DE60025344T2

DE60025344T2 - Synergistische wirkungen von amlodipin und dem hydroxylierten metabolit von atorvastatin

Info

Publication number: DE60025344T2
Application number: DE60025344T
Authority: DE
Inventors: R. Preston Manchester Mason
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1999-04-23
Filing date: 2000-04-18
Publication date: 2006-09-28
Anticipated expiration: 2020-04-19
Also published as: PL351408A1; IL146085A0; EP1173172A1; DE60025344D1; ES2256005T3; TNSN00085A1; EP1173172A4; UY26118A1; PE20010055A1; WO2000064443A9; WO2000064443A1; EP1173172B1; NO20015128L; DK1173172T3; HUP0201016A3; BG106115A; EA004435B1; SK15382001A3; HK1043741A1; AU4647000A

Description

Diese Anmeldung beansprucht Priorität vor den folgenden vier vorläufigen Patentanmeldungen: US-Anmeldung Nr. 60/130,665, angemeldet am 23. April 1999; US-Anmeldung Nr. 60/145,305, angemeldet am 23. Juli 1999; US-Anmeldung Nr. 60/151,121, angemeldet am 27. August 1999; und US-Anmeldung Nr. 60/166,592, angemeldet am 19. November 1999, und stellt eine Teilfortführungsanmeldung unserer US-Anmeldung, Eingangsnummer 09/556,930, angemeldet am 21. April 2000, dar.
Gebiet der Erfindung
Gegenstand der Erfindung sind pharmazeutische Zusammensetzungen und Kombinationen zur Behandlung einer arteriellen und verwandten Herzkrankheit und verwandten Erkrankungen.
Hintergrund der Erfindung
Die koronare Herzkrankheit (KHK) stellt die führende Ursache für Mortalität in der entwickelten Welt dar und geht auch mit erheblicher Morbidität einher. Der Patient mit KHK leidet in der Regel an mehreren konkomitierenden Erkrankungen, einschließlich Hypertonie, Diabetes und Dyslipidämie, die das Gesamtrisiko für einen schlechten Ausgang erhöhen und die Behandlung komplizieren.
Unter den antihypertonischen Therapien stellt der lipophile Calciumkanalblocker (CCB) des Dihydropyridintyps, Amlodipin-Besylat (AML), ein sehr gut verträgliches Mittel mit etabliertem Sicherheits- und Wirksamkeitsnachweis für die Behandlung der Hypertonie und Angina pectoris dar. Vor kurzem wurde in der PREVENT-Studie (Prospective Randomized Evaluation of the Vascular Effects of Norvasc^® (AML)) eine potenzielle therapeutische Rolle für AML in der Behandlung von Patienten mit KHK gezeigt. In dieser dreijährigen Studie wurden die Wirkungen von AML im Vergleich zu Placebo auf die Entwicklung und Progression atherosklerotischer Läsionen in den Koronararterien und Carotiden unter Patienten mit dokumentierter KHK bewertet (Byington RP, Miller ME, Herrington D, et al. Rationale, design, and baseline characteristics of the Prospective Randomised Evaluation of the Vascular Effects of Norvasc Trial (PREVENT). Am. J Cardiol. 1997; 80:1087–1090). Die Ergebnisse von PREVENT zeigten mit der AML-Therapie beeindruckende klinische Vorteile, einschließlich einer 30%igen Gesamtreduktion bedeutender dokumentierter Ereignisse oder Verfahren (Byington RP, Chen J, Furberg CD, Pitt B. Effect of amlodipine on cardiovascular events and procedures. J. Am. Coll. Cardiol. 1999; 33:314A und Pitt B, Byington RP, Hunninghake DB, Mancini J, Miller ME, Riley W. Effect of amlodipine on the progression of atherosclerosis and occurrence of clinical events. Circulation 2000; 102:1503–1510). Die AML-Therapie wurde, wie durch die Ultraschall-Beurteilungen im B-Mode gemessen wurde, auch mit einer signifikanten Verlangsamung der Progression der Atherosklerose der Carotiden in Zusammenhang gebracht (Byington R, Riley W, Booth D, et al. Effect of amlodipine on progression of carotid atherosclerosis in patients with documented heart disease. Am. J Hypertens. 1999; 12:42A–43A und Pitt B, Byington RP, Hunninghake DB, Mancini J, Miller ME, Riley W. Effect of amlodipine on the progression of atherosclerosis and occurrence of clinical events. Circulation 2000; 102:1503–1510). Der mit AML verzeichnete klinische Vorteil bei KHK wurde mit anderen CCB, einschließlich Mitteln des Dihydropyridintyps, die zur Untersuchung dieser Frage verwendet wurden, verglichen (Waters D, Lesperance J, Francetich M, et al. A controlled clinical trial to assess the effect of calcium channel blocker on the progression of coronary atherosclerosis. Circulation 1990; 82:1940–1953; Lichtlen PR, Hugenholtz PG, Rafflenbeul W, et al. Retardation of coronary artery disease in humans by the calcium-channel blocker nifedipine: Results of the INTACT study (International Nifedipine Trial on Antiatherosclerotic Therapy). Cardiovasc. Drugs Ther. 1990; 4:S 1047–S1068; Borhani NO, Mercuri M, Borhani PA, et al. Final outcome results of the Multicenter Isradipine Diuretic Atherosclerosis Study (MIDAS). A randomized controlled trial. JAMA 1996; 276:785–791). Diese Beobachtung hat zu einem Interesse an den potenziellen antiatherogenen Eigenschaften von AML, einschließlich Wirkungen als Antioxidans, die von der Calciumkanalmodulation unabhängig sind, geführt (Mason RP, Leeds PR, Jacob RE, et al. Inhibition of excessive neuronal apoptosis by the calcium antagonist amlodipine and antioxidants in cerebellar granule cells. J. Neurochem. 1999; 72:1448–1456; Tulenko TN, Laury-Kleintop L, Walter MF, Mason RP. Cholesterol, calcium and atherosclerosis: Is there a role for calcium channel blockers in atheroprotection? Int. J. Cardiol, 1997; 62 (2 Suppl):55S–66S; Kramsch DM, Sharma RC. Limits of lipid-lowering therapy: The benefits of amlodipine as an anti-atherosclerotic agent. J. Hum. Hypertens. 1995; 9 (Suppl 1:S3–S9); und Mason RP, Walter MF, Trumbore MW, Olmstead EG, Mason PE. Membrane antioxidant effects of the charged dihydropyridine calcium antagonist amlodipine. J. Mol. Cell. Cardiol. 1999; 31:275–281.
Es wurde auch nachgewiesen, dass die hypolipidämische Therapie bei der Reduktion der mit der KHK einhergehenden Morbidität und Mortalität sehr nützlich ist. Von den ortho- und para-hydroxylierten Metaboliten von Atorvastatin (ATM) wurde gezeigt, dass sie Wirkungen als Antioxidans in Lipoproteinpräparationen aufweisen (Aviram M, Rosenblat M, Bisgaier CL, Newton RS. Atorvastatin and gemfibrozil metabolites but not the parent drugs are potent antioxidants against lipoprotein oxidation. Atherosclerosis 1998: 138:271–280). Die ortho-, meta- und para-hydroxylierten Metaboliten von Atorvastatin (ATM) und ihre Herstellungsverfahren sind in US-Patent 5,385,929 ersichtlich.
Derzeit gibt es jedoch keine pharmazeutische Zusammensetzung, mit der sowohl die Hypertonie als auch die Hyperlipidämie behandelt werden kann. Eine derartige pharmazeutische Zusammensetzung würde mehrere Vorteile mit sich bringen. So könnten zum Beispiel die mehrfachen Risikofaktoren für eine arterielle und verwandte Herzkrankheit, die oft bei einem individuellen Patienten vorliegen, gleichzeitig in Angriff genommen werden. Außerdem könnte die Leichtigkeit der Einnahme von nur einer kombinierten Dosierung die Patienten-Compliance mit den therapeutischen Regimen signifikant verbessern.
Gegenstand dieser Erfindung ist deshalb die Bereitstellung einer Kombinationstherapie, mit der die an der arteriellen und verwandten Herzkrankheit beteiligten mehrfachen pathologischen Vorgänge behandelt werden können.
Diese schließen Hypertonie und Hyperlipidämie ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Gegenstand dieser Erfindung ist auch die Entwicklung nützlicher und bequemer Dosierungen und Formen eines solchen Kombinationstherapeutikums. Diese pharmazeutische Zusammensetzung würde bevorzugt synergistische Wirkungen auf diese Kennzeichen der arteriellen und verwandten Herzkrankheit dergestalt aufweisen, dass die individuellen Wirkungen der Bestandteile dieser Zusammensetzung durch ihre Kombination verstärkt würden.
Diese Erfindung umfasst folglich ein therapeutisches Ziel zur Behandlung der KHK, die mit der Entwicklung von Arzneimitteln verbunden ist, die gleichzeitig mehrfache zugrundeliegende Krankheitsgeschehen targetieren, die zur Atherosklerose beitragen, wodurch der Krankheitsverlauf verändert wird. Wenn die Anwendung eines Antihypertonikums und HMG-CoA-Reduktase-Inhibitors in einem einzelnen Abgabesystem kombiniert würde, könnte die KHK-Therapie unter erfindungsgemäßer Anwendung folglich zu erhöhten positiven Outcomes führen.
Zusammenfassung der Erfindung
Wenn AML und ATM kombiniert wurden, wiesen sie unerwartet eine synergistische Wirkung bei der Verhinderung der Lipidperoxidation in humanen Lipoproteinen niedriger Dichte (LDL) und Lipidmembranen auf. Die Aktivität der Kombination wird für synergistisch gehalten, da die gemessene Wirkung signifikant über jedwede Additivwirkungen der beiden Arzneimittel hinausging. Deshalb weisen diese Mittel bisher unerkannt gewesene synergistische Antioxidans-Wirkungen auf, eine Eigenschaft, die diese Mittel in die Lage versetzen würde, die Resistenz von LDL und Gefäßzellmembranen gegen die oxidative Modifikation während der Atherogenese zu steigern. Die oxidative Modifikation von Lipiden ist in der Tat eine gut etablierte Ursache der Verletzung des Endothels und der darunter liegenden glatten Muskulatur (Ross R. Atherosclerosis. An inflammatory disease. N. Engl. J Med. 1999; 340:115–126; Diaz MN, Frei B, Vita JA, Kearney JF. Antioxidants and atherosclerotic heart disease. N. Eng. J. Med. 1997; 337:408–416). Lipophile Mittel, die vor Lipidperoxidation schützen, haben in verschiedenen Atherosklerose-Modellen ebenso wie in klinischen Studien gezeigt, dass sie die Entwicklung von Läsionen reduzieren (Diaz MN, Frei B, Vita JA, Keaney JF. Antioxidants and atherosclerotic heart disease. N Engl. J. Med. 1997; 337:408–416). Der mit der hypolipidämischen Therapie assoziierte Vorteil wird sowohl seiner Wirkung auf die Spiegel von Lipoproteinen sehr niedriger Dichte (VLDL), LDL und Lipoproteinen hoher Dichte (HDL) im Plasma und als Folge einer Reduktion bei der potenziellen Bildung atherogener oxidierter Lipoproteine zugeschrieben.
Wissenschaftliche Analysen, welche die kombinierte Anwendung von AML (Norvasc^®) und ATM in einem einzelnen Abgabesystem zur Behandlung der kardiovaskulären Erkrankung unterstützen, werden erfindungsgemäß beschrieben. Es wurden spezifisch die synergistischen Antioxidans-Aktivitäten des Calciumkanalblockers AML und des aktiven hydroxylierten Metabolits des HMG-CoA-Reduktase-Inhibitors Atorvastatin, ATM, in humanem LDL und den mit mehrfach ungesättigten Fettsäuren (PUFA) angereicherten Lipidmembranen, dem wichtigsten Target für eine Oxyradikal-Schädigung bei Atherosklerose bewertet. Die synergistischen Wirkungen dieser Mittel wurden in Membranen nachgewiesen, die in Gegenwart von Cholesterin präpariert wurden. Die Kombination aus AML mit ATM bewirkte eine dramatische und anhaltende Reduktion der Oxyradikal-Schädigung des Lipids in Konzentrationen so niedrig wie 10,0 nM. Die mit der Kombination dieser Arzneimittel bei therapeutischen Konzentrationen assoziierte dosisabhängige Antioxidans-Aktivität war hoch synergistisch und konnte durch das endogene Mittel, Vitamin E, nicht wirksam reproduziert werden. Eine Antioxidans-Aktivität wurde jedoch nicht beobachtet, wenn AML mit anderen HMG-CoA-Reduktase-Inhibitoren, einschließlich Lovastatin und Mevastatin kombiniert wurde. Wie anhand der Röntgenbeugung und von chemischen Analysen bestimmt, kann die für diese Arzneimittelkombination beschriebene distinkte Aktivität den starken physikalisch-chemischen Interaktionen mit der Membran-Doppelschicht zugeschrieben werden, die von den gut charakterisierten Wirkungen dieser Arzneimittel auf den Calciumtransport und den Cholesterinmetabolismus unabhängig sind. Dieser synergistische Vorteil des Antioxidans stellt einen neuen pharmakologischen Wirkmechanismus für diese Verbindungen, und eine zwingende Rationale für die kombinierte Anwendung der Wirkstoffe in Norvasc^® und ATM in der Behandlung der kardiovaskulären Erkrankung durch Senkung der LDL-Spiegel im Plasma und Verbesserung des Schutzes vor LDL und der Zellmembranen vor Oxidation dar. Diese neue Eigenschaft komplementiert die etablierten Wirkungen dieser Arzneimittel auf die Hypertonie und Dyslipidämie.
Andere erfindungsgemäße Gegenstände, Merkmale und Vorteile gehen aus der folgenden ausführlichen Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen hervor, die im Zusammenhang mit den beiliegenden Zeichnungen zu betrachten sind, worin:
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 die synergistischen Wirkungen von AML und ATM auf die Lipidperoxidation bei einer niedrigen therapeutischen Konzentration des Arzneimittels (100,0 nM) in Membranen, die physiologische Cholesterinspiegel enthalten, zeigt. x stellt die Inhibition der Lipidperoxidation in % dar und y stellt die Behandlung mit Amlodipin (AML), dem Atorvastatin-Metaboliten (ATM) und der Kombinationen aus sowohl (AML + ATM) in einer Konzentration von 100 nM dar. Bei den Werten handelt es sich um den Mittelwert ± der Standardabweichung für n 6. *** zeigt p < 0,01 versus der Kontrolle und anderen Behandlungen an;
2 die dosisabhängige Antioxidans-Wirkung der Kombination von AML und ATM über einen breiten Konzentrationsbereich (0,01 bis 10,0 μM) zeigt. x stellt die Inhibition der Lipidperoxidation in % dar und y stellt die Behandlung mit der Kombination aus AML und ATM in den angegebenen mikromolaren Konzentrationen dar. Bei den Werten handelt es sich um den Mittelwert ± der Standardabweichung für n = 6.*** zeigt p < 0,001 versus der Kontrolle und anderen Behandlungen an;
3 die einzigartige Antioxidans-Aktivität der AMUATM-Kombination gegenüber Vitamin E als eine Funktion der Zeit bei einer identischen Konzentration (10,0 μm) zeigt. x stellt die Inhibition der Lipidperoxidation in % dar und y stellt die Behandlung mit der Kombination von Amlodipin und dem Atorvastatin-Metaboliten (AML + ATM), dunkel schattiertes Feld, oder Vitamin E (E), schraffiertes Feld, beide bei 10 μM dar. Bei den Werten handelt es sich um den Mittelwert ± der Standardabweichung für n = 6 bis 12. *** zeigt p < 0,001 versus der Kontrolle und anderen Behandlungen an;
4A–4D die Stellen der Protonenabspaltung (S1, S2 und S3) für ATM, die zur Antioxidans-Aktivität in 4A beitragen, zusammen mit Berechnungen der Resonanzstabilisation (4B bis 4D) zeigen;
5 die Vergleichswirkungen der Antioxidans-Aktivität von AML zeigt, wenn es mit verschiedenen HMG-CoA-Reduktase-Inhibitoren bei der gleichen Konzentration kombiniert wird. x stellt die Inhibition der Lipidperoxidation in % dar und y stellt die Behandlung mit der Kombination von Amlodipin und dem Atorvastatin-Metaboliten (AML + ATM), dunkel schattiertes Feld; Amlodipin und Mevastatin (AML + M), schraffiertes Feld; oder Amlodipin und Lovastatin (AML + L), keine Inhibition der Lipidperoxidation; alle bei 1,0 μM dar. Bei den Werten handelt es sich um den Mittelwert ± der Standardabweichung für n = 6 bis 12. *** zeigt p < 0,001 versus der Kontrolle und anderen Behandlungen an;
6A–6B die synergistischen Antoxidans-Wirkungen von AML und ATM in humanen LDL-Proben im Vergleich zu Trolox C (lösliches Vitamin E) zeigt. In (6A) stellt x die Bildung von bei einer Absorption von 532 nm gemessenen reaktiven Thiobarbitursäure-Substanzen (TBARS) dar und y stellt die Zeit in Stunden dar. Die Kontrolle ist durch ausgefüllte Kreise mit ausgezogenen Linien angezeigt, Trolox C (lösliches Vitamin E) ist mit ausgefüllten invertierten Dreiecken mit kleinen gestrichelten Linien angezeigt, AML allein ist durch offene Rauten mit langen gestrichelten Linien angezeigt, ATM allein ist durch offene Kreise mit alternierenden langen und kurzen gestrichelten Linien angezeigt und AML und ATM sind durch ausgefüllte Vierecke mit gepunkteten Linien angezeigt. In (6B) stellt x die Bildung von bei einer Absorption von 532 nm gemessenen reaktiven Thiobarbitursäure-Substanzen (TBARS) dar und y stellt die Behandlung mit der Kombination aus Amlodipin (AML), dunkel schattiertes Feld; Atorvastatin-Metabolit (ATM), schraffiertes Feld; oder Amlodipin und Atorvastatin-Metabolit (AML + ATM), dunkel schattiertes Feld, in einer Konzentration von 3,0 μM dar. Bei den Werten handelt es sich um den Mittelwert ± die Standardabweichung. *** zeigt p < 0,001 versus der Kontrolle und anderen Behandlungen an;
7 die berechneten Enthalpien für ATM, AML und ihre entsprechenden Radikal-Spezies zeigt;
8A–8C die Röntgenbeugungsbestimmung der getrennten versus der kombinierten Lipidmembran-Interaktionen von AML und ATM zeigt. x stellt die relative Elektronendichte dar und y stellt Ångstrom von der Mitte der Lipid-Doppelschicht dar. In allen drei Feldern stellt die Kontrolle die durchgezogene Linie dar; in 8A stellt AML die gepunktete Linie dar; in 8B stellt ATM die gepunktete Linie dar; in 8C stellt die Kombination aus AML und ATM die gepunktete Linie dar. Die dunkel schattierten Bereiche in jedem Feld stellen den Unterschied der Elektronendichten zwischen den Profilen der Elektronendichte für die Kontrolle und Behandlung dar;
9 die getrennten versus die kombinierten Wirkungen von AML und ATM auf die Abmessungen der Membran-Doppelschicht wie durch die Röntgenbeugungsanalyse bestimmt zeigt. x stellt die Veränderung der Membranbreite in Ångstrom dar und y stellt die Behandlung mit AML, dunkel schattiertes Feld; ATM, schraffiertes Feld; und die Kombination aus AML und ATM, schraffiertes Feld, dar. Bei den Werten handelt es sich um den Mittelwert ± der Standardabweichung. *** zeigt p < 0,001 versus Kontrolle und andere Behandlungen an.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Synergistische Antioxidans-Wirkungen von Amlodipin mit dem Atorvastatin-Metaboliten in Lipidmembranen: Die getrennten und kombinierten dosisabhängigen Antioxidans-Aktivitäten von AML und ATM wurden in Membranvesikeln getestet, die aus mit Cholesterin und den PUFA, Dilinoleoylphosphatidylcholin, in einem Molverhältnis von 0,5:1, angereicherten Phospholipiden rekonstituiert wurden. Die Membranvesikel wurden in diesen Experimenten aus den folgenden Gründen verwendet: 1) Dieses System ist gut definiert und hoch reproduzierbar; 2) Linolsäure stellt das primäre Target für die oxidative Schädigung dar und kommt häufig in Gefäßzellmembranen und Lipoproteinpartikeln vor; 3) dieses Membransystem enthält keine Calciumkanäle oder das HMG-CoA-Reduktaseenzym und 4) die Lipidperoxidation in diesem System kann bei 37 °C in Abwesenheit von exogenen chemischen Initiatoren, wie zum Beispiel hohen Eisen- und Ascorbat-Konzentrationen, spontan initiiert werden. In diesen Experimenten trat die Oxidation auf eine graduelle, zeitabhängige Weise auf, die über eine Zeitdauer von 72 h spektralphotometrisch gemessen wurde.
In 1 wurde die synergistische Antioxidans-Aktivität von AML und ATM in Membranvesikeln nachgewiesen, die sich aus Cholesterin und Phospholipid in Konzentrationen, die nahezu physiologische Bedingungen reproduzieren, zusammensetzten (Tulenko TN, Chen M, Mason PE, Mason RP. Physical effects of cholesterol on arterial smooth muscle membranes: Evidence of immiscible cholesterol domains and alterations in bilayer width during atherogenesis. J Lipid. Res. 1998; 39:947–956). Bei 100,0 nM führte nur das ATM getrennt eine signifikante Inhibition (9 % bezogen auf die Kontrolle) der Lipidoxidation in dieser mit Cholesterin angereicherten Membranpräparation herbei. Wenn diese Mittel jedoch kombiniert wurden, nahm der Inhibitionsgrad um 33 % zu, wobei es sich um eine Wirkung handelt, die signifikant (p < 0,01) größer als die für die Mittel getrennt gemessene handelt. Die Antioxidans-Aktivität der Kombination war sehr offensichtlich: die Arzneimittel inhibierten die Lipidperoxidbildung (> 5 × 10² μM) bei einer Konzentration von 100,0 nM (die Kontrollkonzentration der Lipidperoxidbildung betrug 1,6 mM). Diese Arzneimittelkombination rief eine Wirkung hervor, die über einen breiten Konzentrationsbereich hinweg hoch dosisabhängig war (2). Eine signifikante Inhibition (p < 0,05) wurde bei so niedrig wie 10,0 nM mit einer IC₅₀ von 500,0 μM beobachtet. Eine größer als 90%ige Inhibition (> 1 mM Lipidoxidbildung) wurde bei einer Konzentration von 10,0 μM für die Kombination beobachtet (2). Die Tatsache, dass eine Inhibition bei submikromolaren Konzentrationen beobachtet wurde, deutet darauf hin, dass der mit der Kombination von AML und ATM beobachtete Nutzen von therapeutischer Relevanz ist.
Die Wirkung der Kombination als Antioxidans persistierte im Verlauf der Zeit auf eine Weise, die mittels Vitamin E, selbst bei einer erhöhten Konzentration (10,0 μM) nicht reproduziert werden konnte (3). Diese Beobachtung ist konsistent mit dem Konzept, dass Vitamin E oder α-Tocopherol während des Lipidperoxodationsvorgangs graduell verbraucht wird. Im Gegensatz dazu wurde die Aktivität der AML/ATM-Kombination durch die Länge der Inkubationsperiode, worin sich die Gesamtlipidperoxid-Konzentration beim 72-h-Zeitpunkt auf 2,2 mM erhöhte, nicht beeinflusst.
Die erhöhte Polarität von ATM, die durch seine zusätzliche Hydroxygruppe vermittelt wurde, kann stärkere Interaktionen mit der formell geladenen AML erleichtern, was zu distinkten Interaktionen mit Phospholipid-Molekülen führt, wie anhand der Röntgenbeugungsanalyse belegt wurde. Die mit dem ATM assoziierte zusätzliche Hydroxygruppe stellt auch ein zusätzlich abspaltbares Proton bereit, das an radikalische Moleküle abgegeben werden kann (4). Nach dem Verlust des Protons kann das verbleibende ungepaarte freie Elektron in Resonanzstrukturen des Metaboliten, wie in 4 gezeigt, wirksam stabilisiert werden. Die distinkte Antioxidans-Aktivität der Kombination aus AML mit ATM ist durch die Beobachtung angezeigt, dass eine ähnliche Wirkung nicht reproduziert werden konnte, wenn AML mit jedem der beiden anderen Statine (Mevastatin und Lovastatin), wie in 5 ersichtlich ist, kombiniert wurde.
Die Ergebnisse von in vivo-Untersuchungen haben eine wichtige Rolle für lipophile Antioxidantien bei der Reduktion der kardiovaskulären Morbidität und Mortalität, insbesondere der KHK, angezeigt. LDL-Partikel mit einer größeren Resistenz gegen oxidative Schädigung weisen eine reduzierte Cytotoxizität auf, greifen weniger häufig in die sich vom Endothel herleitende Stickstoffmonoxidbildung ein und tragen nicht zu einer Schaumzellbildung bei (Diaz MN, Frei B, Vita JA, Keaney JF.
Antioxidants and atheroscleoritic heart disease. N.
Engl. J Med. 1997; 337:408–416). Es wurde gezeigt, dass die Supplementierung mit einem Antioxidans die LDL-Resistenz gegen die oxidative Modifikation und die Reduktion der Cytotoxizität von Endothelzellen steigert (Belcher JD, Balla J, Balla G, et al. Vitamin E, LDL, and endothelium. Brief oral vitamin supplementation prevents oxidized LDL-mediated vascular injury in vitro. Arterioscler. Thromb. 1993; 13:1779–1789). Probucol, ein lipophiles Antioxidans, schwächte die Bildung atherosklerotischer Plaques in mit Cholesterin gefütterten Primaten ab, eine Wirkung, die mit der erhöhten Resistenz von LDL gegen oxidative Schädigung korrelierte (Sasahara M, Raines EW, Chait A, et al. Inhibition of hypercholesterolemia-induced atherosclerosis in the nonhuman primate by probucol. I. Is the extent of atherosclerosis related to resistance of LDL to oxidation? J Clin. Invest. 1994; 94:155–164). Dieses Antioxidans inhibierte die Bildung von Läsionen bei Watanabe hereditablen hyperlipidämischen Kaninchen (WHHL-Kaninchen), bei denen es sich um ein gut charakterisiertes Tiermodell der Atherosklerose handelt, die von den Cholesterin senkenden Wirkungen unabhängig sind (Carew TE, Schwenke DC, Steinberg D. Antiatherogenic effect of probucol unrelated to its hypocholesterolemic effect: Evidence that antioxidants in vivo can selectively inhibit low density lipoprotein degradation in macrophage-rich fatty streaks and slow the progression of atherosclerosis in the Watanabe heritable hyperlipidemic rabbit. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1987; 84:7725–7729). Über diese Tierstudien hinausgehend hat eine Placebo-kontrollierte klinische Prüfung nachgewiesen, dass Probucol die Restenose bei Patienten mit KHK nach einer Koronararterien-Ballonangioplastie, vermutlich aufgrund seiner Wirkungen als Antioxidans, um 47 % reduzierte. (Tardif JC, Cote G, Lesperance J, et al. Probucol and multivitamins in the prevention of restenosis after coronary angioplasty. Multivitamins and Probucol Study Group. N. Engl. J. Med. 1997; 337:365–372). In einer getrennten Studie wurde nachgewiesen, dass Probucol, im Gegensatz zu Antioxidans-Vitaminen eine vorteilhafte Wirkung auf das vaskuläre Remodelling bei Patienten ausübte, die sich einer Angioplastie unterzogen, wie durch intravasale Ultraschallverfahren ermittelt wurde (Cote G, Tardif J-C, Lesperance J, et al. Effects of probucol on vascular remodeling after coronary angioplasty. Circulation 1999; 99:30–35).
Folglich stellt ein Überblick über verfügbare Daten eine mechanistische Rationale zur Verwendung von lipophilen Antioxidantien zum Eingreifen in mit der KHK assoziierten Entzündungsgeschehen bereit. Durch Steigerung der Resistenz von LDL und Gefäßzellmembranen gegen oxidative Schädigung können Mittel mit Antioxidans-Aktivität während der Atherogenese wirksam in pathologische Veränderungen in der Gefäßwand eingreifen. Diese Vorgänge schließen folgende ein, sind aber nicht darauf beschränkt: Schaumzellbildung, endotheliale Dysfunktion und Toxizität, Leukozyten- und Thrombozytenadhäsion und arterieller Vasospasmus in der Folge eines Verlusts der normalen Stickstoffmonoxidbildung. Diese zellulären Beobachtungen unterstützen die epidemiologischen Analysen, die eine inverse Assoziation zwischen den Serumspiegeln bestimmter Antioxidantien und den mit der koronaren Herzkrankheit einhergehenden unerwünschten Ausgängen erkennen lassen (Stampfer MJ, Hennekens CH, Manson JE, Colditz GA, Rosner B, Willett WC. Vitamin E consumption and the risk of coronary disease in women. N. Engl. J. Med. 1993; 328:1450–1456; Rimm EB, Stampfer MJ, Ascherio A, Giovannucci E, Colditz GA, Willett WC. Vitamin E consumption and the risk of coronary heart disease in men. N Engl. J. Med. 1993; 328:1450–1456; Enstrom JE, Kanim LE, Klein MA. Vitamin C intake and mortality among a sample of the United States population. Epidemiology 1992; 3:194–202; Riemersma RA, Wood DA, Macintyre CC, Elton R, Gey KF, Oliver MF. Low plasma vitamins E and C. Increased risk of angina in Scottish men. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1989; 570:291–295; Ramirez J, Flowers NC. Leukocyte ascorbic acid and its relationship to coronary artery disease in man. Am. J. Clin. Nutr. 1980; 33:2079–2087; Hennekens CH, Buring JE, Manson JE, et al. Lack of effect of long-term supplementation with beta carotene on the incidence of malignant neoplasms and cardiovascular disease. N. Eng. J. Med. 1996; 334:1145–1149; Losonczy KG, Harris TB, Havlik RJ. Vitamin E and vitamin C supplement use and risk of all-cause and coronary heart disease mortality in older persons: The Established Populations for Epidemiologic Studies of the Elderly. Am. J. Clin. Nutr. 1996; 64:190–196). Mehrere dieser epidemiologischen Studien deuteten auf einen Vorteil mit Vitamin E, ein Antioxidans mit begrenzter Kapazität zum Eingreifen in die oxidative Modifikation hin. Die Ergebnisse dieser Studie würden vorhersagen, dass die Kombination von AML und ATM bei der Reduktion der die KHK begleitenden Gefäßverletzung signifikant wirksamer als Vitamin E ist.
Synergistische Antioxidans-Wirkungen von Amlodipin mit dem Hydroxy-Metaboliten von Atorvastatin in humanem LDL: Die getrennten und kombinierten Antioxidans-Wirkungen von AML und ATM wurden auch in humanen LDL-Präparationen bewertet. Die Fähigkeit dieser Mittel bei der Inhibition der LDL-Peroxidation wurde in vitro nach dem Zufügen von Kupfer (10,0 μM) durch Messen der Konzentrationen der reaktiven Thiobarbitursäure-Substanzen (TBARS), einem Marker der Lipidperoxidation, beurteilt. 6 zeigt, dass die Rate der LDL-Oxidation durch die Sigmoidkurven-Kinetik mit einer initialen lag-Phase, gefolgt von einer scharfen Propagations- und schließlich einer Plateauphase gekennzeichnet war (Esterbauer H, Gebicki J, Puhl H, Jurgens G. The role of lipid peroxidation and antioxidants in oxidative modification of LDL. Free Radic. Biol. Med. 1992; 13:341–390). Nach einer 4-stündigen Inkubationsperiode konnten differenzielle Wirkungen dieser Verbindungen bei einer Konzentration von 3,0 μM deutlich beobachtet werden. Im Vergleich zur Kontrolllipidperoxidation (100 % TBARS-Bildung) betrug die TBARS-Bildung für AML und ATM 93,3 ± 6% bzw. 65,6 ± 7 %. Bei Kombination betrug die TBARS-Bildung jedoch nur 29,3 ± 6 %, wobei es sich um Konzentrationen handelt, die signifikant (p < 0.01) niedriger als die für eines der beiden Arzneimittel allein beobachteten lagen. Die synergistische Antioxidans-Wirkung der Kombination persistierte zum Zeitpunkt von 6 h. Diese Befunde stellen einen weiteren Hinweis für die synergistische Aktivität bereit, die mit der in Membranvesikeln beobachteten konsistent ist, da die Arzneimittelkombination einen Inhibitionsgrad produzierte, der im Wesentlichen über ihre erwartete Additivwirkung hinausging. Die Antioxidans-Aktivität von Vitamin E war ähnlich der in diesen Experimenten für ATM allein beobachteten.
Chemische Mechanismen for die synergistische Aktivität von Amlodipin und dem Atorvastatin
Metaboliten: Die für diese Arzneimittelkombination in LDL und rekonstituierten Lipidmembranen beobachtete synergistische Antioxidans-Aktivität deutet darauf hin, dass diese Verbindungen zum Einfangen der Lipidradikalen direkt miteinander interagieren. Basierend auf den thermodynamischen Erwägungen (7) wird vorgeschlagen, dass ATM mit Lipidradikalen (Gleichung 1) schneller als in Gleichung 2 beschriebenes AML reagiert. Wenn es sich bei diesen um die einzigen zur Verfügung stehenden zwei Pfade für diese Arzneimittel handelt, wenn sie mit dem System zusammen zugefügt werden, dann wäre ihre kombinierte Wirkung lediglich additiv. Die Kombination beider Verbindungen stellt jedoch die Möglichkeit für einen dritten Pfad bereit (Gleichung 3), eine Alternative, die durch die Ergebnisse der Peroxidationsexperimente sowohl in LDS als auch Lipidmembranen unterstützt wird. Die Kombination von Pfaden 1 und 3 würde eine synergistische Wirkung hervorrufen, da sie rascher als Pfad 2 auftritt. Die semiempirischen Berechnungen deuten in der Tat darauf hin, dass Reaktion 3 einen günstigen exothermen Vorgang (Δ H_f = –40,7 kJ/mol) darstellt. Folglich aktiviert das Vorliegen des schnellen Inhibitors (ATM) den langsameren Inhibitor (AML) zur Entfernung der freien Radikalen schneller, als wenn die Reaktion mit den Lipidradikalen allein durchgeführt würde. Die drei Pfade, welche diese Interaktionen beschreiben, sind wie folgt, worin LOO• ein Lipidradikal darstellt:

(1) LOO• + ATM → LOOH + ATM• SCHNELL
(2) LOO• + AML → LOOH + AML• LANGSAM
(3) ATM• + AML → ATM + AML• SCHNELL

Aufgrund dieser Synergie zwischen AML und ATM steht der rezyklierte Metabolit nun zum zusätzlichen Einfangen von Lipidradikalen zur Verfügung. Insgesamt basieren die Unterschiede in den Inhibitionsraten zwischen AML und ATM teilweise auf den berechneten Enthalpien für diese Verbindungen und ihre entsprechenden Radikale (7). Je kleiner (d. h. je negativer) der ΔH_f-Wert, um so günstiger ist die mit der Radikalbildung einhergehende Wasserstoffabspaltung. Sobald gebildet, kann das mit der Radikalspezies assoziierte ungepaarte Radikal in Resonanzstrukturen stabilisiert werden.
Molekulare Membran-Interaktionen von Amlodipin und dem Atorvastatin-Metaboliten:
Es wurden kleinwinklige Röntgenbeugungs-Ansätze zur Untersuchung der molekularen Membran-Interaktionen der AML- und ATM-Kombination verwendet. Dieses hoch quantitative Verfahren stellt direkte Informationen über die Struktur der Lipid-Doppelschicht der Membran in An- und Abwesenheit der Arzneimittel dar. Es wurde zuvor berichtet, dass AML im Vergleich zu anderen CCB eine hohe Affinität zu Membranlipiden (K_p > 10³) unter atherosklerotischen Bedingungen aufweist (Mason RP, Moissey DM, Shajenko L. Cholesterol alters the binding of Ca²⁺ channel blockers to the membrane lipid bilayer. Mol. Pharmacol. 1992; 41:315–321). Die distinkte Lipophilität von AML wird seiner amphiphilen chemischen Struktur zugeschrieben, die das Molekül an eine vorteilhafte Stelle in der Membran leitet, wo es dann in die Propagation freier Radikale durch sowohl biophysikalische als auch biochemische Mechanismen, wie zuvor ausführlich von meinem Labor beschrieben wurde, eingreift (Mason RP, Leeds PR, Jacob RF, et al. Inhibition of excessive neuronal apoptosis by the calcium antagonist amlodipine and antioxydants in cerebellar granule cells. J. Neurochem. 1999; 72:1448–1456; Mason RP, Moisey DM, Shajenko L. Cholesterol alters the binding of Ca²⁺ channel blockers to the membrane lipid bilayer. Mol. Pharmacol. 1992; 41:315–321; Mason RP, Campbell SF, Wang SD, Herbette LG. Comparison of location and binding for the positively charged 1,4-dihydropyridine calcium channel antagonist amlodipine with uncharged drugs of this class in cardiac membranes. Mol. Pharmacol. 1989; 36:634–640; Mason RP, Walter MF, Trumbore MW, Olmstead Jr. EG, Mason PE. Membrane antioxidant effects of the charged dihydropyridine calcium antagonist amlodipine. J. Mol. Cell. Cardiol. 1999; 31:275–281. In Membranen, die nicht mit Cholesterin angereichert sind, inhibierte Amlodipin die Lipidperoxidation auf eine Weise, die von anderen CCB oder dem Angiotensin-Converting-Enzyme-Inhibitor (ACE-Inhibitor), Captopril, nicht reproduziert werden konnte (Mason RP, Walter MF, Trumbore MW, Olmstead Jr. EG, Mason PE. Membrane antioxidant effects of the charged dihydropyridine calcium antagonist amlodipin. J. Mol. Cell. Cardiol. 1999; 31:275–281). Auf gleiche Weise weist die chemische Struktur des Atorvastatin-Metaboliten amphiphile Eigenschaften auf, die dem Arzneimittel ermöglichen würden, mit der Lipid-Doppelschicht der Membran stark zu interagieren, wie vor kurzem von meinem Labor berichtet wurde (Mason RP. Inhibition of oxidative damage to low density lipoproteins and isolated membranes by atorvastatin and its active metabolite. J Am. Coll. Cardiol. 2000; 35:317A).
Für diese Studien wurde die Kombination aus AML und ATM den Membranvesikeln, die aus Cholesterol und Phospholipid bei einem Molverhältnis von 0,5:1 rekonstituiert wurden, zugefügt (8). Die Röntgenbeugungsanalyse von den Membranproben produzierte starke und reproduzierbare Beugungsmuster für die repräsentative Kontrolle und die Arzneimittel enthaltenden Proben. In Abwesenheit des Arzneimittels betrug die Breite der Membran-Doppelschicht, einschließlich der Oberflächenhydratation insgesamt 55,5 % mit einer Kopfgruppen-Trennung in der Doppelschicht (Intrabilayer) von 44 %. Das Zufügen der beiden Arzneimittel zusammen in einem Verhältnis von Arzneimittel zu Phospholipid von 1:15 produzierten distinkte Veränderungen in der Struktur und Organisation der Phospholipid-Doppelschicht im Vergleich zu den Arzneimitteln, die getrennt zugefügt wurden (8). In Anwesenheit der Arzneimittel-Kombination wurde die Breite der Membran-Doppelschicht, einschließlich der Oberflächen-Hydratation insgesamt auf 53,5 Å mit einer Kopfgruppen-Trennung in der Doppelschicht von 41 Å reduziert. Getrennt betrugen die Breiten der Membran-Doppelschicht, die AML und ATM allein enthielten, 54,8 Å bzw. 58,0 Å (9). Diese strukturellen Befunde stellen einen direkten Hinweis bereit, dass die Kombination dieser Mittel die Stuktur von Lipidmolekülen, im Vergleich zu ihren getrennten Wirkungen, differenziell modulieren.
Die direkte Subtraktion der Elektronendichteprofile der Membran (Å versus Elektronen/Å³) ließ große Unterschiede in der Lipidstruktur erkennen, die dem Vorliegen der Arzneimittel zugeschrieben werden könnten (8). Das Zufügen der Arzneimittelkombination produzierte spezifisch eine mit dem oberen Kohlenwasserstoffkern/hydratisierte Kopfgruppenregion der Membran-Doppelschicht ± 11–21 Å vom Zentrum der Doppelschicht assoziierte breite Zunahme der Elektronendichte. Diese große Zunahme der Elektronendichte, verteilt über 10 Å, wird der Äquilibriumsstelle der Arzneimittel in der Membran zugeschrieben. Konkomitierend mit dieser Veränderung wurde eine mit der Region des zentralen Kohlenwasserstoffkerns der Membran, ± 0–11 Å, assoziierte beobachtete ungeordnete Wirkung beobachtet. Diese Abnahme der Elektronendichte ist auf eine Zunahme des molekularen Volumens zurückzuführen, das sich aus der Insertion der Arzneimittelmoleküle in eine Region von hoher molekularer Dichte in der Nähe des Kohlenwasserstoffkerns/der Wassergrenzfläche der Membran ergibt. Folglich kann aus diesen Daten geschlossen werden, dass die Insertion der Arzneimittelkombination in die Membran-Doppelschicht die intermolekularen Packungsrestriktionen der Phospholipid-Moleküle auf eine Weise ähnlich der verändern, die mit entweder der Reduktion des Cholesteringehalts oder der Erhöhung der Probentemperatur beobachtet wurde (Tulenko TN, Chen M, Mason PE, Mason RP. Physical effects of cholesterol on arterial smooth muscle membranes: Evidence of immiscible cholesterol domains and alterations in bilayer width during atherogenesis. J Lipid Res. 1998; 39:947–956; Chang HM, Reitstetter R, Mason RP, Gruener R. Attenuation of channel kinetics an conductance by cholesterol: An interpretation using structural stress as a unifying concept. J. Membr. Biol. 1995; 143:51–63). Es wurde gezeigt, dass solche Änderungen der biopysikalischen Eigenschaften in die Propagation von freien Radikalen durch die Matrix der Lipid-Doppelschicht eingreifen (McLean LR, Hagaman KA. Effect of lipid physical state on the rate of peroxidation of liposomes. Free Radic. Biol. Med. 1992; 12:113–119).
AML und ATM im Vergleich zur Arzneimittelkombination bewirkten aufgrund spezifischer Interaktionen mit konstituierenden Phospholipid-Molekülen getrennt distinkte Änderungen in der Membranstruktur (8 und 9). Während die Arzneimittelkombination eine Abnahme von 2 Å oder 4 % (p < 0,01) in der Membranbreite insgesamt bewirkte, führte der ATM getrennt eine 5%ige Steigerung (p < 0,01) der Breite (2,5 Å) herbei, während AML allein die Membranabmessungen, einschließlich der Kopfgruppen-Trennung in der Doppelschicht, nicht signifikant verändert. Im Vergleich zu AML allein produzierte ATM eine größere Reduktion der Elektronendichte im Kohlenwasserstoffkern. Diese Wirkung auf die Membranstuktur kann im Vergleich zu AML zu ihrer größeren Antioxidans-Potenz beitragen. Die Kombination von AML und ATM bewirkte eine neue Interaktionsstelle mit der Lipid-Doppelschicht der Membran zusätzlich zu ihren getrennten Stellen in der Membran (8).
Gegenstand dieser Erfindung ist deshalb eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend Amlodipin und dem Atorvastatin-Metaboliten. Diese individuellen Pharmazeutika können in Kombination oder getrennt in Salzen, Formen und Dosierungen formuliert werden, die maximales therapeutisches Ansprechen herbeiführen. Diese Kombinationstherapie ist zur Behandlung der verschiedenen pathophysiologischen Manifestationen einer arteriellen und verwandten Herzkrankheit, einschließlich, aber nicht beschränkt darauf, Hypertonie, Hyperlipidämie, Atherosklerose, Arteriosklerose, koronare Herzkrankheit, Myokardinfarkt, kardiale Stauungsinsuffizienz, Schlaganfall und Angina pectoris bestimmt. Diese Kombinationstherapie wird spezifisch zur Senkung des Blutdrucks und der systemischen Lipidkonzentrationen ebenso wie den verwandten pathophysiologischen Ergebnissen hinsichtlich des Mangels ihrer Regulation, einschließlich, aber nicht begrenzt auf die arterielle Schwächung und Plaque-Ablagerung ausgelegt. Die Wirkungen dieser individuellen Mittel auf diese mit einer arteriellen und verwandten Herzkrankheit in Zusammenhang stehenden verschiedenen Vorgänge und Ereignisse, wenn sie in Kombination verwendet werden, können additiv und/oder synergistisch sein. Der Fachmann wird nun erkennen, dass andere Ausführungsformen, Verbesserungen, Einzelheiten vorgenommen werden können und Gebrauch davon gemacht werden kann, die mit der Urkunde und dem Gedanken der vorstehenden Offenbarung und im Rahmen dieses Patents und den anhängenden Ansprüchen konsistent sind.
Experimentelle Verfahren
Dilinoleoyl-phosphatidylcholin (DLPC), 1-Palmitoyl-2-oleoyl-phosphatidylcholin (POPC) und nicht verestertes Cholesterin wurden von Avanti Polar Lipids Inc. (Alabaster, AL) bezogen und bei –80 °C gelagert. Aliquote von LDL (L-2139) aus humanem Plasma wurden von der Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) bezogen. Sephadex G-25 M (PD-10) Säulen wurden von Pharmacia Biotech Inc. (Piscataway, NJ) erworben. Amlodipin-Besylat wurde von Pfizer Central Research (Groton, CT) bezogen, während der Hydroxy-Metabolit von Atorvastatin von Parke Davis (Ann Arbor, MI) bezogen wurde. Vitamin E, Trolox (ein Vitamin E-Analogon), Lovastatin und Mevastatin wurden von der Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) erworben.
Membran-Lipidperoxidationsanalyse: Die getrennten und kombinierten dosisabhängigen Antioxidans-Aktivitäten dieser Mittel wurden in Membranen untersucht, die mit bei einem Molverhältnis von Cholesterin zu Phospholipid von 0,5 hergestellten PUFA angereichert wurden (Mason RP, Walter MF, Trumbore MW, Olmstead Jr. EG, Mason PE. Membrane antioxidant effects of the charged dihydropyridine calcium antagonist amlodipine. J. Mol. Cell. Cardiol. 1999; 31:275–281.
Das für diese Proben verwendete Lipid (Dilinoleoyl-phosphatidylcholin und Cholesterin) wurde in Chloroform von HPLC-Gütegrad (25,0 mg/ml) aufgelöst. Ein Aliquot der Lipide (1,0 mg) wurde individuellen Glasreagenzröhrchen (13 × 100 mm) zugefügt und das Chloroform wurde mittels Shell Drying unter einem stetigen N₂-Gasstrom entfernt. Die Lipide wurden in An- oder Abwesenheit von (einem) in Ethanol aufgelösten Arzneimittel(n) getrocknet. Das rückständige Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt, während die Proben vor Licht geschützt wurden. Die Membranvesikel wurden durch rasches Mischen der getrockneten Lipide bei Raumtemperatur nach de Zugabe von 1,0 ml mit HEPES gepufferter Kochsalzlösung (0,5 mM HEPES und 15 ,0 mM NaCl, pH 7,2) hergestellt. Die Phospholipid-Endkonzentration betrug 1,0 mg/ml Puffer und die Endkonzentration des Arzneimittels lag im Bereich von 10,0 nM bis 10,0 μM.
Die Membran-Lipidperoxidation wurde bei 37 °C in einem Schüttelwasserbad ohne Zufügen von exogenen Stimulantien, wie zuvor ausführlich beschrieben wurde, durchgeführt (Mason RP, Walter MF, Trumbore MW, Olmstead Jr. EG, Mason PE. Membrane antioxidant effects of the charged dihydropyridine calcium antagonist amlodipine. J. Mol. Cell. Cardiol. 1999; 31:275–281). Ein Aliquot einer Lipidprobe (10 bis 100 μl) wurde in verschiedenen Zeitintervallen (24, 48, 65, 72 h) entfernt, bevor 25 μl einer 5,0 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und 20 μl eines 35,0 mM butylierten Hydroxytoluens (BHT) der Probe zum Stoppen der Peroxidationsreaktion sofort zugefügt wurden.
Das Ausmaß der Membran-Lipidperoxidation wurde mit dem wie zuvor ausführlich beschriebenen CHOD-Iodid-Assays gemessen (El-Saadani M, Esterbauer H, el-Sayed M, Goher M, Nassar AY, Jurgens G. A spectrophotometric assay for lipid peroxides in serum lipoproteins using a commercially available reagent. J. Lipid. Res. 1989; 30:627–630). Die Menge von I₃ ^– wurde anhand der folgenden Reaktion gemessen, worin L ein Phospholipid-Molekül darstellt: LOOH + 2H⁺ + 2 I^– → LOH + H₂O + I₂ I₂ + I^– → I₃ ^–
Ein Aliquot der Membran-Probe wurde zu verschiedenen Zeitpunkten entnommen und dann einem CHOD-Farbreagens (1,0 ml) zugefügt (E.M. Science, Gibbstown, NJ), das 20,0 μM BHT, 24,0 μM EDTA und 0,2 % Triton-X enthielt. Die Probe wurde dann mit Folie abgedeckt und 2 h unter Lichtausschluss vor Messung der Absorption der Probe bei 365 nm (ε = 2,4 × 10⁴ M^–1cm^–1) inkubieren lassen. Die Hintergrundprobe wurde zusammen mit den Testproben in Dreifachbestimmng laufen lassen und enthält 76,7 μl HEPES (0,652 mM), 20 μl EDTA (5,0 mM) und 3,3 μl doppelt deionisiertes Wasser (DDI-Wasser). Das Ausmaß der Lipidperoxidation wurde für jede Arzneimittel-Konzentration und im Vergleich zu Kontrollproben, die kein Arzneimittel enthielten, in Dreifachbestimmung gemessen. Die statistische Signifikanz dieser Experimente wurde durch den ungepaarten t-Test bereitgestellt. Die Signifikanz wurde für p < 0,05 akzeptiert.
Bestimmung der LDL-Oxidation: Zusätzlich zu den Lipid-Membranen wurde die Antioxidans-Aktivität von AML und ATM in humanem LDL bewertet. Der EDTA-Gehalt der aus humanem Plasma gewonnenen LDL-Proben wurde mittels Gelfiltration mit PD-10 Sephadex G25-M-Filtrationssäulen entfernt; PBS (mit Stickstoff gespült) wurde als Eluent verwendet. Die LDL-Proben (50 μg Protein/ml) wurden dann mit oder ohne Arzneimittel (3,0 μM) 30 min bei 37 °C vorinkubiert. Die Oxidation von LDL wurde dann durch das Zufügen von 10,0 μM CuSO₄ induziert. Der zeitliche Verlauf der LDL-Oxidation, gemessen anhand der TBARS-Bildung, wurde 6 h bei 37 °C verfolgt (Mak IT, Kramer JH, Weglicki WB. Potentiation of free radical-induced lipid peroxidative injury to sarcolemmal membranes by lipid amphiphiles. J. Biol. Chem. 1986; 261:1153–1157). Der LDL-Oxidation, wie mittels der TBARS-Verfahren bestimmt, schloss sich die Sigmoidkurven-Kinetik mit einer initialen lag-Phase, gefolgt von einer scharfen Propagations- und endgültigen Plateau-Phase an (Esterbauer H, Gebicki J, Puhl H, Jurgens G. The role of lipid peroxidation and antioxidants in oxidative modification of LDL. Free Radic. Biol. Med. 1992; 13:341–390). Der Proteingehalt des LDL wurde unter Verwendung des Coomassie Plus Protein Assay-Kits von Pierce Chemical bestimmt. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 1976; 72:278–254).
Kleinwinklige Röntgenbeugungsanalyse: Kleinwinklige
Röntgenbeugungsanalysen wurden zur direkten Untersuchung der Molekularmembran-Interaktionen von AML und ATM verwendet. Die für diese Proben verwendeten Lipide (1-Palmitoyl-2-oleoyl-phosphatidylcholin und Cholesterin) wurden in Chloroform des HPLC-Gütegrads (10,0 mg/ml) aufgelöst. Die Membranvesikel wurden aus diesen Lipiden anhand des gleichen wie für die Peroxidationsexperimente beschriebenen Verfahrens hergestellt. Die Phospholipid-Endkonzentration betrug 5,0 mg/ml Puffer und das Molverhältnis von Arzneimittel zu Phospholipid lag bei 1:15. Die Membran-Proben wurden zur Beugungsanalyse ausgerichtet, wobei sie wie zuvor beschrieben der Zentrifugation unterzogen wurden (Chester DW, Herbette LG, Mason RP, Joslyn AF, Triggle DJ, Koppel DE. Diffusion of dihydropyridine calcium channel antagonists in cardiac sarcolemmal lipid multibilayers. Biophys. J. 1987; 52:1021–1030). Die Vesikel wurden, um es kurz zu fassen, in Sedimentationszellen platziert, die ein Aluminiumfoliensubstrat enthielten. Die Vesikel wurden 1,5 h bei 5 °C in einem SW-28-Rotor (Beckman Instruments Fullerton, CA) bei 35 000 × g sedimentiert. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand von den Pellets entfernt und die Proben wurden dann auf gekrümmte Glasträger aufgezogen. Die Proben wurden zur Kontrolle der relativen Feuchte und Temperatur, wie zuvor ausführlich beschrieben, während der Beugungsexperimente in fest verschlossene Behälter gegeben (Chester DW, Herbette LG, Mason RP, Joslyn AF, Triggle DJ, Koppel DE. Diffusion of dihydropyridin calcium channel antagonists in cardiac sarcolemmal lipid multibilayers. Biophys. J. 1987; 52:1021–1030).
Die Röntgenbeugungsexperimente wurden durch Aligning der Proben bei streifendem Eintritt in Bezug auf eine kollimierte, Nickel-filtrierte monochromatische Röntgenquelle (CuK_α 1,54 Å), die mittels eines Mikrofokus-Generators mit einer Drehanode von hoher Brillianz (Rigaku Rotaflex RU-200, Danvers, MA) durchgeführt wurde. Der linienförmige Strahl von fixierter Geometrie bestand aus einem einzelnen, Nickel-beschichteten Frankschen Spiegel zur Definition einer Linienquelle, worin K_α1 und K_α2 nicht aufgelöst sind. Die Beugungsdaten wurden an einem eindimensionalen positionssensitiven elektronischen Detektor (Innovative Technologies, Newburyport, MA) bei einer Entfernung von 150 mm von der Probe platziert. Jeder Meridionalbeugungspeak wurde wie zuvor beschrieben Lorentz- und Hintergrundkorrigiert (Mason RP, Gonye GE, Chester DW, Herbette LG. Partitioning and location of Bay K 8644, 1,4-dihydropyridine calcium channel agonist, in model and biological membranes. Biophys. J 1989; 55:769–778). Die Phasen für die Vierordnungsdaten wurden durch die Quellungsanalyse bestimmt (Moody MF. X-ray diffraction pattern of nerve myelin: A method for determining the phases. Science 1963; 142:1173–117). Die Fourier-Transformationen der Daten wurden aus den Beugungsdaten mit Origin-Software (Microcal Software, Northampton, MA) generiert.

Claims

Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend: (a) eine wirksame Amlodipin-Menge; (b) eine wirksame Menge eines hydroxylierten Atorvastatin-Metabolits (ATM); und (c) pharmazeutisch verträgliche Formulierungsmittel.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das Amlodipin als ein therapeutisch wirksames Amlodipin-Derivat bereitgestellt wird.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 2, worin das therapeutisch wirksame Amlodipin-Derivat Amlodipin-Besylat umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Anwendung bei der Reduktion des Risikos für eine arterielle und verwandte Herzkrankheit.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 4, worin die genannte arterielle und verwandte Herzkrankheit aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Hypertonie, Hyperlipidämie, Atherosklerose, Arteriosklerose, koronarer Herzkrankheit, Myokardinfarkt, kardialer Stauungsinsuffizienz, Schlaganfall und Angina pectoris.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Anwendung bei der Senkung des Blutdrucks.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 6, worin die genannte pharmazeutische Zusammensetzung den Blutdruck auf eine Höhe senkt, die mit einem reduzierten Risiko für eine arterielle und verwandte Herzkrankheit konsistent ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 6, worin die genannte pharmazeutische Zusammensetzung den Blutdruck auf eine Höhe senkt, die statistisch dem Normalbereich entspricht.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Anwendung bei der Senkung der systemischen Lipikonzentrationen.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 9, worin die genannte pharmazeutische Zusammensetzung die systemischen Lipidkonzentrationen auf eine Höhe senkt, die mit einem reduzierten Risiko für eine arterielle und verwandte Herzkrankheit konsistent ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 9, worin die genannte pharmazeutische Zusammensetzung die systemischen Lipikonzentrationen auf eine Höhe senkt, die statistisch dem Normalbereich entspricht.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Anwendung bei der Senkung des Blutdrucks und der systemischen Lipidkonzentrationen.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 12, worin die genannte pharmazeutische Zusammensetzung den Blutdruck und die systemischen Lipidkonzentrationen auf eine Höhe senkt, die mit einem reduzierten Risiko für eine arterielle und verwandte Herzkrankheit konsistent ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 12, worin die genannte pharmazeutische Zusammensetzung den Blutdruck und die systemischen Lipidkonzentrationen auf eine Höhe senkt, die statistisch dem Normalbereich entspricht.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Anwendung bei der gleichzeitigen Senkung des Blutdrucks und der systemischen Lipidkonzentrationen.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 15, worin die genannte pharmazeutische Zusammensetzung gleichzeitig den Blutdruck und die systemischen Lipidkonzentrationen auf eine Höhe senkt, die mit einem reduzierten Risiko für eine arterielle und verwandte Herzkrankheit konsistent ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 15, worin die genannte pharmazeutische Zusammensetzung gleichzeitig den Blutdruck und die systemischen Lipidkonzentrationen auf eine Höhe senkt, die statistisch dem Normalbereich entspricht.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Anwendung bei der synergistischen Senkung des Blutdrucks und der systemischen Lipidkonzentrationen.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 18, worin die genannte pharmazeutische Zusammensetzung den Blutdruck und die systemischen Lipidkonzentrationen synergistisch auf eine Höhe senkt, die mit einem reduzierten Risiko für eine arterielle und verwandte Herzkrankheit konsistent ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 18, worin die genannte pharmazeutische Zusammensetzung den Blutdruck und die systemischen Lipidkonzentrationen synergistisch auf eine Höhe senkt, die statistisch dem Normalbereich entspricht.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 15 bis 17 und 18 bis 20, worin die gleichzeitige Senkung des Blutdrucks und der systemischen Lipidkonzentrationen mindestens teilweise aus der reduzierten Lipidoxidation resultiert.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 21, worin Amlodipin und der Atorvastatin-Metabolit im gleichen Therapeutikum oder als getrennte Therapeutika oder gleichzeitig oder zu verschiedenen Zeiten verabreicht werden.
Verwendung einer Kombination aus Amlodipin und hydroxyliertem Atorvastatin-Metabolit zur Herstellung eines Arzneimittels zur Anwendung bei: (a) der Behandlung der arteriellen oder verwandten Herzkrankheit; oder (b) der weitgehenden Inhibition der Lipidperoxidation in LDL- und Lipidmembranen; oder (c) der weitgehenden Inhibition der Lipidoxidation und Senkung des Blutdrucks und der systemischen Lipidkonzentrationen; oder (d) der synergistischen Inhibition der Lipidoxidation.
Verwendung nach Anspruch 23, worin Amlodipin ein therapeutisch wirksames Amlodipin-Derivat umfasst.
Verwendung nach Anspruch 24, worin das therapeutisch wirksame Amlodipin-Derivat Amlodipin-Besylat umfasst.
Verwendung nach einem der Ansprüche 23 bis 25, worin das genannte Arzneimittel den Blutdruck und die systemischen Lipidkonzentrationen auf eine Höhe senkt, die mit einem reduzierten Risiko für eine arterielle und verwandte Herzkrankheit konsistent ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 23 bis 25, worin das genannte Arzneimittel den Blutdruck und die systemischen Lipidkonzentrationen auf eine Höhe senkt, die statistisch dem Normalbereich entspricht.
Verwendung nach einem der Ansprüche 23 bis 27, worin das Senken des Blutdrucks und der systemischen Lipidkonzentrationen mindestens teilweise aus der reduzierten Lipidoxidation resultiert.
Verwendung nach einem der Ansprüche 23 bis 25, worin das genannte Arzneimittel die Lipidoxidation bis zu einem Grad inhibiert, der mit einem reduzierten Risiko für eine arterielle und verwandte Herzkrankheit konsistent ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 23 bis 26 oder 29, worin die genannte arterielle und verwandte Herzkrankheit aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Hypertonie, Hyperlipidämie, Atherosklerose, Arteriosklerose, der koronaren Herzkrankheit, dem Myokardinfarkt, der kardialen Stauungsinsuffizienz, Schlaganfall und Angina pectoris.
Verwendung nach einem der Ansprüche 23 bis 25, worin das genannte Arzneimittel den Blutdruck und die systemischen Lipidkonzentrationen synergistisch auf eine Höhe senkt, die statistisch dem Normalbereich entspricht.
Verwendung nach Anspruch 31, worin die synergistische Senkung des Blutdrucks und der systemischen Lipidkonzentrationen mindestens teilweise aus der reduzierten Lipidoxidation resultiert.
Verwendung nach einem der Ansprüche 23 bis 32, worin Amlodipin und der Atorvastatin-Metabolit im gleichen Therapeutikum oder als getrennte Therapeutika oder gleichzeitig oder zu verschiedenen Zeiten verabreicht werden.