DE60033909T2

DE60033909T2 - Interkalator mit Redox-Aktivität

Info

Publication number: DE60033909T2
Application number: DE60033909T
Authority: DE
Inventors: Yoshihiko Asaka-shi Makino; Kazunobu Minami-Ashigara-shi Takahashi; Makoto Fukuoka-shi Takagi; Shigeori Koga-shi Takenaka; Kenichi Fukuoka-shi Yamashita
Original assignee: Fujifilm Corp
Current assignee: Fujifilm Corp
Priority date: 1999-12-08
Filing date: 2000-12-08
Publication date: 2007-12-06
Anticipated expiration: 2020-12-09
Also published as: US20020012917A1; EP1106619A2; US6368807B2; DE60033909D1; EP1106619B1; EP1106619A3

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Verbindung, die in vorteilhafter Weise als elektrochemisch aktiver "Threading"-Interkalator in einem Verfahren zum Analysieren von Oligonucleotiden oder Polynucleotiden, wie DNA-Fragmenten, einsetzbar ist.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
In der Genanalyse in den Gebieten von Biochemie und klinischem Test wird die Detektion einer DNA oder ihres Fragmentes mit einer spezifischen Basensequenz mittels eines Hybridisierungsverfahrens, insbesondere dem Southern-Hybridisierungsverfahren (Southern-Blotting-Verfahren) durchgeführt. Die Southern-Hybridisierung wird unter Verwendung einer Markierung mit einem Radioisotop (RI) durchgeführt. Die konventionellen analytischen Verfahren unter Verwendung einer Markierung mit einem Radioisotop, wie das Southern-Hybridisierungsverfahren, sind dahingehend nachteilig, dass sie problematische Radioisotope benötigen.
Es ist auch ein Southern-Hybridisierungsverfahren unter Verwendung einer Fluoreszenzmarkierung anstelle einer Markierung mit einem Radioisotop bekannt. Dieses Verfahren ist dem Verfahren unter Verwendung von RI in Sicherheit und Geschwindigkeit überlegen. Daher sind DNA-Chips, umfassend ein Substrat, wie einen Glasobjektträger ("slide glass") oder eine Silikonplatte, und eine große Anzahl von Oligonucleotid- oder Polynucleotidmolekülen, die an dem Substrat fixiert sind, nun zur Verwendung in Fluoreszenzdetektionssystemen kommerziell erhältlich. Das Fluoreszenzdetektionssystem hat jedoch andere nachteilige Eigenschaften, d.h., die Fluoreszenzmarkierung nimmt unter Einstrahlung der Anregungsstrahlung ab; ein speziell konstruiertes Fluoreszenzmessgerät sollte installiert werden; und eine Menge einer Fluoreszenzmarkierung ist beschränkt, weil internes Quenchen bzw. innere Löschung auftritt.
Kürzlich wurde ein neues System zur Detektion von DNA-Fragmenten, welches einen Elektrodensensor verwendet, auf welchem eine Gruppe von Sonden, umfassend Oligonucleotidmoleküle oder Polynucleotidmoleküle, fixiert ist, in der Veröffentlichung der ungeprüften japanischen Patentanmeldung ("Japanese Patent Provisional Publication") Nr. H9-288080 und dem Vorabdruck der 57th Conference of Analytical Chemistry, S. 137-138 (1996), vorgeschlagen. In diesem System wird eine Elektrode, die eine Ausgangsklemme hat und an der weiterhin die Sondenmoleküle auf der Oberfläche fixiert sind, mit einer DNA-Probe in einem wässrigen Medium in Gegenwart eines "Threading"-Interkalators in Kontakt gebracht und ein elektrischer Strom, erzeugt durch Anlegen einer elektrischen Spannung zwischen der Elektrode und der anderen Elektrode, eingebracht in das wässrige Medium, wird gemessen.
Als "Threading"-Interkalator ist eine elektrisch leitende Ferrocen-enthaltende Verbindung mit Oxidations-Reduktions-Aktivität (Redoxaktivität), die die folgende chemische Struktur hat und spezifisch an Hybrid- oder hybridisierte DNA binden kann, bekannt:
Das oben genannte elektrochemische Detektionssystem, das einen Elektrodensensor einsetzt, ist beim einfachen Detektieren der Hybrid-DNA-Struktur auf Echtzeit-Basis vorteilhaft. Es findet kein Abnehmen (der Signalstärke) ("fading-out") statt.
Der oben veranschaulichte konventionelle elektrisch leitende "Threading"-Interkalator hat eine Struktur, umfassend einen Kernteil aus einer Naphthalindiimid-Cyclus-Gruppe, ein Paar von Linkerteilen, von denen jedes mit jedem der zwei Enden des Kernteils verbunden ist, und von elektrisch leitenden Ferrocengruppierungen, von denen jede mit dem anderen Ende jedes Linkers verbunden ist. Die Ferrocengruppierung weist eine Redoxaktivität und ein konjugiertes System auf, in dem sich Elektronen frei bewegen.
In den Vorgehensweisen zum Detektieren von DNA-Fragmenten, die komplementär zu den auf der Elektrode fixierten Sonden molekülen sind, hängt die Menge des elektrischen Stroms, erzeugt durch das Anlegen eines elektrischen Potentials an die Elektrode, wesentlich von der Beschaffenheit eines elektrisch leitenden "Threading"-Interkalators ab, obwohl sie teilweise auch von den Beschaffenheiten der Sondenmoleküle und DNA-Fragment-Proben und der Ionenkonzentration der Pufferlösung, die in dem Detektionsverfahren eingesetzt werden, abhängt. Bei der Verwendung des konventionellen "Treading"-Interkalators der oben angegebenen Formel wird eine Spitze des elektrischen Stroms beobachtet, wenn ein elektrisches Potential in dem Bereich von etwa 450 mV bis 620 mV angelegt wird. Daher sollte bei den Detektionsverfahren, die den konventionellen "Treading"-Interkalator einsetzen, ein elektrisches Potential von etwa 450 mV oder höher angelegt werden.
Das elektrische Potential von etwa 450 mV oder höher ist relativ hoch für gegenwärtige bzw. Strom-Detektionsvorrichtungen. Demgemäß sind die Kosten zum Produzieren der Detektionsvorrichtungen für die elektrochemische Analyse von DNA-Fragmenten relativ hoch. Wenn die Sondenmoleküle darüber hinaus nur durch eine schwache Bindung, wie eine elektrostatische Bindung, an der Elektrodenoberfläche befestigt bzw. gebunden sind, neigen die Sondenmoleküle dazu, von der Elektrode freigesetzt zu werden, wenn ein hohes elektrisches Potential an der Elektrode angelegt wird. Die Freisetzung der Sondenmoleküle von der Elektrode beeinflusst die Nachweisempfindlichkeit und die Nachweisgenauigkeit nachteilig. Insbesondere hat die leichte Freisetzung der Sondenmoleküle von der Elektrode einen nachteiligen Effekt, wenn der DNA-Chip wiederholt in den Detektionsverfah ren eingesetzt wird, nachdem temporär fixierte DNA-Fragment-Proben und "Treading"-Interkalator entfernt sind.
Demgemäß ist es eine Aufgabe der Erfindung, einen elektrisch leitenden "Treading"-Interkalator bereitzustellen, der vorteilhafterweise in den elektrochemischen Verfahren zum Detektieren von Polynucleotidproben oder Oligonucleotidproben (wie DNA-Fragmente) mittels eines DNA-Chips, umfassend eine Elektrode und Sondenmoleküle (wie Nucleotidderivate oder ihre Analoga) einsetzbar ist.
Speziell ist es eine Aufgabe der Erfindung, einen elektrisch leitenden "Threading"-Interkalator bereitzustellen, der befähigt ist, in dem elektrochemischen Detektionsverfahren bei einem niedrigen elektrischen Potential, das an die Elektrode angelegt ist, zu funktionieren.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung liegt in einer Verbindung mit der folgenden Formel (2): Ea – L1a – L2a – X – L2b – L1b – Eb (2)worin jedes von Ea und Eb eine Metallocengruppierung ist, die einen oder mehrere Substituenten haben kann; X eine divalente cyclische Gruppe ist; jedes von L1a und L1b eine Alkylengruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder eine Alkenylengruppe mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen ist, wobei jede Gruppe möglicherweise einen oder mehrere Substituenten hat; und jedes von L2a und L2b eine Verknüpfungsgruppe, enthal tend N, O oder S, ist; wobei Ea das gleiche wie Eb ist, L1a das gleiche wie L1b ist und L2a das gleiche wie L2b ist.
Jedes von L1a und L1b ist eine Gruppe, die kein konjugiertes System in Kombination mit dem konjugierten System von jedem von Ea und Eb bildet; und jedes von L2a und L2b enthält eine Verknüpfungsgruppe mit einer Stelle, die der Verbindung Wasserlöslichkeit verleiht, oder einer Stelle, die in eine Stelle umwandelbar ist, die der Verbindung Wasserlöslichkeit verleiht.
Es ist bevorzugt, dass jedes von L2a und L2b eine Verknüpfungsgruppe enthält, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer Aminobindung bzw. einem Aminobindeglied ("amino bonding"), einer Esterbindung, einer Etherbindung, einer Thioetherbindung, einer Diimidbindung, einer Thiodiimidbindung, einer Thioamidbindung, einer Iminobindung, einer Carbonylbindung, einer Thiocarbonylbindung und einer 1,4-Piperazinylbindung, wobei jede Bindung bzw. jedes Bindeglied möglicherweise einen oder mehrere Substituenten hat. Am stärksten bevorzugt ist es, dass jedes von L2a und L2b -NHCO- oder -CONH- enthält.
Die Erfindung liegt auch in einem elektrisch leitenden "Threading"-Interkalator mit Oxidations-Reduktions-Aktivität, der durch die zuvor genannte Formel (2) dargestellt wird.
Die Erfindung liegt weiterhin in einem elektrochemischen Verfahren zur Detektion von Oligonucleotidproben oder Polynucleotidproben, welches den oben genannten erfindungsgemäßen "Threading"-Interkalator einsetzt.
Die Erfindung liegt weiterhin in einem Verfahren zum elektrochemischen Detektieren von Oligonucleotidproben oder Polynucleotidproben, die zu einer Gruppe von Sondenmolekülen von Nucleotidderivaten oder deren Analoga, die auf einem Elektrodensubstrat fixiert sind, komplementär sind, umfassend die Schritte:
In-Kontakt-Bringen der Gruppe von Sondenmolekülen mit den Oligonucleotidproben oder Polynucleotidproben in einem wässrigen Medium in Gegenwart eines erfindungsgemäßen "Threading"-Interkalators, um durch Hybridisierung einen Komplex der Gruppe von Sondenmolekülen und der Oligonucleotidproben oder Polynucleotidproben zu bilden, in welchen der "Threading"-Interkalator interkaliert ist;
und
Detektieren eines elektrischen Stroms, der durch Anlegen eines elektrischen Potentials an das Elektrodensubstrat erzeugt wird.
Die Erfindung liegt weiterhin in einem Verfahren zum elektrochemischen Detektieren von Oligonucleotidproben oder Polynucleotidproben, die zu einer Gruppe von Sondenmolekülen von Nucleotidderivaten oder deren Analoga, die auf einem Elektrodensubstrat fixiert sind, komplementär sind, umfassend die Schritte:
In-Kontakt-Bringen der Gruppe von Sondenmolekülen mit den Oligonucleotidproben oder Polynucleotidproben in einem wässrigen Medium, um durch Hybridisierung einen Komplex der Gruppe von Sondenmolekülen und der Oligonucleotidproben oder Polynucleotidproben zu bilden;
In-Kontakt-Bringen eines "Threading"-Interkalators gemäß Anspruch 15 mit dem gebildeten Komplex, um den Interkalator in den Komplex zu interkalieren;
und
Detektieren eines elektrischen Stroms, der durch Anlegen eines elektrischen Potentials an das Elektrodensubstrat erzeugt wird.
In den oben genannten Verfahren ist es vorteilhaft, dass das elektrische Potential, das an das Elektrodensubstrat angelegt wird, im Bereich von 100 bis 400 mV ist.
Die Erfindung liegt weiterhin in einem Kit zum elektrochemischen Detektieren von Oligonucleotidproben oder Polynucleotidproben, die zu einer Gruppe von Sondenmolekülen von Nucleotidderivaten oder deren Analoga, die auf einem Elektrodensubstrat fixiert sind, komplementär sind, der ein Elektrodensubstrat mit einer Gruppe von Sondenmolekülen von Nucleotidderivaten oder deren Analoga, fixiert an sein Substrat, und einen erfindungsgemäßen "Threading"-Interkalator umfasst. Es ist bevorzugt, dass die Nucleotidderivate und ihre Analoga Oligonucleotide, Polynucleotide oder Peptid-Nucleinsäuren sind.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung gingen davon aus, dass das hohe elektrische Potential in der elektrochemischen Detektion von DNA-Fragment-Proben unter Verwendung des konventionellen elektrisch leitenden "Threading"-Interkalators erforderlich ist, weil sich das konjugierte System, das in der elektrisch leitenden Gruppierung, wie einer Ferrocengruppierung, vorhanden ist, auf die π-Elektronen-Bindungsgruppe ("π electron-bonding group) der Amidgruppe (d.h. -NHCO-) erstreckt, so dass die Elektronen dichte von Elektronen, die sich in dem konjugierten System der Ferrocengruppierung bewegen, abnimmt.
Basierend auf dieser Annahme synthetisierten die Erfinder einen neuen elektrisch leitenden "Threading"-Interkalator, in welchem das konjugierte System der elektrisch leitenden Ferrocengruppierung unabhängig von der π-Elektronen-Bindungsgruppe der Amidgruppe vorliegt, und sie untersuchten die Funktion des neu synthetisierten Interkalators in der elektrochemischen Detektion von DNA-Fragment-Proben. Es wurde bestätigt, dass der neu synthetisierte elektrisch leitende Interkalator eine Spitze des elektrischen Stroms bei einem erwartet niedrigen elektrischen Potential in der elektrochemischen Detektion ergab.
Die vorliegende Erfindung wurde bei der oben genannten Entdeckung gemacht.
Wie hierin vorstehend beschrieben, haben die Verbindungen, die als elektrisch leitende "Threading"-Interkalatoren bei der elektrochemischen Detektion von DNA-Fragment-Proben dienen, die Formel (2): Ea – L1a – L2a – X – L2b – L1b – Eb (2)
In der Formel (2) stellt X eine divalente cyclische Gruppe dar, die einen oder zwei Substituenten haben kann.
Die divalente cyclische Gruppe ist vorzugsweise eine ebene cyclische Gruppe. Beispiele der divalenten cyclischen Gruppen schließen eine Naphthalindiimidgruppe mit zwei Bindungsstellen an ihren zwei Stickstoffatomen, eine Anthra cengruppe mit zwei Bindungsstellen an der 2- und der 6-Position oder der 1- und der 5-Position (vorzugsweise der 2- und der 6-Position), eine Anthrachinongruppe mit zwei Bindungsstellen in der gleichen Weise wie bei der Anthracengruppe, eine Fluorengruppe mit zwei Bindungsstellen an der 2- und der 6-Position, eine Biphenylengruppe mit zwei Bindungsstellen an der 2- und der 6-Position, eine Phenantholengruppe mit zwei Bindungsstellen an der 2- und der 7-Position und eine Pyrengruppe mit zwei Bindungsstellen an der 2- und der 7-Position ein. Bevorzugt ist eine Naphthalindiimidgruppe mit zwei Bindungen an den Stickstoffatomen. Der Substituent kann ein Halogenatom (z.B. F, Cl oder Br) oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, wie Methyl, Ethyl oder n-Propyl sein.
Die Stelle, die in eine Stelle umwandelbar ist, die der Verbindung Wasserlöslichkeit verleiht, bedeutet eine derartige Stelle, die z.B. durch Kontakt mit einer wässrigen sauren Lösung, wie einer wässrigen Schwefelsäure, in eine Stelle umgewandelt werden kann, die der Verbindung Wasserlöslichkeit verleiht. Zum Beispiel kann eine Iminogruppe mit einem Methylsubstituenten durch Kontakt mit Schwefelsäure in eine Stelle mit einer Sulfatgruppe umwandelt werden. Die so gebildete Stelle mit einer Sulfatgruppe verleiht der Verbindung eine notwendige Wasserlöslichkeit. Die Stelle kann eine elektrische Ladung aufweisen.
Die Wasserlöslichkeit ist für die Verbindung in dem Fall erforderlich, dass die Verbindung in einem wässrigen Medium als der "Threading"-Interkalator wirkt.
Beispiele der Substituenten für L1a und L1b schließen Hydroxyl, Halogen, Carboxyl, Amino, Cyano, Nitro, Formyl, Formylamino, Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Alkylamino mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, halogeniertes Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Cycloalkylamino mit 5 bis 7 Kohlenstoffatomen, Dialkylamino mit 2 bis 12 Kohlenstoffatomen, Aryl mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen, Aralkyl mit ? bis 18 Kohlenstoffatomen, welches Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen enthält, Aralkylamino mit 7 bis 18 Kohlenstoffatomen, welches Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen enthält, Alkanoyl mit 2 bis 7 Kohlenstoffatomen, Alkanoylamino mit 2 bis 7 Kohlenstoffatomen, N-Alkanoyl-N-alkylamino mit 3 bis 10 Kohlenstoffatomen, Aminocarbonyl, Alkoxycarbonyl mit 2 bis 7 Kohlenstoffatomen, heterocyclischen Ring mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen, der 1 bis 4 Heteroatome, wie S, N oder 0 hat, und Aryl mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen in seiner Ringstruktur, das 1 bis 5 Substituenten, wie Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Alkoxy mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder Halogen haben kann, ein. Die Anzahl der Substituenten ist vorzugsweise in dem Bereich von 1 bis 12, stärker bevorzugt 1 bis 3, wenn die Hauptkette eine Alkylengruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist. Die Anzahl der Substituenten ist vorzugsweise in dem Bereich von 1 bis 10, vorzugsweise 1 bis 3, wenn die Hauptkette eine Alkenylengruppe mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen ist.
Jedes von L2a und L2b ist vorzugsweise eine Verknüpfungsgruppe, enthaltend eine oder mehrere Gruppen, wie eine Aminobindung, eine Esterbindung, eine Etherbindung, eine Thioetherbindung, eine Diimidbindung, eine Thiodiimidbindung, eine Thioamidbindung, eine Iminobindung, eine Carbonylbindung, eine Thiocarbonylbindung oder eine 1,4-Piperazinyl bindung, wobei jede Bindung bzw. jedes Bindeglied möglicherweise einen oder mehrere Substituenten hat. Jedes von L2a und L2b enthält vorzugsweise -NHCO- oder -CONH-.
Beispiele von Substituenten für L2a und L2b schließen Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen (z.B. Methyl oder Ethyl), Acyl mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen (z.B. Acetyl), Aryl mit 6 bis 20 Kohlenstoffatomen (z.B. Phenyl oder Naphthyl) und Aralkyl mit 7 bis 23 Kohlenstoffatomen, das Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen aufweist (z.B. Benzyl), ein.
Wenn L2a oder L2b eine Iminobindung enthält, enthält die Iminobindung vorzugsweise einen Methylsubstituenten. Demgemäß ist jedes von L2a und L2b vorzugsweise N-Methyl-di(n-propylenyl)imino oder 1,4-Di(n-propylenyl)piperazinyl. Am stärksten bevorzugt ist N-Methyl-di(n-propylenyl)imino.
Jedes von Ea und Eb hat Oxidations-Reduktions-Aktivität, so dass jedes elektrische Leitfähigkeit aufweist.
Jedes von Ea und Eb ist eine Metallocengruppierung, die einen oder mehrere Substituenten haben kann. Bevorzugt sind Ferrocengruppierungen, die einen oder mehrere Substituenten haben können. Beispiele der substituierten Ferrocengruppierungen sind unten stehend veranschaulicht.
In den oben veranschaulichten Ferrocengruppierungen können die Substituenten in anderen Positionen auf der Cyclopentadienylgruppe vorhanden sein.
Die erfindungsgemäße Verbindung, die vorteilhaft als ein elektrisch leitender "Threading"-Interkalator eingesetzt wird, kann durch ein Verfahren hergestellt werden, das dem Verfahren ähnlich ist, das in der zuvor genannten Veröffentlichung der ungeprüften japanischen Patentanmeldung Nr. H9-288080 beschrieben ist.
Alternativ kann die erfindungsgemäße Verbindung effizient aus einer bekannten Diaminverbindung in Übereinstimmung mit dem folgenden Syntheseweg synthetisiert werden:
Der oben veranschaulichte Syntheseweg umfasst die drei Reaktionen <a>, <b> und <c>.
Die an dem Syntheseweg beteiligten Reaktionen werden unten stehend erklärt.
Die Verbindung (4), nämlich A-NH-R-NH₂, kann aus einem bekannten Diamin (5) durch das bekannte Verfahren, das in Green T.W., P.G.M., Protective Groups in Organic Synthesis (2. Auflage, Wiley, New York, 1991, 315-345, 349-359) beschrieben ist, synthetisiert werden. "A" ist vorzugsweise Acyl mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen, Alkoxycarbonyl mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen, Benzoyl, das einen oder mehrere Substituenten haben kann, oder Benzyloxycarbonyl, das ebenfalls einen oder mehrere Substituenten haben kann. Bevorzugt sind Acetyl, t-Butylcarbonyl (d.h. Pivaloyl), t-Butoxycarbonyl oder Benzyloxycarbonyl mit möglicherweise einem oder mehreren Substituenten. Beispiele der Substituenten, die möglicherweise an das Benzoyl oder Benzyloxycarbonyl gebunden sind, schließen Halogenatome, Hydroxyl, Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen und Alkoxy mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ein. Die Anzahl der Substituenten ist vorzugsweise in dem Bereich von 1 bis 5. Am stärksten bevorzugt ist 1.
Das geschützte Amin (4) kann allgemein durch die Reaktion der Diaminverbindung (5) mit einem Säurehalogenid oder einem Säureanhydrid mit einer Gruppierung von A erhalten werden. Bevorzugte Beispiele der Säurehalogenide und Säureanhydride sind reaktive Reagenzien mit einer freisetzbaren Gruppe, wie Benzotriazol-1-yloxy (OBt), Succinimidyloxy (OSu) oder 3-Thiazolidin-2-thion. Das bevorzugte Reagenz ist 3-Benzyloxycarbonyl-1,3-thiazolin-2-thion. Das Diamin (5) wird im Überschuss ("excessive amount") verglichen mit dem oben genannten reaktiven Reagenz, wie der 3- bis 10-fachen Molmenge, eingesetzt.
Die Reaktion kann in Gegenwart einer organischen Base oder einer anorganischen Base durchgeführt werden. Beispiele organischer Basen schließen Pyridin, Triethylamin und Diisopropylethylamin ein. Beispiele anorganischer Basen schließen Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Natriumhydrogencarbonat, Natriumcarbonat und Kaliumcarbonat ein. Die Base wird vorzugsweise in einer Molmenge ("molar amount") von 0,1 bis zu einem Überschuss, stärker bevorzugt 1 bis 10 Molmengen pro 1 Molmenge des reaktiven Reagenzes, wie eines Säurehalogenids, eingesetzt.
Die Reaktion wird vorzugsweise in einem Lösungsmittel durchgeführt, aber die Reaktion kann in Abwesenheit eines Lösungsmittels durchgeführt werden. Das Lösungsmittel sollte alles oder einen Teil der reaktiven Verbindungen und der Reaktionsprodukte lösen, und es ist nicht an der Reaktion beteiligt. Beispiele solcher Lösungsmittel schließen Alkohole (z.B. Methanol, Ethanol, Isopropylalkohol und Ethylenglykol), Amide (z.B. Dimethylformamid, Dimethylacetamid, Acetamid und N-Methylpyrrolidon), Nitrile (z.B. Acetonitril und n-Butyronitril), Ether (z.B. Ethylenglykolmonomethylether, Ethylenglykolmonoethylether, Tetrahydrofuran und Dioxan), Dimethylsulfoxid, Sulforan und Wasser ein. Die Lösungsmittel können in Kombination eingesetzt werden.
Die Reaktion kann unter kühlenden Bedingungen oder unter erwärmten Bedingungen durchgeführt werden. Allgemein wird die Reaktion bei einer Temperatur im Bereich von –50°C bis 150°C, vorzugsweise –10°C bis 100°C, durchgeführt.
Die Verbindung (3), d.h. A-NH-R-NHCO-Q-E, kann hergestellt werden, indem die Amin-Schutzverbindung (4) mit MO₂C-Q-E oder M¹OC-Q-E --- Reaktion <a> kondensiert wird. M ist Wasserstoff, Alkalimetall (z.B. Na, K) und ein Imid mit einer Bindungsstelle an dem Stickstoffatom, wie Succinimid, Phthalimid oder Glutarimid. M¹ ist eine aktive Gruppe, wie Halogen, -SO₂Cl, oder eine Gruppe, entsprechend dem unten genannten Reaktionsintermediat mit dem Kondensationsreagenz.
Die Reaktion <a> ist eine Kondensationsreaktion zwischen einer Aminogruppe und einer Carboxylgruppe. Die Kondensationsreaktion kann in der in Larock R.C., Comprehensive Organic Transformations (VCH, New York, 1989, 972-97) durchgeführt werden. Die Kondensationsreaktion wird vorzugsweise unter Verwendung eines Kondensationsmittels durchgeführt. Das Kondensationsmittel ist vorzugsweise 1,3-Dicyclohexylcarbodiimid oder 1-Ethyl-3-(3'-dimethylaminopropyl)carbodiimid. Die Reaktion kann vorzugsweise in Gegenwart eines Lösungsmittels durchgeführt werden. Das Lösungsmittel sollte alles oder einen Teil der reaktiven Verbindungen und der Reaktionsprodukte lösen und sollte nicht an der Reaktion beteiligt sein. Beispiele verwendbarer Lösungsmittel schließen zusätzlich zu den für die zuvor genannte Reaktion <a> beschriebenen Lösungsmitteln Halogenatome enthaltende Lösungsmittel (z.B. Dichlormethan, Chloroform und 1,2-Dichlorethan) und Ester (z.B. Acetatester) ein. Die organischen Lösungsmittel können in Kombination verwendet werden. Wasser und ein Gemisch aus Wasser und dem organi schen Lösungsmittel können ebenfalls vorteilhaft eingesetzt werden. Bei der Reaktion wird die Carbonsäure (6) vorzugsweise im Überschuss gegenüber der Verbindung (4) in 1 bis 2 Molmengen eingesetzt. Zu der Verbindung (4) wird vorzugsweise die Verbindung M¹OC-Q-E im Überschuss, wie 1 bis 3 Molmengen, zugefügt.
Wenn 1,3-Dicyclohexylcarbodiimid oder 1-Ethyl-3-(3'-dimethylaminopropyl)carbodiimid als Kondensationsmittel eingesetzt wird, kann ein saures oder basisches Additiv in Kombination (damit) eingesetzt werden. Bevorzugte saure Additive sind N-Hydroxysuccinimid, N-Hydroxybenzotriazol und 3,4-Dihydroxy-4-oxo-1,2,3-benzotriazin. Bevorzugte basische Additive sind tertiäre Amine (z.B. Triethylamin), Pyridin und 4-Dimethylaminopyridin. Das Additiv kann im Überschuss wie 0,1 Mol oder in extremem Überschuss, vorzugsweise 1 bis 3 Molmengen pro 1 mol des Kondensationsmittels, eingesetzt werden. Die Reaktion kann unter kühlenden Bedingungen oder erwärmten Bedingungen durchgeführt werden. Allgemein wird die Reaktion bei einer Temperatur in dem Bereich von –50°C bis 150°C, vorzugsweise –10°C bis 100°C, stärker bevorzugt 0 bis 50°C, durchgeführt.
Die Reaktion <b> wird zur Entfernung der Schutzgruppe der Aminogruppe durchgeführt. Die Reaktion zum Entfernen der Schutzgruppe kann unter Bedingungen durchgeführt werden, die abhängig von der Beschaffenheit der Schutzgruppe A ausgewählt werden. Allgemein werden die Reaktionsbedingungen eingesetzt, die in dem zuvor genannten Artikel "Protective Groups in Organic Synthesis" beschrieben sind. Bevorzugt ist ein Verfahren unter Verwendung von Iodtrimethylsilan. Die Reaktion wird vorzugsweise in einem Lösungsmittel durchgeführt, kann aber in Abwesenheit eines Lösungsmittels ausgeführt werden. Das Lösungsmittel sollte alles oder einen Teil der reaktiven Verbindungen und der Reaktionsprodukte lösen und sollte nicht an der Reaktion beteiligt sein. Beispielsweise von Lösungsmitteln schließen halogenierte Lösungsmittel (z.B. Dichlormethan und Dichlorethan), Nitrile (z.B. Acetonitril und n-Butyronitril), Ether (z.B. Tetrahydrofuran und Dioxan), aromatische Lösungsmittel (z.B. Toluol und Benzol) und ihre Gemische ein. In der Reaktion wird vorzugsweise ein Überschuss an Iodtrimethylsilan [Überschuss, verglichen mit der Verbindung (3)], wie 1 bis 10 Molmengen, eingesetzt. Die Reaktion kann unter kühlenden Bedingungen oder erwärmten Bedingungen durchgeführt werden. Allgemein wird die Reaktion bei einer Temperatur in dem Bereich von –50°C bis 150°C, vorzugsweise –10°C bis 100°C, stärker bevorzugt 0 bis 50°C, durchgeführt.
Die Reaktion <c> ist eine Reaktion zum Kondensieren unter Dehydratisierung der Verbindung (2) mit dem Naphthalindiimid-Kern (7) unter Bildung von Seitenketten, um die Verbindung (1) zu ergeben. Das Naphthalindiimid kann vorteilhaft aus 1,4,5,8-Naphthalintetracarbonsäuredianhydrid hergestellt werden. Die Reaktion kann in einem Lösungsmittel durchgeführt werden, das alles oder einen Teil der reaktiven Verbindungen und der Reaktionsprodukte lösen sollte und das nicht an der Reaktion beteiligt sein sollte. Die meisten der zuvor genannten Lösungsmittel sind einsetzbar. In der Reaktion werden vorzugsweise zwei oder mehr Moläquivalente ("equivalent moles") der Verbindung für ein Mol 1,4,5,8-Naphthalintetracarbonsäuredianhydrid eingesetzt. Einige Lösungsmittel können in einer Menge von weniger als den zwei Moläquivalenten eingesetzt werden. Die Reaktion kann unter kühlenden Bedingungen oder erwärmten Bedingungen durchgeführt werden. Vorzugsweise wird die Reaktion bei einer Temperatur in dem Bereich von 0°C bis zur Rückflusstemperatur des eingesetzten Lösungsmittels durchgeführt.
Die elektrochemischen Verfahren zum Detektieren von Nucleinsäureproben gemäß der Erfindung werden weiterhin unten stehend beschrieben.
Das Verfahren der Erfindung zum elektrochemischen Detektieren von Oligonucleotidproben oder Polynucleotidproben, die zu einer Gruppe von erfindungsgemäßen Sondenmolekülen von Nucleotidderivaten oder deren Analoga, die auf einem Elektrodensubstrat fixiert sind, komplementär sind, umfasst die folgenden Schritte:
In-Kontakt-Bringen der Gruppe von Sondenmolekülen mit den Oligonucleotidproben oder Polynucleotidproben in einem wässrigen Medium in Gegenwart eines erfindungsgemäßen "Threading"-Interkalators, um durch Hybridisierung einen Komplex der Gruppe von Sondenmolekülen und der Oligonucleotidproben oder Polynucleotidproben zu bilden, in welchen der "Threading"-Interkalator interkaliert ist;
und
Detektieren eines elektrischen Stroms, der durch Anlegen eines elektrischen Potentials an das Elektrodensubstrat erzeugt wird.
Alternativ umfasst das erfindungsgemäße Verfahren die folgenden Schritte:
In-Kontakt-Bringen der Gruppe von Sondenmolekülen mit den Oligonucleotidproben oder Polynucleotidproben in einem wässrigen Medium, um durch Hybridisierung einen Komplex der Gruppe von Sondenmolekülen und der Oligonucleotidproben oder Polynucleotidproben zu bilden;
In-Kontakt-Bringen eines erfindungsgemäßen "Threading"-Interkalators mit dem gebildeten Komplex, um den Interkalator in den Komplex zu interkalieren;
und
Detektieren eines elektrischen Stroms, der durch Anlegen eines elektrischen Potentials an das Elektrodensubstrat erzeugt wird.
Die Elektrode, die zum Fixieren von Sondenmolekülen eingesetzt wird, sollte als solches die Sondenmoleküle, um sie auf der Oberfläche der Elektrode zu fixieren, aufnehmen. Bevorzugte Elektrodenmaterialien sind Gold, Glaskohlenstoff ("glassy carbon") und Kohlenstoff. Bei der praktischen Verwendung des erfindungsgemäßen Detektionssystems wird vorzugsweise eine Anzahl von Elektroden unter Bildung eines analytischen Chips kombiniert.
Das Sondenmolekül, welches ein einzelsträngiges DNA-Fragment ist, kann aus DNA oder ihrem Fragment erhalten werden, welche/s durch Extraktion aus einem lebenden Körper, Spaltung durch ein Restriktionsenzym, Abtrennung durch Elektrophorese und Denaturierung durch Hitzebehandlung oder Alkalibehandlung erhalten wird. Das einzelsträngige Oligonucleotid kann chemisch synthetisiert werden. In jedem Fall ist es bevorzugt, dass das einzelsträngige Sondenoligonucleotid, wie ein DNA-Fragment, für die Sondenmoleküle zuvor bezüglich der Basensequenz gemäß der bekannten Verfahren analysiert wird.
Das Sondenmolekül wird dann auf einer Elektrode fixiert. Das Fixierungsverfahren ist bereits bekannt. Zum Beispiel wird eine Thiolgruppe an das 5'- oder 3'-Ende (5'-Ende ist bevorzugt) des Sondenmoleküls, wie Oligonucleotid oder Polynucleotid, gebunden und das gebundene Thiol koordiniert Goldatome der Elektrode. Das Verfahren zum Einbauen einer Thiolgruppe in die DNA ist in M. Maeda et al., Chem. Lett., 1805-1806 (1994) und A. Connolly, Nucleic Acids Res., 13, 4484 (1985) beschrieben.
Bei dem Fixierungsverfahren wird das Sondenmolekül mit dem Thiolende auf die Goldelektrode getropft und dann wird das gewünschte Sondenmolekül auf der Elektrode fixiert, nachdem es für wenige Stunden bei geringer Temperatur stehen gelassen wurde.
Bei der Verwendung einer Glaskohlenstoff-Elektrode wird die Elektrode mittels Kaliumpermanganat unter Erzeugung von Carboxylgruppen auf der Oberfläche der Elektrode oxidiert. Auf die Oberfläche mit den Carboxylgruppen wird das Sondenmolekül mit dem Thiolende getropft, so dass eine Amidbindung gebildet wird, um das Sondenmolekül auf der Oberfläche der Glaskohlenstoff-Elektrode zu fixieren. Details dieses Verfahrens sind in K. M. Millan et al., Analytical Chemistry, 65, 2317-2323 (1993) beschrieben.
Die Hybridisierung wird in Gegenwart des erfindungsgemäßen elektrisch leitenden "Threading"-Interkalators durchgeführt, der vorzugsweise in einer Konzentration von einige nM bis zu einige mM verwendet wird. Der Interkalator kann die Hybridisierung zwischen dem Sondenoligonucleotid und einem Proben-DNA-Fragment beschleunigen und inseriert per se in die Komplexstruktur der hybridisierten DNA, so dass die hybridisierte DNA stabilisiert wird. Somit kann der produzierte Komplex des Interkalators und der Hybrid-DNA als ein Polymer mit einer Anzahl von Ferrocengruppierungen an seiner Seite verstanden werden. Die so angeordneten Ferrocengruppierungen dienen dazu, die Elektronenübertragung zwischen der Elektrode, auf der die Sondenmoleküle fixiert sind, und einer Gegenelektrode, die in einer wässrigen Lösung platziert ist, in der die Detektionsverfahren durchgeführt werden, zu unterstützen.
Die Fixierung der DNA-Fragment-Probe an dem Sondenmolekül der Elektrode kann durch Anlegen eines elektrischen Potentials an die Elektrode des DNA-Chips detektiert werden. Bei der Detektion wird eine Gegenelektrode eingesetzt.
Hinsichtlich des elektrischen Potentials, das an die Elektrode angelegt wird, gibt es keine speziellen Beschränkungen. Jedoch ergibt die Hybridstruktur mit dem erfindungsgemäßen elektrisch leitenden "Threading"-Interkalator eine Spitze des elektrischen Stroms sogar, wenn ein niedriges elektrisches Potential, wie 400 mV oder weniger, angelegt wird. Demgemäß ist es vorteilhaft, ein elektrisches Potential in dem Bereich von 100 bis 400 mV, insbesondere 200 bis 400 mV, zum Anlegen an die Elektrode des DNA-Chips einzusetzen, wenn das elektrochemische Detektionsverfahren durchgeführt wird.
Der erfindungsgemäße "Threading"-Interkalator kann auch vorteilhaft zum Detektieren von DNA-Fragment-Proben einsetzbar sein, die teilweise komplementär zu den Sondenmolekülen sind. Derartige Fragmentproben werden allgemein als "Mismatch-Fragment" bzw. "nicht passendes Fragment" bezeichnet. Die Detektion des Mismatch-Fragments kann durch Vergleichen der Stärke des Spitzenstroms, der bei der Detektion des möglicherweise nicht passenden DNA-Fragments erhalten wurde, mit der Stärke des entsprechenden Spitzenstroms, der bei der Detektion eines vollständig komplementären DNA-Fragments (d.h. vollständig passendes ("Full-Match")-Fragment) erhalten wurde, durchgeführt werden.
Die vorliegende Erfindung wird weiterhin durch die folgenden Beispiele beschrieben.
[Herstellung des erfindungsgemäßen "Threading"-Interkalators]
Herstellung von N,N'-Bis(7-ferrocenacetamido-4-methyl-4-azaheptyl)naphthalinimid
(1) Herstellung von N-1-Benzyloxycarbonyl-1,7-diamino-4-methylazaheptan
In Dichlormethan (400 mL) wurde Di(3-aminopropyl)-methylamin (73,0 g, 500 mmol) gelöst. Zu der resultierenden Lösung wurde tropfenweise eine Lösung von 3-Benzyloxycarbonyl-1,3-thiazolidin-2-thion (12,8 g, 50 mmol, Synthesis, 1990, 27) in Dichlormethan (100 mL) zugegeben. Das Gemisch wurde 3 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Das resultierende Präzipitat wurde durch Filtration entfernt. Zu dem Filtrat wurden Ethylacetat und Wasser hinzugefügt. Das wässrige Gemisch wurde dann zweimal mit Ethylacetat extrahiert. Die Ethylacetatanteile wurden vereinigt und nacheinander mit Wasser und gesättigter wässriger Natriumchloridlösung gewaschen. Der gewaschene Ethylacetatanteil wurde dann einer Extraktion mit zwei Portionen wässriger 1 N Salzsäure unterzogen. Die erhaltenen wässrigen Anteile wurden vereinigt und mit Ethylacetat gewaschen. Zu dem wässrigen Anteil wurde wässrige 6 N Natriumhydroxidlösung unter Kühlen zugegeben, um den wässrigen Anteil auf pH 9-10 einzustellen. Die alkalische Lösung wurde mit Ethylacetat extrahiert. Der Ethylacetatanteil wurde mit gesättigter wässriger Natriumchloridlösung gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter reduzierten Druck gesetzt, um das Lösungsmittel abzudestillieren, um 9,4 g des gewünschten Produkts zu erhalten, Ausbeute 66 %.
¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ:
1.58-1.72 (4H, m), 2.20 (3H, s), 2.35-2.45 (4H, m), 2.64 (2H, t), 3.23-3.32 (2H, m), 5.15 (2H, s), 7.22-7.45 (5H, m).
MS:FAB 280 (M⁺ + 1) (Matrix: M-Nitrobenzol)
(2) Herstellung von N-1-Benzyloxycarbonyl-1-amino-7-ferrocenacetamido-4-methyl-4-azaheptan
Das in (1) oben erhaltene N-1-Benzyloxycarbonyl-1,7-diamino-4-methylazaheptan (3,0 g, 11 mmol) wurde in Dichlormethan (30 mL) gelöst. Zu der resultierenden Lösung wurden Ferrocen-Essigsäure (2,7 g, 11 mmol), Pyridin (2 mL) und Ethyl-N,N'-dimethylaminopropylcarbodiimid (2,3 g, 12 mmol) hinzugefügt. Das Gemisch wurde dann 3 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Zu dem Reaktionsgemisch wurde eine wässrige Ammoniumchloridlösung hinzugefügt. Das Gemisch wurde zweimal mit Ethylacetat extrahiert, und die Ethylacetatanteile wurden vereinigt. Der Ethylacetatanteil wurde mit gesättigter wässriger Natriumchloridlösung gewaschen und unter verminderten Druck gesetzt, um das Lösungsmittel abzudestillieren. Das verbleibende braune Öl wurde mittels Säulenchromatographie (Säule: Aluminiumoxid, Eluent: Chloroform/Methanol = 20/1) weiter verarbeitet. Das erhaltene kristalline Produkt wurde mit einem Gemisch aus Hexan und Ethylacetat unter Erhalt von 2,6 g des gewünschten Produkts (Ausbeute: 91 %) als orange-gefärbtes kristallines Produkt gewaschen.
¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ:
1.50-1.72 (4H, m), 2.08 (3H, s), 2.20-2.33 (4H, m), 3.15-3.30 (4H, m), 3.34 (2H, s), 4.15 (5H, s), 4.16 (4H, s), 5.15 (2H, s), 5.54 (1H, bs), 6.44 (1H, bs), 7.32-7.48 (5H, m).
(3) Herstellung von 1-Amino-7-ferrocenacetamido-4-methyl-4-azaheptan
In Acetonitril (30 mL) wurde das in (2) oben erhaltene N-1-Benzyloxycarbonyl-1-amino-7-ferrocenacetamido-4-methyl-4-azaheptan (1,6 g, 3,0 mmol) gelöst. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur gerührt, und zu diesem gerührten Gemisch wurde tropfenweise Trimethylsilaniodid (1,25 mL, 8,8 mmol) hinzugefügt. Nach 5 Minuten wurden wässrige 1 N Salzsäure und Ethylacetat zu dem Reaktionsgemisch hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde dann dreimal mit wässriger 1 N Salzsäure extrahiert. Der wässrige Anteil wurde mit Ethylacetat gewaschen und dann mit Eis gekühlt. Zu dem gekühlten wässrigen Anteil wurde wässrige 2 N Kaliumhydroxidlösung zugegeben, um die wässrige Lösung auf pH 10 einzustellen. Die wässrige alkalische Lösung wurde zweimal mit Chloroform extrahiert. Der Chloroformanteil wurde mit gesättigter wässriger Natriumchloridlösung gewaschen und unter verminderten Druck gesetzt, um das Lösungsmittel abzudestillieren, unter Erhalt von 1,0 g des gewünschten Produkts (Ausbeute: 70 %) als braunes kristallines Produkt.
¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ:
1.48-1.62 (4H, m), 2.09 (3H, s), 2.25-2.35 (4H, m), 2.71 (2H, t), 3.22-3.33 (2H, m), 3.35 (2H, s), 4.1-4.21 (9H, m), 6.75 (1H, bs).
(4) Herstellung von N,N'-Bis(7-ferrocenacetamido-4-methyl-4-azaheptyl)naphthalindiimid
In Tetrahydrofuran (50 mL) wurde das in (3) oben erhaltene 1-Amino-7-ferrocenacetamido-4-methyl-4-azaheptan (0,95 g, 2,5 mmol) gelöst. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur gerührt. Zu dem gerührten Gemisch wurde 1,4,5,8-Naphthalintetracarbonsäuredianhydrid (0,3 g, 1,1 mmol) hinzugefügt. Das Gemisch wurde dann 7 Stunden lang unter Rückfluss erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert und mit Chloroform gewaschen. Die organischen Anteile wurden vereinigt und unter verminderten Druck gesetzt. Der resultierende Rückstand wurde mittels Säulenchromatographie (Säule: Aluminiumoxid, Eluent: Chloroform/Methanol = 15/1) weiter verarbeitet. Das erhaltene kristalline Produkt wurde unter Erhalt von 0,32 g des gewünschten Produkts (Ausbeute: 30 %) als braunes kristallines Produkt mit Ethylacetat gewaschen.
¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ:
1.56-1.70 (8H, m), 1.78-1.92 (4H, m), 2.12 (6H, s), 2.33-2.46 (8H, m), 3.30-3.42 (4H, m), 3.36 (4H, s), 4.13 (10H, s), 4.20 (8H, s), 6.85 (2H, bs), 8.80 (4H, s).
MS:FAB 975 (M + H) (Matrix: m-Nitrobenzol)
[Beispiel 1] – Detektion eines Hybrid-DNA-Fragments
(1) Herstellung eines elektrochemischen analytischen Elements
Auf einer Goldelektrode (Oberflächenfläche: 2,25 mm²) wurden 2 μL einer wässrigen Lösung, enthaltend 100 picomol/μL T₂₀ (Thymin-20-mere mit einer Aminohexylgruppe an ihrem 5'- Ende) aufgetüpfelt. Die aufgetüpfelte Lösung wurde 1 Stunde lang bei Raumtemperatur stehen gelassen und das nicht fixierte T₂₀ wurde ausgewaschen, und es wurde unter Erhalt eines elektrochemischen analytischen Elements getrocknet. Die Herstellung von T₂₀ und seine Fixierung wurden in der Weise durchgeführt, die in der zuvor genannten Veröffentlichung der ungeprüften japanischen Patentanmeldung Nr. H9-288080 beschrieben ist.
(2) Herstellung von Ferrocen-markiertem Oligonucleotid
Eine Probe aus Adenin-20-meren (dA₂₀) wurde in der Weise hergestellt, wie es in der oben genannten Veröffentlichung beschrieben ist, und sie wurde als DNA-Fragment-Probe eingesetzt.
(3) Detektion des Hybrid-DNA-Fragments
Auf das in (1) oben hergestellte analytische Element wurden 2 μL eines Tris-Puffers (10 mM, pH 7,5), enthaltend das in (2) oben erhaltene dA₂₀, aufgetüpfelt. Das analytische Element wurde dann 20 Minuten lang zum Durchführen der Inkubation bei 25°C gehalten. Das inkubierte Element wurde mit einer wässrigen Lösung von 0,1 M Natriumdihydrogenphosphat-Dinatriumhydrogenphosphat (pH 7,0) gewaschen, um das nicht fixierte dA₂₀ zu entfernen.
Das so behandelte Element wurde in einem 0,1 M Kaliumchlorid-0,1 M Essigsäure-Puffer (pH 5,6), enthaltend 50 μM des in dem zuvor genannten Herstellungsbeispiel hergestellten "Threading"-Interkalators, platziert und einer differenziellen Pulsvoltammetrie (DVP) in dem angelegten Spannungs bereich von 100 bis 700 mV, Impulsschwingung ("pulse oscillation") 50 mV, Impulsbreite 50 ms und einer Scanngeschwindigkeit von 100 mV/s unterzogen. Bei dem reagierenden elektrischen Strom bzw. Antwortstrom wurde ein Spitzenwert bei 260 mV detektiert.
Zum Erhalten eines Kontrollstromes wurden die gleichen Vorgehensweisen mit der Ausnahme des Einsatzes des Interkalators wiederholt.
Der Antwortstrom, der bei 260 mV unter Verwendung des erfindungsgemäßen Interkalators erhalten wurde, ist so hoch wie 36 %, verglichen mit dem Kontrollstrom.
[Vergleichsbeispiel 1] – Detektion des Hybrid-DNA-Fragments
Die gleichen Vorgehensweisen wie in Beispiel 1 wurden mit der Ausnahme des Einsatzes des konventionellen Interkalators, der in der zuvor genannten Veröffentlichung der ungeprüften japanischen Patentanmeldung H9-288080 beschrieben ist, wiederholt. Bei dem Antwortstrom wurde ein Spitzenwert bei 460 mV detektiert.
Der Antwortstrom, der bei 460 mV unter Verwendung des konventionellen Interkalators erhalten wurde, ist so hoch wie 38 %, verglichen mit dem Kontrollstrom.
Die Ergebnisse von Beispiel 1 und Vergleichsbeispiel 1 zeigen, dass der erfindungsgemäße "Threading"-Interkalator bei 260 mV eine Spitzenstromstärke ergibt, die nahezu gleich ist wie die Spitzenstromstärke, die bei 460 mV bei der Ver wendung des konventionellen "Threading"-Interkalators erhalten wurde.
[Beispiel 2] – Detektion von Hybrid-DNA mit Mismatch-Struktur
(1) Herstellung eines elektrochemischen analytischen Elements
Die Vorgehensweisen von Beispiel 1-(1) wurden mit der Ausnahme des Verwendens von dT₁₉G₁ (entsprechend dem Mismatch-Oligonucleotid) zum Herstellen eines analytischen Elements wiederholt.
(2) Detektion von Hybrid-DNA mit Mismatch-Struktur
Die Vorgehensweisen von Beispiel 1-(3) und die Vorgehensweisen von Vergleichsbeispiel 1 wurden mit der Ausnahme des Verwendens des in (1) oben hergestellten analytischen Elements wiederholt, wobei sich ein Spitzenstrom von 36 %, erhöht von dem Kontrollwert bei 260 mV bei der Verwendung des erfindungsgemäßen Interkalators, und ein Spitzenstrom von 20 %, erhöht von dem Kontrollwert bei 260 mV bei der Verwendung des konventionellen Interkalators, ergab.

Claims

Verbindung mit der Formel (2): Ea – L1a – L2a – X – L2b – L1b – Eb (2)worin jedes von Ea und Eb eine Metallocengruppierung ist, die einen oder mehrere Substituenten haben kann; X eine divalente cyclische Gruppe ist; jedes von L1a und L1b eine Alkylengruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder eine Alkenylengruppe mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen ist, wobei jede Gruppe möglicherweise einen oder mehrere Substituenten hat; und jedes von L2a und L2b eine Verknüpfungsgruppe, enthaltend N, O oder S, ist; wobei Ea das gleiche wie Eb ist, L1a das gleiche wie L1b ist und L2a das gleiche wie L2b ist.
Verbindung nach Anspruch 1, worin jedes von L2a und L2b eine Verknüpfungsgruppe enthält, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer Aminobindung, einer Esterbindung, einer Etherbindung, einer Thioetherbindung, einer Diimidbindung, einer Thiodiimidbindung, einer Thioamidbindung, einer Iminobindung, einer Carbonylbindung, einer Thiocarbonylbindung und einer 1,4-Piperazinylbindung, wobei jede Bindung möglicherweise einen oder mehrere Substituenten hat.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei jedes von L2a und L2b -NHCO- oder -CONH- enthält.
„Threading"-Interkalator, mit Oxidations-Reduktions-Aktivität, der durch die Formel (2) dargestellt wird: Ea – L1a – L2a – X – L2b – L1b – Eb (2)worin jedes von Ea und Eb eine Metallocengruppierung ist, die einen oder mehrere Substituenten haben kann; X eine divalente cyclische Gruppe ist; jedes von L1a und L1b eine Alkylengruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder eine Alkenylengruppe mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen ist, wobei jede Gruppe möglicherweise einen oder mehrere Substituenten hat; und jedes von L2a und L2b eine Verknüpfungsgruppe, enthaltend N, O oder S, ist; wobei Ea das gleiche wie Eb ist, L1a das gleiche wie L1b ist und L2a das gleiche wie L2b ist.
Verfahren zum elektrochemischen Detektieren von Oligonucleotidproben oder Polynucleotidproben, die zu einer Gruppe von Sondenmolekülen von Nucleotidderivaten oder deren Analoga, die auf einem Elektrodensubstrat fixiert sind, komplementär sind, umfassend die Schritte: In-Kontakt-Bringen der Gruppe von Sondenmolekülen mit den Oligonucleotidproben oder Polynucleotidproben in einem wässrigen Medium in Gegenwart eines „Threading"-Interkalators gemäß Anspruch 4, um durch Hybridisierung einen Komplex der Gruppe von Sondenmolekülen und der Oligonucleotidproben oder Polynucleotidproben zu bilden, in welchen der „Threading"-Interkalator interkaliert ist; und Detektieren eines elektrischen Stroms, der durch Anlegen eines elektrischen Potentials an das Elektrodensubstrat erzeugt wird.
Verfahren nach Anspruch 5, in welchem das elektrische Potential, das an das Elektrodensubstrat angelegt wird, in dem Bereich von 100 bis 400 mV ist.
Verfahren zum elektrochemischen Detektieren von Oligonucleotidproben oder Polynucleotidproben, die zu einer Gruppe von Sondenmolekülen von Nucleotidderivaten oder deren Analoga, die auf einem Elektrodensubstrat fixiert sind, komplementär sind, umfassend die Schritte: In-Kontakt-Bringen der Gruppe von Sondenmolekülen mit den Oligonucleotidproben oder Polynucleotidproben in einem wässrigen Medium, um durch Hybridisierung einen Komplex der Gruppe von Sondenmolekülen und der Oligonucleotidproben oder Polynucleotidproben zu bilden; In-Kontakt-Bringen eines „Threading"-Interkalators gemäß Anspruch 4 mit dem gebildeten Komplex, um den Interkalator in den Komplex zu interkalieren; und Detektieren eines elektrischen Stroms, der durch Anlegen eines elektrischen Potentials an das Elektrodensubstrat erzeugt wird.
Verfahren nach Anspruch 7, in welchem das elektrische Potential, das an das Elektrodensubstrat angelegt wird, in dem Bereich von 100 bis 400 mV ist.
Kit zum elektrochemischen Detektieren von Oligonucleotidproben oder Polynucleotidproben, die zu einer Gruppe von Sondenmolekülen von Nucleotidderivaten oder deren Analoga, die auf einem Elektrodensubstrat fixiert sind, komplementär sind, der ein Elektrodensubstrat mit einer Gruppe von Sondenmolekülen von Nucleotidderivaten oder deren Analoga, fixiert an sein Substrat, und einen „Threading"-Interkalator gemäß Anspruch 4 umfasst.
Kit nach Anspruch 9, in welchem die Oligonucleotidderivate und ihre Analoga Oligonucleotide, Polynucleotide oder Peptid-Nucleinsäuren sind.