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Technisches
Gebiet
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Diese
Erfindung betrifft ein Verfahren zur schnellen Durchführung von
Messungen zentrifugierter Materialschicht-Volumina. Das Verfahren
dieser Erfindung ist besonders brauchbar zur Durchführung von
Blutbestandteils-Mengen-Messungen in einer zentrifugierten Probe
von antikoaguliertem Vollblut.
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Technischer
Hintergrund
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Die
Messung der Mengen an Blutzellen in einer zentrifugierten Probe
von antikoaguliertem Vollblut wurde in der wissenschaftlichen Literatur
beschrieben, und ein Verfahren zur einfachen Messung bestimmter
Blutzellen- und anderer Bestandteils-Schichten ist in dem US-Patent
Nr. 4 027 660, das am 7. Juni 1977 Stephen C. Wardlaw et al. erteilt wurde,
beschrieben. In dem patentierten Verfahren wird eine Probe von antikoaguliertem
Vollblut in einem Präzisions-Kapillarröhrchen,
das einen Kunststoff-Schwimmer enthält, zentrifugiert. Der Schwimmer
dehnt einige der Zellschichten und die Plättchenschicht linear aus.
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Bei
der Durchführung
des patentierten Verfahrens wird die Blutprobe etwa 5 min lang bei
etwa 12.000 U/min zentrifugiert, und dann werden die ausgedehnten
Längen
der Zellschicht und der Plättchenschicht
gemessen. Eines der Probleme bei dem patentierten Verfahren betrifft
die relativ hohen Zentrifugen-Umdrehungszahlen pro Minute (Zentrifugen-U/min),
die erforderlich sind, um die Schichten, insbesondere die Plättchenschicht,
zuverlässig
zu verdichten. Wenn die Bestandteils-Schichten nicht vollständig oder
gleichmäßig gepackt
sind, können die
durch das Verfahren abgeleiteten Ergebnisse ungenau sein. Die vorgenannte
hohe U/min-Zentrifugierung erfordert eine kostspielige Zentrifuge
und erhöht das
Risiko des Zerbrechens des Röhrchens.
Ein anderes Problem betrifft die erforderliche minimale Zentrifugierungs-Zeitdauer
von 5 min, die in vielen medizinischen Situationen unerwünscht ist.
Noch ein anderes Problem betrifft die Notwendigkeit, dass die Bedienungsperson
das Röhrchen
aus der Zentrifuge entfernen und wie der in ein Lesegerät einsetzen muss.
Weil dieser Vorgang innerhalb eines begrenzten Zeitintervalls nach
dem Zentrifugieren durchgeführt
werden muss, erfordert er die Anwesenheit der Bedienungsperson ganz
in der Nähe,
was nicht effizient ist und außerdem
die Bedienungsperson einer möglicherweise
gefährlichen
Probe aussetzt.
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Es
wäre wünschenswert,
in der Lage zu sein, die Blutbestandteils-Schichten in einer kürzeren Zeitspanne
und mit einer niedrigeren U/min-Zentrifuge zu messen, und/oder das
Ausmaß an
Probenröhrchen-Handhabung
zu verringern.
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EP 0 864 854 offenbart ein
Verfahren und ein System zur schnellen Durchführung von Messungen zentrifugierter
Materialschicht-Volumina unter Verwendung einer kombinierten Zentrifugen-
und Lesegerät-Anordnung,
die eine Zentrifugenplatte, eine Vertiefung zum Halten eines transparenten
Kapillarröhrchens,
und einem Motor zum Antreiben der Platte, der von einem Regler geregelt
wird, aufweist. Für kinetische
Messungen der Materialschicht werden mehrere aufeinander folgende
Ablesungen gemacht, die von einer Hinweisvorrichtung wie einem Magneten
an der Seite der Platte, der an einem Hall-Effekt-Sensor, der durch
eine Leitung ein Signal an eine programmierbare Verzögerungseinrichtung
sendet, vorbei streicht und damit wechselwirkt, Gebrauch machen.
Nach einer vorbestimmten Zeit nach diesem Abfühlen betätigt eine Blitzröhren-Betätigungseinrichtung
eine Blitzröhre,
um über
einen Filter einen kurzen Lichtimpuls mit einer gewünschten
Wellenlänge
auf das Röhrchen
auszustrahlen. Die Umdrehungsgeschwindigkeit der Platte wird ebenfalls
durch den Regler überwacht
und ermöglicht
zusammen mit dem bekannten Umfangsabstand zwischen der Position
des Hinweises und der Position des Röhrchens, dass die Zeitverzögerung zum
rechtzeitigen Versorgen der Blitzröhre mit Energie bestimmt werden kann.
Licht von der Zellschicht-Probe geht durch einen Lichtfiltersatz
hindurch und auf einen linearen Bilddetektor wie einen CCD.
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Offenbarung
der Erfindung
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Diese
Erfindung betrifft die Verfahren der Ansprüche 1 und 4 und die Systeme
der Ansprüche
6 und 7.
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Diese
Erfindung betrifft eine Anordnung zum schnellen Bestimmen einzelner
Materialvolumina-Messungen während
des Zentrifugierens einer gravimetrisch trennbaren Materialgemisch-Probe
wie einer antikoagulierten Vollblutprobe. Zusätzlich betrifft diese Erfindung
ein Verfahren, das Blutbestandteils-Volumen-Messungen und Blutbestandteils-Mengen
während
des Zentrifugierens einer antikoagulierten Vollblut-Probe bestimmen
kann, bevor der Schritt des Zentrifugierens beendet ist. Das Verfahren
dieser Erfindung verwendet ein kombiniertes Zentrifugen- und Lesegerät, das die
Funktionen sowohl des Zentrifugierens als auch des Lesens erfüllt und
so die Durchführung
der in den vorgenannten US-Patenten beschriebenen Materialschicht-Messungen
vereinfacht. Das Verfahren dieser Erfindung stellt eine kinetische
Analyse der Blutzellen-Verdichtung bereit. Durch Befolgen der Prinzipien
dieser Erfindung können
weiße
Blutkörperchen-
und Plättchen-Schichten
in einer relativ niedrigen U/min-Zentrifuge quantitativ bestimmt
werden, beispielsweise in einer Zentrifuge, die bei Geschwindigkeiten
von zwischen etwa 8.000 bis etwa 10.000 U/min arbeitet, obwohl die
12.000 U/min-Zentrifuge höherer
Geschwindigkeit ebenfalls verwendet werden kann.
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Während des
Prozesses des gravimetrisch Bildens von Zellschichten in einer zentrifugierten
antikoagulierten Vollblut-Probe sind zwei entgegengesetzt wirkende
Kräfte
bei der Arbeit, d.h. eine nach außen gerichtete Verdichtung
der Zellen und anderer gebildeter Komponenten in der Probe; und
ein Sickern des Plasmas in der Probe nach innen. Wenn sich die Zellen
und andere gebildete Komponenten-Schichten in der Blutprobe während des
Zentrifugierens absetzen, verdichten sich die Schichten, wodurch
sich die Länge
der Schichten verringert. Gleichzeitig sickert die fluide (Plasma-)
Komponente der Blutprobe durch die sich verdichtenden Schichten.
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Damit
die Zellenverdichtung stattfindet, muss die fluide Komponente verdrängt werden,
aber wenn sich die Zellschichten fortgesetzt verdichten, werden
die Sickerwege für
das Fluid gewundener. Die Zellschicht-Verdichtung schreitet zu Beginn schnell
voran, wird aber bei zunehmender Verdichtung und schwieriger werdendem
Durchsickern zunehmend langsamer. Daher ist die Verdichtungsrate nicht-linear.
Da die Verdichtungsrate wegen der Fluid-Viskosität und/oder anderen Faktoren
zwischen verschiedenen Blutproben beträchtlich variiert, kann eine
einzige Ablesung einer Zellschicht, die vor der vollständigen Verdichtung
der Zellschicht getätigt wird,
nicht extrapoliert werden, um das Ausmaß der endgültigen Zellschicht-Verdichtung
vorherzusagen. Daher kann die Dicke (oder Länge) der vollständig verdichteten
Zellschicht nicht aus einer einzigen Messung der Dicke (oder Länge) der
Zellschicht, wobei die Ablesung während des Schritts des Zentrifugierens
getätigt
wird, bestimmt werden. Diese Tatsache bildete die Grundlage des
traditionellen Verfahrens des Bestimmens der optimalen Zentrifugen-Geschwindigkeit
und -Zeit, so dass Messungen der Dicke der Zellschichten erst gemacht
werden, nachdem zu erwarten ist, dass die Zellschichten keine weitere
Verdichtung zeigen. Diese „vollständige Verdichtung"-Zentrifugierungszeit
wird als die minimale Zeit betrachtet, die für erforderlich gehalten wird,
bevor man irgendwelche zentrifugierten Schichten von antikoagulierten
Vollblut-Bestandteilen misst.
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Ich
habe entdeckt, dass die inhärente
Unvorhersagbarkeit des Ausmaßes
der endgültigen
Blutzellschicht-Verdichtung überwunden
werden kann, indem man während
des laufenden Zentrifugierungsschritts mehrere getrennte vorhergehende
Messungen der Dicke der Zellschichten macht und dann die abgeleiteten
Daten an einen nicht-linearen mathematischen Algorithmus, der die
Dicke der vollständig verdichteten
Zellschicht vorhersagt, anpasst. Dieses Verfahren erfordert keine
endgültige
Schicht-Verdichtung, und tatsächlich
kann die Dicke der vollständig verdichteten
Zellschicht nach nur vier oder fünf
vorangehenden Messungen der Zellschicht-Dicke mathematisch vorhergesagt
werden. Zusätzlich
erlaubt das Verfahren dieser Erfindung eine genaue Berechnung des
endgültigen
Ausmaßes
der Verdichtung einer Blutzellschicht, und daher der Dicke einer
vollständig
verdichteten Zellschicht, über
einen breiten Bereich von Zentrifugen-Geschwindigkeiten. So kann
eine Mehrzahl von Zellschicht-Dickemessungen, die während des
Zentrifugierens einer antikoagulierten Vollblut-Probe mit niedriger
Geschwindigkeit genommen werden, den endgültigen Grad der Zellschicht-Verdichtung,
der sich aus einem ausgedehnten Zentrifugierungsschritt, der bei
einer viel höheren
Zentrifugen-Geschwindigkeit durchgeführt wird, wie es beim Stand
der Technik erforderlich ist, ergibt, genau vorhersagen.
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Das
Verfahren dieser Erfindung umfasst die Verwendung einer Zentrifuge,
einer Anregungslichtquelle für
einen fluoreszierenden Farbstoff, und einer Bildgebungseinrichtung.
Die Lichtquelle ist bevorzugt eine gepulste Lichtquelle hoher Intensität, die die Blutprobe
in dem Probenröhrchen
periodisch beleuchtet, wenn die letztere zentrifugiert wird. Die
Beleuchtung der Blutprobe in dem Röhrchen veranlasst eine Fluoreszenz
bestimmter der Blutzellen-Bestandteile sowie eine Beleuchtung der
roten Blutkörperchen-Schicht,
so dass der Fotodetektor zwischen den verschiedenen Zellschichten
in dem Röhrchen, die
während
des Schritts des Zentrifugierens gravimetrisch verdichtet werden,
unterscheiden kann. Durch Wahl der geeigneten Filter sowohl an der Lichtquelle
als auch an dem Detektor kann das von den Materialschichten reflektierte
Licht sowie die Fluoreszenz gemessen werden. Das Pulsen der Lichtquelle
wird mit der Position des Röhrchens
während des
Zentrifugierens synchronisiert, so dass das Röhrchen beleuchtet wird, wenn
es an dem Fotodetektor vorbeizieht. Das optische System und die
Filter, die bei der Durchführung
des Verfahrens dieser Erfindung verwendet werden, sind im Wesentlichen denjenigen ähnlich,
die in dem US-Patent Nr. 4 558 947, das am 17. Dezember 1985 S.
C. Wardlaw erteilt wurde, beschrieben sind.
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Die
Lichtquelle zum Beleuchten des Röhrchens
zur Anregung der Fluoreszenz muss eine ausreichende Emission in
der Anregungsbande (etwa 420 bis 480 nm) haben, um dafür zu sorgen,
dass die Emissionsenergie von dem Probenröhrchen, wenn sie von einem
berührungslosen
Bildzerleger mit Filter, wie einer CCD-Anordnung, empfangen wird, angemessen
ist. Außerdem
muss die Energie in der Zeitspanne zugeführt werden, wenn sich das abzubildende
Röhrchen
innerhalb des Fokussierungsbereichs des Detektors, der typischerweise
etwa 50 ms oder etwa 50 μs
beträgt,
befindet. Diese Erfordernisse werden am besten von einer Xenon-Blitzröhre mit einer
zugehörigen
Fokussierungseinrichtung, statt einem Diffusor, erfüllt, wobei
die Blitzröhre
von einer Stromversorgung betrieben wird, die in der Lage ist, kurze
Impulse bei den benötigten
Energieniveaus zuzuführen,
und wobei die Lichtblitze präzise
auf die Position des Röhrchens
relativ zu dem Detektor abgestimmt werden, wenn die Blitzröhre ausgelöst wird.
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Wenn
die Probe durch die vorgenannte kinetische Technik analysiert wird,
wird das Ausmaß der Verdichtung
der mehreren Schichten der Blutproben-Bestandteile während des
Zentrifugierens periodisch abgebildet, und die aufeinander folgenden
Bestandteilsschicht-Abbildungen werden in der Mikroprozessor-Kontrolleinrichtung
in der Anordnung gespeichert. Nachdem eine ausreichende Anzahl von Abbildungen
erfasst und gespeichert wurde, beispielsweise etwa vier oder fünf, ist
die Mikroprozessor-Kontrolleinrichtung in der Lage, den Grad der endgültigen Verdichtung
der Bestandteilsschicht oder der Bestandteilsschichten, die ge messen
wird (werden), zu berechnen, und zeigt den berechneten Wert an.
An dem Punkt wird das Zentrifugieren der Probe beendet. Die Mikroprozessor-Kontrolleinrichtung
kontrolliert den Betrieb der Anordnung insofern, als sie auf Befehl:
das Zentrifugieren einleitet; die U/min der Zentrifuge überwacht;
die Lichtpulse mit der laufenden Zentrifugen-U/min synchronisiert;
den Betrieb des Fotodetektors kontrolliert; Bestandteilsschicht-Ablesungen
bzw. -Messwerte aufnimmt und speichert; den endgültigen Grad der Bestandteilsschicht-Verdichtung
und die sich ergebenden Bestandteils-Mengen oder -Werte berechnet;
und die Zentrifuge abschaltet. Die Bedienungsperson braucht daher
nur das Blutprobenröhrchen
in der Zentrifuge anzubringen und den Betrieb der Anordnung einzuleiten.
Zur Annehmlichkeit und Sicherheit der Bedienungsperson kann das
Blutprobenröhrchen in
einer speziellen Kassette des allgemeinen Typs, der in dem US-Patent
Nr. 5 776 078 beschrieben ist, enthalten sein.
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Wenn
es andererseits die Aufgabe ist, das endgültige Ausmaß der Zellverdichtung nach
einer festgelegten Zeitspanne des Zentrifugierens zu messen, können die
Schichtlängen
analysiert werden, indem man nach der festgelegten Zeitdauer des
Zentrifugierens eine oder mehrere Abbildungen macht, während die
Zentrifuge weiterhin rotiert. So wird der Vorteil verwirklicht,
in der Lage zu sein, das Ausmaß der
Zellschicht-Verdichtung zu messen, ohne das Blutprobenröhrchen von
der Zentrifuge in ein getrenntes Leseinstrument überführen zu müssen. Eine Vorrichtung zum
Synchronisieren des Pulsens der Lichtquelle unabhängig von
der Rotationsgeschwindigkeit der Zentrifuge ist ebenfalls in der
Anordnung vorgesehen. Eine derartige Vorrichtung berücksichtigt
den Zentrifugenverschleiß,
schaltet die Notwendigkeit aus, die Puls-Synchronisierung der Anordnung
einzustellen oder anzupassen, und erlaubt auch, dass die Zentrifuge
absichtlich mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten betrieben wird.
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Es
ist daher eine Aufgabe dieser Erfindung, ein Verfahren zum Ableiten
einer endgültigen
Materialschicht-Dickenmessung in einem zentrifugierten Materialgemisch
vor dem tatsächlichen
Erreichen der endgültigen
Schichtdicke bereitzustellen.
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Es
ist eine andere Aufgabe dieser Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen,
das das Ablesen der Materialschichtdicken nach einer festgelegten
Dauer des Zentrifugierens, während
sich die Probe noch in der Zentrifuge befindet, erlaubt.
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Es
ist eine weitere Aufgabe dieser Erfindung, ein Verfahren der beschriebenen
Art bereitzustellen, bei dem das Materialgemisch eine antikoagulierte Vollblut-Probe
ist.
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Es
ist eine zusätzliche
Aufgabe dieser Erfindung, ein Verfahren der beschriebenen Art bereitzustellen,
bei dem eine Mehrzahl vorläufiger,
aufeinander folgender Schicht-Grenzflächenstellen während des
Zentrifugierens des Gemisches gemessen und gespeichert werden, wobei
die erhaltenen Grenzflächendaten
verwendet werden, um die endgültige Schichtdicke
zu berechnen.
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Es
ist eine weitere Aufgabe dieser Erfindung, ein Verfahren der beschriebenen
Art bereitzustellen, bei dem die endgültige Dicke einer Mehrzahl
von Materialschichten in der Probe, die zentrifugiert wird, von
vorläufigen
Schichtdicken-Messungen abgeleitet werden kann.
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Diese
und andere Aufgaben und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden
genauen Beschreibung der Erfindung deutlicher, wenn sie betrachtet
wird in Verbindung mit den begleitenden Zeichnungen, in denen:
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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1 eine
schematische Ansicht eines Röhrchens,
das eine Materialgemisch-Probe
enthält, wenn
die letztere in dem Röhrchen
zentrifugiert wird, ist;
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2 eine
Messkurve der Dynamik der Schichtverdichtung während des Zentrifugierens des Materialgemisches
ist, wobei die Schichtdicke gegen die verstrichenen Zentrifugierungszeiten
aufgetragen ist;
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3 eine
grafische Darstellung ist, die zeigt, wie eine endgültige Plättchenschicht-Höhe in einem
speziellen Fall, wenn eine Blutprobe bei zwei unterschiedlichen
Geschwindigkeiten zentrifugiert wurde, berechnet wurde, wobei die
Plättchenschicht gegen
den Kehrwert der verstrichenen Zentrifugierungszeiten aufgetragen
ist;
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4 eine
schematische perspektivische Ansicht einer Blutproben-Messanordnung,
die zur Durchführung
des Verfahrens dieser Erfindung verwendet wurde, ist;
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5 eine
perspektivische Ansicht einer bevorzugten Ausführungsform einer Zentrifugenplatte und
eines Antriebsmechanismus, die zur Verwendung in Verbindung mit
dieser Erfindung konstruiert wurden, ist;
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6 eine
fragmentarische perspektivische Ansicht eines Röhrchen-Halters und eines Röhrchen-Rotationsmechanismus,
die bei der Durchführung
des Verfahrens dieser Erfindung verwendet werden, ist;
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7 eine
Schnittansicht des Röhrchen-Rotationsmechanismus,
der bei der Durchführung
des Verfahrens dieser Erfindung verwendet wird, ist; und
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8 eine
Draufsicht auf die Zentrifugenplatte, die das Lichtpuls-Synchronisierungs-
und Bildgebungs-System-Kalibrierungsmerkmal der Anordnung zeigt,
ist.
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Genaues Beispiel
zur Ausführung
der Erfindung
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Es
wird nun auf 1 Bezug genommen, worin eine
schematische Ansicht eines Röhrchens 2 gezeigt
ist, das eine transparente Seitenwand 4 hat und am Boden
geschlossen ist. Das Röhrchen 2 ist mit
einem Gemisch aus einer Teilchenmaterial-Komponente, die in einer
flüssigen
Komponente 6 suspendiert ist, gefüllt. 1 veranschaulicht
die Dynamik der Teilchen-Verdichtung und des Durchsickerns von Flüssigkeit,
wie durch die Pfeile A bzw. B angegeben, die beide während des
Zentrifugierens des Gemisches von Teilchen-Komponente/Flüssigkeits-Komponente auftreten.
Bei fortschreitender Zentrifugierung trennt sich die Teilchen-Komponente gravimetrisch
von der Flüssigkeitskomponente 6 ab und
bildet an einem gewissen Zeitpunkt eine Grenzfläche 8 aus. Die Grenzfläche 8 bewegt
sich durch Gravitation kontinuierlich von der oberen Oberfläche 7 der
Flüssigkeits-Komponente 6 weg,
wenn das Zentrifugieren andauert. Es versteht sich, dass sich, abhängig von
der Art der Probe, in der Probe, die zentrifugiert wird, mehr als
eine Grenzfläche 8 bilden kann.
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Ich
habe entdeckt, dass, wenn die Position der Teilchen-Komponente/Flüssigkeit- oder der Komponente/Komponente-Grenzflächen 8 im
Zeitverlauf überwacht
werden, die aufeinander folgenden Positionen der Grenzflächen eine
Kurvenfunktion 10 des allgemeinen Typs, der in 2 dargestellt
ist, definieren, worin die anfängliche
Veränderung
der Grenzflächenposition
relativ schnell ist, sich aber merklich verlangsamt, wenn die Teilchenkomponenten-Verdichtung
fortschreitet. An einem bestimmten Zeitpunkt hört die Teilchenkomponenten-Verdichtung auf,
und die Teilchenkomponenten-Flüssigkeitskomponenten-Trennung
ist abgeschlossen. Im Zusammenhang mit dieser Erfindung beziehe
ich mich auf das Aufhören
der Teilchenkomponenten-Verdichtung als „endgültige" Verdichtung, die in 2 durch
die gestrichelte Linie 11 dargestellt wird.
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Es
wird festgestellt, dass dasselbe Phänomen auftritt, wenn ein komplexes
Gemisch von in einer Flüssigkeit
suspendierten Teilchen-Komponenten, wie antikoaguliertes Vollblut,
zentrifugiert wird. In diesem Fall bildet sich gravimetrisch eine
Mehrzahl von Teilchenkomponenten-Schichten, wobei die Flüssigkeits-Komponente 6 zum
oberen Teil des Zentrifugenröhrchens 2 durchsickert.
Blut ist ein Beispiel eines derartigen komplexen Gemisches von Teilchenkomponenten,
da die roten Blutkörperchen schwerer
sind als die Granulozyten, Lymphozyten, Monozyten und Plättchen,
in der Reihenfolge abnehmender Dichte, und da alle Zellen in einer
Blutprobe schwerer sind als die Plasma-Komponente der Blutprobe.
Wenn eine antikoagulierte Vollblut-Probe zentrifugiert wird, bewegen
sich die verschiedenen Zell/Zell- und Zell/Plasma-Grenzflächen in
derselben allgemeinen Weise, wie es durch 2 veranschaulicht
ist, durch Schwerkraft durch die Blutprobe. Es sollte beachtet werden,
dass in einem komplexen Gemisch von Materialien, wie Vollblut, unter
gewissen Umständen
mittlere Schichten tatsächlich
an Dicke zunehmen können,
statt zusammengedrängt
zu werden. Dies kann auftreten, wenn die Trennung einer Zielkomponente
von dem Gemisch die Verdichtungsrate jener Schicht überschreitet.
In allen Fällen wird
jedoch die mathematische Analyse und die Extrapolierung in derselben
Weise durchgeführt
wie bei den Schichten, die an Dicke abnehmen, und hat dieselbe Wirkung.
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Die
Kurve, die von der Veränderungsrate
der Stelle irgendeiner Teilchenbestandteil-Grenzfläche, und
daher der Bestandteils-Schichtdicken in einer Probe, die einem Zentrifugieren
unterliegt, beschrieben wird, ist im Wesentlichen eine Hyperbel.
Diese Tatsache kann verwendet werden, um das endgültige Ausmaß der Teilchenbestandteils-Schicht-Verdichtung,
und daher die endgültigen
Schichtdicken und Schichtvolumina der Teilchenbestandteils-Schicht oder
-Schichten in der zentrifugierten Probe, mathematisch vorherzusagen.
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Es
sollte beachtet werden, dass die Verdichtung der Zellschichten möglicherweise
nicht sofort, beginnend zur Zeit null, einer hyperbolischen Funktion
folgen kann. Um zu bestimmen, wann die Bewegung der Grenzfläche den
Punkt erreicht hat, an dem sie einer hyperbolischen Funktion folgt,
und daher die endgültige
Verdichtung berechnet werden kann, ist es nur notwendig, die Grenzflächenposition
oder Schichtdicke periodisch zu überwachen
und aufeinander folgende Steigungs-Messungen als S = dP/(1/t), worin
S die Steigung der Veränderung
ist; dP die Veränderung
der Grenzflächenposition
(oder Schichtdicke) ist; und t die seit dem Beginn des Zentrifugierens
verstrichene Zeit ist, zu berechnen. Wenn sich aufeinander folgende
Werte von S nicht länger verändern, dann
können
nachfolgende vorläufige Datenpunkte
gesammelt werden, und die endgültige Schichtverdichtung
kann bestimmt werden.
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3 zeigt
ein spezielles Beispiel derselben antikoagulierten Vollblut-Probe,
die bei zwei verschiedenen Geschwindigkeiten zentrifugiert wurde, wobei
die Steigungen der hyperbolischen Kurven, wie sie in 2 gezeigt
sind, linearisiert sind durch Auftragen des Kehrwerts aufeinander
folgender verstrichener Zentrifugierungszeiten gegen aufeinander folgende
gemessene Dicken der verdichteten Plättchenschicht-Grenzflächen 8 bei
zwei verschiedenen Zentrifugen-Geschwindigkeiten, d.h. bei 8.000
U/min und 12.000 U/min. Die Linie 14 bezeichnet allgemein die
Veränderungsrate
der Plättchenschicht-Dicke während des
Zentrifugierens der Testproben in einer 12.000 U/min-Hochgeschwindigkeitszentrifuge;
und die Linie 12 bezeichnet allgemein die Veränderungsrate
der Plättchenschicht-Dicke
während
des Zentrifugierens der Testproben in einer Zentrifuge mit einer niedrigeren
Geschwindigkeit von 8.000 U/min, wobei die letztere nur 40% der
Beschleunigungskraft der ersteren liefert.
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Zur
Bestimmung der Steigungsveränderungsrate
wird eine Reihe von vorläufigen
aufeinander folgenden Plättchenschicht-Dicken 16 gemessen,
und es werden Anpassungen der kleinsten Fehlerquadrate berechnet,
was die beste Strecke 18 zwischen den vorläufigen Schichtdicken-Datenpunkten 16 ergibt.
Zur Berechnung der endgültigen
Dicke der verdichteten Schicht wird die Regressionsfunktion auf eine
endgültige
Rotationszeit, in diesem Fall unendlich, extrapoliert, wo der Wert
des Kehrwerts der verstrichenen Zentrifugierungszeit null ist. Der
Achsenabschnitt der Veränderungsrate
der Schichtdicken-Darstellung an dem Punkt auf der Y-Achse kennzeichnet
die endgültige
Dicke der verdichteten Schicht. Es wird festgestellt, dass, obwohl
sich die Zentrifugen-Geschwindigkeiten beträchtlich unterscheiden, das
Endergebnis dasselbe ist; und dass Ablesungen nur für eine relativ
kurze Zeitdauer, wie für
2 bis 3 min, verglichen mit 5 bis 10 min, die vom Stand der Technik
benötigt
werden, gemacht werden müssen.
Die vorläufigen
Messungen können
gemacht werden, während
die Zentrifuge weiterhin rotiert.
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Es
wird nun auf 4 Bezug genommen, worin eine
schematische Ansicht einer kombinierten Zentrifugen- und Lesegerät-Anordnung
gezeigt ist, die allgemein mit der Ziffer 1 bezeichnet
ist. Die Anordnung 1 umfasst eine Zentrifugenplatte 3,
die eine Aussparung 5 zum Halten eines transparenten Kapillarröhrchens 9 umfasst.
Das Röhrchen 9 kann
direkt in der Aussparung 5 angebracht werden, oder das Kapillarröhrchen 9 kann
in einer Kassette (nicht gezeigt) des Typs, der in der ebenfalls
anhängigen
Patentanmeldung USSN 08/755 363, angemeldet am 25. November 1996,
offenbart ist, gehalten werden. Jedenfalls muss mindestens eine
Oberfläche
des Röhrchens 9 zum
Zweck des Sammelns der gewünschten
optischen Information von den Röhrcheninhalten
optisch sichtbar gemacht werden. Die Zentrifugenplatte 3 wird
von einem Motor 13, der durch eine Ausgabeleitung 21 von
einer Anordnungs-Mikroprozessor-Kontrolleinrichtung 17 geregelt
wird, rotierend angetrieben. Die Rotationsgeschwindigkeit des Motors 13 wird
von der Kontrolleinrichtung 17 über die Leitung 19 überwacht,
was es der Kontrolleinrichtung 17 erlaubt, die Geschwindigkeit
des Motors 13 und daher der Zentrifugenplatte 3 zu
regulieren. Wenn die Zentrifugenplatte 3 ihre vorbestimmte Betriebsgeschwindigkeit
erreicht, die zwischen etwa 8.000 und 12.000 U/min liegen kann,
hängt die
Tätigkeit
der Kontrolleinrichtung 17 von der Art der erforderlichen
Analyse ab. Wenn es erwünscht
ist, die Materialschicht-Verdichtung nach einer festgelegten Zentrifugierungsdauer
abzulesen, versorgt die Kontrolleinrichtung 17 den Motor 13 für eine gewünschte festgelegte
Zeitdauer mit Energie, und die Ablesung der Schichtverdichtung bzw.
der Schichtverdichtungs-Anzeigewert wird danach genommen, während die
Zentrifuge weiter rotiert.
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Andererseits
werden, wenn es gewünscht ist,
die Materialschicht-Verdichtung kinetisch zu messen, mehrere aufeinander
folgende Ablesungen der sich durch Schwerkraft verdichtenden Blutzellen-Schichthöhen in dem
Röhrchen 9 genommen. Wenn
die Platte 3 rotiert, zieht eine Hinweisvorrichtung 15 an
der Seite der Platte 3 an einem Sensor 23, der
durch die Leitung 20 ein Signal an eine programmierbare
Verzögerungseinrichtung 22 sendet,
vorbei und wechselwirkt mit ihm. Die Hinweisvorrichtung 15 kann
ein Permanentmagnet sein, und der Sensor 23 kann ein Hall-Effekt-Sensor
sein. Alternativ könnte die
Hinweisvorrichtung 15 ein reflektierendes Element am Rand
der Platte 3 sein, und der Sensor 23 könnte ein
Infrarot-Strahler-Empfänger-Paar
sein. Noch eine andere alternative Fühlvorrichtung könnte einen
Sensor in dem Antriebsmotor 13 aufweisen, vorausgesetzt,
dass die Platte 3 starr an der Welle des Antriebsmotors 13 befestigt
wäre.
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Nach
dem Verstreichen einer vorbestimmten Zeit nach dem Empfang eines
Signals von dem Nähen-Sensor 23 durch
die Kontrolleinrichtung 17 löst eine Blitzröhren-Betätigungseinrichtung 24 eine
Blitzröhre 26 aus,
die einen kurzen Lichtpuls, bevorzugt von weniger als etwa 50 μs Dauer,
aussendet. Eine Filter- und Linsen-Anordnung 28 fokussiert
das Licht der gewünschten
Wellenlänge
von der Blitzröhre 26 auf
das Röhrchen 9.
Wenn die Blitzröhre 26 unterhalb
der Platte 3 positioniert ist, enthält die letztere eine Öffnung 3' zwischen dem
Probenröhrchen 9 und der
Blitzröhre 26 und
der Filter- und Linsen-Anordnung 28. Aufgrund der Tatsache,
dass die genaue Rotationsgeschwindigkeit der Platte 3 über die
Leitung 19 durch die Kontrolleinrichtung 17 überwacht wird,
und da der Umfangsabstand zwischen der Position des Hinweises 15 und
der Position des Röhrchens 9 festgelegt
ist, kann die erforderliche Zeitverzögerung zum rechtzeitigen Versorgen
der Blitzröhre 26 mit
Energie von der Kontrolleinrichtung 17 bestimmt werden
und durch den Datenübertragungsweg 30 ausgedrückt werden,
um den Betrieb der Blitzröhren-Betätigungseinrichtung 24 zu
kontrollieren.
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Wenn
das Röhrchen 9 von
der Blitzröhre 26 beleuchtet
wird, wird das von den Zellschichten reflektierte Licht oder Licht
von der Fluoreszenz der Zellschichten von einer Linsenanordnung 32 durch einen
Lichtfiltersatz 34 auf einen linearen Bildzerleger 36,
der bevorzugt ein ladungsgekoppelter Speicher (CCD – chargecoupled
device) mit mindestens 256 Elementen und bevorzugt 5.000 Elementen,
um eine optimale optische Auflösung
zu erreichen, ist, fokussiert. Licht einer passenden Wellenlänge kann ausgewählt werden
von einer Verstellvorrichtung 38, wie einem Magnet- oder
Schrittmotor, und die über die
Leitung 40 von der Kontrolleinrichtung 17 kontrolliert
wird, wodurch die Verstellvorrichtung 38, abhängig von
der von der Kontrolleinrichtung 17 ausgewählten Lichtwellenlänge, den
passenden Filter aus dem Filtersatz 34 bereitstellen kann.
Alternativ könnten
elektrisch variable Filter verwendet werden, um die passenden Lichtwellenlängen bereitzustellen, oder
es könnten
CCDs mit mehreren Sensoren, jeder mit seinem eigenen besonderen
Filter, verwendet werden. Geeignete elektrisch variable Filter können von
Cambridge Research and Instrumentation, Inc. of Cambridge, MA, erhalten
werden. Geeignete CCDs sind erhältlich
von Sony, Hitachi und anderen, und sind übliche Gerätekomponenten.
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Unmittelbar
vor dem Empfang des Lichtblitzes von der Blitzröhre 26 wird von der
Kontrolleinrichtung 17 über
die Leitung 42 der elektronische Verschluss in dem CCD 36 geöffnet. Sofort
nach dem Blitz werden die Daten aus dem CCD 36 in einen Analog/Digital-Umsetzer 44,
der die Analogsignale aus jeder der CCD-Zellen in ein digitales
Signal umwandelt, eingelesen. Die digitalisierten Daten werden dann
durch einen Datenübertragungsweg 46 zu
der Kontrolleinrichtung 17 übertragen, so dass die Daten sofort
analysiert oder zur weiteren Untersuchung in der Kontrolleinrichtung 17 gespeichert
werden können.
So kann durch die Verwendung der Anordnung, die in der ebenfalls
anhängigen
US-Patentanmeldung USSN 08/814 536 beschrieben ist, an jedem beliebigen
gewünschten
Punkt während
des Zentrifugierungsprozesses optische Information von dem Probenröhrchen 9 gesammelt
und analysiert werden. Die oben beschriebenen mathematischen Berechnungen,
die zur Herleitung der „endgültigen Verdichtung" verwendet werden
können,
können
durch die Kontrolleinrichtung 17 durchgeführt werden.
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Es
wird nun auf 5 Bezug genommen, worin eine
bevorzugte Ausführungsform
einer Zentrifugenplatten-Anordnung 3 gezeigt ist, die für eine Verwendung
ausgelegt ist, wenn die Blitzlichtquelle 26 und der Analog/Digital-Umsetzer 44,
die in 4 gezeigt sind, über oder unter der Platte 3 positioniert sind.
Die Platte 3 ist im Wesentlichen schalenförmig und
weist einen äußeren Randreifen 50 und
einen Plattenboden 52 auf. Eine zentrale Nabe 54 ist
an dem Plattenboden 52 befestigt, und die Nabe 54 wird von
einer Abdeckung 56 verschlossen. In der Nabe 54 ist
ein Paar diametral entgegengesetzter Fenster 58 ausgebildet.
Das Probenröhrchen 9 wird
auf der Platte 3 montiert. Ein Ende des Röhrchens 9 wird
in eine Öffnung
in der Nabe 54 eingesetzt, und das andere Ende des Röhrchens 9 wird
in einen Schlitz 60, der in einem Block 62 ausgebildet
ist, der an dem Platten-Randreifen 50 montiert ist, abgesenkt.
Der Plattenboden 52 ist mit einer Öff nung (nicht gezeigt) ausgestattet,
die mit einer transparenten Platte 64 abgedeckt ist. Ein
Gegengewicht 66 ist der Platte 64 diametral entgegengesetzt
angeordnet, um die Platte 3 dynamisch auszubalancieren.
Die Platte 64 erlaubt es, dass die Platte 3 mit
Lichtquellen und Detektoren benutzt wird, die entweder oberhalb
oder unterhalb des Plattenbodens 52 angebracht sind. Sie
erlauben auch, dass die Anordnung 1 entweder reflektiertes Licht,
Fluoreszenzemission oder Durchlicht in Verbindung mit der Probe
verwendet, um die gewünschten Ergebnisse
zu erzielen. Das in den 5 und 6 gezeigte
spezielle Beispiel verwendet ein einziges Röhrchen; von der Anordnung 1 können jedoch
auch mehrere Röhrchen
analysiert werden, indem man ein Probenröhrchen in einer diametral entgegengesetzten
Position auf der Platte 3 montiert, und indem man die zeitliche
Abstimmung von der Hinweisvorrichtung zum Blitz so verändert, dass
Anzeigewerte für
jedes getrennte Röhrchen
bereitgestellt werden. Die Antriebswelle des vorher beschriebenen
Zentrifugenmotors 13 wird durch die Ziffer 13' bezeichnet.
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Die 6 und 7 liefern
Details hinsichtlich der Art, in der die Motor-Antriebswelle 13' mit der Platte 3 verbunden
ist; und auch Details hinsichtlich der Art, in der das Probenröhrchen 9 mit
der Plattennabe 54 verbunden ist. Die Motor-Antriebswelle 13' ist an einer
Antriebsscheibe 68, die im Inneren der Nabe 54 angeordnet
ist, befestigt. An der Scheibe 68 sind ein Paar Antriebsstifte 70 befestigt,
wobei die Antriebsstifte 70 durch die Nabenfenster 58 vorspringen.
Die Antriebsstifte 70 schaffen den einzigen Antriebskontakt
zwischen der Motor-Antriebswelle 13' und der Platte 3. Eine
Drehung der Scheibe 68 durch die Motor-Antriebswelle 13' veranlasst
die Stifte 70, mit den Seiten der Nabenfenster 58 in
Eingriff zu kommen, wodurch sie die Nabe 54 und die Platte 3 veranlassen,
sich mit der Scheibe 68 zu drehen. Eine Stange 72 ist
drehbar in der Nabe 54 montiert. Die Stange 72 weist
an einem ihrer Enden eine Manschette 74 auf, wobei die
Manschette 74 ein Ende des Probenröhrchens 9 aufnimmt.
In der Manschette 74 befindet sich ein elastischer O-Ring
(nicht gezeigt), der das Ende des Röhrchens 9 greift.
Ein gezahntes Sperrrad 76 ist an der Stange 72 montiert und
wirkt dahingehend, eine schrittweise selektive Drehung der Manschette 74 und
des Probenröhrchens 9 in
der folgenden Weise zu veranlassen. Eine Feder-vorgespannte, in
das Sperrad eingreifende Sperrklinke 78 ist an der Scheibe 68 montiert,
und eine in das Sperrad eingreifende Blattfeder 80 ist
an der Nabenabdeckung 56 montiert. Wenn die Zentrifugenmotor-Antriebswelle 13' durch den Motor 13 mit Energie
versorgt wird, bewegt die Drehung der Scheibe 68 die Sperrklinke 78 in
Ein griff mit einem der Zähne
auf dem Sperrad 76, und die Blattfeder 80 bewegt
sich nach unten in Eingriff mit einem diametral entgegengesetzten
Zahn an dem Sperrrad 76, wie in 7 gezeigt.
Um das Sperrrad 76 und das Probenröhrchen 9 selektiv
zu drehen, wird die Energie zu dem Zentrifugenmotor 13 periodisch
unterbrochen, um die Drehung der Antriebswelle 13' zeitweilig
zu verlangsamen. Die Wucht der Platte 3 veranlasst sie
und ihre Nabe 54, sich zeitweilig mit einer schnelleren
Geschwindigkeit als die Scheibe 68 zu drehen, so dass die
Sperrklinke 78 außer
Eingriff mit dem Sperrad 76 kommt und die Antriebsstifte 70 außer Eingriff
mit der Plattennabe 54 kommen. Während dieser zeitweiligen Eingriffsfreiheit
kommt die Sperrklinke 78 außer Eingriff mit dem Sperrrad-Zahn, und
bewegt sich zu einer Position, wo sie in Eingriff mit dem nächsten benachbarten
Sperrad-Zahn kommt. Der Motor 13 wird dann wieder bis zur
vollen Geschwindigkeit mit Energie versorgt, was die Antriebsstifte 70 veranlasst,
erneut mit der Nabe 54 in Eingriff zu kommen, und was die
Sperrklinke 78 veranlasst, dem Sperrrad 76 und
dem Probenröhrchen 9 einen
Drehungsschritt im Uhrzeigersinn zu verleihen. Wenn die Sperrklinke 78 so
den nächsten
benachbarten Sperrrad-Zahn
antreibt, veranlasst die Drehung des Sperrrads 76 die Feder 80,
mit einem diametral entgegengesetzten nächsten benachbarten Zahn an
dem Sperrrad 76 in Eingriff zu kommen, wodurch sie das
Sperrrad 76 und das Probenröhrchen 9 in der neuen
Umdrehungsposition stabilisiert. Die schrittweise Drehung des Probenröhrchens 9 erlaubt
es so dem Bildzerleger 36, die gesamte Umfangsoberfläche der
Probe in dem Röhrchen 9 zu „sehen", wenn letzteres
zentrifugiert wird. Umfangsveränderungen
in der Position der sich abwärts
bewegenden Probenkomponenten-Grenzflächen 8 werden so von
dem System berücksichtigt.
Der vorgenannte Sperrklinken- und Sperrad-Röhrchen-Rotationsmechanismus
ist die Erfindung von Michael R. Walters von Becton Dickinson and
Company, und er wird in dieser Anmeldung zum Zweck der Erfüllung der „Beste-Ausführungsform"-Erfordernisse des
Patentgesetzes beschrieben.
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8 ist
eine Draufsicht auf die Zentrifugenplatte 1, die das Probenröhrchen 9 und
eine nachweisbare Ziel-Referenzvorrichtung 25, die auf
der Platte 1 angeordnet und um einen genau bekannten Winkel ∅ gegenüber dem
Röhrchen 9 winkelförmig versetzt
ist, zeigt. Die Vorrichtung 25 ist bevorzugt aus einem
Material wie einem fluoreszierenden Kunststofffilm, der in einer
Weise, die derjenigen des Röhrchens 9 ähnlich ist,
fluoresziert oder Licht reflektiert, hergestellt. Die Vorrichtung 25 hat
bevorzugt eine Mehrzahl von Linien oder Bändern 27, die zu der Ach se
der Vorrichtung 25 senkrecht sind. Die Vorrichtung 25 ist
bevorzugt aus einem stabilen fluoreszierenden oder reflektierend-fluoreszierenden
Kunststofffilm-Material hergestellt, so dass die Energie, die von
der Vorrichtung 25 ausgestrahlt wird, zur Kalibrierung
des optischen Systems des Instruments verwendet werden kann.
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Es
ist wohl bekannt, dass quantitative Messungen der Fluoreszenzenergie
insofern schwierig sind, als die gemessene Energie von der Intensität der Anregungsquelle,
der Temperatur der Probe und der Ansprechempfindlichkeit des Nachweissystems abhängt, die
alle aufgrund einer Anzahl von Faktoren variieren können. Es
ist zwar sehr schwierig, irgendeine Art von Langzeit-Kalibrierung
bereitzustellen, aber es ist zweckmäßig, periodisch die Energieniveau-Antwort
von einem Ziel wie der Referenzvorrichtung 25, deren Antwort
zeitlich stabil ist, mit der Energieniveau-Antwort von der Probe 9,
deren Antwort zeitlich nicht stabil sein kann, zu vergleichen. Wenn
die Energieniveau-Antwort von der Probe 9 dem Instrument
niedrig zu sein scheint, kann ein Vergleich nachfolgender Energieniveau-Antworten der Probe 9 mit
Energieniveau-Antworten der Referenzvorrichtung 25 durchgeführt werden.
Der Vergleich der Energieniveau-Antworten kann verwendet werden,
um zu bestimmen, ob die Energieniveau-Antwort der Probe 9 wegen
einer charakteristischen Eigenschaft der Probe 9 oder wegen
eines Systemfehlers in dem Fluoreszenzantwort-Messsystem des Instrumentes
niedrig ist. Wenn der letztere Fall fehlerhafter Signalniveau-Messungen
festgestellt wird, dann wird das Signalniveau-Messsystem des Instruments
auf der Basis der bekannten Signalniveau-Messungen, die von der
Referenzvorrichtung 25 erhalten wurden, erneut kalibriert.
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Außerdem kann
die Länge
der Bänder 27 in der
Referenzvorrichtung 25 durch das Bildgebungssystem in dem
Instrument erfühlt
werden, und da die Länge
der Bänder 27 präzise dargestellt
werden kann, können
sie zur räumlichen
Kalibrierung des gesamten Bildgebungssystems verwendet werden. Ein optischer
Fehler, der auftreten könnte,
ist beispielsweise, dass das Abbildungslinsen- und Filter-System ein Bild auf
den Detektor 36 werfen kann, das nicht linear ist. So können räumliche
Punkte mit gleichem Abstand in der Mitte des Bildes nicht dieselbe
Detektorfläche
bedecken wie jene Punkte am Rand des Bildes. Dieses Phänomen trifft
man in der Fotografie an, wo es als „Nadelkissen-" oder „Fass-"Effekt bezeichnet
wird, und es verhindert genaue räumliche
Messungen, wenn es nicht behoben wird. Wenn die Bänder 27 mit
gleichem Abstand über
die gesamte Bildlän ge
von dem Detektor 36 kartiert werden, dann kann jegliche
Verzeichnung nachgewiesen und in den abschließenden Berechnungen ausgeglichen werden.
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In
Gebrauch wird die Zentrifugenplatte 1 in der durch den
Pfeil A angegebenen Richtung gedreht, bis sie die Betriebsgeschwindigkeit
erreicht. Das Pulsen der Blitzrohre 26 wird von dem Mikroprozessor 17 angepasst,
bis von dem Bildzerleger 36 ein deutliches Bild der Zielvorrichtung 25 erhalten
wird. In der Praxis wird die Geschwindigkeit der Zentrifuge zuerst
unter Verwendung der von dem Sensor 23 gegebenen Pulse
zur zeitlichen Abstimmung berechnet. Aus diesen Daten wird eine
angenommene Verzögerungszeit
von dem Sensor-Puls bis zu dem Blitz-Auslöser entweder auf der Basis
vorher erhaltener Zeiten oder einer Zeit, die in dem Instrument
vorprogrammiert wird, wenn das Instrument zusammengebaut wird, berechnet.
Dann wird eine Reihe von Bildern der Zielvorrichtung 25 zu
der „Startzeit" und zu anderen Startzeiten,
die sowohl länger
als auch kürzer
sind, gemacht. Die Blitz-Zeitverzögerung, die die beste Antwort
von der Vorrichtung 25 ergibt, wird dann ausgewählt und
in die Betriebs-Software des Systems eingefügt.
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An
diesem Punkt kann insofern, als sowohl die Plattengeschwindigkeit
als auch der Winkel zwischen der Zielvorrichtung 25 und
dem Röhrchen 9 bekannt
sind, die Zeitverzögerung
zwischen der Vorrichtung 25 und dem Detektor 36 berechnet
werden, und der letztere Zeitverzögerungswert wird zu der Zeitverzögerung von
dem Zeitabstimmungspuls zu dem Detektor 25 hinzu gezählt, um
eine Gesamtzeitverzögerung
zu gewinnen, die in die Verzögerungseinrichtung 22 zum
Pulsen der Blitzröhre 26 einzuprogrammieren
ist, damit das Probenröhrchen 9 präzise beleuchtet
wird.
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Es
wird anerkannt werden, dass das vorgenannte System und Betriebsverfahren
ausreichen, um bei jeder beliebigen Zentrifugenplatten-Rotationsgeschwindigkeit
die Blitzröhren-Beleuchtungpulse
mit dem Vorbeiziehen des Probenröhrchens
an der Blitzröhre
zu synchronisieren. Das vorgenannte Verfahren hat unabhängig von
einer Alterung der Zentrifugenkomponenten, der System- oder Proben-Betriebstemperaturen
oder ähnlicher
Veränderungen
der Betriebsbedingungen Anwendbarkeit. Die auf der Platte angeordnete
fluoreszierende Standardvorrichtung erlaubt auch, dass das Bildgebungssystem
in der Anordnung im praktischen Einsatz automatisch kalibriert und
erneut kalibriert wird.
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Da
viele Veränderungen
und Variationen der offenbarten Ausführungsform der Erfindung durchgeführt werden
können,
ohne von dem erfinderischen Konzept abzuweichen, ist nicht beabsichtigt,
die Erfindung in anderer Weise, als es durch die angefügten Ansprüche erforderlich
ist, zu beschränken.