DE60029256T2

DE60029256T2 - Vorrichtung zum schnellen thermischen recycling

Info

Publication number: DE60029256T2
Application number: DE60029256T
Authority: DE
Inventors: Kevin R. Spokane Oldenburg
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2000-09-05
Filing date: 2000-10-18
Publication date: 2007-07-05
Anticipated expiration: 2020-10-19
Also published as: AU2001221136A1; EP1315566A1; EP1315566A4; DE60029256D1; ATE332190T1; US6640891B1; WO2002020161A1; EP1315566B1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft im allgemeinen eine Thermal-Cycling-Vorrichtung und insbesondere eine Vorrichtung zum schnellen Erhitzen und Abkühlen flüssiger Proben.
Hintergrund der Erfindung
Eine Thermal-Cycling-Vorrichtung ist ein Vorrichtung, die dazu dient, die Temperatur einer flüssigen Probe kontinuierlich zu ändern. Der hier verwendete Begriff "Flüssigkeit" bezieht sich auf reine Flüssigkeiten sowie auf Flüssigkeiten, die Feststoffteilchen (insbesondere biologisches Material) enthalten, sowie Lösungsmittel, die gelöste Stoffe enthalten.
Thermal-Cycling-Vorrichtungen sind in der Technik bekannt, und spezielle Ausführungen sind in der wissenschaftlichen sowie der Patentliteratur beschrieben. Diese Einrichtungen gehören zu zwei allgemeinen Kategorien.
Die erste Kategorie ist ein System, das auf dem Erhitzen oder Abkühlen eines Metallblocks üblicherweise entweder durch Bewegen einer Flüssigkeit durch den Block oder durch das direkte Zuführen von Peltier-Wärme zu dem Block basiert. Eine Anzahl einzelner Kunststoffröhren, eine Well-Platte (oder eine Mikrotiterplatte, die im Wesentlichen aus einer Anzahl von Kunststoffröhren besteht, die in einer rechteckigen Anordnung miteinander verbunden sind) dienen dazu, die flüssigen Proben aufzunehmen. Die Kunststoffröhren werden in den Block eingesetzt, und die Temperatur der Probe wird reguliert, indem die Temperatur des Metallblocks geändert wird. Die Rate, mit der die Temperatur geändert werden kann, ist durch die relative große thermische Masse des Metallblocks begrenzt. Da dies der Fall ist, ist die maximale Rate der Temperaturänderung aufgrund der Tatsache relativ gering, dass Wärme einer relativen großen thermischen Masse zugeführt oder aus ihr abgeleitet werden muss und diese Masse eine erhebliche Zeit benötigt, um thermisches Gleichgewicht zu erreichen. Ein zweiter Nachteil dieser Kategorie von Thermal-Cycling-Vorrichtungen besteht darin, dass die zu erwärmenden oder abzukühlende flüssigen Proben durch die Kunststoffwand des Probenbehälters (d.h. durch die Kunststoffröhren) gegenüber dem Block "isoliert" sind. Da Kunststoff eine guter Isolator ist, muss die Erwärmungs- und Abkühlquelle nicht nur die thermische Masse des Metallblocks überwinden, sondern muss auch die isolierenden Eigenschaften des Kunststoff-Probenbehälters überwinden.
Die derzeit für Polymerase-Kettenreaktionen (PCR) und Cycle-Sequencing eingesetzten Probenbehälter sind entweder dünnwandige Mikrofuge-Röhrchen, dünnwandige Mikrowell-Platten (normalerweise mit 96 Kavitäten bzw. Vertiefungen oder 384 Vertiefungen) oder Mikrokapillarröhrchen. All diese Behälter weisen ein gemeinsames Problem dahingehend auf, dass in allen Fällen die Proben von einer externen Quelle erwärmt oder abgekühlt werden und das Erwärmungs- und Abkühlsystem die isolierenden Eigenschaften des Behälters überwinden muss.
Ein bei diesen Vorrichtungen auftretendes Problem besteht darin, dass die Kunststoffröhrchen im Vergleich zu der flüssigen Probe recht groß sind. So liegt, wenn in diesen Systemen eine Platte mit 96 Vertiefungen oder eine Platte mit 384 Vertiefungen eingesetzt wird, das Behältervolumen zwischen 300 Mikrolitern (μl) und 120 μl, während das Probenvolumen gewöhnlich nur 5–25 μl beträgt. Wenn eine Probe während eines Zyklus eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) erwärmt wird, verdampft die Flüssigkeit und kondensiert an den Innenwandflächen des Probenbehälters. Der Verlust von Flüssigkeit aus der Probe ändert die Konzentrationen der Reaktionskomponenten und führt zu fehlerhaften Ergebnissen.
Bestimmte Maßnahmen sind ergriffen worden, um das ernsthafte Problem der Verdampfung und Kondensation zu lösen. Eine Lösung besteht darin, einen Deckel auf die Probenbehälter oder die Well-Platte aufzulegen. Eine erwärmte Well-Platte wird mit dem Probenbehälterdeckel in Kontakt gebracht und auf 20 bis 30°C über der Probentemperatur erwärmt. Dadurch wird die Kondensation der Flüssigkeit an den Wänden und an der Oberfläche des Behälters minimiert, jedoch beeinflusst dies die gesamte Verdampfung nicht, da das Luftvolumen in dem Probenbehälter groß ist und eine erhebliche Menge an Flüssigkeitsdampf (zwischen 0,06–0,15 μl) aufnehmen kann, und zwar insbesondere bei diesen erhöhten Temperaturen. In einem Reaktionsvolumen von 25 μl hat dieser Flüssigkeitsverlust möglicherweise keine nennenswerte Auswirkung, wenn sich je doch das Reaktionsvolumen 1 μl nähert, beeinflusst ein Verlust von 15% des Flüssigkeitsvolumens die Reaktion nachteilig.
Eine Reihe von Herstellern produziert derzeit Thermal-Cycling-Vorrichtungen, bei denen ein Metallblock zum Erhitzen und Abkühlen von flüssigen Proben eingesetzt wird. Dazu gehören MJ Research Techno, Lab Line, Thermolyne, Corbett Research und Hybaid.
Der zweite Typ von Thermal-Cycling-Vorrichtungen beinhaltet den Einsatz von Mikrokapillarröhrchen, die in eine Kammer eingesetzt werden, sowie das Erwärmen der Kammer durch Einblasen von heißer Luft oder kalter Luft in die Kammer. Dieses Verfahren ähnelt dem Erwärmen der Proben mit einem Konvektionsofen und Abkühlen der Proben mit einem Kühlsystem. Ein gegenwärtiger Hersteller dieses Typs von Thermal-Cycling-Vorrichtung ist Idaho Technologies.
Dieser zweite Typ Thermal-Cycling-Vorrichtung hat den Vorteil, das die thermische Masse, die erwärmt werden muss, d.h. die Kapillarröhre, die Probe und der Innenraum der Kammer, relativ gering ist. Dieses System weist jedoch eine Anzahl von Beschränkungen auf. Zunächst müssen die Proben in einer Glas-Kapillar-Röhre abgedichtet werden. Das macht es erforderlich, dass die Probe über Kapillarwirkung in der Röhre angesaugt wird, dann muss das Ende der Röhre mit einer Flamme abgedichtet werden, die heiß genug ist, um das Glas zum Schmelzen zu bringen. Kapillarröhrchen sind ihrem Wesen nach sehr schwierig zu handhaben und nicht für Roboter-Automatisierung geeignet. Das heißt, obwohl eine begrenzte Anzahl von Proben auf diese Weise hergestellt werden kann, wäre es außerordentlich schwierig, wenn nicht unmöglich, die Anzahl von Proben pro Tag zu bearbeiten (gewöhnlich in der Größenordnung von 100000, die üblicherweise für eine bestimmte Studie erforderlich sind). Zweitens ist Glas ein recht guter Isolator, so dass diese Systeme, ähnlich den oben bezüglich der Kunststoffröhrchen beschriebenen, ebenfalls dahingehend Beschränkungen aufweisen, dass, um die Probe zu erwärmen, oder abzukühlen, die isolierenden Eigenschaften des Behälters überwunden werden müssen.
Einer der größten Nachteile der verbreitet eingesetzten Mikrowell-Platten aus Polypropylen besteht darin, dass das Material seine Form bei wiederholten Erwärmungs- und Abkühlzyklen ändert. Beim Erwärmen einer Standard-Mikrowell-Platte aus Polypropylen auf 95°C und anschließendem Abkühlen auf Raumtemperatur kann sich der Kunststoff um bis zu 1 cm von Ecke zu Ecke verformen. Dies führt dazu, dass die Platte nicht direkt mit automatischen Standard-Laboreinrichtungen verwendet werden kann, so würde beispielsweise ein Pipettor mit 96 oder 384 Kanälen auf den Boden der Vertiefungen einer Ecke der Platte aufschlagen, jedoch bis zu 1 cm über dem Boden der anderen Ecke der Platte bleiben. Um dies auszugleichen, werden die Proben normalerweise einzeln in eine Platte hinein bewegt, die keinem Temperaturwechsel unterzogen worden ist, oder die Platte wird in eine Haltevorrichtung gedrückt, die die Platte in der richtigen Form hält.
Mikrokapillare als Behälter für PCR und Cycle-Sequencing weisen eine Reihe damit verbundener Probleme auf. Zunächst ist dies die Tatsache, dass diese Behälter sich nicht gut für Automatisierung eignen. Das heißt, es ist für Roboter-Flüssigkeitsmanipulatoren schwierig, wenn nicht unmöglich, Flüssigkeit in eine Kapillare zu füllen. Daher wird die Handhabung der Flüssigkeit normalerweise in einem Mikrofuge-Röhrchen oder einer Mikrowell-Platte durchgeführt, dann wird die Kapillare mit der Flüssigkeit in Kontakt gebracht, und die Flüssigkeit wird durch Kapillare in die Kapillare gesaugt. Dadurch werden einige der angenommenen Vorteile des Kapillarsystems dahingehend aufgehoben, dass ein erhebliches größeres Volumen an Reagenz selbst dann hergestellt werden muss, wenn nur ein kleiner Teil dieses Reagenz in der Kapillare verwendet wird. Ein weiteres Problem bei Kapillaren besteht darin, dass sie schwer abzudichten sind. Jede Kapillare muss normalerweise durch Hitze so abgedichtet werden, dass die Glaskapillare zum Schmelzen gebracht wird. Selbst wenn andere Typen von Materialien für die Kapillare verwendet werden, ist das Abdichten schwierig und nicht für Automatisierung geeignet. Schließlich muss, nachdem die Reaktion stattgefunden hat, die Kapillare aufgebrochen und geschnitten werden, und das Reaktionsprodukt entfernt werden. Da die Probe durch Kapillarwirkung in den Kapillaren gehalten wird, ist das Entfernen der Probe bestenfalls sehr schwierig.
Um den Durchsatz zu erhöhen und das Reaktionsvolumen zu verringern, wird angestrebt, von Platten mit 384 Vertiefungen zu Platten mit 1536 Vertiefungen überzugehen. Dies ermöglicht eine vierfache Erhöhung der Dichte und des Durchsatzes, und da das Volumen der Vertiefung erheblich kleiner ist (75 μl in einer Platte mit 384 Vertiefungen gegenüber 6 μl in einer Platte mit 1536 Vertiefungen), können die Reaktionen mit 1 μl statt der üblichen 5–25 μl durchgeführt werden, die derzeit in Platten mit 384 Vertiefungen verwendet werden. Der Miniaturisierung bei einem System mit 1536 Vertiefungen gegenüber einem System mit 384 Vertiefungen ergibt eine 5–25-fache Ersparnis an Re agenz. Diese zwei Vorteile gegenüber dem gegenwärtigen Verfahren führen zu einer nahezu 100-fachen Verbesserung bezüglich der Einsparung von Reagenzien und des Durchsatzes.
Handelsübliche Platten mit 1536 Vertiefungen eignen sich nicht für die derzeitigen Methoden des Thermal-Cycling. Dies hat mehrere Gründe. Bei einer sehr hohen Dichte der Vertiefungen und einem Mittenabstand von 2,25 mm beträgt der Abstand zwischen den Vertiefungen ungefähr 0,5 mm. Dieser geringe Abstand macht es nahezu unmöglich, jede Vertiefung mit einer Erwärmungs-/Abkühlungseinheit zu umgeben, wie es derzeit bei Systemen mit 96 Vertiefungen oder 384 Vertiefungen getan wird. Des weiteren ist das Verhältnis von Kunststoffoberfläche zu Volumen ungefähr 7 mal größer als bei einer Platte mit 96 Vertiefungen oder bei einer Platte mit 384 Vertiefungen. Durch die vergrößerte Kunststofffläche können die isolierenden Eigenschaften des Kunststoffs, der die Vertiefung bildet, nur schwer überwunden werden. Einfaches Erwärmen der Platte von der Unterseite aus ist nicht praktikabel, da dies Temperaturgefälle innerhalb der Vertiefung und damit ungleichmäßige Erwärmung verursacht.
Normalerweise sind bei PCR und anderen Verfahren die Proben in eine kleine Mikroröhre eingefüllt worden und die Mikroröhre dann in ein Wasserbad oder einen Erwärmungsblock zur Temperaturregelung eingesetzt worden. Dieses Verfahren der Steuerung der Temperatur der Reaktion ist sehr erfolgreich bei einzelnen Röhrchen, Platten mit 96 Vertiefungen und Platten mit 384 Vertiefungen eingesetzt worden. Wenn jedoch die Dichte der Vertiefungen zunimmt, wird es schwierig, jede Vertiefung mit gleichmäßiger Temperatursteuerung zu umgeben. Des weiteren wirken Kunststoffe normalerweise als hervorragende Isolatoren, so dass das äußere Erwärmungs- und Abkühlsystem die isolierenden Eigenschaften des Kunststoffs überwinden muss, bevor eine Wirkung auf die Lösung zu beobachten ist. Eine zusätzliches Problem besteht darin, dass das Lösungsvolumen verglichen mit dem gesamten Vertiefungsvolumen sehr gering ist. Daher neigt die Lösung, wenn die Vertiefung erhitzt wird, dazu, zu verdampfen und dann an der Abdeckung der Vertiefung zu kondensieren. Dies bewirkt, dass die Konzentration der verschiedenen Bestandteile in der Vertiefung sich ändert, und kann die Reaktion nachteilig beeinflussen. Um dieses Problem auszugleichen, wird bei vielen Systemen die Abdeckung erwärmt, so dass Kondensation an dieser Fläche begrenzt wird. Ein zusätzliches Problem besteht darin, dass, wenn die Vertiefungsdichte von Platten mit 96 Vertiefungen zu Platten mit 384 Vertiefungen zunimmt, die Platten dazu neigen, sich zu verziehen und während der Erwärmungs- und Abkühlzyklen zu verformen. Dieses Verziehen der Platten erschwert es, sie effektiv mit einem Roboter- oder einem automatisiertem System zu handhaben, was ein absolutes Erfordernis für hohen Durchsatz ist. Eine Wärmeübertragungsvorrichtung für eine Mikrotiter-Schale mit mehreren Vertiefungen ist in EP-A-0542422 beschrieben.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung kann in zwei Ausführungen unterteilt werden. Bei einem der Beispiele, das sich auf die vorliegende Erfindung bezieht, ist eine Vorrichtung zum Erwärmen und Abkühlen eines Deckels vorhanden, der so ausgeführt ist, dass er auf eine Vertiefungsplatte passt. Es gibt zwei Varianten für dieses Deckel/Erwärmungs-/Kühlsystem. Zunächst wird eine Luftquelle, die über eine Heizschlange verläuft, und eine andere Luftquelle, die über eine Kühleinheit (Luftkonditionierung) verläuft, proportional gemischt, um die Temperatur zu regeln. Die gemischte Luft wird über eine Reihe von Leitungen so geleitet, dass sie die Oberfläche des Deckels gleichmäßig und genau gesteuert erwärmt oder kühlt. Das zweite Verfahren besteht darin, eine Erwärmungs-/Kühlquelle, wie beispielsweise eine Peltier-Vorrichtung oder eine Wärme/Kälteblock, in direkten Kontakt mit der Oberfläche des Deckels zu bringen. Die große thermische Masse des Wärme-/Kälteblocks führt den Proben über die eingeführten Stifte schnell Wärme zu oder leitet sie aus ihnen ab.
In einer Ausführung der vorliegenden Erfindung wird eine Vorrichtung, insbesondere eine Mikrotiter-Platte geschaffen, die beispielsweise 1536 Vertiefungen aufweist, wobei jede Vertiefung ein Volumen von ungefähr 6 μl hat, sowie einen passenden Plattendeckel. Der Deckel für diese Platte kann eine kupferbeschichtete Fläche haben und eine Gummidichtung an der anderen Fläche enthalten. Durch diesen Deckel steht eine Reihe von "Stiften" vor, die sich ungefähr von der Gummifläche aus erstrecken und die mit der kupferbeschichteten Fläche in Verbindung stehen, um Wärme von dem Deckel zu übertragen. Die Vorrichtung in dem Beispiel, das sich auf die vorliegende Erfindung bezieht, erwärmt oder kühlt die kupferbeschichtete Fläche und die Stifte der Vorrichtung in der vorliegenden Erfindung. Die kupferbeschichtete Fläche und die Stifte übertragen Wärme schnell oder leiten Wärme von den Stiften ab. Die Stifte ihrerseits übertragen Wärme oder leiten Wärme aus der Probe ab.
Die vorliegende Erfindung beschreibt eine Vorrichtung, in der die Vertiefungen einer Platte mit 1536 Vertiefungen beispielsweise gleichmäßig erwärmt werden können, indem eine Wärme- oder Kühlquelle über den Deckel direkt in die Vertiefung hinein wirkt, wobei die Stifte in direktem Kontakt mit der flüssigen Probe sind, so dass sie Wärme in die Probe(n) hinein oder aus ihr heraus leiten können. Bei einem Beispiel, das sich auf die vorliegende Erfindung bezieht, befinden sich die Stifte in der Nähe der flüssigen Probe(n).
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die beigefügten Zeichnungen, die enthalten sind und einen Teil der Patentbeschreibung bilden, stellen die Ausführungen der vorliegenden Erfindung dar und dienen zusammen mit der Beschreibung der Erläuterung der Prinzipien der Erfindung.
1 zeigt einen Deckel mit einer kupferbeschichteten Fläche an einer Seite gemäß der vorliegenden Erfindung.
2 stellt einen Deckel gemäß der vorliegenden Erfindung dar, der eine Kupfer-Silikonkautschuk-Schicht, die auf die untere Fläche aufgetragen ist, und Stifte durch den Deckel hindurch aufweist.
2B ist eine vergrößerte Ansicht des in 2A dargestellten Deckels.
3 ist eine 2 ähnelnde Seitenansicht, die die Position des Deckels mit Stiften in Bezug auf die Mikrotiterplatte darstellt.
4 ist eine Lochpositionierung an dem Deckel zum Einführen der 32 × 48-Stiftanordnung und Arretierungen für die Platten-Positionierkomponente.
5 stellt eine Presspassung des Stiftes dar, durch die dieser fest in dem Loch in dem Deckel sitzt und in direktem Kontakt mit der kupferbeschichteten Fläche ist.
6 ist eine Perspektivansicht einer Platten-Positionierkomponente und ihrer Rolle beim Schutz der Stiftanordnung gegenüber Beschädigung.
7 ist eine Perspektivansicht einer Einrichtung, die Wärme zuführen oder Wärme von den Deckeln ableiten kann.
Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführung
Beim Beschreiben der bevorzugten Ausführung der Erfindung wird der Klarheit halber spezielle Terminologie gewählt. Die Erfindung soll jedoch nicht auf diese ausgewählten speziellen Begriffe beschränkt sein, und es versteht sich, dass jeder spezielle Begriff alle technischen Äquivalente einschließt, die auf ähnliche Weise arbeiten, um einen ähnlichen Zweck zu erzielen.
Die vorliegende Erfindung besteht, wie unter Bezugnahme auf 1 zu sehen ist, aus einem Deckel 10, der Wärme auf flüssigen Proben 95 überträgt, die in einer Well- bzw. Mikrotiterplatte 99 aufbewahrt sind. In einer bevorzugten Ausführung kann eine Einrichtung zum Regulieren der Temperatur des Deckels 10 in dem Wärmeübertragungsdeckel enthalten sein.
Der Deckel 10 muss in der Lage sein, Wärme zu leiten. In einer ersten bevorzugten Ausführung ist der Deckel 10 aus einem Leitenplattenmaterial aufgebaut, das dem Deckel Steifigkeit verleiht. Eine Leiterplatte besteht normalerweise aus einem Polymerträger 12 und kann, wie in 1 dargestellt, eine Kupferüberzugsschicht 14 aufweisen. Die Überzugsschicht kann konkret aus jedem beliebigen geeigneten Metall bestehen und ist vorzugsweise ein Material, das Wärme leitet.
Der Deckel 10 ist vorzugsweise so eingerichtet, dass er durch Reibung oder Passung auf eine Mikrotiterplatte 99 aufgesetzt wird. Eine Einrichtung zum Erwärmen und Kühlen des Deckels ist an dem Deckel 10 angebracht. Die Nähe des Deckels 10 zu den flüssigen Proben 95 in der Mikrotiterplatte 99 steuert die Temperatur der flüssigen Proben. Diese Ausführung ist die grundlegendste Ausführung gemäß der vorliegenden Erfindung. Wenn der Deckel eine kupferbeschichtete Fläche hat, befindet sie sich an der "Ober"seite des Deckels entfernt von den flüssigen Proben. Die kupferbeschichtete Fläche verteilt die Wärme gleichmäßiger über den Deckel 10, ist jedoch für diese Ausführung nicht von entscheidender Bedeutung.
Eine zweite primäre Ausführung ist in 2A, 2B und 3 dargestellt. Der Träger 12 des Deckels 10 hat eine kupferbeschichtete oben liegende bzw. obere Schicht 14. Die kupferüberzogene Schicht 14 dient, wie bereits erläutert, dazu, Wärme gleichmäßig über die gesamte Oberseite des Deckels 10 zu verteilen. Die der Kupferbeschichtung gegenüberliegende Seite kann mit einer dünnen Schicht aus Silikonkautschuk 16 oder einem ähnlichen Material beschichtet sein. Die Silikonkautschuk-Beschichtung 16 trägt dazu bei, den Deckel auf der Mikrotiterplatte 99 abzudichten, so dass Wasserverlust (Verdampfung) der Lösung während der wiederholten Erwärmungs- und Abkühlzyklen unterdrückt wird. Wenn jedoch der Deckel 10 so ausgeführt ist, dass er durch Reibung mit der Mikrotiterplatte 99 in Eingriff kommt, ist möglicherweise nur eine Umfangsbeschichtung aus Silikonkautschuk oder keinerlei Silikonkautschuk erforderlich.
Ein oder mehrere Stifte 18 stehen mit der kupferbeschichteten Fläche des Deckels 10 in Verbindung, um Wärme von der Oberseite des Deckels über die Länge der Stifte 18 zu übertragen.
In einer bevorzugten Ausführung sind eine Vielzahl von Löchern, die im Wesentlichen den Durchmesser der Stifte 18 haben, die eingesetzt werden, in eine Anordnung mit Dimensionen in den Deckel 10 gebohrt, die den Dimensionen der Mikrotiterplatte 99 entsprechen, die verwendet wird. Bei einer Platte mit 1536 Vertiefungen, die eine 32 × 48-Anordnung von Vertiefungen hat, würden die Löcher beispielsweise in einer 32 × 48-Anordnung mit einem Mittenabstand von 2,25 mm gebohrt, wie dies in 4 dargestellt ist. Die 1.536 Stifte 18 werden dann durch diese Löcher hindurch so eingeführt, dass sie über die Silikondichtung hinaus vorstehen, wie dies in 2A, 2B und 3 dargestellt ist. Der Tiefe einer Standardplatte mit 1536 Vertiefungen entsprechend stehen die Stifte ungefähr 3 mm von der Unterseite des Deckels 10 vor.
Die Stifte werden so in den Deckel 10 pressgepasst, dass jeder Stift in direktem Kontakt mit der Kupferbeschichtung ist, wie dies in 5 dargestellt ist. Um dies zu erreichen, können Rändelungen nahe an dem oberen Ende jedes Stiftes 18 ausgebildet sein. Des Weiteren kann ein Kopf an jedem Stift 18 verhindern, dass er vollständig durch das Loch gleitet. Für den Fachmann liegt auf der Hand, dass andere Mittel zum Anbringen der Stifte verwendet werden können, so beispielsweise Löten des oberen Endes jedes Stiftes an die kupferbeschichtete Fläche 14.
Die Stifte können von der Seite mit der Kupferbeschichtung (d.h. der Oberseite des Deckels) vorstehen oder auch nicht. Wenn die Stifte über die kupferbeschichtete Fläche des Deckels vorstehen, sollte dies vorzugsweise 0,2 mm nicht überschreiten.
Die Stifte können aus jedem beliebigen Material aufgebaut sein, das in der Lage ist, Wärme zu leiten. In der bevorzugten Ausführungsform sind die Stifte aus mit Zinn/Blei beschichtetem Messingdraht aufgebaut. Andere Materialien, wie beispielsweise Aluminium, Gold, Kupfer oder andere Metalle, könnten zusammen mit bestimmten keramischen und Kunststoffmaterialien verwendet werden.
Ein Abschnitt des Stiftes 18, der von der unteren Seite des Deckels vorsteht, ist so ausgeführt, dass er Kontakt mit der Probe herstellt, die in der jeweiligen Vertiefung aufbewahrt wird (siehe 3). Für den Fachmann liegt auf der Hand, dass die Stiftlängen und die Menge der flüssigen Probe so eingestellt werden können, dass gewährleistet wird, dass die Stifte wenigstens teilweise in die flüssige Probe eingetaucht sind. Dementsprechend ändert sich, wenn die Temperatur des Deckels geändert wird, die Temperatur der Stifte, um so die Probe direkt zu erwärmen oder abzukühlen.
Ein Vorteil dieses Systems ist das Verhältnis des Volumens des "Stiftes" der Erwärmungs-/Kühlvorrichtung im Vergleich zu dem Volumen der Probe. Bei diesem System hat die Erwärmungs-/Kühlvorrichtung, die direkt in die Probe eingeführt wird, ein Volumen von ungefähr 10% des Flüssigkeitsvolumens. Dieser Stift mit dem vergleichsweise großen Volumen gewährleistet schnelles Temperaturgleichgewicht in der Probe. Des Weiteren kann der Stift 18 so ausgeführt werden, dass die Fläche maximiert wird, so dass die Wärmeübertragung zwischen der flüssigen Probe und dem Stift optimiert wird. Je größer die Querschnittsfläche des Stiftes, umso schneller wird die Wärme übertragen.
Der Fachmann weiß, dass, wenn der Stift 18 direkt mit der flüssigen Probe in Kontakt kommt, die Temperatur der Probe schneller auf eine gewünschte Temperatur gebracht werden kann. Wenn jedoch die Stifte so ausgeführt sind, dass sie nicht direkt mit der flüssigen Probe in Kontakt kommen, ändert sich die Temperatur der Probe dennoch aufgrund der Nähe jeder Probe zu ihrem entsprechenden Stift 18.
Unter bestimmten Umständen kann es notwendig sein, dass die Metallstifte mit einem Kunststoff oder einem anderen inerten Material beschichtet sind, so dass das Metall die Reaktion nicht stört, die in den Proben stattfinden soll. Wenn dies der Fall ist, können die Stifte mit Gold, Polypropylen, Polystyrol oder anderen Metallen, Kunststoffen oder keramischen Stoffen beschichtet sein, die biologisch inert sind.
Die Stifte in der bevorzugten Ausführung sind zylindrisch geformt. Es könnten jedoch auch rechteckige, sechseckige, elliptische, sternförmige oder anders geformte Stäbe verwendet werden.
Die Spitze des Stiftes, die in die Flüssigkeit hinein vorsteht, kann konkav oder konvex sein, kann Grate oder andere Strukturen aufweisen, die kleine Mengen an Flüssigkeit einschließen können. Ein Vorteil dieses Systems besteht darin, dass, nachdem die PCR- oder Cycle-Sequencing-Reaktion abgeschlossen ist, der Deckel entnommen und als eine Aufbewahrungsvorrichtung für eine geringe Menge des Materials in der Vertiefung verwendet werden kann. Wenn die Reaktion wiederholt werden muss, kann der Deckel erneut verwendet werden, um eine neue Probe mit den kleinen Mengen der Proben zu erzeugen, die an den Stiften haften. Der Deckel 10 kann auch verwendet werden, um kleine Mengen an Probe auf andere Substrate aufzubringen.
Wenn der Deckel 10 mit Metall beschichtet ist, können die Stifte entweder reihen- oder spaltenweise oder einzeln erwärmt werden, indem einfach die Metallbeschichtung so eingeschnitten wird, dass zwei oder mehr separate Bereiche individuell erwärmt oder abgekühlt werden können. In diesem Fall sollte die Thermal-Cycle-Vorrichtung in Form einer Peltier-Vorrichtung so aufgebaut sein, dass die Peltier-Wärme in direktem Kontakt mit einer Reihe oder Spalte von Stiften gebracht werden kann.
Der Deckel 10 enthält, wie unter Bezugnahme auf 2A, 3 und 6 zu sehen ist, zwei oder mehr Kunststoffklammern 90, die verschiedene Zwecke erfüllen. Zunächst dienen diese Kunststoffteile dazu, den Deckel so auf der Platte zu positionieren, dass die Stifte direkt in die entsprechende Vertiefung eingeführt werden. Diese Kunststoffklammern 90 dienen auch dazu, die Stifte sowohl vor Verunreinigung als auch vor potenziellem Schaden zu schützen, wie dies in 6 dargestellt ist.
Die tatsächliche thermische Masse, die in dieser Vorrichtung erwärmt oder abgekühlt werden muss, ist sehr gering und enthält die dünne Lage der Kupferbeschichtung auf der Oberfläche des Deckels sowie der Stiftanordnung. Diese niedrige thermische Masse er möglicht es, die Temperatur des Systems sehr schnell zu ändern, und thermisches Gleichgewicht wird schnell erreicht.
Die Platte mit 1536 Vertiefungen ist auf Basis der von der Society for Biomolecular Screening (SBS) vorgeschlagenen Standardplattenkonfiguration aufgebaut. Die Gesamtabmessungen der Platte sind die folgenden: 85,48 mm breit, 127,76 mm lang und 14,75 mm hoch. An der Platte mit 1536 Vertiefungen beträgt der Mittenabstand von Vertiefung zu Vertiefung 2,25 mm und an der Platte mit 384 Vertiefungen 4,5 mm. Die Platte entspricht dem SBS-Standard in jeder Hinsicht bis auf die in 4 dargestellten Positionierungsschlitze 80 zur Aufnahme des PCR-Deckels. An beiden kurzen Seiten der Platte sind Positionierschlitze so ausgebildet, dass der Deckel 10 ohne Erwärmungs-/Kühlstifte, die mit den Seitenwänden der Vertiefungen in Kontakt kommen, direkt auf der Platte positioniert werden kann.
Eine automatisierte Vorrichtung zum Positionieren des Deckels auf der Mikrotiterplatte durch Ausrichten der Stifte auf ihre entsprechende Vertiefung kann, wie in 7 dargestellt, leicht konstruiert werden. Solange die gleiche rechteckige Anordnung von Stiften, die der rechteckigen Anordnung von Vertiefungen entspricht, verwendet wird, kann ein Deckel 10 zur Verwendung mit jeder beliebigen Mikrotiterplatte konstruiert werden.
In einer bevorzugten Ausführung ist die Thermal-Cycling-Vorrichtung so ausgeführt, dass sie von einer bis zu sechs Platten aufnimmt, d.h. die Platten können entweder 96, 384 oder 1536 Vertiefungen haben. Das System kann, wenn es vollständig mit sechs Platten mit 1536 Vertiefungen beschickt ist, jeweils mehr als 9000 Proben verarbeiten.
Die Thermal-Cycling-Schale, auf die die Platten aufgelegt werden, enthält ein Arretiersystem, das jede Platte genau in der Cycling-Einrichtung positioniert. Diese Schale steht zu dem Benutzer nach außen vor und kann entweder manuell oder durch Roboter mit Platten gefüllt werden, wie dies in 7 dargestellt ist. Wenn die Schale wieder in die Thermal-Cycling-Vorrichtung zurückbewegt wird, wird eine Druckplatte nach unten in Kontakt mit dem Deckel gebracht. Diese Druckplatte übt einen leichten Druck auf den Deckel 10 aus und bewirkt, dass er auf die Platte 99 gedrückt wird. Durch diese Wirkung wird die Gummidichtung 16 um jede der Vertiefungen her zusammengedrückt, so dass jede Vertiefung luft- und flüssigkeitsdicht wird.
Temperatursteuerung in der Thermal-Cycling-Vorrichtung kann durch Mischen von zwei Luftquellen durchgeführt werden. Die erste bzw. "Heiß"-Luftquelle wird hergestellt, indem Luft über eine Widerstands-Heizwendel geleitet wird, um die Lufttemperatur auf über 250°C zu bringen. Die zweite bzw. "Kalt"-Luftquelle wird hergestellt, indem Luft über eine Kühleinheit geleitet wird, die die Luft auf 10°C abkühlt. Diese zwei Luftquellen werden dann im richtigen Verhältnis in der Wirbelkammer gemischt, um Luft mit der richtigen Temperatur zu erzeugen. Luft aus der Wirbelkammer wird dann über die kupferbeschichtete Fläche der Deckel 10 in der Probenkammer geleitet. Diese konditionierte Luft erwärmt oder kühlt dann die kupferbeschichtete Fläche 14 und die Kupferstifte 18 des Deckels. Wenn die Stifte erwärmen oder abkühlen, wird Wärme über die Stifte den Proben entweder direkt zugeführt oder über die Stifte direkt aus den Proben abgeleitet und an der kupferbeschichteten Fläche 14 des Deckels 10 verteilt.
Temperatursteuerung kann auch durch den Einsatz einer Peltier-Vorrichtung direkt an der kupferbeschichteten Fläche des Deckels erreicht werden. In diesem Fall wird das Erwärmungs-Kühl-System direkt in die Klemmvorrichtung integriert, so dass, wenn der Deckel auf die Platte geklemmt wird, die Peltier-Vorrichtung auf die kupferbeschichtete Fläche des Deckels gedrückt wird. Durch das Anlegen von Strom an die Peltier-Vorrichtung wird dann eine Fläche der Peltier-Vorrichtung erwärmt, während die andere Seite gekühlt wird. Umkehrung des Stromflusses führt zur Umkehrung der warmen und der kalten Fläche.
Wenn sich die Peltier-Vorrichtung erwärmt, wird die Wärmeenergie auf den kupferbeschichteten Teil des Deckels übertragen. Ähnlich wie bei der Ausführung, bei der Luft zum Regulieren der Temperatur der Bogen verwendet wird, überträgt der Deckel seine Energie auf die Stifte und schließlich auf die Proben.
Andere Mittel zum Erwärmen und Kühlen des Deckels können verwendet werden. So kann beispielsweise ein Metallblock, der auf die geeignete Temperatur entweder erwärmt oder abgekühlt worden ist, eingesetzt werden, um die Temperatur des Deckels 10 und letztlich der flüssigen Proben zu regulieren.
Obwohl die vorliegende Erfindung unter Bezugnahme auf spezifische Ausführungen beschrieben und dargestellt worden ist, weiß der Fachmann, dass verschiedene Änderungen und Abwandlungen vorgenommen werden können, die eindeutig in den Schutzum fang der vorliegenden Erfindung fallen. Die vorliegende Erfindung soll innerhalb des Schutzumfangs der beigefügten Ansprüche weitgehend geschützt sein.

Claims

Vorrichtung zur Steuerung der Temperatur einer flüssigen Probe (95), die in mindestens einer Kavität einer Mikrotiterplatte (99) aufbewahrt ist, wobei die Vorrichtung folgendes umfasst: einen Deckel (10), der aus einem wärmehaltenden Material hergestellt ist, wobei der Deckel so bemessen ist, dass er die Oberseite der Mikrotiterplatte bedeckt, und der Deckel einen wärmeleitenden Abschnitt (14) umfasst, der auf einer Seite des Deckels aufgetragen ist, die der Seite des Deckels gegenüberliegt, welcher der Mikrotiterplatte zugewandt ist; mindestens einen wärmeleitenden Stift (18), der zur Kommunikation mit dem wärmeleitenden Abschnitt des Deckels angeordnet ist, wobei der mindestens eine Stift dafür ausgelegt ist, in die Kavität eingeführt zu werden, die Kavität jedoch nicht physikalisch zu berühren, und der Stift eine derartige Länge aufweist, dass er sich in die Kavität erstreckt, und so ausgelegt ist, dass er die flüssige Probe in der Kavität physikalisch berührt, so dass die Wärme von dem wärmeleitenden Abschnitt des Deckels auf den Stift und schließlich auf die flüssige Probe übertragen wird.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei der wärmeleitende Abschnitt des Deckels ein Metall umfasst.
Vorrichtung nach Anspruch 2, wobei das Metall aus der Gruppe von Metallen ausgewählt wird, die folgendes umfasst: Kupfer, Aluminium, Gold, Silber, Platin, Zinn, Blei oder eine Kombination davon.
Vorrichtung nach Anspruch 1, die des weiteren ein Mittel zum Erwärmen und Kühlen umfasst, das dafür ausgelegt ist, mit dem Deckel zu kommunizieren, um Wärme auf den Deckel zu übertragen.
Vorrichtung nach Anspruch 4, die des weiteren ein Mittel zum Regeln der Temperatur des Mittels zum Erwärmen und Kühlen umfasst, wodurch die Temperatur des Deckels geregelt wird.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Anzahl von Stiften der Anzahl von Kavitäten in der Mikrotiterplatte entspricht.
Vorrichtung nach Anspruch 6, wobei der Deckel eine Mikrotiterplatte bedeckt, die ein Kavitätengitter von 32 Kavitäten mal 48 Kavitäten aufweist.
Vorrichtung nach Anspruch 6, die des weiteren eine Beschichtung umfasst, die auf den Stift aufgetragen ist und einer Reaktion mit der Lösung widersteht, wenn der Stift in Kontakt mit der Lösung angeordnet wird.
Vorrichtung nach Anspruch 8, wobei die Beschichtung eine Art von Polymer ist.
Vorrichtung nach Anspruch 6, wobei jeder Stift in Form eines Hohlrohrs hergestellt ist, so dass der Stift durch Kapillarwirkung eine kleine Menge Flüssigkeit halten kann.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei der Deckel eine Mikrotiterplatte mit einem Kavitätengitter von 16 Kavitäten mal 24 Kavitäten bedeckt.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei der Deckel eine Mikrotiterplatte mit einem Kavitätengitter von 6 Kavitäten mal 12 Kavitäten bedeckt.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei der wärmehaltende Abschnitt des Deckels aus der Gruppe von Materialien ausgewählt wird, die folgendes umfasst: Keramik, Kunststoff, Graphit oder Halbleiter.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei der Deckel des weiteren ein Mittel (16) zum Bilden einer luftdichten Dichtung zwischen dem Deckel und der Mikrotiterplatte umfasst.
Vorrichtung, um eine flüssige Probe (95) einer thermischen Kreislaufführung zu unterziehen, wobei die Vorrichtung folgendes umfasst: a) eine Platte (99) mit mindestens einer Kavität zum Halten der Flüssigkeit; b) eine Vorrichtung nach Anspruch 1; c) ein Mittel zum Steuern der Temperatur des Deckels und der zugehörigen Stifte, wodurch die Temperatur der Flüssigkeit geregelt wird.
Vorrichtung nach Anspruch 15, die des weiteren eine Kupferplattierung auf der oberen Fläche des Deckels umfasst.