CZ20013793A3

CZ20013793A3 - Farmaceutický prostředek obsahující amlodipin, způsob léčby a způsob sniľování krevního tlaku

Info

Publication number: CZ20013793A3
Application number: CZ20013793A
Authority: CZ
Inventors: R. Preston Mason
Original assignee: R. Preston Mason
Priority date: 1999-04-23
Filing date: 2000-04-18
Publication date: 2002-05-15
Also published as: AU4647000A; UY26118A1; WO2000064443A9; WO2000064443A1; CA2370639A1; KR20020024581A; CN1351492A; TNSN00085A1; HUP0201016A3; SK15382001A3; SV2002000058A; PL351408A1; HUP0201016A2; HK1043741A1; NO20015128D0; PE20010055A1; AP2001002324A0; BR0010689A; IL146085A0; EP1173172A1

Description

FARMACEUTICKÝ PROSTŘEDEK OBSAHUJÍCÍ AMLODIPIN,

ZPŮSOB LÉČBY A ZPŮSOB SNIŽOVÁNÍ KREVNÍHO TLAKU.

Oblast techniky

Předkládaný vynález se zabývá farmaceutickými prostředky a jejich kombinacemi určenými k léčbě arteriálních srdečních chorob a příbuzných onemocnění.

Dosavadní stav techniky

Ischemická choroba srdeční (CAD) je hlavní příčinou úmrtnosti ve vyspělém světě a je také spojena s výraznou morbiditou. Pacient s ischemickou chorobou srdeční trpí několika průvodními jevy zahrnujícími vysoký krevní tlak, diabetes, dyslipidemii, které zvyšují celkové riziko špatných výsledků a komplikovaného průběhu léčby.

Mezi antihypertenzitivními terapiemi představuje lipofilní blokátor vápníkových kanálů (CCB) dihydropyridinového typu, amlodipinbesylat (AML), velmi dobře snášenou sloučeninu se zavedenými záznamy o bezpečnosti a účinnosti při léčbě vysokého krevního tlaku a angíny. Potenciální terapeutická úloha AML při léčbě pacientů s ischemickou chorobou srdeční byla nedávno popsána ve studii „Prospective randomized evaluation of the vascular effects of Norvasc® (AML) trial“ (PREVENT). Tyto tříleté zkoušky vyhodnocovaly účinky AML v porovnání s placebo na vývoj a postup atherosklerotických lézí ve věnčitých a karotických tepnách mezi pacienty se zaznamenanou CAD (Byington R. P., Miller Μ. E., Herrington D., et al., „Rationale, design and baseline characteristic of the prospective randomized evaluation of the vascular effects of vorvasc trial (PREVENT)“, Am. J. Cardiol. 1997, 80 : 1087 až 1090). Výsledky PREVENT prokázaly působivé klinické účinky AML terapie, zahrnující celkem 30 % pokles hlavních dokumentovaných případů nebo procedur (Byington R. P., Chen J., Furberg C. D., Pitt B., „Effect of amlodipine on cardiovascular events and procedures.“ J. Am. Coli. Cardiol. 1999, 33 : 314A a Pitt B., Byington R. P., Hunninghake D. B., Mancini J., Miller Μ. E., Riley W., „Effect of amlodipine on progression of carotid atherosclerosis and occurence of clinical events.“, Circulation 2000, 102, 1503 až 1510) AML Terapie byla také spojena s významným zpomalením rozvoje karotické atherosklerózy, což bylo určeno pomocí ultrasonografického stanovení v B-módu (Byington R. P., Riley W., Booth D., at al., „Effect of amlodipine on progression of carotid atherosclerosis in patients with documented heart disease.“, Am. J. Hypertens. 1999, 12 : 42A až 43A a Pitt B., Byington R. P., Hunninghake D. B., Mancini J., Miller Μ. E., Riley W., „Effect of amlodipine on the progression of atherosclerosis and occurence of clinical events.“, Circulation 2000, 102 : 1503 až 1510. Klinický účinek pozorovný u AML při léčbě CAD nebyl nikdy předtím zaznamenán u žádných jiných CCB, včetně sloučenin dihydropyridinového typu, které byly použity pro vyřešení této otázky (Waters D., Lesperance J., Francetich M., et al., „A controlled clinical trial to assess the effect of a calcium channel blocker on the progression of coronary atherosclerosis.“, Circulation 1990, 82 : 1940 až 1953, Lichten P. R., Hugenholtz P. G., Rafflenbeul W., et al., „Retardation of coronary artery disease in humans by the calcium channel blocker nifedipine: Results of the INTACT study (International nifedipine trial an atheriosclerotic therapy).“ Cardiovasc. Drugs. Ther. 1990, 4 : S1047 až S1068 a Borhani N. O., Mercuri M., Borhani P. A., at al., „Finál outcome results of the multicenter isradipine diuretic atherosclerosis study (MIDAS). A randomized controlled trial.“ JAMA 1996, 276 : 765 až 791). Toto pozorování vedlo k zvýšenému zájmu o potenciální antiatherogenické vlastnosti AML, zahrnující antioxidační účinky, které jsou nezávislé na modulaci vápníkových kanálů (Mason R. P., Leeds P. R., Jacob R. E., et al., „Inhibition of excessive neuronal apoptosis by the calcium antagonist amlodipine and antioxidants in cerebral granule cells.“, J. Neurochem. 1999, 72 : 1448 až 1456, Tulenko T. N., Laury-Kleitop L., Walter M. F., Mason R. P., „Cholesterol, calcium and atherosclerosis: Is there a role for calcium channel blockers in atheroprotection?“ Int. J. Cardiol. 1997, 62 (2 Suppl) : 55S až 66S, Kramsch D. M., Sharma R. C., „Limits of lipid-lowering therapy: The benefits of amlodipine as an anti-atherosclerotic agent.“ J. Hum. Hypertens. 1995, 9 (Suppl 1 : S3 až S9) a Mason R. P., Walter M. F., Trumbore M. W., Olmstead E. G., Mason P. E., „Membrane antioxidant effects of the charged dihydropyridine calcium antagonist amlodipine.“

J. Mol. Cell. Cardiol. 1999, 31 : 375 až 281).

Bylo prokázáno, že hypolipidemická terapie je také velmi užitečná při snižování morbidity a mortality spojené s CAD. Bylo zjištěno, že orto- a para-hydroxylované matabolity atorvastatinu ATM vykazují antioxidační účinky v lipoproteinových preparátech (Aviram M., Rosenblat M., Bisgaier C. L„ Newton R. S., „Atorvastatin and gemfíbrozil metabolites but not parent drugs, are potent antioxidants against lipoprotein oxidation.“ Atherosclerosis 1998, 138 : 271 až 280). Orto-, meta- a para-hydroxylované metabolity atorvastatinu (ATM) a způsoby jejich přípravy jsou popsány v patentu US 5 385 929.

V současnosti bohužel neexistuje farmaceutický prostředek, který by byl využitelný k léčbě jak vysokého krevního tlaku, tak i hyperlipidemie. Takový farmaceutický prostředek by

byl v mnoha směrech výhodný. Například četné rizikové faktory spojené s arteriálními a příbuznými srdečními onemocněními, které se často vyskytují u mnohých pacientů, by mohly být pokryty současně. Navíc by snadné podávání jedné kombinované farmaceutické dávky mohlo významně zlepšit dodržování léčebného režimu pacientů.

Předmětem předkládaného vynálezu je tedy poskytnout kombinovanou terapii, která by umožnila léčbu četných patologických procesů spojených s arteriálními a příbuznými srdečními onemocněními.

Tyto nemoci zahrnují mimo jiné vysoký krevní tlak a hyperlipidemii. Předmětem předkládaného vynálezu je také vyvinout vhodné formy a množství farmaceutických dávek tohoto kombinovaného léku. Je preferováno, aby tento farmaceutický prostředek vykazoval synergické účinky na tyto průvodní znaky arteriálních a příbuzných nemocí, tak že účinky jednotlivých složek tohoto vynálezu budou působením jejich kombinace posíleny.

Přdkládaný vynález tedy představuje terapeutický mezník při léčbě CAD, který vede k vývoji léků, které mohou současně postihnout mnohé zásadní patologické procesy přispívající k atheroskleróze a ovlivnit tak průběh této nemoci. S využitím tohoto vynálezu může léčba CAD vykazovat nárůst pozitivních výsledků, jestliže je použití antihypertenzitivní látky a inhibitoru HMG-CoA reduktasy spojeno do jednotného systému.

Podstata vynálezu

Překvapivě, když byly AML a ATM zkombinovány, vykazovaly synergický účinek při prevenci peroxidace lipidů v lidských nízkohustotních lipoproteinech (LDL) a lipidových membránách. Aktivita této kombinace je považována za synergickou, protože změřený účinek výrazně překročil všechny aditivní účinky těchto dvou léků. Tyto sloučeniny tedy vykazují dříve neznámé synergické antioxidační účinky, vlastnosti které umožňují těmto sloučeninám zvyšovat odolnost LDL a vaskulárních buněčných membrán proti oxidativní modifikaci během atherogeneze. Oxidativní modifikace lipidů je dobře prozkoumanou příčinou poškození endotelu a hladké svaloviny (Ross R., „Atherosclerosis - an inflammatory disease.“, N. Engl. J. Med. 1999, 340 : 115 až 126, Diaz Μ. N., Frei B., Vita J. A., Keaney J. F., „Antioxidants and atherosclerotic heart disease.“, N. Eng. J. Med. 1997, 337 : 408 až 416). Bylo zjištěno, že lipofilní sloučeniny které chrání před peroxidací lipidů přispívají k omezení rozvoje lézí v různých atherosklerotických modelech a v klinických studiích (Diaz Μ. N., Frei B., Vita J. A., Keaney J. F. „Antioxidants and atherosclerotic heart disease.“, N. Eng. J. Med. 1997, 337 : 408 až 416). Mimo to, je účinek spojený s hypolipidemickou terapií přisuzován jak účinku na ···· ···· ·*· • 0 · · · · • y · · ···· plazmatické velmi nízkohustotní lipoproteiny (VLDL), LDL a vysokohustotní lipoproteiny (HDL), tak, v důsledku, i na snížení možné tvorby atherogenických oxidovaných lipoproteinů.

V předkládaném vynálezu jsou popsány odborné analýzy, které podporují kombinované použití AML (Norvasc®) a ATM v jediném systému určeném k léčbě kardiovaskulárních nemocí. Synergické antioxidační aktivity blokátoru vápníkových kanálů, AML, a aktivního hydroxylovaného metabolitů inhibitoru HMG-CoA reduktasy atorvastatinu, ATM, byly určeny v lidských LDL a lipidových membránách bohatých na polynenasycené mastné kyseliny (PUFA), klíčové struktury podléhající poškozeni kyslíkovými radikály při atheroskleróze. Synergické účinky těchto sloučenin byly demonstrovány na membránách vytvořených v přítomnosti cholesterolu. Kombinace AML s ATM způsobila výraznou a trvalou inhibici poškození lipidů kyslíkovými radikály, již při velmi nižných koncentracích 10,0 nM. Antioxidační aktivita závislá na dávce spojená s kombinací těchto léků byla na terapeutické úrovni velmi synergická a nemohla být reprodukována pomocí endogenní látky, vitaminu E. Antioxidační aktivita ale nebyla pozorována v případě, kdy byl AML použit v kombinaci s jiným inhibitorem HMG-CoA reduktasy, jako je lovastatin nebo mevastatin. Jak bylo zjištěno pomocí x-paprskové difrakce a chemických analýz, může být výrazná aktivita popsaná pro tuto kombinaci léků spojena se silnými fyzikálně-chemickými interakcemi s membránovnou dvojvrstvou, nezávislými na dobře charakterizovaných účincích těchto léků na transport vápníku a metabolismus cholesterolu. Tento synergický antioxidační účinek představuje nový farmakologický mechanismus působení těchto chemických sloučenin a vede ke kombinovanému využití aktivních složek Norvasc® a ATM k léčbě kardiovaskulárních onemocnění snižováním obsahu LDL v krevní plazmě a zlepšováním ochrany LDL a buněčných membrán proti oxidaci. Tato nová vlastnost doplňuje známé účinky těchto léků při léčbě vysokého krevního tlaku a dyslipidemie.

Synergické antioxidační působení amlodipinu a atorvastatinového metabolitů na lipidové membrány:

Na dávce závislé antioxidační aktivity samotného AML a ATM a jejich kombinace byly stanoveny v membránových váčcích vytvořených z fosfolipidů obohacených o cholesterol a PUFA, dilinoleoylfosfatidylcholin, v molárním poměru 0,5 : 1. Membránové váčky byly pro tyto experimenty použity z následujících důvodů: 1) tento systém je dobře definovaný a vysoce reprodukovatelný, 2) linoleová kyselina představuje prvořadý cíl oxidativního poškození a tato sloučenina je běžně obsažena v membránách buněk cévního systému a lipoproteinových částicích, 3) tento membránový systém neobsahuje vápníkové kanály ani enzym HMG-CoA • · · · φ φ · • φφφ φ· φ φ · « φ φ • · · · φ · · φ 4 · « ·<··· ♦ 4 · · · « φ φφφφ φφ» ·»«»··« ·« φφφ reduktasu a 4) peroxidace lipidů v tomto systému může být spontánně iniciována při 37 °C v nepřítomnosti exogenních chemických iniciátorů, jako jsou vysoké koncentrace železa a askorbatu. V těchto experimentech docházelo k postupné, na čase závislé oxidaci, která byla měřena spektroskopicky během 72 h periody.

Synergická antioxidační aktivita AML a ATM znázorněná na obrázku 1 byla demonstrována na membránových váčcích složených z cholesterolu a fosfolipidů za fyziologických podmínek (Tulenko T.N., Chen M., Mason P.E., Mason R.P., „Physical effects of cholesterol on arterial smooth muscle membranes: Evidence of immiscible cholesterol domains and alterations in bilayer width during atherogenesis.“, J. Lipid. Res. 1998, 39 : 947 až 956). Při koncentraci 100,0 nM vykazoval v tomto membránovém preparátu obohaceném cholesterolem jedinou znatelnou inhibici peroxidace lipidů (9 % z kontrolní) pouze samotný ATM. Avšak když byly obě sloučeniny zkombinovány, zvýšil se stupeň inhibice na 33 %, což představuje výrazně vyšší účinek (p < 0,01), než účinek změřený pro tyto sloučeniny samostatně. Antioxidační aktivita této kombinace byla velmi patrná, léky inhibovaly tvorbu lipidových peroxidů (> 5 x 10² μΜ) při koncentraci 100,0 nM (kontrolní úroveň tvorby lipidových peroxidů byla 1,6 mM). Tato kombinace léků vykazovala účinek, který byl výrazně závislý na dávce v širokém rozsahu koncentrací (obrázek 2). Významná inhibice (p < 0,05) byla pozorována jěště při koncentraci 10,0 nM s IC50 = 500,0 μΜ. Pro kombinaci byla při koncentraci 10,0 μΜ pozorována vyšší než 90 % inhibice (> 1 mM tvorba lipidových peroxidů) (obrázek 2). Skutečnost, že inhibice byla pozorována na submikromolámí úrovni značí, že účinek pozorovaný u kombinace AML a ATM je terapeuticky významný.

Antioxidační účinek kombinace přetrvával v průběhu času a nemohl být reprodukován pomocí vitaminu E ani při zvýšené koncentraci. (10,0 μΜ) (obrázek 3). Toto zjištění je v souladu s představou, že vitamin E nebo α-tokoferol je v průběhu procesu peroxidace lipidů průběžně spotřebováván. Naproti tomu nebyla aktivita AML/ATM ovlivněna délkou inkubační periody, během které se v průběhu 72 hodin zvýšila úroveň celkových lipidových peroxidů na 2,2 mM.

Zvýšená polarita ATM způsobená přítomností dodatečné hydroxylové skupiny může přispívat k snadnějším interakcím s formálně nabitým AML, vedoucím k zřetelným interakcím s fosfolipidovými molekulami, jak bylo prokázáno pomocí x-paprskové difrakční analýzy. Dodatečná hydroxylová skupina ATM také poskytuje další volný proton, který lze přenést na volné radikálové molekuly (obrázek 4). Po ztrátě protonu může být zbývající nepárový volný elektron účinně stabilizován v rezonančních strukturách metabolitu, jak je znázoněno na obrázku 4. Odlišná antioxidační aktivita kombinace AML s ATM je prokázána pozorováním, že stejný • »

................ ··· účinek nemohl být reprodukován když byl AML zkombinován s jakýmkoliv ze dvou dalších statinů (mevastatin a lovastatin), jak je znázorněno na obrázku 5.

Výsledky výzkumů in vivo prokázaly důležitou roli lipofílních antioxidantů při snižování kardiovaskulární morbidity a mortality, především CAD. LDL částice, které mají vyšší odolnost vůči oxidativnímu poškození, vykazují sníženou cytotoxicitu, méně interferují s endoteliální tvorbou oxidu dusnatého a nepřispívají k tvorbě pěnových buněk (Diaz Μ. N., Frei B., Vita J. A., Keaney J. F., “Antioxidants and atherosclerotic heart disease.”, N. Engl. J. Med. 1997, 337 : 408 až 416). Poskytování antioxidantů vedlo ke zvýšení odolnosti LDL před oxidativní modifikací a ke snížení endoteliální buněčné cytotoxicity (Belcher J. D., Balla J., Balí G., et al., “Vitamin E, LDL, and endothelium. Brief oral vitamin supplementation prevents oxidized LDL-mediated vascular injury in vitro.”, Aterioscler. Thromb. 1993, 13 : 1779 až 1789). Lipofilní antioxidant probucoi vedl ke zmírnění tvorby arteriosklerotických plaků u cholesterolem živených primátech, které bylo ve vztahu se zvýšenou odolností LDL proti oxidativnímu poškození (Sasahara M., Raines E. W., Chait A., et al., “Inhibition of hypercholestereolemia-induced atherosclerosis in the nonhuman primáte by probucoi. I. Is the extent of atherosclerosis related to resistance of LDL to oxidation?”, J. Ciin. Invest. 1994, 94 : 155 až 164). Tento antioxidant inhiboval tvorbu lézí u Watanabe - dědičných hyperlipidemických králíků (WHHL), dobře charakterizovaného zvířecího modelu atherosklerózy, nezávisle na účincích vyplývajících ze snižování hladiny cholesterolu (Carew T. E., Schwenke D. C., Steinberg D., “Antiatherogenic effect of probucoi unrelated to its hypocholesterolemic effect: Evidence that antioxidants in vivo can selectively inhibit low density lipoprotein degradation in macrophage-rich fatty streaks and slow the progression of atherosclerosis in the Watanabe heritable hyperlipidemic rabbit.”, Pro. Nati. Acad. Sci. USA 1987, 84 : 7725 až 7729).

Vedle těchto studií na zvířecích systémech prokázala klinická placebo-kontrolovaná studie, že použití probucolu vedlo po předcházejícím angioplastickém rozšíření věnčitých tepen ke snížení restenózy u pacietů s CAD o 47 %, pravděpodobně díky svému antioxidačnímu působení (Tardif J. C., Cote G., Lesperance J., at al., „Probucoi and multivitamins in the prevention of restonosis after coronary angioplasty. Multivitamins and probucoi study group.“, N. Eng. J. Med. 1997, 337 : 365 až 372). Samostatná studie prokázala, že probucoi na rozdíl od antioxidačních vitamínů vykazoval pozitivní účinek na vaskulámí přeměnu u pacientů, kteří postoupili angioplastiku, což bylo prokázáno pomocí intravaskulámích ultrazvukových metod (Cote G., Tardif J.-C., Lesperance J., et al., „Effects of probucoi on vascular remodeling after coronary angioplasty.“, Circuiation 1999, 99 : 30 až 35).

Přehled dostupných údajů tedy poskytuje racionální základ pro využití lipofilních antioxidantů k léčbě zánětlivých procesů spojených s CAD. Zvyšováním odolnosti LDL a membrán buněk cévního systému před oxidativním poškozením mohou látky s antioxidační aktivitou účinně působit na patologické změny v cévní stěně v průběhu atherogeneze. Tyto procesy zahrnují mimo jiné tvorbu pěnových buněk, endoteliální dysfunkci a toxicitu, adhesi leukocytů a krevních destiček a arteriální angiospazmus, sekundárně také k útlumu přirozené tvorby oxidu dusnatého. Tato pozorování na buněčné úrovni podporují epidemiologické analýzy, které naznačuji inverzní vztah mezi koncentrací určitých antioxidantů v séru a nežádoucími důsledky spojenými s koronárními chorobami (Stampfer M. J., Hennekens C. H., Manson J. E., Colditz G. A., Rosner B., Willet W. C., „Vitamin E consumption and the risk of coronary disease in women.“, N. Engl. J. Med. 1993, 328 : 1450 až 1456, Rimm Ε. B., Stampfer M. J., Asoherio A., Giovannuci E., Colditz G. A., Willett W. C., „Vitamin E consumption and the risk of coronary heart disease in men.“, N. Engl. J. Med. 1993, 328 : 1450 až 1456, Enstrom J. E., Kanim L. E., Klein M. A., „Vitamin C intake and mortality among sample of the United States population.“, Epidemiology 1992, 3 : 194 až 202, Rimersma R. A., Wood D. A., Macintyre C. C., Elton R., Gey K. F., Oliver M. F., „Low plasma vitamins E and C. Increased risk of angína in Scottish men.“, Ann. N. Y. Acad. Sci. 1989, 570 : 291 až 295, Ramirez J., Flowers N. C., „Leukocyte ascorbic acid and its relationship to coronary artery disease in man.“, Am. J. Clin. Nutr. 1980, 33 : 2079 až 2087, Hennekens C. H., Buring J. E., Manson J. E., et al., „Lack of effect of long-term supplementation with beta carotene on the incidence of malignant neoplasms and cardiovascular disease.“, N. Engl. J. Med. 1996, 334 : 1145 až 1149, Losonczy K.G., Harris T. B., Havlík R. J., „Vitamin E and vitamin C supplement use and risk of all-cause and coronary heart disease mortality in older persons: The established populations for epidemiologie studies of the elderly.“, Am. J. Clin. Nutr. 1996, 64 : 190 až 196). Některé z těchto epidemiologických studií prokázaly účinek vitaminu E jako antioxidantů s omezenou schopností bránit oxidativnímu poškození. Výsledky této studie naznačují, že kombinace AML a ATM je při omezování poranění cév spojených s CAD podstatně účinnější než vitamin E.

Synergické antioxidační působení amlodipinu s hydroxyatorvastatinovým metabolitem na lidských LDL:

Antioxidační působení samotného AML a ATM a jejich kombinace bylo stanoveno také na lidských LDL preparátech. Schopnost těchto sloučenin inhibovat peroxidaci LDL byla po přidání iontů mědi (10,0 mM) ověřena in vitro měřením obsahu reaktivních thiobarbiturátových substancí (TBARS) - ukazatele lipidové peroxidace. Obrázek 6 znázorňuje, že stupeň oxidace

LDL byl charakterizován sigmoidální kinetickou křivkou s počáteční lag fází, kterou následovala ostrá propagace a konečná fáze plato (Esterbauer H., Gebicki J., Puhl H„ Jurgens G., „The role of lipid peroxidation and antioxidants in oxidative modification of LDL.“, Free Radíc. Biol. Med. 1992, 13 : 341 až 390). Po 4 h inkubace byly různé účinky těchto sloučenin pozorovány při koncentraci 3,0 μΜ. V porovnání s kontrolní peroxidací lipidů (100 % tvorba TBARS) představovala zaznamenaná tvorba TBARS pomocí AML a ATM 93,3 ± 6 % a 65,6 ± 7 %. Avšak když byly tyto sloučeniny použity v kombinaci, představovala tvorba TBARS pouze 29,3 ± 6 %, tedy úroveň která byla výrazně nižší (p < 0,01), než která byla pozorována pro každou sloučeninu zvlášť. Synergický antioxidační účinek kombinace setrval po dobu 6 h. Tato zjištění jsou dalším důkazem synergické aktivity shodující se s aktivitou pozorovanou na membránových váčcích, protože tato kombinace léků vykazovala úroveň inhibice, která výrazně překročila jejich očekávaný aditivní efekt. Antioxidační aktivita vitaminu E v těchto experimentech byla blízká aktivitě pozorované pro samotný ATM.

Chemické mechanismy synergické aktivity amlodipinu a atorvastatinového metabolitu: Synergická antioxidační aktivita pozorovaná pro tuto kombinaci léků na LDL a rekonstituované lipidové membrány napovídá, že tyto sloučeniny vzájemně přímo interagují jedna s druhou, což vede k zachycování lipidových radikálů. Podle termodynamických studií (obrázek 7) je uvažováno, že ATM reaguje rychleji s lipidovými radikály (rovnice 1) než AML, jak je popsáno v rovnici 2. Pokud by tyto rovnice představovaly dvě jediné možné metabolické cesty těchto látek, tak by po společném přidání do systému byl účinek jejich kombinace aditivní. Ale kombinace obou sloučenin poskytuje možnost třetí metabolické cesty (rovnice 3), jako alternativy podporované výsledky peroxidačních experimentů na LDL a lipidových membránách. Kombinace cesty 1 a 3 by vedla k synergickému efektu, který se projevuje výrazněji než při cestě 2. Semiempirické výpočty naznačují, že reakce 3 je upřednostňovaný exotermický proces (Hf = - 40,7 KJ/mol). Přítomnost rychlého inhibitoru (ATM) tedy umožňuje slabšímu inhibitoru odstraňovat volné radikály rychleji, než když by reagoval s lipidovými radikály sám o sobě. Tři cesty popisující tyto interakce, kde LOO· představuje lipidový radikál, jsou:

(1)	LOO·+ ATM	->	LOOH + ATM·	rychle
(2)	LOO· + AML	->	LOOH + AML·	pomalu
(3)	ATM· + AML		ATM + AML·	rychle

• · · · · · · e · · » · · • · · · · • 9 · · » 9 • * 9 ♦ · • · 9 · 9 · · ·· · · ·

Výsledkem této synergie mezi AML a ATM je, že recyklovaný metabolit je dále schopný dalšího zachytávání lipidových radikálů. Rozdíly v míře inhibice mezi AML a ATM jsou částečně založeny na vypočtených entalpiích těchto látek, respektive příslušných radikálů (obrázek 7). Čím nižší (tj. zápornější) hodnota ÁHf, tím snažší je odtržení vodíku spojené s tvorbou radikálu. Jednou vytvořený nespárovaný radikál může být stabilizován ve formě rezonančních struktur.

Molekulární membránové interakce amlodipinu a atorvastatinového metabolitu:

K výzkumu molekulárních membránových interakcí kombinace AML a ATM bylo využito techniky X-paprskové difrakce pod malým úhlem. Tato vysoce kvantitativní metoda poskytuje přímé informace o struktuře membránové dvojvrstvy v nepřítomnosti a v přítomnosti léků. Již dříve bylo popsáno, že AML se v porovnání s jinými CCB vyznačuje vysokou afinitou k membránových lipidům (K_p > 10³) za atherosklerotických podmínek (Mason R. P., Moisey D.

O i

M., Shajenko L., „Cholesterol alters the binding of Ca channel blockers to the membrane lipid bilayer.“, Mol. Pharmacol. 1992, 41 : 315 až 321). Určitá lipofilita AML je přisuzována jeho amfifilní chemické struktuře, která směruje molekulu do výhodné polohy v membráně, kde může zabraňovat šíření volných radikálů pomocí biofýzikálních a biochemických mechanismů, jak bylo dříve podrobněji popsáno naší laboratoří (Mason R. P., Leeds P. R., Jacob R. F., et al., „Inhibition of excessive apoptosis by the calcium antagonist amlodipine and antioxidants in cerebellar granule cells.“, J. Neurochem. 1999, 72 : 1448 až 1456, Mason R. P., Moisey D. M., Shajenko L., „Cholesterol alters the binding of Ca²⁺ channel blockers to the membrane lipid bilayer.“, Mol. Pharmacol. 1992, 41 : 315 až 321, Mason R. P., Campbell S. F., Wang S. D., Herbette L. G., „Comparison of location and binding for the positively charged 1,4dihydropyridine calcium channel antagonist amlodipine with uncharged drugs of this class in cardiac membranes.“, Mol. Pharmacol. 1989, 36 : 634 až 640. Mason R. P., Walter M. F., Trumbore M. W., Olmstead Jr. E. G., Mason P. E., „Membrane antioxidant effects of the charged dihydropyridine calcium antagonist amlodipine.“, J. Mol. Cell. Cardiol. 1999, 31 : 275 až 281). V membránách, které nebyly obohacené o cholesterol amlodipin inhiboval peroxidaci lipidů do takové míry, která nemohla být reproukována s použitím jiného CCB nebo inhibitoru enzymu přeměňujícího angiotenzin (ACE), captoprilu (Mason R. P., Walter M. F., Trumbore M. W., Olmstead Jr. E. G., Mason P. E., „Membrane antioxidant effects of the charged dihydropyridine calcium antagonist amlodipine.“, J. Mol. Cell. Cardiol. 1999, 31 : 275 až 281). Podobně jako u amlodipinu, má chemická struktura atorvastatinového metabolitu amfifilní chrakter, který umožňuje tomuto léku silnou interakci s membránovou lipidovou dvojvrstvou, ···♦

jak bylo dříve popsáno mojí laboratoří (Mason R. P., „Inhibition of oxidative damage to low density lipoproteins and isolated membrances by atorvastatin and its active matabolite.“, J. Am. Coll. Cardiol. 2000, 35 : 317A).

Při těchto studiích byla kombinace AML a ATM přidána k membránovým váčkům rekonstituovaným z cholesterolu a fosfolipidu s molámím poměrem složek 0,5 : 1 (obrázek 8). X-paprsová difrakční analýza vzorků membrán poskytla přesvědčivé a reprodukovatelné difraktogramy pro kontrolní vzorek a vzorky s obsahem léků. V nepřítomnosti léku byla celková šířka membránové dvojvrstvy včetně hydratačního obalu 5,55 χ 10⁹ nm s vzdáleností mezi hlavami fosfolipidů uvnitř dvojvrstvy 4,4 x 10‘⁹ nm. Přídavek obou léků dohromady v poměru léků k fosfolipidu 1 : 15 vedl v porovnání s přídavkem léků odděleně k patrným změnám ve struktuře a organizaci fosfolipidové dvojvrstvy (obrázek 8). V přítomnosti kombinace léků došlo ke snížení celkové šířky membránové dvojvrstvy včetně hydratačního obalu na 5,35 χ 10'⁹ nm s vzdáleností mezi hlavami fosfolipidů uvnitř dvojvrstvy 4,1 χ 10'⁹ nm. Při přídavku samotného AML a ATM byly šířky membránové dvojvrstvy 5,48 χ 10'⁹ nm a 5,8 χ 10'⁹ nm (obrázek 9). Tyto výsledky strukturálních studii poskytují přímý důkaz, že kombinace těchto látek ovlivňuje strukturu lipidových molekul jiným způsobem, než při odděleném působení léků.

Přímé odčítaní hustotních profilů membránových elektronů (vzdálenost versus elektrony/ vzdálenost³) dokazuje výrazné rozdíly ve struktuře lipidů, které nemohou být připsány přítomnosti léků (obrázek 8). Přídavek kombinace léků vedl k výrazném zvýšení elektronové hustoty spojené s vnějším uhlovodíkovým jádrem/oblastí hydratovaných hlav lipidů membránové dvojvrstvy ve vzdálenosti ± 1,1 x 10‘⁹ nm až 2,1 χ 10'⁹ nm od středu dvojvrstvy. Toto zvýšení elektronové hustoty v rozsahu 1,0 χ 10'⁹ nm je přisuzováno rovnovážnému rozmístění léků v membráně. Současně s touto změnou byl pozorován efekt neuspořádání spojený s oblastí centrálního uhlovodíkového jádra membrány ± 1,1 χ 10'⁹ nm. Toto snížení elekronové hustoty je důsledkem zvýšení molekulárního objemu vyplývajícího z vstupu molekul léku do oblasti vysoké molekulární hustoty poblíž membránového uhlovodíkového jádra/rozhraní s vodou. Z těchto dat je tedy možné usuzovat, že vstup kombinace léků do membránové dvojvrtsvy ovlivňuje možnosti intermolekulámího uspořádání fosfolipidových molekul podobným způsobem, jaký byl pozorován při snížení obsahu cholesterolu nebo při zvýšení teploty (Tulenko T. N., Chen M., Mason P. E., Mason R. P., „Physical effects of cholesterol on arterial smooth muscle membranes: Evidence of immiscible cholesterol domains and alterations in bilayer width during atherogenesis. J. Lipid. Res. 1998, 39 : 947 až 956, Chang Η. M., Reitstetter R., Mason R. P., Gruener R., „Attenuation of channel kinetics and condustance by cholesterol: An interpretation using structural stress as ♦ 4 4 · 4 · β · 4 , , · 4 » · 4 4 4 ] 44*4 444 444 4444 44 444 a unifying concept.“, J. Membr. Biol. 1995, 143 : 51 až 63). Bylo posáno, že takové změny v biofyzikálních vlastnostech vedou k omezení šíření volných radikálů matricí lipidové dvojvrstvy (McLean L. R., Hagaman K. A., „Effect of lipid physical statě on the rate of peroxidation of liposomes.“, Free Rádie. Biol. Med. 1992, 12 : 113 až 119).

Použití AML a ATM odděleně vedlo v porovnání s jejich kombinací k různým změnám v mambránové struktuře z důvodu specifických interakcí se stavebními fosfolipidovými molekulami (obrázek 8 a 9). Zatím co použití kombinace těchto sloučenin vedlo k 2 x 10'¹⁰nm neboli 4 % snížení (p < 0,01) celkové šířky membrány, vedlo použití samotného ATM k 5 % zvýšení (p < 0,01) šířky (2,5 x 10'^1θ nm) a použití AML nijak významně neovlivnilo rozměry membrány ani vzdálenost mezi hlavami fosfolipidů uvnitř dvojvrstvy. V porovnání se samotným AML vedlo použiti ATM k výraznějšímu snížení elektronové hustoty uhlovodíkového jádra. Toto působení na mambránovou strukturu může přispívat k vyšším antioxidačním schopnostem ATM v porovnání s AML. Kombinace AML a ATM umožnila vedle jejich odlišných umístění v membráně také vytvoření nového místa interakce s lipidovou membránovou dvojvrstvou (obrázek 8).

Předkládaný vynález se tedy vztahuje k farmaceutickému prostředku obsahujícímu amlodipin a atorvastatinový metabolit. Tyto individuální farmaceuticky aktivní sloučeniny mohou být připraveny samostatně nebo jako jejich kombinace, ve formě solí a dávek poskytujících maximální terapeutickou odezvu. Tato kombinační terapie je určena k léčbě patofyziologických projevů arteriálních a příbuzných srdečních onemocnění zahrnujících mimo jiné vysoký krevní tlak, hyperlipidemii, atherosklerozu, arteriosklerózu, ischemickou chorobu srdeční, infarkt myokardu, městnavé srdeční selhání, mrtvici a angínu pectoris. Specificky je tato kombinační terapie určena ke snižování krevního tlaku a systémové koncentrace lipidů, tak jako s nimi spojeným patofyziologickým důsledkům absence jejich regulace zahrnujícím mimo jiné cévní ochabování a ukládání a arteriosklerotického plátu. Pokud jsou tyto sloučeniny použity v kombinaci, může být jejich působení na rozličné procesy a důsledky spojené s arteriálními a příbuznými srdečními onemocněními aditivní a/nebo synergické.

Zkušeným osobám bude jistě zřejmé, že při konkrétní realizaci jednotlivých konceptů a postupů zde popsaných mohou být provedeny jisté úpravy a změny, které jsou v souladu s podstatou a rámcem předkládaného vynálezu a připojených patentových nároků.

« ·· • · · · fc • fcfc • · · fc

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1 znázorňuje synergické účinky AML a ATM na peroxidaci lipidů za nízké terapeutické koncentrace léku (100,0 nM) v membránách obsahujících fyziologická množství cholesterolu, x Představuje procentuální inhibici peroxidace lipidů a y představuje léčbu amlodipinem (AML), atorvastatinovým metabolitem (ATM) a kombinací obou sloučenin (AML+ATM) o koncentraci 10 nM. Hodnoty jsou uvažovány pro ± standartní odchylku pro n = 6. *** Znázorňuje p < 0,001 versus kontrolní a jiné způsoby léčby.

Obrázek 2 znázorňuje na dávce závislý antioxidační účinek kombinace AML a ATM v širokém rozsahu koncentrací (0,01 až 10,0 μΜ). x Představuje procentuální inhibici peroxidace lipidů a y představuje léčbu pomocí kombinace AML a ATM za udaných mikromolámích koncentrací. Hodnoty jsou uvažovány pro ± standartní odchylku pro n = 6. *** Znázorňuje p < 0,001 versus kontrolní a jiné způsoby léčby.

Obrázek 3 znázorňuje lepší antioxidační aktivitu kombinace AML/ATM než vitamin E, jako funkci času při shodných koncentracích (10,0 μΜ). x Představuje procentuální inhibici peroxidace lipidů a y představuje léčbu pomocí kombinace amlodipinu a atorvastatinového metabolitu (AML + ATM), prázdný sloupec, nebo pomocí vitaminu E (E), čárkovaný sloupec, v obou případech za koncentrace 10 μΜ. Hodnoty jsou uvažovány pro ± standartní odchylku pro η - 6 až 12. *** Znázorňuje p < 0,001 versus kontrolní a jiné způsoby léčby.

Obrázky 4A až 4D znázorňují místa odebrání protonů (Sl, S2 a S3) pro ATM, která přispívají k antioxidační aktivitě (obrázek 4A), spolu s úvahami o stabilizaci rezonančních struktur (obrázky 4B až 4D).

Obrázek 5 znázorňuje pro srovnání účinek antioxidační aktivity AML, pokud je zkombinován s různými inhibitory HMG-CoA reduktasy za stejných koncentrací, x Představuje procentuální inhibici peroxidace lipidů a y představuje léčbu pomocí kombinace amlodipinu a atorvastatinového metabolitu (AML + ATM), tmavý sloupec, amlodipinu a mevastatinu (AML + M), čárkovaný sloupec, nebo pomocí amlodipinu a lovastatinu (AML + L), žádná inhibice peroxidace lipidů, všechny při koncentraci 1,0 μΜ. Hodnoty jsou uvažovány pro ± standartní odchylku pro n = 6 až 12. *** Znázorňuje p < 0,001 versus kontrolní a jiné způsoby léčby.

9» • ·

9 9· •· «·· · 9 · «· • · · · · · • · · · 9 9 · · • 9 · · · · • 99 ··· 99·· 99 «··

Obrázky 6A až 6B znázorňují synergické antioxidační účinky AML a ATM v lidských LDL vzorcích srovnávané s účinkem Trolox C (rozpustný vitamin E). Na obrázku 6A představuje x tvorbu thiobarbiturátových reaktivních substancí (TBARS) měřenou jako absorbanci při 532 nm a y představuje čas v hodinách. Kontrola je znázorněna plnou čarou s plnými kolečky, Trolox C (rozpustný vitamin E) je znázorněn tečkovanou čarou s plnými převrácenými trojúhelníky, samotný AML je znázorněn čárkovanou čarou s prázdnými kosočtverci, ATM samotný je znázorněn čerchovanou čarou s prázdnými kolečky a kombinace AML a ATM je znázorněna čárkovanou čarou s plnými čtverečky. Na obrázku 6B představuje x tvorbu thiobarbiturátových reaktivních substancí (TBARS) měřenou jako absorbanci při 532 nm a y představuje působení amlodipinu (AML), prázdný sloupec, atorvastatinového metabolitu (ATM), čárkovaný sloupec, nebo pomocí kombinace amlodipinu a atorvastatinového metabolitu (AML + ATM), tmavý sloupec, při koncentraci 3,0 μΜ. Hodnoty jsou uvažovány pro ± standartní odchylku. *** Znázorňuje p < 0,001 versus kontrolní a jiné způsoby léčby.

Obrázek 7 znázorňuje vypočtené enthalpie pro ATM, AML a jejich odvozených radikálů.

Obrázky 8A až 8C znázorňují x-paprskovou difrakční analýzu interakci samotných AML a ATM a jejich kombinace s lipidovou membránou, x Představuje relativní hustotu elektronů a y představuje vzdálenost v nm od středu lipidové dvojvrstvy. Ve všech třech grafech slouží plná čára jako kontrola. Na obrázku 8A je jako tečkovaná čára znázorněn AML, na obrázku 8B je jako tečkovaná čára znázorněn ATM a na obrázku 8C je jako tečkovaná čára znázorněna kombinace AML a ATM. Tmavé oblasti v každém grafu představují rozdíly v elektronových hustotách mezi kontrolními a stanovenými profily elektronové hustoty.

Obrázek 9 znázorňuje pomocí x-paprskové difrakční analýzy vliv samotného AML a ATM na rozměry membránové dvojvrstvy. x Představuje změny v šířce membrány v nm a y představuje působení AML - tmavý sloupec, ATM - šrafovaný sloupec a kombinace AML a ATM - šrafovaný sloupec. Hodnoty jsou uvažovány pro ± standartní odchylku. *** Znázorňuje p < 0,001 versus kontrolní a jiné způsoby léčby.

Dilinoleoylfosfatidylcholin (DPLC), l-palmitoyl-2-oleoylfosfatidylcholin (POPC) a neesterifikovaný cholesterol byly získány od firmy Avati Polar Lipids lne. (Alabaster, AL) a uchovány při - 80 °C. Alikvotní podíly LDL (L-2139) z lidské plazmy byly získány od firmy Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Kolony Sephadex G-25 M (PD-10) byly zakoupeny od firmy Pharmacia Biotech lne. (Piscataway, NJ). Amlodipinbesylat byl získán od firmy Pfizer Central Research (Groton, CT) a hydroxy metabolit atorvastatinu byl získán od firmy Parke

4« • 4 ♦

• 4 *

• 4

444 • 44 • 4 •

>

4·4·

4444 • 4

4 • ·

4

4 Β 4 4 • 04

Davis (Ann Arbor, MI). Vitamin E, Trolox (analog Vitaminu E), lovastatin a mevastatin byly zakoupeny od firmy Sigma Chemical Co. (St Louis, MO).

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Stanovení peroxidace membránových lipidů

Samostatné a kombinované na dávce závislé aktivity těchto sloučenin byly stanoveny v membránách obohacených PUF A, připravených z cholesterolu a fosfolipidu v molámím poměru 0,5 : 1 (Mason R. P., Walter M. F., Trumbore M. W., Olmstead Jr. E. G., Mason P. E., „Membrane ontioxidant effects of the charged dihydropyridine calcium antagonist amlodipine.

J. Mol. Cell. Cardiol. 1999, 31 : 275 až 281). Lipidy použité pro přípravu vzorků (dilinoleoylfosfatidylcholin a cholesterol) byly rozpuštěny v chloroformu (HPLC čistota, 25,0 mg/ml). Do skleněných zkumavek (13 x 100 mm) bylo přidán alikvotní podíl lipidů (1,0 mg) a chloroform byl odstraněn pomocí volného odpařování na misce pod ochrannou N2 atmosférou. Lipidy byly vysušeny za absence a za přítomnosti léku(ů) rozpuštěných v ethanolu. Zbytky rozpouštědla byly odstraněny za vakua a vzorky byly chráněny před světlem. Membránové váčky byly vytvořeny za laboratorní teploty rychlým mícháním vysušených lipidů v 1,0 ml fyziologického roztoku s přídavkem pufru HEPES (0,5 mM HEPES a 154,0 mM NaCl, pH 7,2). Konečná koncentrace fosfolipidů byla 1,0 mg/ml pufru a konečná koncentrace léku byla v rozsahu od 10,0 nM do 10,0 μΜ.

Peroxidace membránových lipidů byla, jak bylo dříve detailněji popsáno, prováděna při 37 °C v míchané vodní lázni bez přídavku exogenních stimulantů (Mason R. P., Walter M. F. Trumbore M. W., Olmstead Jr. E. G., Mason P. E., „Membrane antioxidant effects of the charged dihydropyridine calcium antagonist amlodipine.“, J. Mol. Cell. Cardiol. 1999, 31 : 275 až 281). Po různých časových intervalech (24, 48, 65, 72 h) byl odebrán alikvotní podíl vzorku lipidu (10 až 100 μΐ) a poté bylo ke vzorku pro zastavení peroxidační reakce ihned přidáno 25 μΐ 5,0 mM kyseliny ethylendiamintetraoctové (EDTA) a 20 μΐ 35,0 mM butylovaného hydroxy toluenu (BHT).

Stupeň peroxidace membránových lipidů byl změřen pomocí CHOD-jodidové analýzy, jak bylo dříve podrobněji popsáno (El-Saadani M., Esterbauer H.,el-Sayed M., Gober M., Nassar A. Y., Jurgens G., „A spectroscopic assay for lipid peroxides in sérum lipoproteins using a commercially available reagent.“, J. Lipid. Res. 1989, 30 : 627 až 630). Množství I3' bylo stanoveno podle následující reakce, kde L reprezentuje fosfolipidovou molekulu:

fc· ·	9 fcfc	fc* fc
• *	• ·	fcfc · ·	• fc	• fc
•	•	• «	fc ·
•	• fc	• fc	« · ·
•	•	fc ·	• ·
• fcfcfc	fc··	• fcfc fcfcfcfc	• fc	• fc

LOOH + 2Η· + 2Γ -> LOH + H₂O +1₂I₂ + 21' -> I₃'

Po různých časových intervalech byl odebrán alikvotní podíl membránového vzorku a poté byl přidán k 1,0 ml barevného CHOD činidla (E. M. Science, Gibbstown, NJ), který obsahoval 20,0 μΜ BHT, 24,0 μΜ EDTA a 0,2 % Triton-X. Vzorek byl poté zabalen do fólie a ponechán 2 h inkubovat za nepřítomnosti světla a nakonec byla změřena absorbance vzorku při 365 nm (ε = 2,4 χ 10⁴ M^cm'¹). Jako slepý pokus byl vedle vzorků měřen v triplikátech vzorek obsahující 76,7 μΐ 0,652 mM HEPES, 20 μΐ 5,0 mM EDTA a 33 μΐ DDI vody. Stupeň peroxidace membránových lipidů byl měřen v triplikátech pro každou koncentraci léku a porovnán s kontrolními vzorky, které neobsahovaly lék. Statistická významnost těchto experimentů byla vypočtena pomocí nepárového t-testu. Významnost byla přijatená při p < 0,05.

Příklad 2: Stanovení oxidace LDL

Vedle stanovení na lipidových membránách byla stanovena aktivita AML a ATM na lidských LDL. EDTA obsažená ve vzorcích LDL byla odstraněna pomocí gelové filtrace na filtračních kolonách PD-10 Sephadexu G25-M s použitím PBS (promytým dusíkem) jako eluentu. Vzorky LDL (50 pg proteinu / ml) byly poté preinkubovány za absence nebo za přítomnosti léku (3,0 μΜ) po dobu 30 minut při 37 °C. Oxidace LDL byla poté indukována přídavkem 10,0 μΜ CuSCL. Časový průběh oxidace LDL měřený pomocí tvorby TBARS byl zanamenáván po dobu 6 hodin při 37 °C (Mak I. T., Kramer J. H., Weglicki W. B., „Potentiation of free radical-induced lipid peroxidative injury to sarcolemnal membranes by lipid amphiphiles.“, J. Biol. Chem. 1986, 261 : 1153 až 1157). Oxidace LDL stanovená pomocí TBARS metody byla popsána sigmoidální kinetickou křivkou s počáteční lag fází následovanou silnou propagací a konečnou fází plato (Esterbauer H., Gebicky J., Puhl H., Jurgens G., „The role of lipid peroxidation and antioxidants in oxidative modifícation of LDL.“, Free Rádie. Biol. Med. 1992, 13 : 341 až 390). Obsah proteinů v LDL byl stanoven pomocí analytické soupravy Coomasie Protein Plus od firmy Pierce Chemical („A rapid and sensitive method for the quantitation od microgram quantities of protein utilizing the priciple of protein-dye binding.“, Anal. Biochem. 1976, 72 : 248 až 254).

Φ Φ φ φ ΦΦ ·» φφφφ φφφφ ΦΦΦ

Příklad 3: X-paprsková difrakční analýza pod malým úhlem

X-paprsková difrakční analýza pod malým úhlem byla použita k přímému výzkumu molekulárních membránových interakcí AML a ATM. Lipidy použité pro tyto vzorky (l-palmitoyl-2-oleoylfosfatidylcholin a cholesterol) byly rozpuštěny v chloroformu (HPLC čistota, 10,0 mg/ml). Membránové váčky byly vytvořeny z těchto lipidů pomocí stejné metody, která ja popsána u peroxidaěních experimentů. Konečná koncentrace fosfolipidů byla 5,0 mg/ml pufru a molámí poměr léku k fosfolipidů byl 1 : 15. Membránové vzorky byly pro difrakční analýzu připraveny pomocí centrifugace, jak bylo posáno dříve (Chester D. W., Herbette L. G., Mason R. P., Joslyn A. F., Triggle D. J., Koppel D. E., „Diffusion of dihydropyridine calcium channel antagonists in cardiac sarcolemmal lipid multibilayers.“, Biophys. J. 1987, 52 : 1021 až 1030). Váčky byly vloženy do sedimentačních cel, které obsahovaly podklad z hliníkové fólie. Váčky byly sedimentovány v rotoru SW-28 (Beckman Instruments Fullerton, CA) při 35 000 g po dobu 1,5 h při 5 °C. Po skončení centrifugace byl supernatant oddělen od pelet a vzorky byly připevněny na skleněné nástavce. Vzorky byly umístěny do uzavřených nádob pro kontrolu relativní vlhkosti a teploty v průběhu difrakční ch experimentů, jak bylo dříve podrobněji popsáno (Chester D. W., herbette L. G., Mason R. P., Joslyn A. F., Triggle D. J., Koppel D. B., „Diffusion of dihydropyridine calcium channel antagonists in cardiac sarcolemmal lipid multibilayers.“, Biophys. J. 1987, 52 : 1021 až 1030).

X-paprskové difrakční experimenty byly provedeny měřením vzorků pomocí kolimovaného zářiče, přes nikl filtrovaných monochromatických x-paprsků (CuK_a 1,54 x 10'¹⁰nm) produkovaných pomocí vysoce výkonného rotačního anodového mikroohniskového generátoru (Rigaku Rotaflex RU-200, Danvers, MA). Dráha paprsku s pevnou geometrií sestávala z jediného niklem pokrytého Franksova zrcadla definujícího čárový zdroj, kde K_a a K_anejsou rozlišeny. Difrakční data byla shromážděna na jednorozměrném polohově citlivém elektronickém detektoru (Innovative Technologie, Newburyport, MA) umístěném ve vzdálenosti 150 mm od vzorku. Každý poledníkový difrakční pík byl korigován podle Lorentze a podle pozadí, jak bylo dříve popsáno (Mason R. P., Gonye G. E., Chester D. W., Herbette L. G., „Partitioning and location of Bay K 8644, 1,4-dihydropyridine calcuim channel antagonist, in model and biological membranes.“, Biophys. J. 1989, 55 : 769 až 778). Fáze pro data čtvrtého řádu byly určeny pomocí bobtnavé analýzy (Moody M. F., „X-ray diffřaction pattem of nerve myelin: A method for determining the phases.“, Science 1963, 142 : 1173 až 117). Fourierovy transformace dat byly provedeny pomocí softwaru Origin (Microcal Software, Nothampton, MA).

Claims

1. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že obsahuje:

a) účinné množství amlodipinu,

b) účinné množství hydroxylovaného atorvastatinového metabolitu (ATM), a

c) farmaceuticky přijatelné pomocné látky, kde účinná množství amlodipinu a ATM jsou dostačující pro výraznou inhibici peroxidace lipidů v lidských nízkohustotních lipoproteinech nebo lipidových membránách a k dosažení terapeutického efektu.

2. Farmaceutický prostředek podle nároku 1 vyznačující se tím, že amlodipin je poskytován jako terapeuticky účinný derivát amlodipinu.

3. Farmaceutický prostředek podle nároku 2 vyznačující se tím, že terapeuticky účinný derivát amlodipinu představuje amlodipinbesylat.

4. Farmaceutický prostředek podle nároku 1 vyznačující se tím, že snižuje riziko arteriální a příbuzné srdeční choroby.

5. Farmaceutický prostředek podle nároku 4 vyznačující se tím, že arteriální a příbuzná srdeční choroba je vybrána ze skupiny zahrnující vyskoký krevní tlak, hyperlipidemii, atherosklerózu, arteriosklerózu, ischemickou chorobu srdeční, infarkt myokardu, městnavé srdeční selhání, mrtvici a angínu pectoris.

6. Farmaceutický prostředek podle nároku 1 vyznačující se tím, že snižuje krevní tlak.

7. Farmaceutický prostředek podle nároku 6 vyznačující se tím, že snižuje krevní tlak na úroveň odpovídající sníženému riziku arteriální a příbuzné choroby.

8. Farmaceutický prostředek podle nároku 6 vyznačující se tím, že snižuje krevní tlak na úroveň statisticky shodnou s úrovní přirozenou.

9. Farmaceutický prostředek podle nároku 1 vyznačující se tím, že snižuje systémové koncentrace lipidů.

10. Farmaceutický prostředek podle nároku 9 vyznačující se tím, že snižuje systémové koncentrace lipidů na úrovně odpovídající sníženému riziku arteriální a příbuzné srdeční choroby.

·* 1 • · 1

11. Farmaceutický prostředek podle nároku 9 vyznačující se tím, že snižuje systémové koncentrace lipidů na úrovně statisticky shodné s přirozenými úrovněmi.

12. Farmaceutický prostředek podle nároku 1 vyznačující se tím, že snižuje krevní tlak a systémové koncentrace lipidů.

13. Farmaceutický prostředek podle nároku 1 vyznačující se tím, že snižuje krevní tlak a systémové koncentrace lipidů na úrovně odpovídající sníženému riziku arteriální a příbuzné srdeční choroby.

14. Farmaceutický prostředek podle nároku 1 vyznačující se tím, že snižuje krevní tlak a systémové koncentrace lipidů na úrovně statisticky shodné s úrovněmi přirozenými.

15. Farmaceutický prostředek podle nároku 1 vyznačující se tím, že současně snižuje krevní tlak a systémové koncentrace lipidů.

16. Farmaceutický prostředek podle nároku 15 vyznačující se tím, že současně snižuje krevní tlak a systémové koncentrace lipidů na úrovně odpovídající sníženému riziku arteriální a příbuzné srdeční choroby.

17. Farmaceutický prostředek podle nároku 15 vyznačující se tím, že současně snižuje krevní tlak a systémové koncentrace lipidů na úrovně statisticky shodné s úrovněmi přirozenými.

18. Farmaceutický prostředek podle nároku 1 vyznačující se tím, že synergicky snižuje krevní tlak a systémové koncentrace lipidů.

.}

19. Farmaceutický prostředek podle nároku 18 vyznačující se tím, že synergicky snižuje krevní tlak a systémové koncentrace lipidů na úrovně odpovídající sníženému riziku arteriální a příbuzné srdeční choroby.

20. Farmaceutický prostředek podle nároku 18 vyznačující se tím, že synergicky snižuje krevní tlak a systémové koncentrace lipidů na úrovně statisticky shodné s úrovněmi přirozenými.

21. Farmaceutický prostředek podle kteréhokoliv z nároků 15 až 17 a 18 až 20 vyznačující se tím, že současné snížení krevního tlaku a systémových koncentrací lipidů je alespoň částečně způsobeno sníženou oxidací lipidů.

22. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že zahrnuje:

a) terapeuticky účinné množství kombinace amlodipinu a hydroxylovaného atorvastatinového metabolitů, a

b) farmaceuticky přijatelné pomocné látky, který snižuje krevní tlak a systémové koncentrace lipidů, což je alespoň částečně způsobeno sníženou oxidací lipidů.

23. Farmaceutický prostředek podle nároku 22 vyznačující se tím, že amlodipin je poskytován jako terapeuticky účinný derivát amlodipinu.

24. Farmaceutický prostředek podle nároku 23 vyznačující se tím, že terapeuticky účinný derivát amlodipinu představuje amlodipinbesylat.

25. Farmaceutický prostředek podle nároku 22 vyznačující se tím, že snižuje riziko arteriální a příbuzné srdeční choroby.

26. Farmaceutický prostředek podle nároku 25 vyznačující se tím, že arteriální a příbuzná srdeční choroba je vybrána ze skupiny zahrnující vyskoký krevní tlak, hyperlipidemii, atherosklerózu, arteriosklerózu, ischemickou chorobu srdeční, infarkt myokardu, městnavé srdeční selhání, mrtvici a angínu pectoris.

• ·

J • ·

V

27. Farmaceutický prostředek podle nároku 22 vyznačující se tím, že snižuje krevní tlak a systémové koncentrace lipidů na úrovně odpovídající sníženému riziku arteriální a příbuzné srdeční choroby.

• 9 • · · • ·

9 9 9

9 9

9999 999

28. Farmaceutický prostředek podle nároku 22 vyznačující se tím, že snižuje krevní tlak a systémové koncentrace lipidů na úrovně statisticky shodné s úrovněmi přirozenými.

29. Způsob léčby arteriální a příbuzné srdeční choroby a výrazné omezení tvorby lipidových peroxidů v LDL a lipidových membránách vyznačující se tím, že zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství kombinace amlodipinu a hydroxylovaného atorvastatinového metabolitu.

30. Způsob podle nároku 29 vyznačující se tím, že amlodipin je poskytován jako terapeuticky účinný derivát amlodipinu.

31. Způsob podle nároku 30 vyznačující se tím, že terapeuticky účinný derivát amlodipinu představuje amlodipinbesylat.

32. Způsob podle nároku 29 vyznačující se tím, že arteriální a příbuzná srdeční choroba je vybrána ze skupiny zahrnující vyskoký krevní tlak, hyperlipidemii, atherosklerózu, arteriosklerózu, ischemickou chorobu srdeční, infarkt myokardu, městnavé srdeční selhání, mrtvici a angínu pectoris.

33. Způsob podle nároku 29 vyznačující se tím, že amlodipin a atorvastatinový metabolit jsou podávány jako společný lék.

34. Způsob podle nároku 29 vyznačující se tím, že amlodipin a atorvastatinový metabolit jsou podávány jako samostatné léky.

35. Způsob podle nároku 29 vyznačující se tím, že amlodipin a atorvastatinový metabolit jsou podávány ve stejnou dobu.

36. Způsob podle nároku 29 vyznačující se tím, že amlodipin a atorvastatinový metabolit jsou podávány v různých dobách.

• ·· ·

37. Způsob výrazně omezující oxidaci lipidů a snižující krevní tlak a systémové koncentrace lipidů vyznačující se tím, že zahrnuje podávání pro tyto účely terapeuticky účinného množství amlodipinu a hydroxylovaného atorvastatinového metabolitů.

38. Způsob podle nároku 37 vyznačující se tím, že amlodipin je poskytován jako terapeuticky účinný derivát amlodipinu.

39. Způsob podle nároku 38 vyznačující se tím, že terapeuticky účinný derivát amlodipinu představuje amlodipinbesylat.

40. Způsob podle nároku 37 vyznačující se tím, že amlodipin a atorvastatinový metabolit jsou podávány jako společný lék.

41. Způsob podle nároku 37 vyznačující se tím, že amlodipin a atorvastatinový metabolit jsou podávány jako samostatné léky.

42. Způsob podle nároku 37 vyznačující se tím, že amlodipin a atorvastatinový metabolit jsou podávány ve stejnou dobu.

43. Způsob podle nároku 37 vyznačující se tím, že amlodipin a atorvastatinový metabolit jsou podávány v různých dobách.

44. Způsob podle nároku 37 vyznačující se tím, že snižuje krevní tlak a systémové koncentrace lipidů na úrovně odpovídající sníženému riziku arteriální a příbuzné srdeční choroby.

45. Způsob podle nároku 37 vyznačující se tím, že arteriální a příbuzná srdeční choroba je vybrána ze skupiny zahrnující vyskoký krevní tlak, hyperlipidemii, atherosklerózu, arteriosklerózu, ischemickou chorobu srdeční, infarkt myokardu, městnavé srdeční selhání, mrtvici a anginu pectoris.

46. Způsob podle nároku 37 vyznačující se tím, že snižuje krevní tlak a systémové koncentrace lipidů na úrovně statisticky shodné s úrovněmi přirozenými.

47. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 37 až 46 vyznačující se tím, že snížení krevního tlaku a systémových koncentrací lipidů je alespoň částečně způsobeno sníženou oxidací lipidů.

48. Způsob synergicky omezující oxidaci lipidů vyznačující se tím, že zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství kombinace amlodipinu a hydroxylovaného atorvastatinového metabolitů.

49. Způsob podle nároku 48 vyznačující se tím, že amlodipin je poskytován jako terapeuticky účinný derivát amlodipinu.

50. Způsob podle nároku 49 vyznačující se tím, že terapeuticky účinný derivát amlodipinu představuje amlodipinbesylat.

51. Způsob podle nároku 48 vyznačující se tím, že amlodipin a atorvastatinový metabolit jsou podávány jako společný lék.

52. Způsob podle nároku 48 vyznačující se tím, že amlodipin a atorvastatinový metabolit jsou podávány jako samostatné léky.

53. Způsob podle nároku 48 vyznačující se tím, že amlodipin a atorvastatinový metabolit jsou podávány ve stejnou dobu.

54. Způsob podle nároku 48 vyznačující se tím, že amlodipin a atorvastatinový metabolit jsou podávány v různých dobách.

55. Způsob podle nároku 48 vyznačující se tím, že farmaceutický prostředek snižuje oxidaci lipidů na úroveň odpovídající odpovídající sníženému riziku arteriální a příbuzné srdeční choroby.

56. Způsob podle nároku 55 vyznačující se tím, že arteriální a příbuzná srdeční choroba je vybrána ze skupiny zahrnující vyskoký krevní tlak, hyperlipidemii, atherosklerózu, c · · · arteriosklerózu, ischemickou chorobu srdeční, infarkt myokardu, městnavé srdeční selhání, mrtvici a angínu pectoris.

57. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že obsahuje:

a) terapeuticky účinné množství amlodipinu,

b) terapeuticky účinné množství hydroxylovaného atorvastatinového metabolitu, a

c) farmaceuticky účinné pomocné látky

58. Farmaceutický prostředek podle nároku 57 vyznačující se tím, že amlodipin je poskytován jako terapeuticky účinný derivát amlodipinu.

59. Farmaceutický prostředek podle nároku 57 vyznačující se tím, že terapeuticky účinný derivát amlodipinu představuje amlodipinbesylat.

60. Způsob snižující krevní tlak a systémové koncentrace lipidů vyznačující se tím, že zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství kombinace amlodipinu a hydroxylovaného atorvastatinového metabolitu.

61. Způsob podle nároku 60 vyznačující se tím, že farmaceutický prostředek synergicky snižuje krevní tlak a systémové koncentrace lipidů na úrovně statisticky shodné s úrovněmi přirozenými.

62. Způsob podle nároku 61 vyznačující se tím, že synergické snížení krevního tlaku a systémových koncentrací lipidů je alespoň částečně způsobeno sníženou oxidací lipidů.