse (siehe oben) oder an ZDF-Ratten (Genetic Models, Inc.; Indianapolis, IN) verabreicht, wobei ein Verabreichungsschema, das mehrere Dosen über mehrere Tage umfasst (multi-day, multidose regimen), oder ein Einzelbolus verwendet wird. Die ZDF-Ratten wurden im Alter von 8 Wochen erhalten und für die Untersuchung der Wirksamkeit 1–2 Wochen später verwendet. Das Futter wurde etwa 30 Minuten vor der Dosisverabreichung entfernt, und ein einzelner Bolus der Testverbindung wurde verabreicht (das Dosisvolumen reichte von 1 bis 8 mg/ml). Blutproben wurden wie oben beschrieben an 1 bis 6 Zeitpunkten über die nächsten 2–3 Stunden gesammelt. Nach der Entnahme der Blutproben wurde das Futter zurück in die Tierkäfige gegeben.
  • Primärer Endpunkt:
  • Glucose- und Insulinspiegel werden in Plasma- und/oder Blutproben gemessen. Die Glucosespiegel werden mit dem One-Touch-Glucometer (Lifescan Co., CA) in Vollblut und mit einem Beckman-Glucose-Analysegerät in Plasma gemessen. Die Ergebnisse für Glucose spiegeln üblicherweise die Blutwerte der Untersuchung für die Maus und die Plasmawerte Blutwerte der Untersuchung für die Ratte wieder. Die Messung der Insulinspiegel erfolgte mit einem ELISA (Crystal Chem. Co., IL) gemäß den Anweisungen des Herstellers.
  • Quantifizierung der Ergebnisse:
  • Die Wirksamkeit kann für Plasmaglucose (oberhalb der normalglykämischen Basislinie von 100 mg/dL) oder für Insulin (oberhalb der normalen Basislinie für Insulin von 1 ng/ml) als mg/dl Glucose oder als ng/ml Insulin oder als Fläche unter der Kurve (area under the curve, AUC) ausgedrückt werden. Wenn die Ergebnisse wie es üblich ist als AUC ausgedrückt werden, dann sind diese eigentlich als verringerte AUC dargestellt ([(AUC Vehikelkontrolle – AUC Testgruppe)/AUC Vehikelkontrolle × 100]). Ein solcher Ausdruck stellt eine einzelne quantitative Aussage über die Größe der verbesserten Glucoseverfügbarkeit und/oder über die verringerte, basale Hyperglykämie oder Insulinumwandlung relativ zu der Placebokontrollgruppe bereit.
  • Ergebnisse:
  • Repräsentative erfindungsgemäße Verbindungen zeigten eine gute in vitro-Wirksamkeit, wenn diese in Captisol formuliert waren und s. c. an Mäuse verabreicht wurden (30 mg/kg), und sie zeigten eine hohe Bioverfügbarkeit und Gewebedurchdringung in vivo. Ein signifikante Verringerung hinsichtlich der basalen Hyperglykämie unmittelbar vor dem Glucose-Toleranz-Test und eine signifikant verbesserte Glucoseverfügbarkeit nach Glucose-Challenge wurden beobachtet. Es wurde eine 45–50%ige Verringerung der AUC relativ zur Kontrollgruppe beobachtet, wenn die Glucoseantwort quantifiziert wurde, indem die Fläche unter der Blutglucosekurve (AUC) von –60 Minuten bis +120 Minuten bestimmt wurde. Dies ist vergleichbar mit der Wirksamkeit, die mit Troglitazon erhalten wird (wenn dieses oral für mindestens einige Tage bei entweder 60 oder 100 mg/kg/Tag dosiert wird). Ferner war die Beobachtung signifikant, dass die Insulinspiegel in behandelten Tieren kleiner blieben als in Kontrollmäusen.

Claims (35)

  1. Verbindung mit der Struktur
    Figure 00680001
    in der: X und Y Stickstoff sind, A1 und A2 gegebenenfalls substituiertes Aryl oder Arylamino, Aryloxy oder Heteroaryl sind, R1, R2, R3 und R4 unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Hydroxyl und gegebenenfalls substituiertem Niederalkyl, Cycloniederalkyl, Alkylaminoalkyl, Niederalkoxy, Amino, Alkylamino, Alkylcarbonyl, Arylcarbonyl, Aralkylcarbonyl, Heteroarylcarbonyl, Heteroaralkylcarbonyl, Aryl und Heteroaryl, R'2 und R'3 unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff und gegebenenfalls substituiertem Niederalkyl, R5 und R6 unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Hydroxy, Halogen, Carboxyl, Nitro, Amino, Amido, Amidino, Imido, Imidino, Cyano und substituiertem oder unsubstituiertem Niederalkyl, Niederalkoxy, Alkylcarbonyl, Arylcarbonyl, Aralkylcarbonyl, Heteroarylcarbonyl, Heteroaralkylcarbonyl, Alkylcarbonyloxy, Arylcarbonyloxy, Aralkylcarbonyloxy, Alkylaminocarbony loxy, Arylaminocarbonyloxy, Formyl, Niederalkylcarbonyl, Niederalkoxycarbonyl, Aminocarbonyl, Aminoaryl, Alkylsulfonyl, Sulfonylamino, Sulfonamido, Aminoalkoxy, Alkylamino, Arylamino, Aralkylamino, Heteroarylamino, Heteroaralkylamino, Alkylcarbonylamino, Alkylaminocarbonylamino, Aminocarbonylamino, Arylaminocarbonylamino, Aralkylcarbonylamino, Heteroaralkylcarbonylamino, Arylcarbonylamino, Heteroarylcarbonylamino, Amidino, Cycloalkyl, Cycloamido, Cyclothioamido, Cycloamidino, Heterocycloamidino, Cycloimido, Heterocycloimido, Guanidinyl, Aryl, Biaryl, Heteroaryl, Heterobiaryl, Heterocycloalkyl, Arylsulfonyl und Arylsulfonamido, und pharmazeutisch annehmbare Salze davon, wobei "Cycloalkyl" einen mono- oder polycyclischen, heterocyclischen oder carbocyclischen Alkylsubstituenten bezeichnet, wobei Cycloalkylsubstituenten 3 bis 8 Hauptketten-(d. h., Ring-)Atome aufweisen, wobei jedes Hauptkettenatom entweder Kohlenstoff oder ein Heteroatom ist, "Heterocycloalkyl" Cycloalkylsubstituenten bezeichnet, die in der Ringstruktur 1 bis 5 Heteroatome aufweisen, "Aryl" monocyclische oder polycyclische aromatische Gruppen mit 3 bis 14 Hauptkettenkohlenstoff- oder -heteroatomen bezeichnet, "Heteroaryl" Arylgruppen 1 bis 4 Heteroatomen als Ringarome in einem aromatischen Ring bezeichnet, wobei der Rest der Ringatome Kohlenstoffatome sind, der Ausdruck "Nieder-"Gruppen bezeichnet, die 1 bis 10 Kohlenstoffatome enthalten, die unsubstituiert oder substituiert sind, und "gegebenenfalls substituiert" den Austausch von Wasserstoff mit einem einwertigen oder zweiwertigen Rest bezeichnet, der ausgewählt ist aus Hydroxyl, Nitro, Amino, Imino, Cyano, Halogen, Thio, Thioamido, Amidino, Oxo, Oxamidino, Methoxamidino, Imidino, Guanidino, Sulfonamido, Carboxyl, Formyl, Niederalkyl, halogeniertem Niederalkyl, Niederalkoxy, halogeniertem Niederalkoxy, Niederalkoxyalkyl, Alkylcarbonyl, Arylcarbonyl, Aralkylcarbonyl, Heteroarylcarbonyl, Heretoalkylcarbonyl, Alkylthio, Aminoalkyl und Cyanoalkyl, wobei die Substitutionsgruppe selbst mit einer Gruppe substituiert sein kann, die Carboxyl, Halogen, Nitro, Amino, Cyano, Hydroxyl, Niederalkyl, Niederalkoxy, Aminocarbonyl, -SR, Thioamido, -SO3H, -SO2R oder Cycloalkyl sein kann, wobei R Wasserstoff, Hydroxyl oder Niederalkyl ist, wobei die substituierten Substituenten geradkettige, verzweigte oder cyclische Anordnungen von kovalent gebundenen Kohlenstoff- oder Heteroatomen sein können.
  2. Verbindung nach Anspruch 1, bei der mindestens einer von A1 und A2 ein aromatischer Ring mit 3 bis 10 Kohlenstoffringatomen und gegebenenfalls einem oder mehreren Ringheteroatomen ist.
  3. Verbindung nach Anspruch 2, bei der mindestens einer von A1 und A2 gegebenenfalls substituiertes carbocyclisches Aryl, Arylamino oder Aryloxy ist.
  4. Verbindung nach Anspruch 2, bei der mindestens einer von A1 und A2 gegebenenfalls substituiertes Heteroaryl ist.
  5. Verbindung nach Anspruch 2, bei der mindestens einer von A1 und A2 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus substituiertem oder unsubstituiertem Phenylamino, Phenyloxy, Py ridyl, Pyrimidinyl, Thiazolyl, Indolyl, Imidazolyl, Oxadiazolyl, Tetrazolyl, Pyrazinyl, Trizolyl, Thiophenyl, Furanyl, Chinolinyl, Purinyl, Naphthyl, Benzothiazolyl, Benzopyridyl und Benzimidazolyl.
  6. Verbindung nach Anspruch 2, bei der mindestens einer von A1 und A2 mit mindestens einer und nicht mehr als drei Substitutionsgruppen substituiert ist.
  7. Verbindung nach Anspruch 6, bei der die Substitutionsgruppen unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Nitro, Amino, Cyano, Halogen, Thioamido, Amidino, Oxamidino, Alkoxyamidino, Imidino, Guanidino, Sulfonamido, Carboxyl, Formyl, Niederalkyl, halogeniertem Niederalkyl, Niederalkoxy, halogeniertem Niederalkoxy, Niederalkoxyalkyl, Niederalkylaminoniederalkoxy, Niederalkylcarbonyl, Niederaralkylcarbonyl, Niederheteroaralkylcarbonyl, Alkylthio, Aminoalkyl und Cyanoalkyl.
  8. Verbindung nach Anspruch 1, bei der mindestens einer von R1, R2, R3 und R4 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff und unsubstituiertem oder substituiertem Niederalkyl, halogeniertem Niederalkyl, Heterocycloaminoalkyl und Niederalkylaminoniederalkyl.
  9. Verbindung nach Anspruch 8, bei der mindestens einer von R1, R2, R3 und R4 Niederalkylaminoniederalkyl ist.
  10. Verbindung nach Anspruch 8, bei der R1, R2 und R3 Wasserstoff sind, und R4 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Methyl, Ethyl, Aminoethyl, Dimethylaminoethyl, Pyridylethyl, Piperidinyl, Pyrrolidinylethyl, Piperazinylethyl und Morpholinylethyl.
  11. Verbindung nach Anspruch 1, bei der mindestens einer von R5 und R6 ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus substituiertem und unsubstituiertem Aryl, Heteroaryl und Biaryl.
  12. Verbindung nach Anspruch 11, bei der mindestens einer von R5 und R6 ein substituierter oder unsubstituierter Rest der Formel:
    Figure 00720001
    ist, wobei R10, R11, R12, R13 und R14 unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Nitro, Amino, Cyano, Halogen, Thioamido, Carboxyl, Hydroxy und gegebenenfalls substituiertem Niederalkyl, Niederalkoxy, Niederalkoxyalkyl, halogeniertem Niederalkyl, halogeniertem Niederalkoxy, Aminoalkyl, Alkylamino, Alkylthio, Alkylcarbonylamino, Aralkylcarbonylamino, Heteroaralkylcarbonylamino, Arylcarbonylamino, Heteroarylcarbonylamino, Aminocarbonyl, Niederalkylaminocarbonyl, Aminoaralkyl, Niederalkylaminoalkyl, Aryl, Heteroaryl, Cycloheteroalkyl, Aralkyl, Alkylcarbonyloxy, Arylcarbonyloxy, Aralkylcarbonyloxy, Arylcarbonyloxyalkyl, Alkylcarbonyloxyalkyl, Heteroarylcarbonyloxyalkyl, Aralkylcarbonyloxyalkyl und Heteroaralkylcarbonyloxyalkyl.
  13. Verbindung nach Anspruch 12, bei der R10, R11, R13 und R14 Wasserstoff sind, und R12 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Niederalkyl, Hydroxy, Niederalkoxy, halogeniertem Niederalkyl, Aminocarbonyl, Alkylaminocarbonyl, Morpholino, Piperidino und Cyano.
  14. Verbindung nach Anspruch 12, bei der R11, R13 und R14 Wasserstoff sind, und R10 und R12 unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Niederalkyl, Hydroxy, Niederalkoxy, halogeniertem Niederalkyl, Morpholino, Piperidino und Cyano.
  15. Verbindung nach Anspruch 12, bei der R10, R11, R13 und R14 Wasserstoff sind, und R12 Heteroaryl ist
  16. Verbindung nach Anspruch 12, bei der R10, R11, R13 und R14 Wasserstoff sind, und R12 Heterocycloalkyl ist.
  17. Verbindung nach Anspruch 12, bei der mindestens einer von R10, R11, R12, R13 und R14 Halogen ist, und der Rest von R10, R11, R12, R13 und R14 Wasserstoff ist.
  18. Verbindung nach Anspruch 12, bei der mindestens einer von R10, R11, R12, R13 und R14 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Morpholino und Piperidino und der Rest von R10, R11, R12, R13 und R14 Wasserstoff ist.
  19. Verbindung nach Anspruch 12, bei der mindestens einer von R5 und A2 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Chlorphenyl, Dichlorphenyl, Fluorphenyl, Difluorphenyl, Bromphenyl, Dichlorfluorphenyl, Trifluormethylphenyl, Chlorfluorphenyl, Bromchlorphenyl, Bromfluorphenyl, Ethylphenyl, Methylchlorphenyl, Ethylchlorphenyl, Imidazolylphenyl, Cyanophenyl, Morpholinophenyl und Cyanochlorphenyl.
  20. Verbindung nach Anspruch 1, bei der R6 substituiertes Alkyl ist, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Aralkyl, Hydroxyalkyl, Aminoalkyl, Aminoaralkyl, Carbonylaminoalkyl, Alkylcarbonylaminoalkyl, Arylcarbonylaminoalkyl, Aralkylcarbonylaminoalkyl, Aminoalkoxyalkyl und Arylaminoalkyl.
  21. Verbindung nach Anspruch 1, bei der R6 substituiertes Amino ist, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alkylamino, Alkylcarbonylamino, Alkoxycarbonylamino, Arylalkylamino, Arylcarbonylamino, Alkylthiocarbonylamino, Arylsulfonylamino, Heteroarylamino, Alkylcarbonylamino, Arylcarbonylamino, Heteroarylcarbonylamino, Aralkylcarbonylamino und Heteroaralkylcarbonylamino.
  22. Verbindung nach Anspruch 1, bei der R6 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus unsubstituiertem oder substituiertem Aminocarbonyl, Alkyloxycarbonyl, Aryloxycarbonyl, Aralkyloxycarbonyl und Alkylaminoalkyloxycarbonyl.
  23. Verbindung nach Anspruch 1, bei der R6 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Amidino, Guanidino, Cycloimido, Heterocycloimido, Cycloamido, Heterocycloamido, Cyclothioamido und Heterocycloniederalkyl.
  24. Verbindung nach Anspruch 1, bei der R6 Aryl ist.
  25. Verbindung nach Anspruch 1, bei der R6 Heteroaryl ist.
  26. Verbindung nach Anspruch 25, bei der R6 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus substituiertem oder unsubstituiertem Pyridyl, Pyrimidinyl, Thiazolyl, Indolyl, Imidazolyl, Oxadiazolyl, Tetrazolyl, Pyrazinyl, Triazolyl, Thienyl, Furanyl, Chinolinyl, Pyrrolylpyridyl, Benzothiazolyl, Benzopyridyl, Benzotriazolyl und Benzimidazolyl.
  27. Zusammensetzung, die eine Menge einer Verbindung nach Anspruch 1 enthält, welche wirksam ist, die GSK3-Aktivität in einem menschlichen oder tierischen Subjekt zu modulieren, wenn sie diesem verabreicht wird, zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger.
  28. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 27 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Inhibierung der GSK3-Aktiviät in einem menschlichen oder tierischen Subjekt, wobei die Zusammensetzung einem menschlichen oder tierischen Subjekt verabreicht wird.
  29. Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung einer Zelle, wobei der Zelle eine Menge der Verbindung verabreicht wird, welche wirksam ist, die GSK3-Aktiviät in der Zelle zu inhibieren.
  30. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 27 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung einer GSK3-vermittelten Störung in einem menschlichen oder tierischen Subjekt, wobei dem menschlichen oder tierischen Subjekt eine Menge der Zusammensetzung verabreicht wird, welche wirksam ist, um die GSK3-Aktivität in dem Subjekt zu inhibieren.
  31. Verwendung nach Anspruch 30, bei der die Zusammensetzung durch eine Verabreichungsart verabreicht wird, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus oraler, subkutaner, transdermaler, transmukosaler, ionophoretischer, intravenöser, intrathekaler, bukkaler, sublingualer, intranasaler und rektaler Verabreichung.
  32. Verwendung nach Anspruch 30, bei der die GSK3-vermittelte Störung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Diabetes, Alzheimer-Erkrankung, Fettleibigkeit, atheriosklerotische Herzkreislauf-Erkrankung, essentieller Bluthochdruck, polyzystisches Ovarialsyndrom, Syndrom X, Ischämie, traumatische Hirnverletzung, bipolare Störung, Immunschwäche und Krebs.
  33. Verwendung nach Anspruch 30, bei der dem Subjekt ferner ein oder mehrere weitere Wirkstoffe verabreicht werden.
  34. Verwendung nach Anspruch 30, bei der die GSK3-vermittelte Störung Diabetes ist, und der weitere Wirkstoff ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Insulin, Troglitazon, Rosiglitazon, Pioglitazon, Glipizid und Metformin.
  35. Verbindung nach Anspruch 1 zur Verwendung als Arzneimittel.
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