CN102266317A

CN102266317A - 丙戊酸及其衍生物的应用

Info

Publication number: CN102266317A
Application number: CN201110172994A
Authority: CN
Inventors: 张志仁; 吴玉章; 王磊; 罗邦伟
Original assignee: Third Military Medical University TMMU
Current assignee: Third Military Medical University TMMU
Priority date: 2011-06-24
Filing date: 2011-06-24
Publication date: 2011-12-07

Abstract

本发明涉及药物新用途，特别涉及丙戊酸及其盐制剂的新用途，具体为丙戊酸和/或丙戊酸盐在制备治疗多发性硬化的药物中的应用，该应用首先通过建立多发性硬化的动物模型，再对治疗前后神经学及体重的评价，组织学变化及验证细胞聚集及中性炎细胞的释放，最终得出丙戊酸及其盐在制备治疗多发性硬化的药物中的应用；本发明为治疗多发性硬化提供了新的思路。

Description

丙戊酸及其衍生物的应用

技术领域

本发明涉及药物新用途，特别涉及丙戊酸及其盐制剂的新用途。

背景技术

多发性硬化(multiple sclerosis,MS)是一种慢性、渐进性变性疾病，以中枢神经系统白质脫髓鞘病变为主要特点,主要由T细胞介导的自身免疫性疾病,好发于青壮年,发病年龄多在20～40岁,女性多见,具有高致残率、高复发性的特点,部分患者病情呈进行性加重。MS的病理特点是脱髓鞘、炎症反应、轴突变性及胶质细胞增生反应。MS炎症病灶通常有大量不同类型炎症细胞的浸润，例如T细胞，B细胞，巨噬细胞和小胶质细胞，同时有广泛的细胞因子、趋化因子、抗体、补体和其他毒性物质表达升高。约50%的患者在发病后15年左右导致瘫痪，现有的治疗均不能延缓疾病的进程。

由于MS 发病率较高, 呈慢性病程, 患者常致残, 治疗手段有限, 因而受到广大医药工作者的重视。目前MS的治疗药物主要有一下几类：1、糖皮质激素是一种治疗M S 的传统药物, 具有非特异性免疫抑制作用, 可降低脂质过氧化物的含量, 并抑制辅助T 细胞的迁移和免疫应答, 从而控制MS症状。但连续大剂量使用糖皮质激素时可引起糖皮质激素受体表达下调, 从而造成疗效衰减。同时皮质类固醇可导致多种不良反应( 高血压、骨质疏松、动脉硬化、白内障、葡萄糖耐量异常、肥胖等) 。2、免疫球蛋白( IVIG)可调节免疫系统, 抑制脱髓鞘, 并促进髓鞘的再生。IVIG 可通过中和血液循环中的髓鞘碱性蛋白( MBP) 抗体, 下调炎症介质的释放, 并刺激B 细胞克隆产生抗特异性抗体, 从而治疗MS。但IVIG 对继发??进展型MS 没有显示出明显的疗效，并且用药时需注意对IVIG 过敏或有抗IgA抗体的选择性IgA 缺乏者禁用。3、他汀类药物具有减少炎性分子表达、抑制T 细胞迁移、保护过氧化物酶、阻止髓鞘脱失等作用。4、干扰素是美国FDA 批准的用于防治MS 的首选药物之一，可通过抑制淋巴细胞的增殖及抗原递呈, 从而调节机体免疫功能达到治疗MS 的目的。5、醋酸格拉默是一种人工合成的MBP 蛋白, 其结构和MBP 相似,通过竞争性抑制MBP 与受体结合, 从而减少免疫系统对中枢神经系统的损伤，为国外治MS 的一线用药。6、米托蒽醌是一种抗肿瘤药, 通过与DNA 分子结合, 抑制核酸合成而导致细胞死亡从而起到免疫调节作用。米托蒽醌的主要不良反应包括骨髓抑制, 引起白细胞和血小板减少。少数患者可能出现心悸、早搏及心电图异常。用药期间应严格检查白细胞, 同时对有心脏疾病、用过蒽环类药物或胸部照射的患者还应密切注意心脏毒性的发生。7、硫唑嘌呤是嘌呤类似物, 抑制腺嘌呤和鸟嘌呤的合成, 进而抑制DNA 合成。该药通过干扰细胞周期, 可使DNA、RNA 合成减少, 并主要通过抑制T 淋巴细胞而调节免疫, 起到治疗MS的作用。8、那他珠单抗，即重组α4 整合素单克隆抗体，通过选择性地与白细胞表面的α4 联脂结合, 阻断α4 整合蛋白而阻止激活的T 淋巴细胞通过血脑屏障进入中枢神经系统,达到治疗MS 的效果。该药的常见不良反应为头痛、疲乏、尿道感染、抑郁、下呼吸道感染、关节痛和腹部不适等。

但总体而言，目前MS 的治疗手段仍然有限, 药物治疗对某些MS 亚型如原发进展型MS 仍难以奏效, 对M S 发病机制的深入研究以及相关新型药物的研发仍然是今后科研工作者及临床医师努力的方向。

发明内容

本发明的目的在于提供丙戊酸的新应用，该应用为治疗多发性提供了新思路。

丙戊酸和/或丙戊酸衍生物在制备治疗多发性硬化的药物中的应用，所述丙戊酸衍生物为丙戊酸镁、丙戊酸钠或丙戊酰胺。

根据权利要求1所述的应用，所述药物为口服剂或鼻腔吸入剂。

进一步，所述药物为片剂、粉末剂、注射剂、颗粒剂、糖浆、胶囊、溶液剂、栓剂或药膏。

上述丙戊酸的应用是通过上述思路实现的：首先建立多发性硬化的动物模型，通过对治疗前后神经学及体重的评价，组织学变化及验证细胞聚集及中性炎细胞的释放，最终得出丙戊酸在制备治疗多发性硬化的药物中的应用；同理可以推测出丙戊酸的盐制剂在制备治疗多发性硬化的药物中的应用。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：本发明为治疗多发性硬化提供了新的思路。更多有益效果将在实施例中体现。

图1为通过皮下注射人工合成的神经物质gpMBP_68-84肽诱导的多发性硬化大鼠模型的神经学得分分析图；其中分为PBS组和gpMBP_68-84肽诱导组；

图2为通过皮下注射人工合成的神经物质gpMBP_68-84肽诱导后对多发性硬化大鼠给予治疗后的神经学得分分析图；

图3为通过皮下注射人工合成的神经物质gpMBP_68-84肽诱导后对多发性硬化大鼠给予治疗后的体重分析图；其中，A为组织学得分图；B为每平方毫米巨噬细胞数目，C为每平方毫米T细胞数目，D为每平方毫米B细胞数目；

图4为多发性硬化大鼠脊柱HE染色的组织照片；

图5为多发性硬化大鼠脊柱HE染色的组织的分析；

图6为经过VPA治疗后，IL-1b, IFN-γ, TNF-α, IL-17 及 MMP9的mRNA水平分析图；

图7为多发性硬化大鼠外周血中CD4⁺细胞的数量分析图。

具体实施方式

:将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术,首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。

染色：又称苏木精 — 伊红染色法 ( hematoxylin-eosin staining ) ，石蜡切片技术里常用的染色法之一。苏木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。

流式细胞术：在液流系统中，快速测定单个细胞或细胞器的生物学性质，并把特定的细胞或细胞器从群体中加以分类收集的技术。其特点是通过快速测定库尔特电阻、荧光、光散射和光吸收来定量测定细胞 DNA含量、细胞体积、蛋白质含量、酶活性、细胞膜受体和表面抗原等许多重要参数。

实施例中采用的健康成年Lewis大鼠由北京维通利华实验动物公司提供,雄性，8至10周龄，体重170至200g。

实施例1 丙戊酸及丙戊酸盐

丙戊酸化学名称为2-丙基戊酸钠，1963年由法国Meurier首次证实有抗癫痫作用，1977年由我国试制成功。丙戊酸在临床被用来作为一种抗惊厥和稳定情绪的药物。主要用来治疗癫痫、躁郁症和不太常见的重性抑郁障碍。目前常用的是为丙戊酸、丙戊酸盐及丙戊酸与丙戊酸盐的复方制剂，丙戊酸盐包括丙戊酸镁、丙戊酰胺及其他临床常见的丙戊酸盐类药物。目前，尚无关于丙戊酸及其盐类治疗多发性硬化的报道。丙戊酸盐为丙戊酸的制剂，也可以用丙戊酸替代丙戊酸实现其功能。

丙戊酸可以制备为口服剂或鼻腔吸入剂，具体包括：片剂、粉末剂、注射剂、颗粒剂、糖浆、胶囊、溶液剂、栓剂或药膏。上述制备方法均按照《中国药典》及本领域常规方法制备。

实施例2多发性硬化动物模型的建立

一抗原乳化剂的制备

将50μL 碱性髓鞘蛋白氨基酸序列68至84位的短肽（1毫克/每毫升于PBS溶液中）与50μL 的完全弗氏佐剂（其中含1mg/mL结核分枝杆菌）混合，充分乳化制成抗原乳化剂。

二多发性硬化模型制备及发病情况分级和评价

分别给Lewis大鼠双后足皮下注射50μL 按上述方法制备的抗原乳化剂，免疫当天为第0天。第0天开始，每日称体重，观察大鼠的摄食情况，并采用双盲法每天两次进行神经功能评分，评分标准为通用的0～5级评分法：0分，正常、未发病；1分，鼠尾张力障碍；2分，部分后肢瘫痪或步态不稳；3分，完全后肢瘫痪；４分，部分或完全前肢瘫痪；5分，濒死状态或死亡。

结果见图1，可见该方法诱导的多发性硬化模型，在第9天左右发病，第13天达到疾病顶峰，随后症状逐渐减轻，在第19天左右恢复正常。

实施例3 丙戊酸在治疗多发性硬化的应用

本实施例中采用了实例2中的方法诱导出多发性硬化的大鼠作为实验对象。

一治疗方案及分组

治疗组：共计6只，从0-18天，每日灌胃丙戊酸（VPA）的PBS溶液1mL，500 mg/kg。

空白对照组：给予与治疗组等体积的PBS进行灌胃，共计6只。

二神经学得分及体重评价

免疫之后立即对空白对照组每日灌胃PBS溶液，对治疗组每日灌胃丙戊酸的PBS溶液（500 mg/kg）。在空白对照组，第一个神经病学的症状(尾部张力减弱)出现于9天 (临床评分：0.33±0.21)。接着，多发性硬化的神经病学状况快速加重，并于13天达到最大值(临床评分：3.67±0.42)。最后，多发性硬化的病重程度缓慢减轻，并在18天完全康复(临床评分：0±0)。在丙戊酸治疗组，第一个神经病学症状出现于11天(临床评分：0.5±0.22)，在13天达到最高评分(临床评分1.2±0.37)，然后在16天完全康复，详见图2。由此可知，丙戊酸的抑制治疗极大的延缓了侵袭，减轻了神经病理学的严重程度，并且减短了多发性硬化的持续时间。

多发性硬化的另外一个特征是进行性的体重下降。免疫之后，空白对照组和治疗组均可立即观测到快速的体重减轻( 1- 2天)，之后则是缓慢的体重恢复。空白对照组的老鼠在免疫之后8-14天的这段神经病理学发病期期间，体重下降，然后才有缓慢的体重回升，详见图3。治疗组的大鼠，出现了与较轻临床症状相一致的现象，体重减轻的量比对空白照组少。

三 VPA治疗减轻了多发性硬化大鼠脊柱中的组织学变化及炎症细胞聚集

按空白对照组及治疗组的大鼠部分在第13天处死，取出脊柱进行，对脊柱进行HE染色以观察组织的完整性及细胞的浸润情况，具体包括取材与固定、脱水透明、浸蜡包埋、切片与贴片、脱蜡染色、脱水透明及封固几个步骤。

由图4可见，空白对照组的大鼠的脊柱中可见到明显的血管周炎性细胞浸润。治疗组的大鼠则显著的减少了血管周炎性细胞浸润的发生率。治疗组和空白对照组大鼠之间的组织学变化则进一步通过半定量的方法来进行比较。在脊柱中，VPA治疗组的平均的组织学分数(1.08±0.11)要显著低于PBS对照组(2.07±0.18)，详见图5。

为了考察损伤脑组织的炎症细胞浸润情况，取大鼠脑组织做免疫组化染色。用乙醚深度麻醉大鼠后心内灌注4℃遇冷，体积分数为4％的多聚甲醛的磷酸盐缓冲液。脑迅速拆除，后在体积分数为4％多聚甲醛固定过夜，石蜡包埋，连续切片（3微米）、经过脱蜡，坐骨神经切片在柠檬酸缓冲液中煮沸15分钟以灭活内源性过氧化物酶。体积分数为1％的甲醇15分钟抑制过氧化氢酶，孵育于体积分数为10％的正常猪血清（Biochrom，柏林，德国），以阻止非特异性免疫球蛋白的结合。使用的单克隆抗体为：ED1（1:100; Serotec，牛津，英国）标记激活的巨噬细胞。使用stereologer软件进行细胞计数。

治疗组的大鼠在13天的时候脊柱中浸润的不同形态的炎症细胞有所下降。空白对照组大鼠中可以观察到T细胞(CD3⁺)，B细胞(OX22⁺)和巨噬细胞(ED1⁺)的浸润，详见图5；VPA治疗组则显著的抑制了T细胞(p＜0.01)，B细胞(p＜0.05)和巨噬细胞(p＜0.05，图5)的聚集。

四 VPA的治疗抑制了多发性硬化大鼠脊柱中炎性细胞因子的释放

在炎性细胞因子，IL-1β，IFN-γ，IL-17 及 MMP9在多发性硬化中扮演着疾病促进的角色，但是Th2类的细胞因子IL-4则与多发性硬化的转归相关。因此，我们通过RT-PCR进一步分析VPA对于多发性硬化大鼠13天时脊柱中某些炎症相关的细胞因子mRNA释放的影响。RT-PCR的实验采用常规方法进行，具体为大鼠在麻醉状态下4℃心内灌注PBS，然后快速取出损伤部位脑组织，放入液氮中保存时。用Trizol LS试剂(Invitrogen, Karlsruhe, Germany)分离出总RNA，然后使用QuantiTect Reverse Transcription试剂盒(Qiagen, Hilden, Germany)逆转录成为cDNA。根据操作指南(BioRad)使用SYBR green qPCR master mix转录所得的cDNA来测量基因表达量的多少。使用iCycler热循环系统和iQ5光学系统软件(BioRad)对基因的表达进行实时检测，用来检测基因表达的引物及其序列如下：

IL-1β上游引物: tgctgatgtaccagttgggg(SEQ ID NO:1), IL-1β下游引物 :ctc cat gag ctt tgt aca ag(SEQ ID NO:2);

TNF-α上游引物: tga tcg gtc cca aca agg a(SEQ ID NO:3), TNF-α下游引物: tgcttggtggtttgctacga(SEQ ID NO:4);

IFN-γ上游引物: aaagacaaccaggccatcag(SEQ ID NO:5), IFN- γ下游引物: cttttccgcttccttaggct(SEQ ID NO:6);

IL-4 上游引物: tgatgggtctcagcccccaccttgc(SEQ ID NO:7), IL-4 下游引物: ctt tca gtg ttg tga gcg tgg act c(SEQ ID NO:8);

IL-17 上游引物: tggactctgagccgcattga(SEQ ID NO:9), IL-17 下游引物: gacgcatggcggacaataga(SEQ ID NO:10);

T-bet上游引物: aaccagtatcctgttcccagc(SEQ ID NO:11), T-bet 下游引物: tgtcgccactggaaggatag(SEQ ID NO:12);

MMP9 上游引物: aaatgtgggtgtacacaggc(SEQ ID NO:13), MMP9 下游引物: ttcacccggttgtggaaact(SEQ ID NO:14);

β-actin 上游引物:ccgtcttcccctccatcgt(SEQ ID NO:15), β-actin 下游引物: atcgtcccagttggttacaatgc(SEQ ID NO:16)。

结果

如图6所示，经过VPA治疗后，IL-1β, IFN-γ, TNF-α, IL-17 ，MMP9的mRNA水平都显著下降了，IL-4的mRNA水平则上升了(p＜0.05). 伴随Th1细胞因子IFN-γ的下降，特异性Th1转录因子T-bet的mRNA水平也显著下降了 (p＜0.05)，这标志着接受VPA治疗的多发性硬化大鼠脊柱中的Th1细胞的数量是减少的。

五 VPA减少了多发性硬化大鼠外周血中辅助性T细胞的数量

因为多发性硬化是一种主要由辅助性T细胞促成的自身免疫紊乱，而辅助性T细胞为了发挥他们的效能必须进入循环系统，所以运用流式细胞术分析了VPA对于13天时多发性硬化大鼠外周血中CD4⁺细胞数量的影响。如图7所示，治疗组外周血中CD4 阳性的T细胞数量明显少于对照组(p＜0.05)，说明丙戊酸可显著的减少了多发性硬化大鼠外周血中CD4⁺细胞的数量，从而减轻炎症反应。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

<110> 中国人民解放军第三军医大学

<120> 丙戊酸及其衍生物的应用

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 引物IL-1β F

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 引物TNF-α F

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 引物TNF-α R

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tgctt ggtgg tttgc tacga 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 引物IFN- γ F

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<212> DNA

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<223> 引物IL-17 F

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tggac tctga gccgc attga 20

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<223> 引物IL-17 R

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 引物T-bet R

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tgtcg ccact ggaag gatag 20

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<212> DNA

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<223> 引物MMP9 F

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 引物MMP9 R

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ttcac ccggt tgtgg aaact 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 引物β-actin F

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ccgtc ttccc ctcca tcgt 19

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 引物β-actin R

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atcgt cccag ttggt tacaa tgc 23

Claims

1.丙戊酸和/或丙戊酸衍生物在制备治疗多发性硬化的药物中的应用，所述丙戊酸衍生物为丙戊酸镁、丙戊酸钠或丙戊酰胺。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药物为口服剂或鼻腔吸入剂。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药物为片剂、粉末剂、注射剂、颗粒剂、糖浆、胶囊、溶液剂、栓剂或药膏。