DE60035689T2

DE60035689T2 - Anionische Polymere als Toxinbindemittel und antibakterielle Mittel

Info

Publication number: DE60035689T2
Application number: DE60035689T
Authority: DE
Inventors: Caroline Sudbury KURTZ; Richard Marblehead FITZPATRICK
Original assignee: Genzyme Corp
Current assignee: Genzyme Corp
Priority date: 1999-05-13
Filing date: 2000-05-11
Publication date: 2008-04-30
Anticipated expiration: 2020-05-12
Also published as: DE60035689D1; NO329497B1; EP1189622B1; ATE367818T1; NO20015524D0; NO20015524L; PL352411A1; WO2000069428A2; IL146211A; PL197157B1; HK1044490A1; US20010041171A1; US6419914B2; EP1189622A2; WO2000069428A3; AU768592B2; BR0011520A; CA2374108A1; KR20020005032A; PT1189622E

Description

VERWANDTE ANMELDUNG
Diese Anmeldung beansprucht die Priorität der US-Anmeldung Nr. 09/541,268, eingereicht am 03. April 2000 und den Zeitrang der Provisional-Anmeldung Nr. 60/133,975, eingereicht am 13. Mai 1999, deren Inhalte hiermit in ihrer Gesamtheit per Verweis eingefügt werden.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Viele Pathogene produzieren Toxine, die für den Wirtsorganismus schädlich und in manchen Fällen tödlich sind. Durch Pathogene produzierte Toxine können in zwei allgemeine Kategorien klassifiziert werden, Exotoxine und Endotoxine.
Exotoxine sind im Allgemeinen Proteine oder Polypeptide. Diese Toxine, die von dem Pathogen sekretiert werden, können innerhalb des Wirts wandern und Schäden in Regionen des Wirts verursachen, die von der Infektionsstelle weit entfernt sind. Mit Exotoxinen verknüpfte Symptome variieren sehr und umfassen Hämolyse, systemischen Schock, Zerstörung von Leukozyten, Erbrechen, Paralyse und Diarrhoe.
Enterotoxine sind Exotoxine, die auf den Dünndarm wirken und eine massive Sekretion von Flüssigkeit in das Darmlumen bewirken, was zu Diarrhoe führt. Enterotoxine werden durch eine Vielzahl Bakterien produziert, einschließlich die Nahrungsmittel-vergiftenden Organismen Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens und Bacillus cereus, und die Darmpathogene Vibrio cholerae, Escherichia coli und Salmonella enteritidis.
Endotoxine sind Lipopolysaccharide/Lipoproteine, die in der äußeren Schicht der Zellwände gram-negativer Bakterien aufgefunden werden. Diese Lipopolysaccharide sind an die Zellmembran gebunden und werden bei Zytolyse freigesetzt. Mit der Freisetzung von Endotoxinen verknüpfte Symptome umfassen Fieber, Diarrhoe und Erbrechen. Insbesondere stimulieren Endotoxine Wirtszellen zur Freisetzung von Proteinen, endogenen Pyrogenen, welche die Hirnregion beeinflussen, die die Körpertemperatur reguliert. Zusätzlich zu Fieber, Diarrhoe und Erbrechen kann das Wirtslebewesen einen schnellen Abfall der Lymphozyten, Leukozyten und Blutplättchenanzahl erfahren und in einen allgemeinen Entzündungszustand eintreten.
Obwohl Endotoxine weniger giftig sind als Exotoxine, können große Dosen Endotoxine den Tod bewirken, im Allgemeinen durch hämorrhagischen Schock und Gewebenekrose. Beispiele von Bakterien, die Endotoxine produzieren, umfassen Bakterien der Gattung Escherichia, Shigella und insbesondere Salmonella.
In manchen Fällen kann die durch ein Endotoxin bewirkte aktive Krankheit durch Verabreichung eines Antitoxins an den Patienten behandelt werden. Ein Antitoxin umfasst Antikörper zu dem Toxin, die vom Serum eines Tieres abgleitet sind, typischerweise eines Pferdes, das durch Injektion eines Toxitoides, eines nicht-toxischen Derivates des Toxins, immunisiert wurde. Jedoch ist die Wirksamkeit von Antitoxinen begrenzt, weil Toxine durch Zellen schnell aufgenommen werden und für die Antikörper unerreichbar werden. Weiterhin kann das Immunsystem des Patienten auf fremde Proteine, die in dem Antitoxin vorhanden sind, reagieren, was einen Zustand erzeugt, der als Serumkrankheit bekannt ist.
Clostridium difficile ist einer der meist üblichen nosokomial-erworbenen Organismen in Hospitälern und Langzeitpflegeeinrichtungen geworden. Der Organismus infiziert typischerweise Patienten, deren normale Darmflora durch die Verabreichung eines Breitspektrumantibiotikums zerstört wurde. Die Diarrhoe und die entzündliche Kolitis, die mit der Infektion verbunden sind, stellen eine ernsthafte medizinische/chirurgische Komplikation dar, die zu einer erhöhten Krankhaftigkeit und Sterblichkeit führt, und zu verlängerten Hospitalaufenthalten von im Durchschnitt nahezu drei Wochen. Dies gilt insbesondere für die Älteren und für Patienten mit ernsthaften zugrundeliegenden Krankheiten, bei denen es am wahrscheinlichsten ist, dass sie die Infektion entwickeln. C. difficile assoziierte Diarrhoe (CDAD) stellt eine bedeutende ökonomische Belastung für das Gesundheitssystem dar, konservativ geschätzt mit 3-6 Milliarden Dollar pro Jahr zusätzlichen Krankenhauskosten in den Vereinigten Staaten allein.
Zurzeit sind Behandlungen für CDAD unzureichend. Solche Behandlungen umfassen das Absetzen des Antibiotikums, das die Manifestierung von CDAD bewirkt hat, und das Ermöglichen der schnellstmöglichen Regeneration der normalen Darmflora. In den meisten Fällen ist dies jedoch nicht ausreichend, und noch ein weiteres Antibiotikum, Metronidazol oder Vancomycin, wird verwendet, um C. difficile-Organismen zu töten. Die symptomatische Verbesserung mit Metronidazol ist langsam, braucht typischerweise 4 bis 8 Tage. Zusätzlich zeigen 20 % der behandelten Patienten, weil Metronidazol auch die normale Flora durch Ausrottung der meisten Anaeroben aus dem Darm verändert, einen Rückfall oder ein Wiederauftreten von CDAD, üblicherweise innerhalb von 1 bis 2 Wochen des Therapiestopps. In schweren oder wiederkehrenden Fällen von CDAD kann Vancomycin verwendet werden. Jedoch besitzt dieses Medikament eine gleiche Rückfallrate wie Metronidazol und hat auch das Potential für die unerwünschte Nebenwirkung der Bewirkung einer Selektion auf multimedikamentenresistente Enterococci und Staphylococci.
Diarrhoe und Kolitis sind ein direktes Ergebnis der Darmschädigung und Entzündung, die durch C. difficile-Toxine A und B bewirkt werden. Die Toxine A und B, produziert von C. difficile, beschädigen die Darm-Mukosa und sind die ursächlichen Mittel, die für die entzündliche Kolitis verantwortlich sind. Zurzeit sind keine Therapien verfügbar, um die bakteriellen Toxine zu inhibieren, die von C. difficile produziert werden, und die für die Darmschädigung und Entzündung, die zu Diarrhoe und Kolitis führen, verantwortlich sind. Pharmazeutika, welche die Toxine A und B inhibieren können, sind der meist logische Ansatz für die CDAD-Therapie.
Somit existiert ein Bedürfnis für ein verbessertes Verfahren zur Behandlung eines Toxinvermittelten Zustands, welche die oben erwähnten Probleme signifikant reduziert oder eliminiert.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Essentielle und optionale Merkmale der vorliegenden Erfindung sind in den begleitenden Hauptansprüchen bzw. Unteransprüchen festgelegt. Somit betrifft die vorliegende Erfindung im Allgemeinen ein Verfahren zur Inhibierung eines Toxins in einem Lebewesen, wie einem Menschen, durch Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Polymers an das Lebewesen, welches eine Vielzahl anhängende säurefunktionale Gruppen umfasst, die mit dem Polymerrückgrat durch eine Spacergruppe verbunden sind. Die Spacergruppe kann eine Länge im Bereich von 0 bis etwa 20 Atomen aufweisen. Das Toxin ist typischerweise ein Exotoxin, das durch einen pathogenen Mikroorganismus, wie einem Bakterium, sekretiert wird. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Polymer im Wesentlichen frei von Säureanhydriden.
Ebenso hierin offenbart sind pharmazeutische Zusammensetzungen, die anionische Polymere umfassen, und Verfahren zur Behandlung von CDAD und anderen antibiotisch assoziierten Diarrhoen (AAD) bei Säugern und insbesondere bei Menschen. Die therapeutischen Zusammensetzungen der Erfindung inaktivieren vorzugsweise sowohl C. difficile-Toxine A als auch B und sind hochwirksam bei der Verhinderung der Entwicklung von CDAD (prophylaktische Behandlung), wie auch bei der Verhinderung der Wiederkehr und des Rückfalls von CDAD, wenn es als Monotherapie verwendet wird, oder wenn es als Co-Therapie mit Antibiotika verwendet wird (z. B. Metronidazol und Vancomycin).
Die in den beschriebenen Verfahren verwendeten Polymere sind mit säurefunktionalen Gruppen substituiert, die ausgewählt sind aus Carbonsäure, Sulfonsäure, Phosphonsäure, Hydrogensulfat, Hydrogenphosphat, Sulfaminsäure und Borsäuregruppen. Diese Gruppen können auch in der konjugaten Basenform in Kombination mit einem geeigneten Kation vorhanden sein.
In einer Ausführungsform ist das zu verabreichende Polymer ein Copolymer, das gekennzeichnet ist durch ein erstes Monomer oder eine Wiederholungseinheit, die eine anhängende Säurefunktionale Gruppe hat, und ein zweites Monomer oder eine Wiederholungseinheit, die eine anhängende hydrophobe Gruppe hat. In einer weiteren Ausführungsform ist das Polymer durch ein Monomer oder eine Wiederholungseinheit gekennzeichnet, welches sowohl eine anhängende Säurefunktionale Gruppe als auch eine anhängende hydrophobe Gruppe hat. Das zu verabreichende Polymer kann wahlweise weiterhin durch ein Monomer oder eine Wiederholungseinheit gekennzeichnet sein, welche eine neutrale hydrophile Gruppe umfasst, wie eine Hydroxylgruppe oder eine Amidgruppe.
Bevorzugte therapeutische Zusammensetzungen zur Verwendung in erfindungsgemäßen Verfahren umfassen Poly(styrolsulfonat) und Salze davon. Bevorzugte Verfahren der Erfindung umfassen die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung an einen Patienten entweder als Co-Therapie mit dem Breitspektrumantibiotikum, welches andernfalls den Ausbruch von CDAD oder AAD herbeiführen kann, wäre die Polystyrol-haltige Zusammensetzung der Erfindung nicht zugegen. Die Co-Therapie mit einem Breitspektrumantibiotikum wird die Effektivität des Antibiotikums nicht beeinträchtigen, wird aber zur selben Zeit den Ausbruch von CDAD oder AAD verhindern.
In einer weiteren Ausführungsform können die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen nach Ausbruch der Krankheit entweder allein als Monotherapie verwendet werden oder als Co-Therapie mit Metronidazol, Vancomycin oder anderen Antibiotika, die zur Behandlung von CDAD oder AAD verwendet werden. In noch einer weiteren Ausführungsform können die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen entweder allein oder als eine Co-Therapie mit anderen Antibiotika verwendet werden, um die Wiederkehr oder den Rückfall der Krankheit zu verhindern.
Die vorliegende Erfindung hat viele Vorteile. Zum Beispiel werden die in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Zusammensetzungen unter Verwendung von Standardtechniken der Polymersynthese und billigen Ausgangsmaterialien leicht hergestellt. Die erfindungsgemäßen Verfahren beeinträchtigen im Allgemeinen nicht die Breitspektrumantibiotika, die zur Behandlung anderer Infektionen des Körpers oftmals nötig sind, und können somit in Verknüpfung mit Breitspektrumantibiotika verwendet werden. Zusätzlich kann der Patient gleichzeitig vor den nachteiligen Nebenwirkungen solcher Breitspektrumantibiotika geschützt werden, die oftmals zu CDAD oder AAD führen, wenn die prophylaktischen Behandlungskuren der Erfindung in Verknüpfung mit der Verabreichung von Breitspektrumantibiotika an den Patienten eingesetzt werden. Gleichermaßen beeinträchtigen die Behandlungskuren der Erfindung im Allgemeinen nicht die Wirkungen von Metronidazol oder Vancomycin und können daher auch in Verknüpfung mit solchen Behandlungen nach dem Ausbruch der Krankheit oder in der Nachbehandlung zur Verhinderung der Wiederkehr und des Rückfalls der Krankheit verwendet werden. Zusätzlich können die Zusammensetzungen und Verfahren der Erfindung als Monotherapie verwendet werden, um den Ausbruch der Krankheit (prophylaktisch) zu verhindern, die Behandlung nach Ausbruch zu behandeln oder den Rückfall zu verhindern. Die Monotherapie gemäß der Erfindung ist insbesondere vorteilhaft, wenn Patienten antibiotische Kuren nicht vertragen können.
KURZE BESCHREIBUNG DIE ZEICHNUNGEN
Die vorangehenden und weitere Gegenstände, Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der nachfolgenden spezielleren Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ersichtlich, wie in den begleitenden Zeichnungen verdeutlicht, in denen gleiche Referenzbuchstaben auf die gleichen Teile überall in den verschiedenen Ansichten verweisen. Die Zeichnungen sind nicht notwendigerweise maßstabsgerecht, stattdessen wird die Betonung auf die Verdeutlichung der erfindungsgemäßen Prinzipien gelegt.
Die 1 und 2 beschreiben die Wirkungen von Polystyrolsulfonat (160-246) auf Toxin A in zwei Hamstermodellen, nachfolgend detaillierter beschrieben.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Inhibierung eines pathogenen oder mikrobiellen Toxins in einem Patienten, wie z. B. einem Menschen, durch Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Polymers an den Patienten, das eine Vielzahl anhängender säurefunktionaler Gruppen umfasst. Die säurefunktionale Gruppe kann durch eine aliphatische Spacergruppe mit einer Länge von 1 bis etwa 20 Atomen mit dem Polymerrückgrat verbunden sein.
Wie hierin verwendet, verweist der Begriff „Inhibierung eines mikrobiellen Toxins" auf die Inhibierung der Aktivität eines Toxins, das mit der Entwicklung eines bestimmten Krankheitszustands oder medizinischen Zustands assoziiert ist. Das mikrobielle Toxin ist ein Endotoxin oder Exotoxin, das durch einen Mikroorganismus, wie ein Bakterium, einen Pilz, einen Protozoon oder einen Virus produziert wird. Das Toxin kann durch jeden Mechanismus inhibiert werden, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, der Bindung des Toxins durch das Polymer. Wie hierin verwendet, ist eine „therapeutisch wirksame Menge" eine Menge, die zur teilweisen oder totalen Inhibierung oder Verhinderung eines Gewebeschadens oder anderer Symptome, die mit der Wirkung des Toxins innerhalb oder auf den Körper des Patienten assoziiert ist, oder zur Verhinderung oder Reduzierung des weiteren Fortschritts solcher Symptome ausreichend ist.
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren und therapeutische Zusammensetzungen bereit, die zur Behandlung von AAD, einschließlich CDAD, und Kolitis nützlich sind. Wie hier verwendet, umfasst der Begriff „Behandlung" von Krankheiten der Erfindung: die prophylaktische Behandlung derjenigen Säuger, die gegen AAD, CDAD oder entzündliche Kolitis empfindlich sind, die Behandlung des Erstausbruchs von AAD, CDAD oder entzündlicher Kolitis, die Behandlung von fortschreitender AAD, CDAD oder entzündlicher Kolitis und die Behandlung von wiederkehrender AAD, CDAD oder entzündlicher Kolitis in empfindlichen Säugern. Wie hierin verwendet, ist ein „empfindlicher" Säuger ein Säuger, der Krankheit entwickeln kann oder einen Krankheitsrückfall aus irgendeinem Grund zeigt, einschließlich der Verwendung von Breitspektrumantibiotika, welche die normale Flora stören können, was zu CDAD führt. Therapeutische Zusammensetzungen der Erfindung umfassen vorzugsweise Polystyrolsulfonat, Salze und Copolymere davon.
Der Begriff „Monomer", wie hierin verwendet, verweist sowohl auf ein Molekül, das eine oder mehrere polymerisierbare funktionale Gruppen vor der Polymerisation umfasst, und eine Wiederholungseinheit eines Polymers. Ein Copolymer ist durch die Anwesenheit von zwei oder mehr verschiedenen Monomeren gekennzeichnet.
Wie hierin verwendet, verweist der Begriff „Polymerrückgrat" oder „Rückgrat" auf den Teil des Polymers, der eine kontinuierliche Kette ist, welche die Bindungen umfasst, die bei der Polymerisation zwischen Monomeren gebildet werden. Die Zusammensetzung des Polymerrückgrats kann bezüglich der Identität der Monomere beschrieben werden, aus denen es gebildet ist, ohne Rücksicht auf die Zusammensetzung von Verzweigungen oder Seitenketten, die vom Polymerrückgrat weggehen. Somit sagt man, dass Poly(acrylsäure) ein Poly(ethylen)-Rückgrat hat, das mit Carbonsäure-(-C(O)OH)-Gruppen als Seitenketten substituiert ist.
Eine „anhängende" Gruppe ist eine Einheit, die einen Teil einer Seitenkette bildet, welche an das Polymerrückgrat angehängt ist. Die anhängende Gruppe ist mittels einer Spacergruppe mit dem Polymerrückgrat verbunden.
Das säurefunktionalisierte Monomer umfasst eine säurefunktionale Gruppe, die ausgewählt ist aus einer Carbonsäuregruppe, einer Sulfonsäuregruppe, eine Hydrogensulfatgruppe, einer Phosphonsäuregruppe, einer Sulfaminsäuregruppe, einer Hydrogenphosphatgruppe oder einer Borsäuregruppe. Als säurefunktionale Gruppen werden hierin die Säure-protonierte Form oder teilweise protonierte Form bezeichnet. Jedoch versteht es sich, dass jede säurefunktionale Gruppe auch in der konjugierten Basen- oder deprotonierten Form in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Kation vorliegen kann. Das zu verabreichende Polymer kann säurefunktionale Gruppen sowohl in der protonierten Form, der deprotonierten Form oder einer Kombination davon umfassen. Geeignete Kationen umfassen Alkalimetallionen, wie Natrium-, Kalium- und Cäsiumionen, Erdalkali-Ionen, wie Calcium- und Magnesiumionen, Übergangsmetallionen und unsubstituierte und substituierte (primäre, sekundäre, tertiäre und quaternäre) Ammoniumionen. In einer Ausführungsform ist das Kation ein polyvalentes Metallion, wie Ca²⁺‚ Mg²⁺, Zn²⁺, Al³⁺, Bi³⁺, Fe²⁺ oder Fe³⁺ Das Polymer ist im Wesentlichen frei von Säureanhydridgruppen. Zum Beispiel weniger als 5 %, vorzugsweise weniger als 2 %. Mehr bevorzugt ist keine der säurefunktionalen Gruppen innerhalb des Polymers in der Anhydridform zugegen.
Die säurefunktionale Gruppe ist an das Polymerrückgrat über eine Spacergruppe angehängt. Die Spacergruppe ist eine Komponente der Polymerseitenkette und verbindet die säurefunktionale Gruppe mit dem Polymerrückgrat. Die Spacergruppe kann linear oder verzweigt, aliphatisch, aromatisch oder teilweise aromatisch und teilweise aliphatisch sein. Geeignete aliphatische Spacergruppen umfassen normale oder verzweigte, gesättigte oder teilweise ungesättigte Hydrocarbylgruppen, einschließlich Alkylengruppen, z. B. Polymethylengruppen, wie -(CH₂)_n-, worin n eine ganze Zahl von 1 bis etwa 20 ist, und Cycloalkylengruppen, wie die 1,4-Cyclohexylengruppe. Die Alkylengruppe kann substituiert oder unsubstituiert sein. Geeignete Alkylen-Substituenten umfassen Hydroxylgruppen und Halogenatome, z. B. Fluor-, Chlor- und Bromatome. Die Alkylengruppe kann auch, wahlweise, an einem oder mehreren Punkten durch ein Heteroatom unterbrochen sein, wie ein Sauerstoff-, Stickstoff- oder Schwefelatom. Beispiele umfassen die Oxalkylengruppen, z. B. -(CH₂)₂O[(CH₂)₂O]_n(CH₂)₂-, worin n eine ganze Zahl im Bereich von 0 bis etwa 3 ist. Die Spacergruppe kann auch eine teilweise ungesättigte Gruppe sein, wie eine substituierte oder unsubstituierte C₂-C₂₀-Alkenylengruppe oder eine C₂-C₂₀-Alkenylengruppe, die an einem oder mehreren Punkten durch ein Heteroatom unterbrochen ist. Geeignete aromatische Spacergruppen umfassen Ortho-, Meta- und Para-Phenylengruppen, Naphthylengruppen und Biphenylengruppen.
In einer Ausführungsform umfasst mindestens ein Teil der Wiederholungseinheiten innerhalb des Polymers weiterhin eine anhängende hydrophobe Gruppe. Die anhängende hydrophobe Gruppe kann eine substituierte oder unsubstituierte, gesättigte oder teilweise ungesättigte C₂-C₂₄-Hydrocarbylgruppe oder eine substituierte oder unsubstituierte Aryl- oder Arylalkylgruppe sein. Beispiele geeigneter Alkyl-Substituenten beinhalten Halogenatome, wie Fluor- oder Chloratome, und Arylgruppen, wie eine Phenylgruppe. Aryl-Substituenten können Halogenatome, C₁-C₆-Alkylgruppen und C₁-C₆-Alkoxygruppen beinhalten. Vorzugsweise ist die anhängende hydrophobe Gruppe eine normale oder verzweigte C₂-C₂₄-Alkylgruppe.
In einer Ausführungsform ist das zu verabreichende Polymer ein Homopolymer. In einer weiteren Ausführungsform ist das zu verabreichende Polymer ein Copolymer, das durch ein säurefunktionalisiertes Monomer und ein hydrophobes Monomer charakterisiert ist. Der Begriff „hydrophobes Monomer", wie hierin verwendet, bedeutet ein Monomer, das eine anhängende hydrophobe Gruppe, wie oben beschrieben, umfasst. Geeignete hydrophobe Monomere umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, ein substituiertes oder unsubstituiertes N-C₃-C₂₄-Alkylacrylamid, wie ein N-n-Decylacrylamid und N-Isopropylacrylamid, substituierte oder unsubstituierte C₃-C₂₄-Alkylacrylate, wie n-Butylacrylat und n-Decylacrylat, Styrol und substituierte Styrole, wie Pentafluorstyrol und 4-Fluorstyrol, Vinylnaphthalin und Vinylbiphenyl. Das Copolymer kann einen weiten Bereich Zusammensetzungen haben, umfassend z. B. von etwa 10 Mol-% bis etwa 50 Mol-% des hydrophoben Monomers und von etwa 90 Mol-% bis etwa 50 Mol-% des säurefunktionalisierten Monomers.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das zu verabreichende Polymer durch eine Wiederholungseinheit gekennzeichnet, die eine säurefunktionale Gruppe umfasst. In dieser Ausführungsform werden keine zwei säurefunktionalen Gruppen innerhalb des Polymers mit benachbarten Polymerrückgrat-Atomen verbunden sein. In einer Ausführungsform ist das zu verabreichende Polymer durch eine Wiederholungseinheit oder ein Monomer der allgemeinen Formel
gekennzeichnet, worin X eine Spacergruppe ist, wie oben beschrieben, oder eine direkte Bindung, R¹ und R² jeweils unabhängig Wasserstoff oder eine Alkylgruppe sind, vorzugsweise Methyl oder Ethyl, und Y die säurefunktionale Gruppe ist. Beispiele geeigneter Monomere dieses Typs umfassen Acrylsäure, Methacrylsäure, Vinylsulfonsäure, Vinylphosphonsäure, 3-Allyloxy-2-hydroxy-1-propansulfonsäure, Vinylessigsäure und Ester von Vinylalkohol und Allylalkohol mit Mineralsäuren, wie Schwefel-, Phosphor- und Borsäuren, einschließlich Vinylhydrogensulfat, Vinyldihydrogenphosphat, Allylhydrogensulfat, Allyldihydrogenphosphat und konjugierte Basen davon. Das Monomer kann auch polymerisiertes Alken sein, das mit einer säurefunktionalen Gruppe substituiert ist, wie Undecensäure, Undecenylhydrogensulfat und Undecenylsulfonsäure. Andere geeignete Beispiele umfassen säurefunktionalisiertes Styrol, wie Styrolsulfonat, Styrolphosphonat und Vinylbenzoesäure, säurefunktionalisiertes Vinylnaphthalin, wie Vinylnaphthalinsulfonat und säurefunktionalisiertes Vinylbiphenyl, wie Vinylbiphenylsulfonat.
In einer weiteren Ausführungsform ist das zu verabreichende Polymer durch eine Wiederholungseinheit oder Monomer der allgemeinen Formel
gekennzeichnet, worin Z Sauerstoff oder NH ist, und X eine Spacergruppe ist, wie oben beschrieben. Y ist die säurefunktionale Gruppe und R¹ und R² sind jeweils unabhängig Wasserstoff oder eine Alkylgruppe, vorzugsweise Methyl oder Ethyl. Beispiele geeigneter Monomere dieses Typs umfassen 2-Acrylamidoglycolsäure und 2-Acrylamido-2-methyl-1-propansulfonsäure.
Geeignete Copolymere zur Verwendung im vorliegenden Verfahren umfassen Copolymere von Acrylsäure und einem C₂-C₂₀-Alkylacrylat, wie Poly(acrylsäure-co-n-decylacrylat) und Poly(acrylsäure-co-n-butylacrylat). Ebenso umfasst sind Copolymere von Acrylsäure und einem N-C₂-C₂₀-Alkylacrylamid, wie Poly(acrylsäure-co-N-isopropylacrylamid) und Poly(acrylsäure-co-N-n-decylacrylamid), und Copolymere von Acrylsäure mit Styrol oder einem substituierten Styrol, wie Pentafluorstyrol oder 4-Fluorstyrol.
In einer weiteren Ausführungsform ist das zu verabreichende Polymer ein Copolymer, das ein säurefunktionalisiertes Monomer, ein hydrophobes Monomer und ein neutrales hydrophiles Monomer umfasst. Ein neutrales hydrophiles Monomer ist ein Monomer, das eine polare Gruppe umfasst, die bei physiologischem pH weder zusehends sauer noch zusehends basisch ist. Beispiele geeigneter neutraler hydrophiler Monomere umfassen Acrylamid, N-(2-hydroxyethyl)acrylamid, N-(3-Hydroxypropyl)acrylamid, 2-Hydroxyethylacrylat, Vinylacetat, Vinylalkohol und N-Vinylpyrrolidon. Ein geeignetes Copolymer dieses Typs ist das Terpolymer Poly(acrylsäure-co-n-decylacrylat-co-acrylamid).
Das zu verabreichende Polymer kann auch durch eine Wiederholungseinheit gekennzeichnet sein, die sowohl eine anhängende hydrophobe Gruppe als auch eine anhängende säurefunktionale Gruppe umfasst. Geeignete hydrophobe Gruppen und säurefunktionale Gruppen umfassen diejenigen, die oben diskutiert sind. Polymere dieses Typs umfassen Poly(2-alkylacrylsäure), worin die Alkylgruppe 2 bis etwa 24 Kohlenstoffatome umfasst. Ein geeignetes Polymer dieses Typs ist Poly(2-ethylacrylsäure) oder eine konjugate Base davon. Das zu verabreichende Polymer kann auch ein erstes Monomer umfassen, das eine anhängende hydrophobe Gruppe hat und eine anhängende säurefunktionale Gruppe, und ein zweites neutrales, hydrophiles Monomer, wie die zuvor diskutierten neutralen hydrophilen Monomere.
In einer Ausführungsform umfasst das zu verabreichende Polymer eine erste Wiederholungseinheit, die eine anhängende säurefunktionale Gruppe umfasst, und eine zweite Wiederholungseinheit, die ein anhängendes Säurederivat umfasst, wie eine Amidgruppe oder eine Estergruppe. Geeignete Beispiele von Polymeren dieses Typs umfassen Poly(styrolsulfonat), in dem ein Teil der Sulfonatgruppen in Sulfonamid- oder Sulfonatestergruppen überführt wurde, und Polyacrylat, in dem ein Teil der Carboxylatgruppen in Amid- oder Estergruppen überführt wurde. Die Eigenschaften des Polymers können durch Variation der Menge und chemischen Eigenschaften der über die Amidierung oder den Veresterungsprozess in das Polymer eingeführten Gruppen variiert werden. In einer Ausführungsform umfasst das Polymer Wiederholungseinheiten mit anhängenden Estergruppen, worin die Estergruppe von einem Alkohol, wie Menthol, einer Gallensäure, wie Cholsäure oder Lithocholsäure, oder einem Alkanol, wie einem normalen oder verzweigten C₄-C₁₂-Alkanol, abgeleitet ist. In einer weiteren Ausführungsform umfasst das Polymer Wiederholungseinheiten mit anhängenden Amidgruppen, worin die Amidgruppen von einem Amin, wie einem Alkylamin, z. B. einem normalen oder verzweigten C₄-C₁₂-Alkylamin, oder einem Ammonioalkylamin abgeleitet sind. Geeignete Ammonioalkylamine umfassen Verbindungen der Formel R¹(R²)(R³)N⁺(CH₂)_nNH₂, worin R₁, R₂ und R₃ jeder unabhängig Wasserstoff, eine C₁-C₁₂-Alkylgruppe oder eine Arylalkylgruppe sind, und n eine ganze Zahl von 1 bis etwa 12 ist.
In einer weiteren Ausführungsform ist das zu verabreichende Polymer ein Copolymer, das ein säurefunktionalisiertes Monomer oder Wiederholungseinheit, eine kationische Wiederholungseinheit und, wahlweise, eine hydrophobe Wiederholungseinheit und/oder eine neutrale hydrophile Wiederholungseinheit umfasst. Zum Beispiel kann die säurefunktionalisierte, hydrophobe und neutrale hydrophile Wiederholungseinheit jede der Wiederholungseinheiten derjenigen Typen umfassen, die oben diskutiert sind. Die kationische Wiederholungseinheit trägt unter physiologischen Bedingungen eine positive Ladung und umfasst bevorzugt eine anhängende Amino- oder Ammoniumgruppe. Geeignete Wiederholungseinheiten dieses Typs umfassen diejenigen, die in der US-Patentanmeldung der Serien-Nr. 08/934,495 offenbart sind, worauf hierin in ihrer Gesamtheit verwiesen wird. Beispiele geeigneter kationischer Wiederholungseinheiten umfassen Allylamin, N-substituiertes Allylamin, quaternisiertes Allylamin, Diallylamin, N-substituiertes Diallylamin, quaternisiertes Diallylamin, Vinylamin, N-substituiertes Vinylamin, quaternisiertes Vinylamin, N-Aminoalkylacrylamid und -methacrylamid, N- Ammonioalkylacrylamid und -methacrylamid, Aminoalkylacrylat und -methacrylat und Ammonioalkylacrylat und -methacrylat. Das Verhältnis von anionischen und kationischen Wiederholungseinheiten kann weit variieren, z. B. von etwa 95 % anionischem Monomer und 5 % kationischem Monomer relativ zu der Gesamtheit an geladenen Monomeren in dem Polymer, bis etwa 5 % anionischem Monomer und 95 % kationischem Monomer relativ zu der Gesamtheit an geladenen Monomeren, vorzugsweise sind 75 % der Monomere oder mehr anionisch.
Bevorzugte erfindungsgemäße Polymere umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein:
Poly(propensulfat), Poly(butensulfat), Poly(pentensulfat), Poly(hexensulfat), Poly(heptensulfat), Poly(octensulfat), Poly(nonensulfat), Poly(decensulfat), Poly(undecensulfat), Poly(dodecensulfat)
Poly(propensulfonat), Poly(butensulfonat), Poly(pentensulfonat), Poly(hexensulfonat), Poly(heptensulfonat), Poly(octensulfonat), Poly(nonensulfonat), Poly(decensulfonat), Poly(undecensulfonat), Poly(dodecensulfonat),
Poly(propenphosphat), Poly(butenphosphat), Poly(pentenphosphat), Poly(hexenphosphat), Poly(heptenphosphat), Poly(octenphosphat), Poly(nonenphosphat), Poly(decenphosphat), Poly(undecenphosphat), Poly(dodecenphosphat),
Poly(propenphosphonat), Poly(butenphosphonat), Poly(pentenphosphonat), Poly(hexenphosphonat), Poly(heptenphosphonat), Poly(octenphosphonat), Poly(nonenphosphonat) , Poly(decenphosphonat), Poly(undecenphosphonat), Poly(dodecenphosphonat),
Poly(styrolsulfonat), Poly(styrolsulfat), Poly(styrolsulfanilat), Poly(sulfophenylalanin), Poly(tyrosinsulfat), Poly(sulfophenethylacrylamid), Poly(sulfophenethylmethacrylamid), Poly(vinylnaphthalinsulfonat), Poly(vinylnaphthalinsulfat), Poly(vinylbiphenylsulfonat), Poly(vinylbiphenylsulfat), Poly(anetholsulfonat), Poly(vinylbenzoesäure),
Poly(sulfophenylpropen), Poly(sulfophenylbuten), Poly(sulfophenylpenten), Poly(sulfophenylhexen), Poly(sulfophenylhepten), Poly(sulfophenylocten), Poly(sulfophenylnonen), Poly(sulfophenyldecen), Poly(sulfophenylundecen), Poly(sulfophenyldodecen),
Poly(sulfatphenylpropen), Poly(sulfatphenylbuten), Poly(sulfatphenylpenten), Poly(sulfatphenylhexen), Poly(sulfatphenylhepten), Poly(sulfatphenylocten), Poly(sulfatphenylnonen), Poly(sulfatphenyldecen), Poly(sulfatphenylundecen), Poly(sulfatphenyldodecen),
Poly(phosphophenylpropen), Poly(phosphophenylbuten), Poly(phosphophenylpenten), Poly(phosphophenylhexen), Poly(phosphophenylhepten), Poly(phosphophenylocten), Poly(phosphophenylnonen), Poly(phosphophenyldecen), Poly(phosphophenylundecen), Poly(phosphophenyldodecen),
Poly(phosphatphenylpropen), Poly(phosphatphenylbuten), Poly(phosphatphenylpenten), Poly(phosphatphenylhexen), Poly(phosphatphenylhepten), Poly(phosphatphenylocten), Poly(phosphatphenylnonen), Poly(phosphatphenyldecen), Poly(phosphatphenylundecen), Poly(phosphatphenyldodecen),
Sulfoniertes Poly(vinylphenyl keton), sulfoniertes Poly(phenylsulfon), sulfoniertes Poly(4-methylstyrol), sulfoniertes Poly(α-methylstyrol), sulfoniertes Poly(styrol-block-ethylenoxid-block-styrol), sulfoniertes Poly(ethylen oxid-block-styrol-block-ethylenoxid), sulfoniertes Poly(4-methoxystyrol), sulfoniertes Poly(diphenoxyphosphazen), sulfoniertes Poly(ethylenoxid-block-styrol), sulfoniertes Polystyrol-block-ethylen) , sulfoniertes Poly(acenaphthylen), sulfoniertes Poly(vinylcarbazol), sulfoniertes Poly(styrol-co-butadien), sulfoniertes Polystyrol-block-(ethylen-co-butylen)-block-styrol),
Poly(styrolsulfonat-co-maleinsäure), Poly(styrolsulfonat-co-acrysäure), Poly(styrolsulfonat-co-methacrylsäure), Poly(styrolsulfonat-co-acrylamidomethylpropansulfonat), Poly(styrolsulfonat-co-itaconsäure), Poly(styrolsulfonat-co-vinylbenzoesäure),
Poly(styrolsulfonat-co-diallylmethylammoniumchlorid), Poly(styrolsulfonat-co-diallyldimethylammoniumchlorid), Poly(styrolsulfonat-co-diallylmethyloctylammoniumchlorid), Poly(styrolsulfonat-co-allylamin), Poly(styrolsulfonat-co-vinylamin), Poly(styrolsulfonat-co-vinylbenzyltrimethylammonium chlorid),
Poly(styrolsulfonat-co-styrol), Poly(styrolsulfonat-co-octylstyrolsulfonamid), Poly(styrolsulfonat-co-menthylstyrolsulfonat), Poly(styrolsulfonat-co-lithocholsäure styrolsulfonat).
Die Polymere zur Verwendung im vorliegenden Verfahren können linear oder vernetzt sein. Das Polymer kann beispielsweise durch Einfügung eines multifunktionalen Comonomers innerhalb des Polymers vernetzt sein. Geeignete multifunktionale Comonomere umfassen Diacrylate, Triacrylate und Tetraacrylate, Dimethacrylate, Diacrylamide, Diallylacrylamid, Di(methacrylamide), Triallylamin und das Tetraalkylammoniumion. Spezielle Beispiele umfassen Ethylen glycol diacrylat, Propylen glycol diacrylat, Butylen glycol diacrylat, Ethylen glycol dimethacrylat, Butylen glycol dimethacrylat, Methylen bis(methacrylamid), Ethylen bis(acrylamid), Ethylen bis(methacrylamid), Ethyliden bis(acrylamid), Ethyliden bis(methacrylamid), Pentaerythritol tetraacrylat, Trimethylolpropan tiacrylat, Bisphenol A dimethacrylat und Bisphenol A diacrylat. Weitere geeignete multifunktionale Monomere umfassen Polyvinylarene, wie Divinylbenzol. Die Menge Vernetzer ist typischerweise zwischen 1,0 % und etwa 30 %, bezogen auf das Gewicht relativ zum Gewicht des Polymers, vorzugsweise von etwa 5 % bis etwa 25 % bezogen auf das Gewicht.
Das Polymer kann auch im Anschluss an die Polymerisation vernetzt werden. Zum Beispiel kann ein Teil der säurefunktionalen Gruppen in ein reaktives Derivat überführt werden, wie aus dem Stand der Technik bekannt. Zum Beispiel reagieren Carbonsäure- und Sulfonsäuregruppen mit Thionylchlorid, um Acylchlorid- bzw. Sulfonylchloridgruppen zu bilden. Diese reaktiven Gruppen können dann mit einem Diamin, einem Dialkohol oder einem Aminoalkohol, vorzugsweise Diamin, einem Dialkohol oder einem Aminoalkohol, in dem die Amino- und/oder Hydroxylgruppen durch eine Alkylenkette getrennt sind, wie z. B. eine C₃-C₁₈-Alkylenkette, umgesetzt werden. Diese Reaktion resultiert in der Bildung von Ester- und/oder Amidgruppen an einer gegebenen Polymerkette, die an entsprechende Gruppen an benachbarten Polymerketten geknüpft sind. Das Ausmaß an Vernetzung kann kontrolliert werden, z. B. durch Kontrolle des Anteils säurefunktionaler Gruppen, die in reaktive Gruppen überführt werden.
Das Molekulargewicht des Polymers ist nicht kritisch, aber es ist vorzugsweise geeignet für die beabsichtigte Art der Verabreichung und ermöglicht dem Polymer das Erreichen und Verbleiben innerhalb der Zielregion des Körpers. Zum Beispiel sollte ein Verfahren zur Behandlung einer Darminfektion ein Polymer ausreichend hohen Molekulargewichts oder Grad der Vernetzung einsetzen, um der partiellen oder vollständigen Absorption vom Verdauungstrakt in andere Teile des Körpers zu widerstehen. Vorzugsweise, falls linear, besitzt das zu verabreichende Polymer ein Molekulargewicht im Bereich von etwa größer als 1 bis etwa 1 Million Dalton oder mehr, wie 2000 Dalton bis etwa 500000 Dalton, 5000 Dalton bis etwa 150000 Dalton, oder etwa 25000 Dalton bis etwa 1 Million Dalton. Alternativ kann das Molekulargewicht von etwa 100000 bis etwa 1 Million oder zwischen etwa 400000 bis etwa 1 Million Dalton betragen.
Die Polymere zur Verwendung im vorliegenden Verfahren sind vorzugsweise im Wesentlichen nicht bioabbaubar und nicht absorbierbar. Das heißt, die Polymere bauen unter physiologischen Bedingungen nicht wesentlich in Fragmente ab, die durch Körpergewebe absorbierbar sind. Die Polymere besitzen vorzugsweise ein nicht-hydrolysierbares Rückgrat, das unter Bedingungen, wie sie in der Zielregion des Körpers anzutreffen sind, wie dem Verdauungstrakt, im Wesentlichen inert ist. Ein besonders bevorzugtes Polymer ist Polystyrolsulfonat. Vorzugsweise ist das Polymer ein lösliches, nicht-vernetztes Polystyrolsulfonatpolymer mit einem Molekulargewicht zwischen etwa 400000 und 1 Million Dalton, wie z. B. 600000 Dalton. Alternativ umfassen Polymerrückgrate, die für die vorliegende Erfindung geeignet sind, Polyacrylamid-, Polyacrylat-, Poly(vinyl)- und Poly(ethylenimin)-, Polystyrol-Rückgrate. Ein Copolymer der vorliegenden Erfindung kann eine Kombination von zwei oder mehr dieser Rückgratelemente umfassen. Das zu verabreichende Polymer kann auch ein Kondensationspolymer sein, wie z. B. ein Polyamid oder ein Polyester.
Die Menge eines vorgegebenen zu verabreichenden Polymers wird auf einer individuellen Basis bestimmt und wird, zumindest teilweise, durch Berücksichtigung der Größe des Individuums, der Identität des bekannten oder vermuteten pathogenen Organismus, der Schwere von zu behandelnden Symptomen und des gesuchten Ergebnisses bestimmt. Das Polymer kann allein oder in einer pharmazeutischen Zusammensetzung verabreicht werden, welche das Polymer und einen oder mehrere pharmazeutisch verträgliche Träger, Lösemittel oder Hilfsstoffe umfasst. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann wahlweise auch einen oder mehr zusätzliche Arzneistoffe, wie Antibiotika, Anti-Entzündungsmittel oder Schmerzmittel umfassen.
Das Polymer kann durch subkutane oder andere Injektion, intravenös, topisch, oral, parenteral, transdermal oder rektal durch eine Einführröhre verabreicht werden. Vorzugsweise wird das Polymer oder die pharmazeutische Zusammensetzung, die das Polymer umfasst, oral verabreicht. Die Form, in der das Polymer verabreicht wird, z. B. Pulver, Tablette, Kapsel, Lösung oder Emulsion, wird von dem Weg abhängen, auf dem es verabreicht wird. Die therapeutisch wirksame Menge kann in einer Einfachdosis oder in einer Serie Dosen verabreicht werden, die durch geeignete Zeitintervalle, wie Stunden, getrennt sind.
Für die orale Zuführung können Polymere in einer Dosierung von etwa 0,1 bis 10 g/kg/Tag und mehr bevorzugt von 1,0-7,0 g/kg/Tag und noch mehr bevorzugt von 2,0 bis 6,6 g/kg/Tag) verabreicht werden.
Das Polymer kann auch in Kombination mit einem oder mehr antimikrobiellen Mitteln, z. B. ausgewählt aus Antibiotika, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, verabreicht werden. Das zu verabreichende Antibiotikum wird im Allgemeinen auf Basis der Identität oder vermuteten Identität des pathogenen Mikroorganismus ausgewählt, wie aus dem Stand der Technik bekannt. Wenn z. B. der pathogene Mikroorganismus C. parvum ist, ist ein geeignetes Antibiotikum, das in Kombination mit dem Polymer verabreicht werden kann, Paromomycin. Das Polymer und das antimikrobielle Mittel können gleichzeitig, z. B. in separaten Dosierungsformen, oder in einer Einzeldosierungsform, oder in einer Sequenz, die durch geeignete Zeitintervalle getrennt ist, verabreicht werden.
Der Begriff „antimikrobielles Mittel" soll antibakterielle Mittel, Anti-Pilz-Mittel, Antiseptika und dergleichen umfassen. Geeignete antimikrobielle Mittel sind aus dem Stand der Technik bekannt und umfassen Isoniazid, Rifampin, Pyrazinamid, Ethambutol, Erythromycin, Vancomycin, Tetracyclin, Chloramphenicol, Sulfonamide, Gentamicin, Amoxicillin, Penicillin, Streptomycin, P-Aminosalicylsäure, Clarithromycin, Clofazimin, Minocyclin, Sulfonamide, Ethionamid, Cycloserin, Kanamycin, Amikacin, Capreomycin, Viomycin, Thiacetazon, Rifabutin und die Chinolone, wie Ciprofloxacin, Ofloxacin und Sparfloxicin. Der Begriff „antibakterielles Mittel" umfasst, ohne darauf beschränkt zu sein: natürlich vorkommende Antibiotika, die von Mikroorganismen produziert werden, um das Wachstum anderer Mikroorganismen zu unterdrücken, und im Labor synthetisierte oder modifizierte Mittel, die entweder bakterizide oder bakteriostatische Aktivität haben, z. B. β-Lactam antibakterielle Mittel, einschließlich z. B. Carbencillim, Ampicillin, Cloxacillin, Oxacillin und Pieracillin, Cephalosporine und andere Cepheme einschließlich z. B. Cefaclor, Cefamandol, Cefazolin, Cefoperazon, Ceftaxim, Cefoxitin, Ceftazidim, Ceftriazon und Carbapeneme einschließlich z. B. Imipenem und Meropenem; und Glycopeptide, Macrolide, Chinolone (z. B. Nalidixinsäure), Tetracycline, Aminoglycoside (z. B. Gentamicin und Paromomycin) und umfasst weiterhin Antipilzmittel. Wenn das antibakterielle Mittel bakteriostatisch ist, bedeutet das im Allgemeinen, dass das Mittel im Wesentlichen bakterielles Zellwachstum stoppt (aber die Bakterien nicht tötet), wenn das Mittel bakteriozid ist, bedeutet es, dass das Mittel bakterielle Zellen tötet (und das Wachstum vor Tötung der Bakterien stoppen kann).
Somit können die hierin beschriebenen Polymere und Zusammensetzungen in der Medizin eingesetzt werden, z. B. bei der Herstellung eines Medikaments für die hierin beschriebenen Therapien und Behandlungen.
In einer Ausführungsform wird das Polymer, das eine Vielzahl anhängender säurefunktionaler Gruppen umfasst, in Kombination mit einem kationischen Polymer verabreicht, vorzugsweise einem Polymer, das Amino- und/oder Ammoniumgruppen umfasst. Beispiele geeigneter Polymerer dieses Typs sind in der ebenfalls anhängigen Anmeldung der Seriennummer 08/934,495 offenbart, auf die hierin in ihrer Gesamtheit verwiesen wird. Geeignete kationische Polymere können linear oder vernetzt sein. Umfasst sind Polymere, die Wiederholungseinheiten oder Monomere umfassen wie Allylamin, Diallylamin, Diallylmethylamin, Vinylamin, N-Aminoalkylacrylamid, N-Aminoalkylmethacrylamid, Aminoalkylacrylat, Aminoalkylmethacrylat und Säureadditionssalze und monoalkylierte, dialkylierte und trialkylierte (quaternisierte) Derivate davon. Geeignete kationische Polymere umfassen Hornopolymere aus diesen Wiederholungseinheiten und Copolymere, die mindestens eine dieser Wiederholungseinheiten enthalten und, wahlweise, ein oder mehr hydrophobe Monomere und/oder neutrale hydrophile Monomere, wie oben diskutiert. Das säurefunktionalisierte Polymer und das kationische Polymer können in variierenden Gewichtsverhältnissen verabreicht werden und können gleichzeitig verabreicht werden, z. B. in einer Einzeldosierungsform, oder in separaten Dosierungsformen, oder in einer Sequenz, die durch Minuten oder Stunden getrennt ist. Geeignete Dosierungen und Verabreichungsmethoden können durch den Fachmann leicht bestimmt werden. In einer Ausführungsform ist das anionische Polymer Poly(styrolsulfonat) und das kationische Polymer ist Poly(diallylmethylamin) oder Poly(diallylmethylamin), in dem ein Teil der Wiederholungseinheiten alkyliert wurde, z. B. mit einer C₄-C₁₂-Alkylgruppe, wie einer Octylgruppe oder einer Decylgruppe.
Die Polymere der vorliegenden Erfindung können durch Verfahren hergestellt werden, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, z. B. durch direkte Polymerisation eines säurefunktionalisierten Monomers oder Copolymerisation einer Monomermischung, die ein säurefunktionalisiertes Monomer und mindestens ein zusätzliches Comonomer, wie ein zweites säurefunktionalisiertes Monomer, ein hydrophobes Monomer, ein neutrales hydrophiles Monomer, ein multifunktionales vernetzendes Monomer oder eine Kombination davon umfasst. Die Monomermischung kann beispielsweise unter Verwendung von Verfahren der freien Radikal-, kationischen oder anionischen Polymerisation polymerisiert werden, die aus dem Stand der Technik wohlbekannt sind. Aufgrund von Differenzen in den Reaktivitätsverhältnissen von zwei oder mehr Monomeren kann das Molverhältnis der Monomere in dem Copolymer-Produkt verschieden sein von dem Molverhältnis der Monomere in der anfänglichen Reaktionsmischung. Diese Reaktivitätsdifferenz kann auch zu einer nicht-statistischen Verteilung von Monomeren entlang der Polymerkette führen.
Die Polymere können auch durch nukleophile Seitenkettensubstitution an einem aktivierten Polymer synthetisiert werden. Dieses Verfahren verläuft über ein Zwischenstufenpolymer, das labile Seitenketten hat, welche leicht durch eine erwünschte Seitenkette substituiert werden. Geeignete Polymeren dieses Typs umfassen Poly(N-acryloyloxysuccinimid) (pNAS), das mit einem primäre Amin reagiert, um z. B. ein N-substituiertes Polyacrylamid zu bilden. Ein weiteres geeignetes Polymer mit labilen Seitenketten ist Poly(4-nitrophenylacrylat), das bei Reaktion mit einem primären Amin auch ein N-substituiertes Polyacrylamid bildet.
Zum Beispiel kann ein Copolymer mit einem Polyacrylamid-Rückgrat, das Amidstickstoffatome umfasst, die mit einer säurefunktionalen Gruppe substituiert sind, und Amidstickstoffatome, die mit einer hydrophoben Gruppe substituiert sind, durch Behandlung von pNAS mit weniger als einem Äquivalent (relativ zu N-Acryloyloxysuccinimidmonomer) eines primären Amins, welches in einer säurefunktionalen Gruppe, wie einer Aminosäure, beispielsweise Glycin, terminiert, hergestellt werden. Eine hydrophobe Gruppe kann dann durch Umsetzung mindestens eines Teils der verbleibenden N-Acryloyloxysuccinimid-Monomeren mit einem zweiten primären Amin, wie C₂-C₂₀-Alkylamin, eingeführt werden. Ein Copolymer, das weiterhin ein neutrales hydrophiles Monomer umfasst, kann durch Umsetzung jeglicher verbleibender N-Acryloyloxysuccinimid-Monomerer mit beispielsweise 2-Aminoethanol oder Ammoniak hergestellt werden. Eine Vielzahl Copolymer-Zusammensetzungen kann somit leicht durch Behandlung des aktivierten Polymers mit verschiedenen Verhältnissen ausgewählter Amine erhalten werden.
Die Polymere zur Verwendung im vorliegenden Verfahren können auch durch Funktionalisierung eines Vorläuferpolymers mit einer säurefunktionalen Gruppe synthetisiert werden. Zum Beispiel kann ein Polymer mit Seitenketten, die Arylgruppen enthalten, durch Verwendung bekannter Verfahren sulfoniert werden, um ein Polymer mit anhängenden Sulfonsäuregruppen herzustellen. Vorläuferpolymere, die Hydroxylgruppen enthalten, wie Poly(vinylalkohol) und Poly(allylalkohol) können durch Verwendung bekannter Verfahren sulfatiert werden, um Polymere zu bilden, die Sulfatestergruppen umfassen. Polymere, die sowohl säurefunktionale Gruppen als auch hydrophobe Gruppen haben, können somit unter Verwendung dieses allgemeinen Ansatzes synthetisiert werden. Zum Beispiel kaum ein Poly(vinylaren)polymer, wie Polystyrol, durch Reaktion mit beispielsweise rauchender Schwefelsäure sulfoniert werden, um Poly(styrolsulfonat) zu bilden.
Ein säurefunktionalisiertes Polymer kann durch Überführung von mindestens einem Teil der Säuregruppen in ein Säurederivat, wie ein Amid oder einen Ester, modifiziert werden. Zum Beispiel kann Poly(styrolsulfonat) mit einer substöchiometrischen Menge, bezogen auf Sulfonatgruppen, Thionylchlorid umgesetzt werden, wodurch ein Teil der Sulfonatgruppen in Sulfonylchloridgruppen überführt wird. Das resultierende Polymer kann beispielsweise mit einem Überschuss eines primären Amins umgesetzt werden, um die Sulfonylchloridgruppen in N-substituierte Sulfonamidgruppen zu überführen, oder mit einem Alkohol, um die Sulfonylchloridgruppen in Sulfonatestergruppen umzuwandeln.
Die Hydrophobizität des resultierenden Polymers kann durch Variation des N-Substituenten und/oder der Ester-Funktionalität und das Ausmaß Umwandlung von Sulfonatgruppen zu Sulfonamid- oder Sulfonatestergruppen variiert werden.
Pathogene Toxine, die durch das erfindungsgemäße Verfahren inhibiert werden können, umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Toxine wie Exotoxine und/oder Endotoxine, die produziert werden von Streptococcus spp., einschließlich Streptococcuspneumoniae, Streptococcus pyogenes und Streptococcus Sanguis; Salmonella spp., einschließlich Salmonella enteritidis; Campylobacter spp., einschließlich Campylobacter jejuni; Escherichia spp., einschließlich E. coli; Clostridia spp., einschließlich Clostridium difficile und Clostridium botulinum; Staphylococcus spp., einschließlich Staphylococcus aureus; Shigella spp., einschließlich Shigella dysenteriae; Pseudomonas spp., einschließlich Pseudomonas aeruginosa; Bordatella spp., einschließlich Bordatella pertussis; Listeria spp., einschließlich Listeria monocytogenes; Vibrio cholerae; Yersinia spp., einschließlich Yersinia enterocolitica; Legionella spp., einschließlich Legionella pneumophilia; Bacillus spp., einschließlich Bacillus anthracis; Helicobacter spp.; Corynebacteria spp.; Actinobacillus spp.; Aeromonas spp.; Bacteroides spp. einschließlich Bacteroides fragilis; Neisseria spp, einschließlich N. meningitidis; Moraxella spp., wie Moravella catarrhalis und Pasteurella spp.. Ebenso eingeschlossen sind protozoale Toxine, wie Toxine, die durch Entameoba histolytica und Acanthameoba produziert werden; und parasitäre Toxine.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch zur Inhibierung eines viralen Toxins verwendet werden, wie einem Toxin, das durch einen Rotavirus, HI-(Human Immunodeficiency)-Virus, Influenzavirus, Poliovirus, vesikulären Stomatitisvirus, Vacciniavirus, Adenovirus, Piavirus, Togaviren (wie Sindbis- und Semlikofores-Viren), Paramyxoviren, Papillomaviren produziert wird. Toxine, die durch Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens inhibiert werden können, umfassen Viroporin-Moleküle, die von jedem dieser Viren hergestellt werden. Ein bevorzugtes Toxin, das durch das erfindungsgemäße Verfahren inhibiert werden kann, ist das Rotavirus NSP4-Protein. Weitere Toxine, die inhibiert werden können, umfassen das Influenza-M2-Protein, HIV-Vpu- und -gp41-Proteine, Picornavirus-3A-Protein, Togavirus-6K-Protein, Respiratory-Syncitial-Virus-SH-Protein, Coronavirus-D3-Protein und Adenovirus-E5-Protein.
Die Infektion kann eine systemische Infektion oder eine lokalisierte Infektion sein. Vorzugsweise ist die Infektion auf die Mundhöhle, das Auge, den Verdauungstrakt, einschließlich des Halses, die Haut und/oder das Ohr, wie den Gehörgang oder das Mittelohr, lokalisiert.
Die Menge eines vorgegebenen zu verabreichenden Polymers wird auf einer individuellen Basis bestimmt und wird zumindest teilweise durch Betrachtung der individuellen Größe, der Schwere von zu behandelnden Symptomen und dem erwünschten Resultat bestimmt. Das Polymer kann allein oder in einer pharmazeutischen Zusammensetzung verabreicht werden, die das Polymer, einen verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel und wahlweise ein oder mehr zusätzliche Arzneistoffe umfasst.
Das Polymer kann systemisch oder nicht-systemisch verabreicht werden, z. B. durch subkutane oder andere Injektion, intravenös, topisch, oral, parenteral, transdermal oder rektal. Der ausgewählte Verabreichungsweg wird im Allgemeinen davon abhängen, ob die Infektion systemisch oder lokalisiert ist. Die Form, in der das Polymer verabreicht wird, z. B. Pulver, Tablette, Kapsel, Lösung oder Emulsion, wird von dem Weg abhängen, auf dem es verabreicht wird. Die therapeutisch wirksame Menge kann in einer Serie Dosen verabreicht werden, die durch geeignete Zeitintervalle getrennt sind, wie z. B. Stunden. Vorzugsweise wird das Polymer nicht systemisch verabreicht, z. B. oral oder topikal, beispielsweise durch Anwendung auf die Haut, das Auge, das Mundgewebe, wie die orale Mukosa, oder die Darm-Mukosa.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Toxin ein Exotoxin, das durch einen pathogenen Bakterienstamm produziert wird. Von besonderer pathogener Wichtigkeit sind Escherichia coli, z. B. E.-coli-Stämme 06:H-, 0156:117, 0143 und andere klinische Isolate, und Clostridium difficile. Enterohämorrhagische E. coli (EHEC), wie 0157:117, können eine charakteristische, nicht-febrile blutige Diarrhoe, bekannt als hämorrhagische Kolitis, bewirken. EHEC produziert hohe Konzentrationen von einem oder beiden der zwei verwandten Zytotoxine, die in Struktur und Funktion ein Shiga-Toxin nachbilden und als Shiga-artige Toxine (SLTI oder SLTII) bezeichnet werden. Von diesen Shiga-artigen Toxinen wird angenommen, dass sie die Darm-Mukosa schädigen, was zu einer Manifestierung von hämorrhagischer Kolitis führt.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden das mikrobielle Toxin oder die Toxine von Clostridium difficile produziert. C. difficile produziert zwei Toxine, Toxin A und Toxin B. Toxin A ist ein Enterotoxin, das die Infiltration von Neutrophilen und die Freisetzung von Entzündungsmediatoren stimuliert, was zu einer Flüssigkeitssekretion, veränderter Membranpermeabilität und hämorrhagischer Nekrose führt. Das Toxin B ist ein Zytotoxin. C. difficile ist mit vielen Fällen Antibiotikum-assoziierter Diarrhoe assoziiert und in den meisten Fällen von Pseudomembran-Kolitis, einer schweren, potentiell tödlichen Entzündung des Darms. Die Behandlung von C. difficile-Infektion umfasst typischerweise die Verabreichung von Vancomycin oder Metronidazol. In einer Ausführungsform ist der zu behandelnde Zustand C. difficile-induzierte Gastroenteritis, wie Antibiotikumassoziierte Diarrhoe oder Pseudomembran-Kolitis. In dieser Ausführungsform kann das Polymer wahlweise in Kombination mit ein oder mehr antibiotischen Mitteln verabreicht werden, die zumindest teilweise gegen C. difficile wirksam sind, wie Vancomycin und Metronidazol.
Wie hierin verwendet, umfasst die „Behandlung" von C. difficile-assoziierter Diarrhoe (CDAD): die prophylaktische Behandlung derjenigen Patienten, die gegen CDAD empfindlich sind, die Behandlung beim Erstausbruch von CDAD, die Behandlung fortschreitender CDAD und die Behandlung wiederkehrender CDAD in empfindlichen Patienten. Wie hierin verwendet, ist eine „therapeutisch wirksame Menge" eine Menge, die zur Verhinderung, der Verringerung oder Auslöschung von Krankheitssymptomen ausreichend ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst eine therapeutische/prophylaktische CDAD-Behandlungskur (die zur Prävention der Krankheit, der Verringerung oder Auslöschung der Krankheit nach Ausbruch, oder der Prävention des Krankheitsrückfalls führt) die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer therapeutischen Zusammensetzung, umfassend Polystyrolsulfonat, vorzugsweise löslich, nicht vernetztes Polystyrolsulfonat und noch mehr bevorzugt lösliches, nicht vernetztes Polystyrolsulfonat mit einem Molekulargewicht zwischen 400000 und 1 Million, und meist bevorzugt einen Molekulargewicht von 600000. Ohne auf einen Mechanismus beschränkt sein zu wollen, binden Zusammensetzungen gemäß der Erfindung die Toxine, z. B. Toxine, die von C. difficile produziert werden. Das Toxin A ist ein Enterotoxin, das die Infiltration von Neutrophilen und die Freisetzung von Entzündungsmediatoren stimuliert, was zu Flüssigkeitssekretion, veränderter Membranpermeabilität und hämorrhagischer Nekrose führt. Toxin B ist ein Zytotoxin. Es wird angenommen, dass diese Toxine für die Symptome von CDAD und anderen AAD verantwortlich sind.
Die vorliegende Erfindung beinhaltet auch eine prophylaktische Behandlungskur, welche die Verabreichung einer therapeutischen Zusammensetzung umfasst, die Polystyrolsulfonat als Co-Therapie mit einer Breitspektrumantibiotika-Therapie umfasst. Wie hierin verwendet, bedeutet „Co-Therapie" eine Behandlungskur, worin zwei Arzneistoffe gleichzeitig oder sequentiell verabreicht werden, getrennt durch Minuten, Stunden oder Tage, aber in irgendeinem Weg zusammenwirken, um die erwünschte therapeutische Antwort zu liefern.
Die Erfindung wird nun weiter und spezifisch durch die nachfolgenden Beispiele beschrieben.
BEISPIELE
Beispiel 7 – Herstellung von 2 % vernetztem Poly(ethylenglycolmethacrylat phosphat)-Gel.
Poly(ethylenglycolmethacrylat phosphat)-Gel wurde durch Polymerisation von Ethylenglycolmethacrylat phosphat (29,4 mMol, 6,178 g) mit Divinylbenzol ("DVB") (0,926 mMol, 0.1319 ml) in Ethanol/Wasser (50/50) unter Verwendung von etwa 1 Mol% AIBN als Initiator hergestellt. Das resultierende elastische Gel wurde in zwei Teile in zwei 50 ml Zentrifugenröhrchen geteilt und 4 mal mit Ethanol in einer Gesamtmenge von etwa 120 ml Ethanol gewaschen. Das Gel wurde über Nacht in einem Zwangsbelüftungsofen bei 70°C getrocknet. Das getrocknete Gel wurde gemahlen und gesiebt und 3 mal in Wasser in einem 50 ml Zentrifugenröhrchen gewaschen. Das Gel wurde über Nacht in einem Zwangsbelüftungsofen bei 70°C getrocknet.
Beispiel 8 – Herstellung von sulfonierten Polystyrol-Gelen.
Polystyrol-Gele wurden durch Polymerisation von Styrol mit Divinylbenzol in Toluol unter Verwendung von etwa 1 Mol% AIBN als Initiator wie folgt hergestellt: Polystyrol-Gel (6 % DVB). Styrol (282 mMol, 3,23 ml) wurde in eine 40 ml Ampulle gegeben, die mit einer Septumkappe verschlossen war. Toluol (5 ml) wurde zugegeben und die Lösung wurde 15 Minuten entgast. Eine Lösung von AIBN (0,9852 g in 10 ml Toluol) wurde hergestellt und 0,5 ml wurden zu der Lösung gegeben. Die Lösung wurde 5 Minuten weiter entgast und dann für 21 Stunden bei 60°C belassen. Das resultierende klare, farblose Gel wurde 5 mal mit Ethanol in einem 50 ml Zentrifugenröhrchen gewaschen und über Nacht in einem 70°C Zwangsbelüftungsofen getrocknet.
Polystyrolgele wurden auch mit den folgenden Vernetzungsgraden unter Verwendung dieser Prozedur hergestellt: 4 % DVB; 2 % DVB; 1,5 % DVB; 1 % DVB; and 0,5 % DVB.
Sulfonierung von Polystyrolgel.
Getrocknetes Polystyrolgel wurde in eine 40 ml Glasampulle überführt. Konzentrierte Schwefelsäure (10 ml) wurde zugegeben und die Mischung wurde 1 Stunde bei 100°C erhitzt. Das resultierende braune, gequollene Gel wurde auf Raumtemperatur abkühlen gelassen und gründlich mit Methanol gewaschen, bis der pH bei 4-5 war. Das Gel wurde über Nacht in einem 70°C Zwangsbelüftungsofen getrocknet. Das getrocknete Gel wurde dann in einer Kaffeemühle gemahlen, in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen überführt und mehrmals mit Wasser gewaschen.
Beispiel 9 – Herstellung von sulfonierten Poly(2-vinylnaphthalin) Gelen
Poly(2-vinylnaphthalin) Gele wurden durch Polymerisation von 2-Vinylnaphthalin mit Divinylbenzol in Toluol unter Verwendung von ~1 Mol% AIBN als Initiator wie folgt hergestellt:
Poly(2-vinyl naphthalin) Gel (2 % DVB)
2-Vinylnaphthalin (29,4 mMol, 4,534 g) und Divinylbenzol (0,6 mMol, 85,46 Mikroliter) wurden in eine 40 ml Ampulle gegeben, verschlossen mit einer Septumkappe. Toluol (10 ml) wurde zugegeben und die Lösung wurde erhitzt, um das Monomer aufzulösen. Die Lösung wurde 15 Minuten entgast. Eine Lösung von AIBN (0,9852 g in 10 ml in Toluol) wurde hergestellt und 0,5 ml wurden zu der Polymerisationslösung gegeben. Die Lösung wurde 5 Minuten weiter entgast und dann für 21 Stunden bei 60°C belassen. Das resultierende klare, braune Gel wurde mit Ethanol (2 l gesamt) per Schwerkraftfiltration gewaschen und 2 Tage in einem 70°C Zwangsbelüftungsofen getrocknet.
Sulfonierung von Poly(2-vinyl naphthalin) Gel
Getrocknetes Poly(2-vinyl naphthalin) Gel wurde in eine 40 ml Glasampulle überführt. Konzentrierte Schwefelsäure (10 ml) wurde zugegeben und die Mischung wurde 1 Stunde bei 100°C erhitzt. Das resultierende braune, gequollene Gel wurde auf Raumtemperatur abkühlen gelassen und gründlich mittels Schwerkraftfiltration mit Methanol gewaschen bis der pH bei 4-5 war. Das Gel wurde mehrmals mit Wasser gewaschen. Das Gel wurde 2 Tage in einem 70°C Zwangsbelüftungsofen getrocknet.
Beispiel 10 – Herstellung von sulfonierten Poly(4-vinylbiphenyl) Gelen
Poly(4-vinylbiphenyl) Gele wurden durch Polymerisation von 4-Vinylbiphenyl mit Divinylbenzol in Toluol unter Verwendung von ~1 Mol% AIBN als Initiator wie folgt hergestellt:
Poly(4-vinylbiphenyl)-Gel (2 % DVB)
4-Vinylbiphenyl (29,4 mMol, 5,299 g) und Divinylbenzol (0,6 mMol, 85,46 Mikroliter) wurden in eine 40 ml Ampulle gegeben, verschlossen mit einer Septumkappe. Toluol (10 ml) wurde zugegeben und die Lösung wurde erhitzt, um das Monomer aufzulösen. Die Lösung wurde 15 Minuten entgast. Eine Lösung von AIBN (0,9852 g in 10 ml in Toluol) wurde hergestellt und 0,5 ml wurden zu der Polymerisationslösung gegeben. Die Lösung wurde 5 Minuten weiter entgast und dann für 21 Stunden bei 60°C belassen. Das resultierende klare, braune Gel wurde mit Ethanol (2 l gesamt) per Schwerkraftfiltration gewaschen und 2 Tage in einem 70°C Zwangsbelüftungsofen getrocknet.
Sulfonierung von 2 % vernetztem Poly(4-vinylbiphenyl)-Gel
Getrocknetes Poly(4-vinylbiphenyl) Gel wurde in eine 40 ml Glasampulle überführt. Konzentrierte Schwefelsäure (10 ml) wurde zugegeben und die Mischung wurde 1 Stunde bei 100°C erhitzt. Das resultierende braune, gequollene Gel wurde auf Raumtemperatur abkühlen gelassen und gründlich mittels Schwerkraftfiltration mit Methanol gewaschen bis der pH bei 4-5 war. Das Gel wurde mehrmals mit Wasser gewaschen und dann 2 Tage in einem 70°C Zwangsbelüftungsofen getrocknet.
Beispiel 11 – Herstellung von Poly(styrolsulfonat-co-styrol-n-N-octylsulfonamid)
Natrium-poly(styrolsulfonat) (114,9 mMol, 20 g) wurde in N,N-Dimethylformamid ("DMF", 100 ml, wasserfrei) dispergiert. Thionylchlorid (114,9 mMol, 9,95 ml) wurde zugegeben und das Gemisch wurde 16 h bei 60°C erhitzt. Das Gemisch wurde über Eis gegossen und mit 50 % NaOH (aq) neutralisiert bis der pH etwa 6,5 betrug. Die Lösung wurde durch einen SpectraPor 6-8K MWCO Dialyseschlauch in 4 × 3 Gallonen deionisiertem Wasser dialysiert bis die Leitfähigkeit des Dialysats 0,00 mS/cm betrug. Die Probe wurde zum Erhalt eines weißen Pulvers lyophilisiert.
Poly(styrolsulfonat) w/10Mol% n-Octylsulfanamid
Natrium-poly(styrolsulfonat) (114,9 mMol, 20 g) wurde in DMF (100 ml, wasserfrei) dispergiert. Thionylchlorid (114,9 mMol, 9,95 ml) wurde zugegeben und das Gemisch wurde 16 h bei 60°C erhitzt. n-Octylamin (11,486 mMol, 1.8980 ml) wurde zugegeben und das Gemisch wurde 5,5 h bei gerührt. Das Gemisch wurde über Eis gegossen und mit 50 % NaOH (aq) neutralisiert bis der pH 6,1 betrug. Die Lösung wurde durch einen SpectraPor 6-8K MWCO Dialyseschlauch in 4 × 3 Gallonen deionisiertes Wasser dialysiert bis die Leitfähigkeit des Dialysats 0,00 mS/cm betrug. Die Probe wurde zum Erhalt eines weißen Pulvers lyophilisiert.
Poly(styrolsulfonat) w/20 Mol% n-Octylsulfanamid
Poly(styrolsulfonat, Na) (114,9 mMol, 20 g) wurde in DMF (100 ml, wasserfrei) dispergiert. Thionylchlorid (114,9 mMol, 9,95 ml) wurde zugegeben und das Gemisch wurde 16 h bei 60°C erhitzt. n-Octylamin (22,97 mMol, 3,7967 ml) wurde zugegeben und das Gemisch wurde 5,5 h bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wurde über Eis gegossen und mit 50 % NaOH (aq) neutralisiert bis der pH 6,7 betrug. Die Lösung wurde durch einen SpectraPor 6-8K MWCO Dialyseschlauch in 4 × 3 Gallonen deionisiertes Wasser dialysiert bis die Leitfähigkeit des Dialysats 0,00 mS/cm betrug. Die Probe wurde zum Erhalt eines weißen Pulvers lyophilisiert.
Poly(styrolsulfonat) w/30 Mol% n-Octylsulfanamid
Poly(styrolsulfonat, Na) (114,9 mMol, 20 g) wurde in DMF (100 ml, wasserfrei) dispergiert. Thionylchlorid (114,9 mMol, 9,95 ml) wurde zugegeben und das Gemisch wurde 16 h bei 60°C erhitzt. •n-Octylamin (34,457 mMol, 5,6950 ml) wurde zugegeben und das Gemisch wurde 5,5 h bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wurde über Eis gegossen und mit 50 % NaOH (aq) neutralisiert bis der pH 6,5 betrug. Die Lösung wurde durch einen SpectraPor 6-8K MWCO Dialyseschlauch in 4 × 3 Gallonen deionisiertes Wasser dialysiert bis die Leitfähigkeit des Dialysats 0,00 mS/cm betrug. Die Probe wurde zum Erhalt eines weißen Pulvers lyophilisiert.
Poly(styrolsulfonat) w/40Mol% n-Octylsulfonamid
Natriumpoly(styrolsulfonat) (114,9 mMol, 20 g) wurde in DMF (100 ml, wasserfrei) dispergiert. Thionylchlorid (114,9 mMol, 9,95 ml) wurde zugegeben und das Gemisch wurde 16 h bei 60°C erhitzt. n-Octylamin (55,131 mMol, 7,5934 ml) wurde zugegeben und das Gemisch wurde 5,5 h bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wurde über Eis gegossen und mit 50 % NaOH (aq) neutralisiert bis der pH etwa 6,7 betrug. Die Lösung wurde durch einen SpectraPor 6-8K MWCO Dialyseschlauch in 4 × 3 Gallonen deionisiertes Wasser dialysiert bis die Leitfähigkeit des Dialysats 0,00 mS/cm betrug. Die Probe wurde zum Erhalt eines weißen Pulvers lyophilisiert.
Beispiel 12 – Synthese von Poly(styrolsulfonat)-Calciumsalz
In einen 500 ml 3-Hals Rundkolben wurden 2 g of Poly(natrium 4-styrol sulfonat) und 100 ml deionisiertes Wasser gegeben. Das Gemisch wurde mehrere Minuten gerührt bis eine homogene Lösung erhalten wurde. Zu dieser Polymerlösung wurden 6,46 ml einer 0,225 M Lösung von CaCl₂ gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 15 Stunden bei Raumtemperatur gerührt.
Das Reaktionsgemisch wurde mit Membranzentrifugation unter Verwendung von Molekulargewichts 3K Cut-off-Filtern gereinigt. Die Lösung wurde 24 Stunden bei 70°C in einem Zwangsbelüftungsofen getrocknet, was 1,4 g des Polymers als einen cremefarbenen Feststoff ergab.
Beispiel 13 – Herstellung von vernetzten Styrolsulfonat-Copolymeren mit hydrophoben Comonomeren
Polystyrolsulfonat/hydrophobe Gele wurden durch Copolymerisation von Styrolsulfonat mit Acrylamid, n-Butylacrylamid, n-Decylacrylamid, oder Styrol mit entweder Divinylbenzol (2 %) oder N,N'-Methylenbisacrylamid (8 %) als Vernetzer wie folgt hergestellt:
Polystyrolsulfonat-Gel (2 % vernetzt)
Polystyrolsulfonat (29,4 mMol, 5,119 g) und Divinylbenzol (0,6 mMol, 85,5 Mikroliter) wurden in 10 ml Ethanol und 10 ml Wasser in einer mit einer Septumkappe verschlossenen 40 ml Ampulle gelöst. Die Lösung wurde mittels Durchperlen von Stickstoff entgast und 1 Mol% AIBN wurde als Lösung zugegeben. Die Polymerisationslösung wurde weiter entgast und 18 Stunden in einem geheizten Reaktionsblock bei 60°C platziert. Es bildete sich ein klares, farbloses Gel.
Polystyrolsulfonat-co-acrylamid-Gel (75 Mol%: 23 Mol%: 2 % vernetzt)
Polystyrolsulfonat (22,5 mMol, 3,918 g), Acrylamid (6.90 mMol, 0.490 g) und Divinylbenzol (0,6 mMol, 85,5 Mikroliter) wurden in 10 ml Ethanol und 10 ml Wasser in einer mit einer Septumkappe verschlossenen 40 ml Ampulle gelöst. Die Lösung wurde mittels Durchperlen von Stickstoff entgast und 1 Mol% AIBN wurde als Lösung zugegeben. Die Polymerisationslösung wurde weiter entgast und 18 Stunden in einem geheizten Reaktionsblock bei 60°C platziert. Es bildete sich ein klares, farbloses Gel.
Polystyrolsulfonat-co-n-butylacrylamid-Gel (75 Mol%: 23 Mol%: 2 % vernetzt)
Polystyrolsulfonat (22,5 mMol, 3,918 g), n-Butylacrylamid (6,90 mMol, 0,878 g) und Divinylbenzol (0,6 mMol, 85,5 Mikroliter) wurden in 15 ml Ethanol und 5 ml Wasser in einer mit einer Septumkappe verschlossenen 40 ml Ampulle gelöst. Die Lösung wurde mittels Durchperlen von Stickstoff entgast und 1 Mol% AIBN wurde als Lösung zugegeben. Die Polymerisationslösung wurde weiter entgast und 18 Stunden in einem geheizten Reaktionsblock bei 60°C platziert. Es bildete sich ein klares, farbloses Gel.
Polystyrolsulfonat/Acrylamid/n-Butylacrylamid-Gel (75 Mol%: 11,5 Mol%: 11,5 Mol%: 2 % vernetzt)
Polystyrolsulfonat (22,5 mMol, 3, 918 g), Acrylamid (3,45 mMol, 0,245 g), n-butylacrylamid (3,45 mMol, 0,439 g) und Divinylbenzol (0,6 mMol, 85,5 Mikroliter) wurden in 15 ml Ethanol und 5 ml Wasser in einer mit einer Septumkappe verschlossenen 40 ml Ampulle gelöst. Die Lösung wurde mittels Durchperlen von Stickstoff entgast und 1 Mol% AIBN wurde als Lösung zugegeben. Die Polymerisationslösung wurde weiter entgast und 18 Stunden in einem geheizten Reaktionsblock bei 60°C platziert. Es bildete sich ein klares, schwach gelbes Gel.
Polystyrolsulfonat-co-n-decylacrylamid-Gel (75 Mol%: 23 Mol%: 2 % vernetzt)
Polystyrolsulfonat (22,5 mMol, 3,918 g), n-Decylacrylamid (6,90 mMol, 1,458 g) und Divinylbenzol (0,6 mMol, 85,5 Mikroliter) wurden in 15 ml Ethanol und 5 ml Wasser in einer mit einer Septumkappe verschlossenen 40 ml Ampulle gelöst. Die Lösung wurde mittels Durchperlen von Stickstoff entgast und 1 Mol% AIBN wurde als Lösung zugegeben. Die Polymerisationslösung wurde weiter entgast und 18 Stunden in einem geheizten Reaktionsblock bei 60°C platziert. Es bildete sich ein cremiges, gelbes Gel.
Polystyrolsulfonat/Acrylamid/n-Decylacrylamid-Gel (75 Mol%: 11,5 Mol%: 11,5 Mol%: 2 % vernetzt)
Polystyrolsulfonat (22,5 mMol, 3,918 g), Acrylamid (3,45 mMol, 0,245 g), n-Decylacrylamid (3,45 mMol, 0,729 g) und Divinylbenzol (0,6 mMol, 85,5 Mikroliter) wurden in 15 ml Ethanol und 5 ml Wasser in einer mit einer Septumkappe verschlossenen 40 ml Ampulle gelöst. Die Lösung wurde mittels Durchperlen von Stickstoff entgast und 1 Mol% AIBN wurde als Lösung zugegeben. Die Polymerisationslösung wurde weiter entgast und 18 Stunden in einem geheizten Reaktionsblock bei 60°C platziert. Es bildete sich ein cremiges, gelbes Gel.
Polystyrolsulfonat-co-Styrol-Gel (75 Mol%: 23 Mol%: 2 % vernetzt)
Polystyrolsulfonat (22,5 mMol, 3,918 g), Styrol (6,90 mMol, 0,7906 ml) und Divinylbenzol (0,6 mMol, 85,5 Mikroliter) wurden in 10 ml Ethanol und 10 ml Wasser in einer mit einer Septumkappe verschlossenen 40 ml Ampulle gelöst. Die Lösung wurde mittels Durchperlen von Stickstoff entgast und 1 Mol% AIBN wurde als Lösung zugegeben. Die Polymerisationslösung wurde weiter entgast und 18 Stunden in einem geheizten Reaktionsblock bei 60°C platziert. Es bildete sich ein klares, farbloses Gel.
Polystyrolsulfonat/Acrylamid/Styrol-Gel (75 Mol%: 11,5 Mol%: 11,5%; 2 % vernetzt)
Polystyrolsulfonat (22,5 mMol, 3,918 g), Acrylamid (3,45 mMol, 0,245 g), Styrol (3,45 mMol, 0,3953 mL) und Divinylbenzol (0,6 mMol, 85,5 Mikroliter) wurden in 10 ml Ethanol und 10 ml Wasser in einer mit einer Septumkappe verschlossenen 40 ml Ampulle gelöst. Die Lösung wurde mittels Durchperlen von Stickstoff entgast und 1 Mol% AIBN wurde als Lösung zugegeben. Die Polymerisationslösung wurde weiter entgast und 18 Stunden in einem geheizten Reaktionsblock bei 60°C platziert. Es bildete sich ein klares, farbloses Gel.
Polystyrolsulfonat-co-acrylamid-Gel (50 Mol%: 48 Mol%: 2 % vernetzt)
Polystyrolsulfonat (15,0 mMol, 2,612 g), Acrylamid (14,4 mMol, 1,024 g) und Divinylbenzol (0,6 mMol, 85,5 Mikroliter) wurden in 5 ml Ethanol und 15 ml Wasser in einer mit einer Septumkappe verschlossenen 40 ml Ampulle gelöst. Die Lösung wurde mittels Durchperlen von Stickstoff entgast und 1 Mol% AIBN wurde als Lösung zugegeben. Die Polymerisationslösung wurde weiter entgast und 18 Stunden in einem geheizten Reaktionsblock bei 60°C platziert. Es bildete sich ein klares, farbloses Gel.
Polystyrolsulfonat/Acrylamid/n-Butylacrylamid-Gel (50 Mol%: 24 Mol%: 24 Mol%: 2 % vernetzt)
Polystyrolsulfonat (15,0 mMol, 2,612 g), Acrylamid (7,2 mMol, 0, 512 g), n-Butylacrylamid (7,2 mMol, 0, 916 g) und Divinylbenzol (0,6 mMol, 85,5 Mikroliter) wurden in 5 ml Ethanol und 15 ml Wasser in einer mit einer Septumkappe verschlossenen 40 ml Ampulle gelöst. Die Lösung wurde mittels Durchperlen von Stickstoff entgast und 1 Mol% AIBN wurde als Lösung zugegeben. Die Polymerisationslösung wurde weiter entgast und 18 Stunden in einem geheizten Reaktionsblock bei 60°C platziert. Es bildete sich ein klares, farbloses Gel.
Polystyrolsulfonat/Acrylamid/Styrol-Gel (50 Mol%: 24 Mol%: 24 Mol%: 2 % vernetzt)
Polystyrolsulfonat (15,0 mMol, 2,612 g), Acrylamid (7,2 mMol, 0,512 g), Styrol (7,2 mMol, 0,8250 ml) und Divinylbenzol (0,6 mMol, 85,5 Mikroliter) wurden in 10 ml Ethanol und 10 ml Wasser in einer mit einer Septumkappe verschlossenen 40 ml Ampulle gelöst. Die Lösung wurde mittels Durchperlen von Stickstoff entgast und 1 Mol% AIBN wurde als Lösung zugegeben. Die Polymerisationslösung wurde weiter entgast und 18 Stunden in einem geheizten Reaktionsblock bei 60°C platziert. Es bildete sich ein klares, farbloses Gel.
Polystyrolsulfonat-co-Acrylamid-Gel (25 Mol%: 73 Mol%: 2 % vernetzt)
Polystyrolsulfonat (7,5 mMol, 1,306 g), Acrylamid (21,9 mMol, 1,557 g) und Divinylbenzol (0,6 mMol, 85,5 Mikroliter) wurden in 5 ml Ethanol und 15 ml Wasser in einer mit einer Septumkappe verschlossenen 40 ml Ampulle gelöst. Die Lösung wurde mittels Durchperlen von Stickstoff entgast und 1 Mol% AIBN wurde als Lösung zugegeben. Die Polymerisationslösung wurde weiter entgast und 18 Stunden in einem geheizten Reaktionsblock bei 60°C platziert. Es bildete sich ein klares, farbloses Gel.
Alle Proben wurden durch Aufteilen des Gels in 2 Teile in zwei 50 ml Zentrifugenröhrchen gereinigt. Die Gele wurden mindestens drei mal mit Ethanol gewaschen bis der Überstand klar und farblos war. Das Gesamtvolumen des verwendeten Ethanols betrug grob zwischen 75 ml und 100 ml, abhängig vom Quellungsindex des Gels. Die Gele wurden 2 Tage bei 60°C in einem Zwangsbelüftungsofen getrocknet.
Die Gele wurden in einer Kaffeemühle gemahlen und durch 140, 230 Mesh Siebe gesiebt. Eine 0.5-1 g Probe der Gelpartikel mit 140-230 Größe wurde 3 mal in 50 ml Zentrifugenröhrchen mit Wasser gewaschen. Manche Proben waren hoch absorbierend und mußten über mehrere Röhrchen verteilt werden. Im Allgemeinen wurde das Material in jedem Röhrchen mit einer Gesamtmenge von 20-80 ml Wasser gewaschen. Die Proben wurden dann 1x mit MeOH gewaschen, zentrifugiert, dekantiert und zwei Tage bei 70°C getrocknet. Das Gel wurde mit einer Gesamtmenge von 20-80 ml Wasser gewaschen.
Beispiel 14 – Herstellung von Poly(4-vinylbiphenylsulfonat)
Polymerisation von 4-Vinylbiphenyl
4-Vinylbiphenyl (166,4 mMol, 30 g) wurde in einen 500 ml 3-Hals Rundkolben gegeben, der mit einem Rückflußkühler, einer J-Kem Thermokupplung und einem Septum versehen war. Toluol (60 ml) wurde zugegeben und die Lösung wurde 1 h entgast. AIBN (1 Mol%, 0,294 mMol, 0,2733 g) wurde zugegeben und die Lösung wurde weitere 15 min entgast. Das Polymerisationsgemisch wurde 21 h auf 60°C erhitzt. Die resultierende klare braune Lösung wurde in 2 l Methanol gegossen und mehrere Stunden gerührt. Das feine braune Pulver wurde filtriert und mit 3 × 500 ml Methanol gewaschen und über Nacht bei 70°C in einem Zwangsbelüftungsofen getrocknet. Es wurde ein feines braunes Pulver erhalten (28,02 g, 93,40 % Ausbeute).
Sulfonierung von Poly(4-vinylbiphenyl)
Poly(4-vinylbiphenyl) wurde mit konzentrierter Schwefelsäure (100 ml) gemischt und 8 h bei 100°C erhitzt. Das Gemisch wandelte sich schließlich in einer klare braune viskose Lösung um. Die Polymerlösung wurde in Eis gegossen und mit 50 % wäßriger NaOH auf pH 6,2 neutralisiert. Die Lösung wurde durch eine Dialysemembran mit einem Molekulargewichtstrenngrenze von 3,5 K in 4 mal 5 l deionisiertem Wasser dialysiert. Die Leitfähigkeit des Dialysats betrug < 0,1 mS/cm. Das Wasser wurde durch Destillation in einem Rotationsverdampfer entfernt, um einen klaren, braunen, flockigen Feststoff zu erhalten.
Beispiel 15 – Herstellung von Poly(2-vinylnaphthalinsulfonat)
Polymerization von 2-Vinylnaphthalin
2-Vinylnaphthalin (194,5 mMol, 30 g) wurde in einen 500 ml 3-Hals Rundkolben gegeben, der mit einem Rückflußkühler, einer J-Kem Thermokupplung und einem Septum versehen war. Toluol (60 ml) wurde zugegeben und die Lösung wurde 1 h entgast. AIBN (1 Mol%, 0,294 mMol, 0,3195 g) wurde zugegeben und die Lösung wurde weitere 15 min entgast. Das Polymerisationsgemisch wurde 21 h auf 60°C erhitzt. Die resultierende klare braune Lösung wurde in 2 l Methanol gegossen und mehrere Stunden gerührt. Das feine braune Pulver wurde filtriert und mit 3 × 500 ml Methanol gewaschen und über Nacht bei 70°C in einem Zwangsbelüftungsofen getrocknet. Es wurde ein feines braunes Pulver erhalten (28,45 g, 94,83 % Ausbeute).
Sulfonierung von Poly(2-vinylnaphthalin)
Poly(2-vinylnaphthalin) wurde mit konzentrierter Schwefelsäure (100 ml) gemischt und 8 h bei 100°C erhitzt. Das Gemisch wandelte sich schließlich in einer klare braune viskose Lösung um. Die Polymerlösung wurde in Eis gegossen und mit 50 % wäßriger NaOH auf pH 6,4 neutralisiert. Die Lösung wurde durch eine Dialysemembran mit einem Molekulargewichtstrenngrenze von 3,5 K in 4 mal 5 l deionisiertem Wasser dialysiert. Die Leitfähigkeit des Dialysats betrug < 0,1 mS/cm. Das Wasser wurde durch Destillation in einem Rotationsverdampfer entfernt, um einen klaren, braunen, flockigen Feststoff zu erhalten.
Beispiel 16 – Poly(natrium 4-styrol sulfonat-co-(-)-menthyl-4-styrol sulfonat), 5 % (-)-Menthol
Zu einer Mischung von Poly(natrium 4-styrol sulfonat) (30,0 g; 0,145 Mol Sulfonat) in 300 ml wasserfreiem DMF, gerührt bei Raumtemperatur, wurde Thionylchlorid (17,3 g; 0,145 Mol) gegeben. Die Zugabe wurde langsam vorgenommen, sich versichernd, dass die Temperatur nicht über 50°C stieg. Das Rühren wurde über Nacht fortgesetzt und anschließend wurde ein Drittel des Reaktionsgemisches mit Pyridin (0,764 g; 00966 Mol) behandelt. Nach Rühren bei Raumtemperatur für 2,5 h wurde (-)-Menthol (0,375 g; 0,00240 Mol) zugegeben und das resultierende Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht und anschließend bei 50°C für 3 h gerührt. Das Gemisch wurde dann langsam in einen Liter Natriumbicarbonat (5 g) haltiges Wasser gegossen. Nachdem die Zugabe vollständig war, wurde mehr Natriumbicarbonat zugegeben, bis die Blasenbildung beendet und der pH neutral war. Die gründliche Dialyse gefolgt von einer Trocknung mit einem Luftstrom ergab einen weißen Feststoff.
Beispiel 17 – Synthese von Poly(natrium 4-styrol sulfonat-co-Lithocholylsäure-4-styrol sulfonat), 5 % Lithocholsäure
Zu einer Mischung von Poly(natrium 4-styrol sulfonat) (30,0 g; 0,145 Mol Sulfonat) in 300 ml wasserfreiem DMF, gerührt bei Raumtemperatur, wurde Thionylchlorid (17,3 g; 0,145 Mol) gegeben. Die Zugabe wurde langsam vorgenommen, sich versichernd, dass die Temperatur nicht über 50°C stieg. Das Rühren wurde über Nacht fortgesetzt und anschließend wurde ein Drittel des Reaktionsgemisches mit Pyridin (0,764 g; 00966 Mol) behandelt. Nach Rühren bei Raumtemperatur für 2,5 h wurde Lithocholsäure (0,904 g; 0,00240 Mol) zugegeben und das resultierende Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht und anschließend bei 50°C für 3 h gerührt. Das Gemisch wurde dann langsam in einen Liter Natriumbicarbonat (5 g) haltiges Wasser gegossen. Nachdem die Zugabe vollständig war, wurde mehr Natriumbicarbonat zugegeben, bis die Blasenbildung beendet und der pH neutral war. Die gründliche Dialyse gefolgt von einer Trocknung mit einem Luftstrom ergab einen weißen Feststoff.
Das in vivo Hamster-Assay wurde auch verwendet wie oben beschrieben, um die Effizienz der folgenden Polymere zu untersuchen, wie in Tabelle 1 gezeigt.
Beispiel 18 – Poly(natrium 3-styrol sulfonat) with 40 % Metronidazol
Polynatrium 4-styrol sulfonat (160-246-001, 25 g) wurde in deionisiertem Wasser in einem 3 Liter Plastikeimer unter Verwendung einer magnetischen Rührplatte gelöst (500 ml). In einem seperaten, geeignet dimensionierten Becherglas wurde Metronidazol (8,32 g) in deionisiertem Wasser (600 ml) und 1 M HCl (0,75 äq) gelöst. Diese Metronidazollösung wurde langsam in die Polynatrium 4-styrol sulfonat)-Lösung gegossen. Die resultierende Lösung wurde etwa 17 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Sie wurde in Dialyseschläuchen (6K-8K MWCO) platziert, bis eine Leitfähigkeit von < 0,05 erzielt war. Die Polymerlösung wurde in einem Zwangsbelüftungsofen bei 70°C getrocknet. Annähernd 22 g des Polymers wurden erhalten. Die Analyse mit HPLC zeigte eine 13,8 % Beladung von Metronidazol.
Beispiel 19 – Sulfonierung von Poly(4-methoxystyrol)
Poly(4-methoxystyrol) (1 g) wurde in einer 30 ml Ampulle platziert. Konzentrierte Schwefelsäure (5 ml) wurde in die Ampulle gegeben. Unter Rühren wurde dies 8 Stunden auf 100°C erhitzt. Nach den 8 Stunden war das Polymer gelöst (klare, dunkle Lösung). Deionisiertes Wasser wurde zugegeben (50 ml). Die Probe wurde durch tropfenweise Zugabe von NaOH (50 % Lsg.) neutralisiert. Sie wurde in Dialyseschläuchen (6K-8K MWCO) platziert, bis eine Leitfähigkeit von < 0,1 erzielt war. Die Polymerlösung wurde filtriert und dann auf der Speedvac getrocknet.
Beispiel 20 – Sulfonierung von Poly(diphenoxyphosphazen)
Poly(diphenoxyphosphazen) (1 g) wurde in einer 30 ml Ampulle platziert. Konzentrierte Schwefelsaure (5 ml) wurde in die Ampulle gegeben. Unter Rühren wurde dies 8 Stunden auf 100°C erhitzt. Nach den 8 Stunden war das Polymer gelöst (klare, gelbe Lösung).
Deionisiertes Wasser wurde zugegeben (50 ml). Die Probe wurde durch tropfenweise Zugabe von NaOH (50 % Lsg.) neutralisiert. Sie wurde in Dialyseschläuchen (6K-8K MWCO) platziert, bis eine Leitfähigkeit von < 0,1 erzielt war. Die Polymerlösung wurde filtriert und dann auf der Speedvac getrocknet.
Beispiel 21 – Sulfonierung von Ethylenoxid-Styrol-Ethylenoxid-Blockcopolymer
Ethylenoxid-Styrol-Ethylenoxid-Blockcopolymer (900 mg) wurde in einer 30-ml-Ampulle platziert. Konzentrierte Schwefelsäure (5 ml) wurde in die Ampulle zugegeben. Während Rühren wurde dies 8 Stunden bei 100°C erhitzt. Nach den 8 Stunden war das Polymer nicht aufgelöst. Mehr konzentrierte Schwefelsäure (5 ml) wurde in die Ampulle zugegeben. Es wurde dann bei 110°C bei Rühren für weitere 8 Stunden erhitzt. Dies wurde noch zweimal wiederholt. Eine Gesamtmenge von 20 ml konzentrierter Schwefelsäure wurde zugegeben (5 ml, 100°C, 8 Stunden; 15 ml, 110°C, 24 Stunden). Deionisiertes Wasser wurde zugegeben (50 ml). Die Probe wurde durch tropfenweise Zugabe von NaOH (50 % Lösung) neutralisiert. Sie wurde in Dialysetaschen (6K-8K MWCO) platziert, bis eine Leitfähigkeit von < 0,1 erreicht war. Das Polymer wurde filtriert (eine Menge unlöslichen Materials verblieb) und dann in einer Speed Vac getrocknet.
Beispiel 22 – Co-Verabreichung von Poly(styrolsulfonat) und Poly(diallylmethylamin)
Lösliches Polystyrolsulfonat und vernetztes C₈-alkyliertes Polydiallylmethylamin (PDMA) sind beide in der Lage, die Mortalität von C. difficile-Infektion in einem Hamstermodell von C. difficile-Kolitis zu reduzieren. Diese Polymere zeigen verschiedene Toxinbindungseigenschaften in vitro. Polystyrolsulfonat bindet C. difficile-Toxin-A und schützt Zellen in Kultur von Toxin A vermittelter Zellrundung. Vernetztes C₈-alkyliertes PDMA bindet Toxin A und B in vitro und kann Zellen in Kultur vor Toxin-vermittelter Zellrundung schützen. Dieses Polymer ist etwa fünfmal mehr wirksam zur Bindung von Toxin B als zur Bindung von Toxin A in vitro. Um den Vorteil optimaler Toxin-A- und -B-Bindung zu erlangen, wurden diese Polymere in Kombination im Hamstermodell von C. difficile-Kolitis getestet. Die Behandlung mit Polymer begann 24 Stunden vor der Infektion mit C. difficile. Hamster wurden 3 tägliche Dosen Polymer um 8 Uhr, 12 Uhr und 16 Uhr verabreicht. Die Hamster wurden insgesamt 7 Tage mit Salzlösung (Kontrolle), Polystyrolsulfonat allein, vernetztes, C₈-alkyliertes PDMA allein oder einer Kombination der zwei Polymere behandelt, verabreicht in separaten Dosen (2 Dosen Polystyrolsulfonat, 1 Dosis C₈ PDMA). Die Tiere wurden insgesamt 7 Tage beobachtet. Keines der mit Salzlösung behandelten Tiere überlebte die Behandlung. Die Polystyrolsulfonatbehandelten Tiere zeigten zu 80 % Überleben am Tag 7, wobei die Überlebenden eine leichte oder moderate Krankheit zeigten. Die C₈-alkyliertes PDMA Tiere zeigten zu 50 % Überleben am Tag 7, wobei die Überlebenden eine moderate oder keine Krankheit zeigten. Die Kombination des Polystyrolsulfonats und des C₈-alkylierten PDMA führte zu einem 90 %-Überleben am Tag 7, wobei 80 % der Tiere keine Krankheit zeigten. Daher scheint die Kombination von löslichem Polystyrolsulfonat und C₈-alkyliertem PDMA eine wirksame Therapie für C. difficile-Kolitis in vivo zu sein.
Beispiel 23 – Toxin-Bindungsassays
ELISA
Ein Enzyme Linked Immunosorbant Assay (ELISA) ist kommerziell für die Diagnose von C. difficile-Toxinkonzentrationen in Stuhlproben erhältlich. Dieses Assay verwendet Mikrotiterplatten, die mit gereinigten monoklonalen Antikörpern gegen C. difficile-Toxine A und B beschichtet sind, um Toxin in Lösung zu binden. Die gebundenen Toxine werden dann mit einem Affinitäts-gereinigten polyklonalen Antiserum detektiert, das mit dem Enzym Meerrettichperoxidase („HRP") verknüpft wurde. Ungebundener Antikörper wird weggewaschen und das Antikörper-gebundene Toxin wird dann mit einem gefärbten Substrat auf die HRP detektiert. Das Assay ist auf Nanogramm-Mengen der Toxine A und B empfindlich. Dieses ELISA-Assay wurde verwendet, um freie Toxinkonzentrationen nach Inkubation von gereinigtem Toxin A oder B zu bestimmen, mit einer Vielzahl Polymerer in Gegenwart von Hamsterzäkalbestandteilen, die verwendet wurden, um physiologisch relevante Bedingungen bereitzustellen, die für die in vivo Toxinbindung voraussagend sind.
Um das ELISA-Assay durchzuführen, wurde Polymer (10 mg) in jedes von vier 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen eingewogen. 500 μL zäkale Inhaltsstoffe wurden dann in jedes Röhrchen zugegeben, und die Röhrchen wurden dann auf einem Vortex gemischt und 1 Stunde auf dem Nutator platziert. 500 μl einer 200 ng/ml oder 2000 ng/ml Lösung von Toxin A oder Toxin B in Phosphatpuffer wurden dann in jedes Röhrchen zugegeben, um eine endgültige Toxinkonzentration von 1000 ng/mL oder 100 ng/mL herzustellen. Die Röhrchen wurden danach wiederum gevortext und dann auf dem Nutator für eine weitere Stunde platziert. Die Röhrchen wurden dann zentrifugiert.
100 μl verdünnter Überstand von jedem Röhrchen wurden in jede Vertiefung einer Platte gegeben, unter Vermeidung festen Materials. 100 μl Konjugat 1 wurde dann in jede Vertiefung gegeben. Die Vertiefungen wurden mit einem Plattenabdichter bedeckt und 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Die Vertiefungen wurden in einen Aufnahmebehälter für biologische Risikostoffe eingezogen (Reservoir, das Wescodyne oder 10 % Bleichbad in Wasser enthält). Die Platte wurde unter Verwendung eines Plattenwaschers gewaschen, wobei die Vertiefungen mit 300 μl Waschpuffer gefüllt wurden. Nach der finalen Waschung wurde die Platte umgedreht und aufgeschlagen, um jeden restlichen Waschpuffer auf Papierhandtücher zu entfernen. 100 μl verdünntes Schritt-2-Konjugat wurde in jede Vertiefung gegeben. Die Platte wurde abgedeckt und 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Vertiefungen wurden fünfmal unter Verwendung des Plattenwaschers, wie oben, gewaschen, und dann aufgeschlagen, um restlichen Puffer zu entfernen. 100 μl Substratmix wurden in jede Vertiefung gegeben, anschließend wurde die Platte abgedichtet und 15 Minuten bei Raumtemperatur irrkubiert. 150 μl Stopp-Lösung wurden dann in jede Vertiefung gegeben, und die Platte wurde behutsam durch die Drallplatte auf der Bank gemischt. Die Absorption bei 450 nm wurde unmittelbar abgelesen.
Zellkultur-Assay
C. difficile-Toxine bewirken die Rundung von Zellen in Kultur. Diese Eigenschaft kann verwendet werden, um die Inhibierung von Toxinaktivität durch polymere Verbindungen abzusuchen. Die Empfindlichkeiten auf Toxine A und B unterscheiden sich zwischen verschiedenen Zelllinien. Im vorliegenden Fall wurden Vero-Zellen (ATCC-Zelllinie) verwendet. Diese Zellen sind auf 600 pg Toxin A und weniger als 2 pg Toxin B empfindlich. Das Assay wurde durch Plattierung von Vero-Zellen in 12-Vertiefungs- Transwell-Platten oder 96-Vertiefungs-Mikrotiterplatten laufengelassen. Die Zellen wurden 24 Stunden vor dem Test geimpft und waren zum Zeitpunkt der Toxinzugabe zusammenfließende Monoschichten. Polymere (5 mg/ml) wurden in Gewebekulturmedium (Minimales Essentielles Medium mit 10 % fötalem Rinderserum) mit Toxin A oder Toxin B für 1 Stunde bei Raumtemperatur unter Schaukeln inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Proben verschieden gehandhabt, abhängig davon, ob sie unlösliche Gele oder lösliche Polymere waren. Unlösliche Gele wurden in Transwells gegeben (0,5 ml/Vertiefung), da die direkte Zugabe der Gele auf die Monoschicht die Zellen verdecken würde, was die Detektion der Zellrundung verhindert. Lösliche Polymere wurden direkt zu Zell-Monoschichten in 96-Vertiefungs-Mikrotiterplatten (0,1 ml/Vertiefung) gegeben. Die Zellen wurden 18 Stunden bei 37°C inkubiert und auf Zellrundung untersucht. Der Endpunkt des Assay wurde gewertet als die geringste Konzentration Polymer, die 50 % und 100 % der Monoschicht vor der Zellrundung bei 18 Stunden Inkubation schützen kann. Die Kontrollen beinhalteten ein aktives Polymer, das mit Toxinen A und B, Toxin A und B allein inkubiert war, und jedes Polymer allein ohne Toxin.
Ratten-Ileumschleifenmodell-Assay
Die Zielsetzung dieses Assay war die Messung der Fähigkeit polymerer Verbindungen, Toxin-A-vermittelte Flüssigkeitsakkumulation und die Permeabilität in einem ligierten Abschnitt des Rattenileums zu verhindern. Ratten wurden anästhesiert und ein 5-cm-Abschnitt des Rattenileums wurde mit Seidennaht abgebunden. Polymer (1-5 mg) und 5 μg gereinigtes Toxin A wurden in diesen Abschnitt injiziert. Die Ratte empfing auch eine intravenöse Injektion von 10 μCi von ³H Mannitol als Marker für die Darmpermeabilität. Das Toxin A erhöht die vaskuläre Permeabilität im Darm, was es dem Mannitol ermöglicht, in die Schleife einzudringen. 4 Stunden nach Injektion von Toxin A und Polymer wurden die Ileum-Schleifenabschnitte entfernt, gewogen, und eine Gesamtflüssigkeitsakkumulation wurde gemessen. Die Akkumulation von ³H Mannitol wurde durch Flüssigszintillationszählung gemessen. Polymere Verbindungen, die Toxin A binden, werden die Darmflüssigkeitsakkumulation und -permeabilität für ³H Mannitol blockieren. Der Endpunkt des Assay ist die Konzentration an Polymer, welche die Toxin-A-vermittelte Flüssigkeitsakkumulation und Permeabilität vollständig inhibiert. Eine Modifikation dieses Assay beinhaltete die Verabreichung des Polymers durch orale Sondenernährung. Ratten empfingen 250 mg/kg in Lösung durch orale Sondenernährung 90 Minuten vor Präparation von Ileumschleifen. Das Toxin wurde in Ileumschleifen wie oben beschrieben injiziert.
Ergebnisse

Die Ergebnisse des ELISA, der Zellkultur, der Ratten-Ileumschleife und der Hamster-Assays sind in der Tabelle 1 für eine Vielzahl Polymerer angegeben. Ebenso beinhaltet sind entsprechende Daten für Cholestyramin, einem kationischen Polymer, das klinisch verwendet wird, um C. difficile-Toxine zu neutralisieren. Tabelle 1 Ergebnisse der biologischen Assays

Polymer	Toxinbindung (in vitro) Konzentration von Toxin neutralisiert mit einer 5 mg/ml Polymerlösung	Rattenzyklus Dosis, die 5μ Toxin A inhibiert (direkt) (Sondenfütterung)		Hamster % Überleben an Tag 5
Natrium Polystyrol sulfonat	A = 10 ng/ml B = 0,004-0,008 ng/ml	2-5 mg	250 mg/kg	90 %
Polystyrol Sulfonat, 15 % Ca++	A = 10 ng/ml B = nicht detektiert	< 0,5 mg	nicht detektiert	80 %
Polystyrol Sulfonat, 5 % Menthol	A = 10 ng/ml B = 0,004 ng/ml	2,5 mg	nicht detektiert	90 %
Cholestyramin	A = < 0,015 ng/ml B = < 0,015 ng/ml	> 20 mg	nicht detektiert	10 %

Die für das Hamstermodell gezeigten Daten zeigen das Prozent-Überleben am Tag 5 nach der Inokulierung mit C. difficile an.
Die in der Tabelle 1 gezeigten Ergebnisse zeigen, dass jedes der getesteten Polystyrolsulfonatpolymere in jedem der Assays effektiver ist als Cholestyramin.
In vivo Tests
Basisvorschrift
Hamster sind sehr empfindlich gegen Infektion mit C. difficile und entwickeln eine tödliche Kolitis, wenn die Krankheit durch Behandlung mit Antibiotika initiiert wird. Verbindungen wurden auf ihre Fähigkeit zur Inhibierung der Aktivität von C. difficile-Toxinen des Hamstermodells von C. difficile-Kolitis untersucht. Männliche Hamster (80-100 g) wurden erworben Biobreeders Inc. (Falmouth MA). Alle Tiere wurden in Gruppen von fünf in Mikroisolator-Käfigen auf autoklaviertem Lagerstreu (Beta Chips) gehalten und freier Zugang zu autoklaviertem Futter und autoklaviertem gefilterten Wasser gegeben. Die Tiere wurden nach Ankunft und vor der Initiierung einer Studie etwa 1 Woche ausruhen gelassen. Ein C. difficile-Stamm, der anfangs aus einer humanen C. difficile-Kolitis isoliert wurde, wurde verwendet, um die Tiere zu infizieren. Dieser Stamm (HUC2-4) produziert moderate bis hohe Konzentrationen von Toxinen in vitro und in vivo. Eine Suspension von 10⁶-10⁷ bakteriellen Zellen/ml wurde aus einer Übernacht-Bouillonkultur hergestellt und 0,1 ml wurden durch orale Sondenernährung am Tag 1 verabreicht. Vierundzwanzig Stunden später wurde jedes Tier subkutan mit Cleocin Phosphat IV^® in einer Dosis von 10·mg/kg injiziert. Polymere wurden in Gruppen von zehn Tieren durch Sondenernährung dreimal täglich (t.i.d) verabreicht. Die Dosis der Polymeren betrug 25-100 mg/Tag, verabreicht in drei unterteilten Dosen von jeweils 0,75 ml. Die Initiierung und Dauer der Dosierung variierte gemäß den unten beschriebenen Behandlungskuren. Die Tiere wurden täglich auf Krankhaftigkeit oder Sterblichkeit beobachtet. Zusätzlich ermittelte Parameter waren das allgemeine Erscheinungsbild, die Zeit des Beginns klinischer Zeichen und die Anwesenheit oder Abwesenheit von Diarrhoe („wet tail"). Tiere, die daraufhin beurteilt wurden, dass sie in extremis sind, und überlebende Tiere am Ende der Studie wurden schmerzlos durch Erstickung mit 100 % CO₂ eingeschläfert. Zäkale Inhalte wurden in manchen Studien erhalten und für die spätere Toxinanalyse eingefroren.
Die Verabreichung von Clindamycin (am Tag 0) induzierte vorhersehbar eine Krankheit in Hamster, die mit C. difficile infiziert waren (am Tag 1), durch Eliminierung der normalen Darmflora und der Ermöglichung der Proliferation von C. difficile. C. difficile führt zu einer tödlichen Kolitis in 90-100 % der infizierten Hamster innerhalb von 2-4 Tagen.
Der primäre Endpunkt des Assay ist der Schutz der Hamster vor Sterblichkeit. Dies ist ein sehr hartes und herausforderndes Modell, und CDAD in Hamster ist eine sehr viel aggressivere Krankheit, sowohl in Schwere als auch in Zeitverlauf, im Vergleich mit der humanen Form der Krankheit. Pharmazeutische Zusammensetzungen der Erfindung wurden unter Verwendung des Hamstermodells von CDAD unter Verwendung zweier verschiedener Behandlungsparadigmen evaluiert. Im Prophylaxemodell wurden die Studien gestaltet, um das Potential für die Vorbehandlung mit den Toxinbindern zur Verhinderung von CDAD zu bestimmen, statt der Entwicklung einer toxigenen C. difficile-Infektion. Im therapeutischen Modell wurden die Zusammensetzungen nach der Entwicklung von CDAD verabreicht.
Prophylaxemodell
In diesem Modell wurden vier verschiedene Dosen (25, 50, 75 oder 100 mg/Tag oral in drei Dosen von 0,750 ml verabreicht) einer pharmazeutischen Zusammensetzung von Polystyrolsulfonat (oder Salzlösungskontrolle) an männliche Syrische Goldhamster (10 Tiere pro Testgruppe und 10 Tiere pro Testgruppe) oral über 7 Tage verabreicht, vom Tag – 2 bis Tag 5. Die Hamster wurden mit C. difficile (Onderdonk-Stamm (G69)) am Tag – 1 inokuliert und mit Clindamycin am Tag 0 behandelt. Bei Tieren, welche die Plazebo-Kontrolle empfingen, entwickelten 100 % die Krankheit und waren am Tag 3 tot. Im Gegensatz führte die Prophylaxe mit der Zusammensetzung zum Überleben von 70 %, und 90 % der Tiere in der 50-mg/Tag-Dosis- bzw. 100-mg/Tag-Dosisgruppen. Obwohl all die Tiere eine Toxin-produzierende C. difficile-Infektion erfuhren, inhibiert die Zusammensetzung, die Polystyrolsulfonat enthält, wirksam die Toxine und minimiert die Kolitis während der Zeitdauer der geänderten Darmflora. Als die normale Flora wiederhergestellt ist, scheint C. difficile unfähig zu konkurrieren und wird auf eine nicht-pathogene Konzentration reduziert. Hat man somit den Toxinbinder während der anfänglichen Stadien der Toxineinwirkung an Bord, wird die Kolitis verhindert, bevor sie sich entwickelt.
Therapeutisches Modell
Die Polymertherapie wurde am Tag 1 in einer Dosis von 25, 50, 75 oder 100 mg/Tag initiiert. Das Polymer wurde dreimal täglich in 0,7-1,5 ml steriler Salzlösungs-t.i.d. von Tag 1 bis Tag 7 über eine Gesamtheit von 7 Behandlungstagen verabreicht. Die Tiere wurden auf Krankhaftigkeit, Sterblichkeit und klinische Zeichen der Krankheit über 7-14 Tage nach Ende der Behandlung beobachtet.
Kombinationstherapiemodell
Tieren wurde eine Kombination von 50-100 mg/Tag Polymer und Antibiotikum in einem Gesamtvolumen von 0,75 ml Salzlösung von Tag 1 (48 Stunden nach Verabreichung von Pathogen) bis zu Tag 5 verabreicht. Das Antibiotikum war entweder Metronidazol oder Vancomycin. Die Dosis Metronidazol betrug 21 mg/Tag. Die Dosis Vancomycin betrug 3 mg/Tag. Nach der Kombinationstherapie wurde den Tieren für weitere 4 Tage 50-100 mg/Tag Polymer allein verabreicht. Die Tiere wurden auf Krankhaftigkeit, Sterblichkeit und klinische Zeichen von Krankheit über 7-14 Tage nach dem Ende der Behandlung beobachtet.
Metronidazol ist wirksam bei der Verhinderung des Tods durch CDAD von Hamster solange das Arzneimittel aktiv verabreicht wird. Jedoch hatten beim Abschluss der Therapie 80-90 % der Tiere einen Rückfall/eine Wiederkehr der CDAD und sterben innerhalb von 3-6 Tagen der Absetzung von Metronidazol. Experimente zeigen die Wirksamkeit einer Polystyrolsulfonat-(PSS)-Zusammensetzung, die als Behandlung nach dem CDAD-Beginn und in der Prävention des Rückfalls verabreicht wird. Die Sterblichkeit an C. difficile-Rückfall nach Absetzen von Metronidazol wurde bei 90 % der behandelten Tiere mit einer hohen Dosis einer Zusammensetzung, die Polystyrolsulfonat umfasst, verhindert. Der Rückfall wurde bei 70 % der Tiere in der Geringdosis-Polystyrolsulfonatgruppe verhindert. Keine der mit Salzlösung behandelten Kontrollen überlebte. Nur 20 % der mit Metronidazol allein behandelten Tiere überlebten 16 Tage nach der letzten Dosis Antibiotikum (überlebende Tiere hatten weiterhin Diarrhoe am Tag 21). Somit verhinderte die Inhibierung der Toxine durch die PSS-Zusammensetzung Kolitis und weitere assoziierte Pathologie während der Zeit, die zur Wiederherstellung der normalen Flora nach der Metronidazol-Therapie notwendig ist, und scheint die Entwicklung eines Rückfalls zu verhindern
Monotherapie mit PSS-Zusammensetzungen
Die Behandlung mit PSS-Zusammensetzung allein wurde ebenso studiert und mit dem derzeitigen Standard der Pflege, Metronidazol allein, verglichen. Die PSS-Zusammensetzung gemäß der Erfindung war Metronidazol überlegen, bewahrte 40 % der Tiere im Vergleich mit 20 % in der alleinigen Metronidazolgruppe. Dieses Ergebnis in einem strengen Modell legt nahe, dass die PSS-Zusammensetzung dem Metronidazol als Monotherapie überlegen ist. PSS-Zusammensetzungen schienen nicht mit der Aktivität von Antibiotika wechselzuwirken.
Verfahren für das Vero-Zellkultur-Assay:
Für alle Screens wurden Vero-Zellen in dem 96-Vertiefungsformat mit 4 × 10⁴ Zellen pro Vertiefung, mit 100 μl pro Vertiefung, verwendet. Die Platten wurden über Nacht bei 37°C C inkubiert, um am folgenden Tag verwendet zu werden. Alle Medien, Platten, Pipetten und Ausrüstung, die für die Kultur verwendet wurden, wurden steril gehalten. Die Platten wurden bedeckt und mit EtOH eingesprüht, bevor sie in dem Inkubator platziert wurden.
Regulärer Toxin A- und B Screen
Polymere wurden in 15 ml konischen Röhrchen mit 10 mg/ml zum Start ausgewogen, wobei die endgültige Konzentration in den Vertiefungen bei 5 mg/ml lag. Üblicherweise hatten die Röhrchen etwa 40 mg bis 4 ml Medium als Verdünnung. Der Überschuss wurde in dem 4°C-Kühlschrank aufgehoben, für den Fall, dass ein Wiederholungstestbedarf erwünscht war. Die Medien wurden steril in die Röhrchen pipettiert und die Röhrchen wurden dann gründlich gevortext. Wenn das Polymer nicht in Lösung war, wurden die Röhrchen in einem 37°C-Wasserbad für 15-20 Minuten platziert. Für dieses Experiment betrugen die Toxin-A-Konzentrationen 10 ng/ml und das Toxin B war final 1 ng/ml. Die Toxine und das Polymer wurden 2X zurechtgemacht und 1:1 gemischt, um eine Endkonzentration von 1X für beide zu ergeben. Dieses Lösungen wurden in konischen Röhrchen hergestellt und auf Eis platziert.

Nachdem die Polymere einmal gründlich gelöst waren, wurden sterile 96-Vertiefungsplatten erfasst und Medien in 100 μl pro Vertiefung in den Reihen G-H wie auch in den Spalten 2-6 und 8-12 in den Reihen A-F platziert. Vier Polymere wurden pro Platte gescreent und jedes Polymer hatte drei Reihen, eine für Polymer und Medien allein, eine für Toxin A und Polymer und eine für Toxin B und Polymer. Der Setup ist folgendermaßen:

Polymer 1:	Polymer allein Polymer + A Polymer + B	- Reihe A, Spalte 1-6 - Reihe B, Spalte 1-6 - Reihe C, Spalte 1-6
Polymer 2:	Polymer allein Polymer + A Polymer + B	- Reihe D, Spalte 1-6 - Reihe E, Spalte 1-6 - Reihe F, Spalte 1-6
Polymer 3:	Polymer allein Polymer + B Polymer + A	- Reihe A, Spalte 7-12 - Reihe C, Spalte 7-12 - Reihe B, Spalte 7-12
Polymer 4:	Polymer allein Polymer + A Polymer + B	- Reihe D, Spalte 7-12 - Reihe E, Spalte 7-12 - Reihe F, Spalte 7-12

Nachdem die Medien zugegeben waren, wurden 200 μl der Polymerlösung zu den ersten Spalten in jedem Segment (Spalte 1 oder 7) gegeben und zweifach über die Platte bis zum Ende des Abschnitts verdünnt (Spalte 6 oder 12). Medien wurden zu den Reihen A, D und H gegeben, und das Toxin A wurde zu den Reihen B, E und G (Spalte 1-6) gegeben. Das Toxin B wurde zu den Reihen C, F und G (Spalte 7-12) gegeben. Das Toxin und die Medien wurde beide in 100 μl pro Vertiefung zugegeben, was das Gesamtvolumen in der Vertiefung hinauf auf 200 μl brachte. Die letzte Reihe (H) wurde in dem Assay nicht verwendet. Die Platten wurden dann auf einem Schüttler platziert und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.
Die Platten mit Zellen, die über Nacht in dem Inkubator gelassen wurden, wurden dann herausgenommen, und die Medien aus den Vertiefungen wurden unter Verwendung eines Vakuumabsaugapparates abpipettiert. Medium wird nur von einer Platte zu einer Zeit entfernt, da die Zellen dazu tendieren, während des Prozesses auszutrocknen. Nach der Entfernung von Medium wurde die Toxin-/Polymermischung auf die Zellen pipettiert. Die Lösung wurde in 100 μl pro Vertiefung zugegeben, von der Mindestmenge Toxin zu den meist konzentrierten Vertiefungen, unter Verwendung der gleichen Pipettenspitze während der ganzen Prozedur. Die Pipettenspitzen wurden für jeden neuen Polymerlauf gewechselt. Die Reihe H wurde unberührt gelassen und die Platten wurden dann unter dem Mikroskop untersucht, um zu versichern, dass der Monolayer an Zellen während der Absaugung nicht beschädigt wurde. Die Platten wurden dann zurück in den 37°C-Inkubator getan und nach 18 Stunden nach der Polymer-/Toxinbehandlung geprüft und auf Zellrundung, keine Zellrundung oder teilweise (50 %) Zellrundung bewertet.
Toxin-B-Dosis-runter

Polymere wurden in 10 mg/ml (5 mg/ml final) in konischen Röhrchen eingewogen. Üblicherweise waren etwa 70 mg bis 7 ml Medium (das verwendete Verdünnungsmittel) angemessen, um einen Lauf zu vervollständigen. Sie wurden in Lösung gevortext. Polymere, die nicht in Lösung waren, wurden in dem 37°C-Wasserbad für 15-20 Minuten platziert. Lösungen, die immer noch nicht zur vollständigen Lösung in der Lage waren, wurden notiert und Gele wurden mit der Gelprozedur laufengelassen. Das Toxin B wurde beginnend bei 2 ng/ml (1 ng/ml final) hergestellt und auf Eis gelassen. Sterile 96-Vertiefungsplatten wurden verwendet und Medium wurde in 100 μl pro Vertiefung in alle Vertiefungen gegeben, außer der ersten Spalte. Jedes Polymer wurde in drei verschiedenen Reihen (zwei Polymere pro Platte) getestet, die erste Reihe für das Polymer allein ohne Toxin und die nächsten zwei mit Polymer und Toxin B. Die Reihe G war eine heruntergesetzte Dosis von Toxin B alleine und die Reihe H wurde unbehandelt gelassen. Das Setup war wie folgt:

Polymer 1:	Reihe A (1-12)	- Polymer allein
	Reihe B (1-12)	- Polymer mit Toxin B
	Reihe C (1-12)	- Polymer mit Toxin B
Polymer 2:	Reihe D (1-12)	- Polymer allein
	Reihe E (1-12)	- Polymer mit Toxin B
	Reihe F (1-12)	- Polymer mit Toxin B
Extra Reihen:	Reihe (1-12)	- herabgesetzte Dosis von Toxin B allein
	Reihe H	- unbehandelt

200 μl von entweder Medium oder Toxin wurden in der ersten Spalte platziert (Medien für Reihen mit Polymer allein) und dies wurde zweifach über die Platte verdünnt, übertragend 100 μl in jede neue Spalte. Die Polymermischung wurde in 100 μl in alle Vertiefungen zugegeben, außer Reihe G und H. Die Reihe, die mit 100 μl Medium substituiert war, und die Reihe H wurden leer gelassen. Diese Platten wurden eine Stunde auf den Schüttler getan und die Prozedur von oben wurde von diesem Schritt an befolgt.
Als das Toxin und das Polymer zu den Zellen gegeben wurde, wurden die Platten anschließend mit EtOH eingesprüht, in dem 37°C-Inkubator über Nacht platziert und 18 Stunden später bewertet. Die Bewertung war positiv für die Zellrundung, negativ für normale Zellen und +/– für Vertiefungen mit der Morphologie von mindestens 50 % normal.
Prozedur für Gele
Die Gele wurden in zwei verschiedenen Polymerkonzentrationen mit Konzentrationen von entweder 5 oder 10 mg/ml laufengelassen. Die Konzentrationen von Toxin waren bei 100, 10, 1 für Toxin A und B. Diese Konzentrationen variierten, abhängig vom Polymertyp. 12 Eppendorf-Röhrchen wurden für jedes Polymer eingewogen. Die Toxine wurden in der 1X-Verdünnung hergestellt, und 1 ml Toxin in das entsprechende Eppendorf-Röhrchen gegeben. Kontrollröhrchen wurden mit Polymer allein (in allen Konzentrationen) und mit Toxinen allein verwendet. Die Röhrchen wurden dann bei Raumtemperatur für 1 Stunde nutiert und 5 Minuten bei 14000 U/min zentrifugiert. 200 μl jeder Probe wurde in einer Vertiefung auf sterilen 96-Vertiefungsplatten platziert. Platten mit Vero-Zellen wurden aus dem Inkubator entfernt und die Medien über Absaugen (eine Platte zu einem Zeitpunkt) entfernt. 100 μl von der Toxin-/Polymermischung wurden direkt auf die Platten mit Zellen gegeben, und die Platten wurden bedeckt und über Nacht zur Bewertung am nächsten Tag im Inkubator platziert. Die Bewertung verwendete die oben beschriebenen Prozeduren.
Ratten-Ileumschleifen-Experimente
Dieses Protokoll beschreibt die Präparation von Ileumschleifen in anästhesierten Ratten. Dieses experimentelle Modell kann verwendet werden, um die Wirkungen enterotoxischer Mittel, wie bakterieller Toxine, auf die Darmstruktur und -funktion zu testen; die Effekte putativer Schutzmittel können ebenso bestimmt werden.
Zwei Darmschleifen, etwa 5 cm in der Länge, wurden in jedem Tier durch Abbinden des Ileums mit Seidenfaden hergestellt. Die renalen Pedikel wurden abgebunden, um die Exkretion von Mannitol zu verhindern, und radiomarkiertes Mannitol (³H-Mannitol) i. v. injiziert. Testmittel (± Toxin ± Polymer) wurden dann in diese Schleifen injiziert. Vier Stunden später wurden die Tiere getötet und die Schleifen geerntet. Die Darmflüssigkeitssekretion (ein Index sekretorischer Diarrhöe) wurde durch Wiegen der Schleifen und Messen ihrer Länge bestimmt. Die Permeabilität der Darmmukosa wurde durch Messen der Akkumulation radiomarkierten Mannitols (³H-Mannitol) in der Schleife bestimmt. Gewebeproben wurden ebenso im Fixativ platziert zur anschließenden morphologischen Untersuchung von mukosaler Verletzung und Entzündung.
Tierpräparation
Männliche Wistar-Ratten, 200-250 g, wurden über Nacht (18-22 Stunden) in Drahtbodenkäfigen angezurrt, um die Koprophagie zu minimieren. Wasser war ad libidum verfügbar. Die Ileumschleifen waren im Wesentlichen frei von luminalen Inhalten (Futter und Galle), die an das Toxin oder die verwendeten Testmittel binden könnten oder sie denaturieren könnten.
Lösungspräparation:
Jede Ileumschleife empfing ein 0,5 ml Volumen eines Testmittels oder Mittel in PBS. Vier Sätze gelabelter Röhrchen und gelabelter Spritzen wurden präpariert (± Toxin ± Polymer). Das Toxin A haftet an Plastikware, wodurch seine effektive Konzentration vermindert wird. Aus diesem Grund sollten Röhrchen und Spritzen zwischen den Schleifen wiederverwendet werden.
Toxin A
Das Toxin A wurde kommerziell von TechLab Inc. hergestellt und wurde in 0,5-ml-Ampullen, die 2 mg/ml enthielten, bereitgestellt. Jeder Schleife, die Toxin A empfing, wurde 5 μg insgesamt oder 2,5 μl der obigen Lösung verabreicht.
Polymer
Polymer-empfangende Schleifen empfingen eine Gesamtmenge von 10 mg in einem Volumen von 0,5 ml PBS (20 mg/ml). Neue Polymerlösungen/-suspensionen wurden vor jedem Experiment hergestellt.
³H-Mannitol
Eine Ausgangslösung 1 mCi/ml ³H-Mannitol (Mannitol, D-[1-³H(N)]-, NEN Katalog-Nr. NET101) wurde gekühlt. Jedes Tier empfing 10 μCi ³H-Mannitol, injiziert i. v. in einem Volumen von 200 μl(d. h. 10 μl Ausgangs-³H-Mannitol + 190 μl PBS pro Tier).
Anästhesie
Die Tiere wurden mit 35-60 mg/kg Pentobarbital i. p. anästhesiert (50 mg/ml Lösung). Somit anästhesiert eine i. p. Injektion von 0,2-0,3 ml eine 200-250 g Ratte. Als eine Alternative kann ein Ketamin/Xylazin-Cocktail verwendet werden. Dieser Cocktail kann durch Mischen von 5,4 ml Ketamin (100 mg/ml) und 0,45 Xylazin (100 mg/ml) hergestellt werden. Die Tiere wurden mit 0,25-0,3 ml dieses Cocktails anästhesiert. 10-15 Minuten zur Induzierung der Anästhesie wurden ermöglicht. Die Anästhesie im chirurgischen Narkosestadium wurde durch das Fehlen einer Antwort auf einen schmerzvollen Stimulus (Kniff in die Zehe) bestätigt.
Chirurgische Präparation
Ein Unterleibseinschnitt auf der Mittellinie wurde vorgenommen und der Blinddarm und der Dünndarm vorgelagert. Ein Länge von 3,5 Nähseide wurde um den linken Nierenstiel herum platziert und das Gefäßsystem abgebunden. Die Eingeweide wurden dann derart positioniert, dass sie die rechte Niere und den abgebundenen rechen Nierenstiel freilegen, wobei man vorsichtig war, dass man nicht die Vena cava beschädigte. Das Zäkum wurde dann so positioniert, dass der Dünndarm und die ihn versorgenden Blutgefäße sichtbar waren. Zwei 5-cm-Längen Ileum wurden identifiziert, die von luminalen Inhaltsstoffen frei waren (Nahrung oder Galle), und die Abbindungen wurden so gebunden, dass sie zwei Blindschleifen bildeten. Die Schleifen wurden dann mit den erwünschten Testmitteln injiziert. Die Mittel wurden in die Schleife unterhalb der Abbindung injiziert, die zum Zäkum distal war. Die Eingeweide wurden dann so positioniert, dass die Vena cava sichtbar war, und 200 μl der ³H-Mannitol-Lösung i. v. injiziert. Leichter Druck wurde auf die Einstichwunde nach Entfernung der Nadel appliziert, um die Blutgerinnung zu befördern. Nach der Injektion von Mannitol wurden die Eingeweide zurück in den Bauch platziert und die Muskel- und Hautschichten der Wunde mit chirurgischen Klammern geschlossen.
Injizierung von Ileumschleifen:
5 μg Toxin A wurden in 0,5 ml PBS (± Polymer) gelöst und die Mischung in eine Spritze geladen und in die Schleife injiziert. Die Inhaltsstoffe der Spritze werden darin schnell in die Darmschleife injiziert.
Haltung der Tiere
Nach der Operation wurden die Tiere in einem Schuhkartonkäfig mit Holzchips platziert und für eine 4-Stunden-Zeitdauer erholen gelassen. Die Tiere gewannen das Bewusstsein während dieser Zeitdauer wieder. Jegliche Tiere, die offene Zeichen von Schmerz oder Leid zeigten, wurden sofort eingeschläfert.
Ernte und Verarbeitung der Schleifen
Vier Stunden nachdem die Testsubstanzen verabreicht wurden, wurden die Ileumschleifen geerntet. Die Tiere wurden unter Verwendung von 100 % CO₂ geopfert, der Bauch geöffnet und die Schleifen visuell und durch Verwendung von Chirurgiemarkern identifiziert. Überschüssiges Gewebe wurde von den Schleifen abgeschnitten und chirurgisch entfernt, wobei man sicherstellte, dass man nichts von den Inhaltsstoffen der Schleife verlor. Die Schleifen wurden auf ein Stück Wiegepapier gelegt, ihre Länge gemessen und das Schleifengewicht gemessen. Das distale Ende der Schleife wurde dann in einem vorgewogenen Röhrchen platziert und aufgeschnitten, um seine Inhaltsstoffe zu sammeln. 500 μl PBS wurden dann in das proximale Ende der Schleife injiziert, um bei dem Durchwaschen von den Inhaltsstoffen zu helfen. Die Schleife wurde dann hälftig geschnitten und ein 0,5-cm-Abschnitt isoliert, geöffnet und in einem Fixiermittel platziert.
Probenpräparation für die Szintillationszählung
Die Röhrchen wurden rückgewogen, um das Volumen der Schleifeninhaltsstoffe zu bestimmen. Die Röhrchen wurden energisch gevortext und 200 μl Probe in ein 7-ml- Plastik-Szintillationsröhrchen aliquotiert. Diese Proben wurden mit 5 ml Ultima-Gold-Szintillationscocktail gemischt und gevortext. Die Proben wurden über Nacht ins Gleichgewicht gebracht (um Chemilumineszenz zu minimieren), gevortext und am nächsten Tag gezählt.
MIC-Assay
Das minimale inhibitorische Konzentration (MIC) Assay bestimmt die Minimumkonzentration eines antimikrobiellen Mittels, das zur Verhinderung des Wachstums der Testorganismen benötigt wird. MIC-Assays wurden gegen ein Standardpanel an Organismen als Screeningwerkzeug durchgeführt, um Verbindungen zu identifizieren, die antimikrobielle Aktivität haben. Das MIC-Assay wurde anschließend gegen andere spezialisierte mikrobielle Panels wiederholt, Verbindungen wurden auf biozide Aktivität getestet, auf Zeitverlauf der Tötung getestet, auf Toxizität gegen in vitro angezüchtete Gewebekulturzellen getestet und in manchen Fällen auf antimikrobielle Aktivität in vivo getestet.
Der MIC-Assay wurde gemäß den Ausführungsstandards für antimikrobielle Empfindlichkeitstestung, 1998, Vol. M100-S8, Eighth Informational Supplements, NCCLS, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, PA 19087, durchgeführt.
Kurz gesagt, wurden die zu testenden Polymere in 0,85 % Salzlösung auf eine Endkonzentration von bis zu 5000 μg/ml aufgelöst, der pH wurde auf 7,0 eingestellt und die Lösung wurde durch einen 0,22-Mikrometerfilter-Filter sterilisiert. Zweifache Serienverdünnungen Polymer wurden in Mueller-Hinton-Brühe mit Kationen aliquotiert in 96-Vertiefungsmikrotiterplatten hergestellt. Die Platten wurden dann mit 5 × 10⁵ Zellen/Vertiefung am Zielorganismus inokuliert und 18-24 Stunden bei 35°C inkubiert. Die optische Dichte (OD) wurde dann bei 590 nm abgelesen und das Mikroorganismenwachstum wurde gezählt (OD > 0,1 wird als Wachstum betrachtet, OD < 0,1 wird als Wachstumsinhibierung betrachtet). Der MIC-Wert wurde als niedrigste Konzentration der Verbindung definiert, die Wachstum inhibiert.
Die getesteten Organismen umfassen ein breites Panel aerober gram-negativer und gram-positiver Bakterienstämme von klinischer Signifikanz, eine einzige anaerobe Spezies (Clostridium difficile), wie auch verschiedene Stämme Candida spp.
Obwohl diese Erfindung speziell mit Bezug auf bevorzugte Ausführungsformen davon gezeigt und beschrieben wurde, verstehen Fachleute, dass verschiedene Änderungen in Form und den Details darin vorgenommen werden können, ohne von der Idee und dem Schutzbereich der Erfindung, wie in den beigefügten Ansprüchen definiert, abzuweichen.

Claims

Verwendung eines Polymers, oder eines Salzes davon mit einem pharmazeutischen annehmbaren Kation, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von mit Antibiotika assoziierter Diarrhoe in einem Säuger, wobei das Polymer anhängende säurefunktionale Gruppen umfasst, die mit dem Polymerrückgrat durch eine Spacergruppe verbunden sind, ausgewählt aus (i) einer aromatischen Spacergruppe, (ii) einer linearen aliphatischen Spacergruppe und (iii) einer verzweigten aliphatischen Spacergruppe, wobei das Polymer im Wesentlichen frei von Säureanhydridgruppen ist, wobei die säurefunktionale Gruppe ausgewählt ist aus Carbonsäuregruppen, Sulfonsäuregruppen, Phosphonsäuregruppen, Sulfaminsäuregruppen, Borsäuregruppen, Hydrogensulfatgruppen und Hydrogenphosphatgruppen, und wobei das Polymer durch wiederkehrende Einheiten der Formel 1 gekennzeichnet ist,
worin X die Spacergruppe ist; R¹ und R² jeweils unabhängig Wasserstoff oder eine Alkylgruppe sind; oder R¹ ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe ist und R² eine säurefunktionale Gruppe; und Y die säurefunktionale Gruppe ist, oder ein Salz davon mit einem pharmazeutischen annehmbaren Kation, wobei das Polymer im Wesentlichen frei von Säureanhydridgruppen ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Spacergruppe eine aromatische Spacergruppe ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Polymer durch Wiederholungseinheiten gekennzeichnet ist, die eine anhängende säurefunktionale Gruppe haben.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Polymer eine hydrophobe Gruppe umfasst.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das säurefunktionale Polymer ein anderes ist als eine Sulfaminsäuregruppe.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei die säurefunktionale Gruppe Sulfonsäure ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei X eine C₂-C₂₀-Alkylengruppe, eine C₂-C₂₀-Alkenylengruppe ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Polymer ein Homopolymer ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Polymer ein Copolymer ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Polymer ein Copolymer ist, das ein Terpolymer ist; und gegebenenfalls wobei das Polymer weiterhin ein neutrales hydrophiles Monomer umfasst; und in welchem Fall weiterhin gegebenenfalls das neutrale hydrophile Monomer ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Acrylamid, Methacrylamid, N-(2-Hydroxyethyl)acrylamid und 2-Hydroxyethylmethacrylat.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Polymer ein Copolymer ist, welches weiterhin gekennzeichnet ist durch eine Monomer, das eine anhängende hydrophobe Gruppe hat; und gegebenenfalls wobei die hydrophobe Gruppe eine geradkettige oder verzweigte, substituierte oder nicht-substituierte, zyklische oder azyklische C₃-C₂₄-Alkylgruppe ist, eine Arylgruppe oder eine Arylalkylgruppe; und in welchem Fall weiterhin gegebenenfalls das hydrophobe Monomer ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Styrol, N-Isoproylacrylamid, N-t-Butylacrylamid, N-n-Butylacrylamid, Heptafluorobutylacrylat, N-n-Decylallylamin, N-n-Decylacrylamid, Pentafluorstyrol, n-Butylacrylat, t- Butylacrylat, n-Decylacrylat, N-t-Butylmethacrylamid, n-Decylmethacrylat, n-Butylmethacrylat, n-Hexylmethacrylat, N-n-Hexylvinylamin, N-n-Hexylallylamin, N-Benzylallylamin, N(Cyclohexylmethyl)allylamin und N-(n-Decy)allylamin.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Monomer ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Acrylsäure, Methacrylsäure, Vinylsulfonsäure, Vinylphosphonsäure, 3-Allyloxy-2-hydroxy-1-propansulfonsäure, Vinylessigsäure, Vinylhydrogensulfat, Vinyldihydrogenphosphat, Undecensäure, Undecenylhydrogensulfat, Undecenylsulfonsäure, Styrolsulfonat und Vinylbenzolensäure; und konjugierten Basen davon in Verbindung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Kation.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Polymer dem Patienten oral verabreicht wird.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Polymer Polystyrolsulfonat umfasst.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Polymer Natriumpolystryolsulfonat umfasst.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Polymer Polystyrolsulfonat ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Polymer Natriumpolystyrolsulfonat ist.
Verwendung eines Polymers oder eines Salzes davon mit einem pharmazeutisch annehmbarem Kation zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von mit Antibiotika assoziierter Diarrhoe in einem Säuger, wobei das Polymer gekennzeichnet ist durch eine Wiederholungseinheit der Formel II
worin R¹ und R² jeweils unabhängig ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe sind; oder R¹ ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe ist und R² eine säurefunktionale Gruppe; Z O oder NH ist; Y eine säurefunktionale Gruppe ist; und X eine normale, verzweigte, substituierte oder nicht-substiuierte, gesättigte oder ungesättigte Hydrocarbylengruppe ist, in welcher wenigstens ein Kohlenstoffatom durch ein Hetroatom substituiert ist, wobei die säurefunktionale Gruppe ausgewählt aus Carbonsäuregruppen, Sulfonsäuregruppen, Phosphonsäuregruppen, Sulfaminsäuregruppen, Borsäuregruppen, Hydrogensulfatgruppen und Hydrogenphosphatgruppen.
Verwendung nach Anspruch 18, wobei X eine C₂-C₂₀-Alkylengruppe ist, eine C₂-C₂₀-Alkenylengruppe, eine C₂-C₂₀-Alkylengruppe unterbrochen an ein oder mehreren Punkten durch ein Heteroatom, oder C₂-C₂₀-Alkenylengruppe unterbrochen an ein oder mehreren Punkten durch ein Heteroatom.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die mit Antibiotika-assoziierte Diarrhoe mit Clostridium Difficile assoziierte Diarrhoe ist.
Verwendung nach Anspruch 20, wobei das Polymer löslich ist; und gegebenenfalls wobei das Polymer eine Molekulargewicht im Bereich von 400 000 bis 1 Million Dalton hat; und in welchem Fall weiterhin gegebenenfalls das Polymer ein Molekulargewicht von etwa 600 000 Dalton hat.