MX2007005784A - Efecto sinergistico de amlodipina y atorvastatina sobre la liberacion de oxido nitrico en celulas endoteliales de la aorta. - Google Patents

Abstract

La combinacion de amlodipina y atorvastatina actuan para sintetizar sinergisticamente la produccion NO. Ademas, la adicion de un compuesto terciario complementa esta combinacion de amlodipina y atorvastatina en la produccion de NO.

Description

EFECTO SINERGISTICO DE AMLODIPINA Y ATORVASTATINA SOBRE LA LIBERACIÓN DE ÓXIDO NÍTRICO EN CÉLULAS ENDOTELIALES DE LA AORTA Campo de la Invención Esta invención se relaciona al efecto de amlodipina y atorvastatina, solas, o en combinación entre sí, o entre sí más un agente terciario, sobre la producción y liberación de óxido nítrico (NO) de las células endoteliales. Antecedentes de la Invención La enfermedad de arteria coronaria (CAD) es la causa principal de mortalidad en el mundo desarrollado y está asociada con la morbidez sustancial también. Típicamente, el paciente con CAD tiene varias condiciones concomitantes, incluyendo hipertensión, diabetes, y dislipidemia, incrementando el riesgo total para pobres resultados y complicando el tratamiento. Un objetivo terapéutico para el tratamiento de CAD es el desarrollo de fármacos que puedan dirigirse simultáneamente a múltiples procesos de enfermedad implícitos que contribuyen a la aterosclerosis, para alterar de esta manera el curso de la enfermedad. Por lo tanto, la terapia de CAD puede tener resultados positivos incrementados si el uso de un agente antihípertensivó e inhibidor de HMGCoA reductasa se combinara en un solo sistema de suministro. El colesterol libre es un componte estructural importante de la membrana de plasma de la célula que modula el empaquetamiento de moléculas de fosfolípido, regulando de esta manera la dinámica y estructura de la bicapa del lípido. La molécula de colesterol está orientada en la membrana tal que el eje largo yace paralelo a las cadenas de acilo de fosfolípido, incrementando eJ orden en la región de cadena de acilo de la membrana mientras que disminuye las restricciones de empaquetamiento en los grupos de metilo terminales. Durante la aterogénesis, sin embargo, el incremento de los niveles del colesterol celular conduce a su deposición anormal en la pared del vaso y la formación de cristales de colesterol . En modelos anímales de aterosclerosis, se ha demostrado que el contenido de colesterol de membranas asociadas con las células del músculo liso vascular y de espuma de macrófago llega a ser elevado, dando por resultado la formación de dominios discretos. Estas estructuras de colesterol altamente organizadas, caracterizadas por una periodicidad de célula unitaria de 34-0 A, aparecen para servir como sitios de nucleación para la formación de cristales extracelulares. Estos dominios han sido previamente descritos en sistemas de membrana modelo. Un estudio reciente de laboratorio de los inventores mostró que las células de espuma de macrófago peritoneales de ratón cultivadas produjeron cristales de colesterol libres que se extienden desde los sitios de membrana intracelulares con varias morfologías que incluyen placas, agujas y hélices. Con el uso de procedimientos de difracción de rayos X, las etapas tempranas de la formación de cristal podrían ser identificadas en las membranas aisladas de estas células. La prevención de la formación de cristal es un objetivo importante ya que el colesterol en este estado es prácticamente inerte y no responde bien a las intervenciones farmacológicas que promueven la regresión de la lesión. Además, la producción normal de NO por el endotelio es crítica para mantener la función vascular. Durante la aterosclerosis, sin embargo, la disfunción endotelial efectúa una reducción significante en la producción de NO, dando por resultado: 1) monocito incrementado e infiltración de LDL, 2) pérdida de función de la célula del músculo liso y proliferación anormal, 3) tensión oxidante incrementada y 4) agregación de plaquetas incrementadas. Las intervenciones farmacológicas que restauran la función endotelial y el metabolismo de NO han demostrado beneficio en el tratamiento de varios desórdenes cardiovasculares, incluyendo la enfermedad de arteria coronaria. Una composición farmacéutica que trata tanto la hipertensión como la hiperlipidemia tendría varios beneficios. Por ejemplo, los factores de riesgos múltiples para la enfermedad arterial y relacionada al corazón que frecuentemente están presentes en un. paciente individual podrían ser dirigidos simultáneamente. Adicionalmente, la facilidad para tomar una dosificación combinada podría significantemente aumentar la conformidad del paciente con los regímenes terapéuticos. Por lo tanto, es un objetivo de esta invención proporcionar una terapia de combinación que tratará los procesos patológicos múltiples involucrados en la enfermedad arterial y relacionada al corazón. Estos incluyen, pero no se limitan a, hipertensión e hiperlipidemia. También es un objetivo de esta invención desarrollar niveles de dosificación útiles y convenientes y formas de tal combinación terapéutica. Preferíblemente, esta composición farmacéutica tendría efectos sinergísticos sobre estos sellos de enfermedad arterial y relacionada al corazón, tal que los efectos individuales de los componentes de esta composición serían aumentados por su combinación. Así, esta invención abarca un objetivo terapéutico para el tratamiento de CAD que implica el - desarrollo de fármacos que pueden dirigir simultáneamente procesos de enfermedad subyacentes múltiples que contribuyen a la aterosclerosis, alterando de esta manera el curso de la enfermedad. Por lo tanto, usando esta invención, la terapia de CAD puede tener resultados positivos incrementados si el uso de un agente antihipertensivo e inhibidor de HMG-CoA reductasa se combinó en un sistema de suministro -individual .

Las manifestaciones clínicas de aterosclerosis, incluyendo enfermedad de la artería coronaria y la apoplejía, son la causa conducente de muerte y de discapacidad en los Estados Unidos. La aterosclerosis, a su vez, causalmente se vincula a un deterioro de las relajaciones dependientes del endotelio, caracterizada por la bíodisponibilidad reducida de óxido nítrico (NO) producida del NO sintasa endotelíal (eNOS) . En realidad, los factores de riesgo principales para la aterosclerosis tal como hiperlipidemia, diabetes, obesidad, falla del corazón, hipertensión, y tabaquismo todos son asociados con la relajación dependiente del endotelio deteriorado (EDR) . Aunque los mecanismos subyacentes del EDR reducido son multifactoriales, su causa más importante es una interrupción d'e la ruta de óxido nítrico (NO) . Así, los agentes que mejoran y restauran la producción normal de NO representarían un desarrollo nuevo importante en el tratamiento de la aterosclerosis, y finalmente, la enfermedad cardiovascular. Los inventores han descubierto recientemente que la combinación de la amlodipina y la atorvastatina afecta sinergísticamente la biodisponibilidad de NO. Existe un deseo actual para combinar estos agentes con un tercer agente que mejoraría adicionalmente la biodisponibilidad del NO. Breve Descripción de la Invención Esta invención se relaciona al efecto de la amlodipina y la atorvastatina, solas, o en combinación entre sí, o entre sí más un agente terciario, sobre la producción y liberación de óxido nítrico (NO) de las células endoteliales. Una modalidad de la presente invención se dirige a una composición farmacéutica para mejorar la producción de NO que comprende cantidades terapéuticamente efectivas de amlodipina, atorvastatina y un compuesto terciario que aumenta el NO. En un aspecto de esta modalidad, la atorvastatina puede ser cualquier atorvastatina por sí misma o su metabolito hidroxilado. En todavía otro aspecto, el agente terciario que aumenta el NO puede ser, por ejemplo, L-arginina, tetrahidrobiopterina, un inhibidor de ACE, un oxidante, un ß-bloqueador, un antagonista receptor de tipo 1 de angiotensina II y los similares. En todavía otra modalidad, se describe un método para incrementar sinergísticamente la producción de óxido nítrico mediante células endoteliales que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de una combinación de amlodipina, un compuesto de atorvastatina y un agente terciario que aumenta el NO. En todavía otra modalidad, se describe un método para tratar la enfermedad arterial y relacionada al corazón que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de una combinación de amlodipina, un compuesto de atorvastatina y un agente terciario que aumenta el NO. Otra modalidad de la presente invención se dirige a un método para disminuir la presión sanguínea y las concentraciones de lípidos sistémicos que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de una combinación de amlodipina, un compuesto de atorvastatina y un 5 agente terciario que aumenta el NO. Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1 muestra el patrón de difracción de rayos X y el modelo molecular correspondiente para la bicapa de membrana enriquecida con colesterol. Los máximos de difracción que corresponden a los dominios ricos y pobres en esterol se pueden distinguir claramente a 87% de humedad relativa a 20°C. Los máximos marcados 1' y 2' corresponden al dominio rico en esterol (d = 34.0 A) mientras que el área pobre en esterol circundante de la membrana tuvo un valor de espacio d de 60.7 A, que corresponde a los máximos marcados 1, 2, y 4. El modelo molecular correspondiente demuestra el dominio de bicapa de colesterol con una dimensión de 34.0 Á (cada molécula de monohídrato de colesterol individual es 17.0 Á) que es resaltada por la región sombreada de la figura. La Figura 2 muestra los efectos diferenciales de "" temperatura (Figura 2A) y humedad relativa (Figura 2B) sobre las dimensiones moleculares de los dominios de monohidrato de colesterol contra las regiones de membrana pobres en esterol circundantes para las muestras que contienen verapamil. El / ancho de la membrana, como es medido en unidades A por el análisis de difracción de rayos x, representa la distancia del centro de una membrana a la siguiente, que incluye la hidratación de superficie. En la Fig. 2A, el efecto de temperatura sobre el ancho de la membrana se evaluó en una constante de 93% de humedad relativa mientras que en la Fig. 2B el efecto de la humedad' relativa se midió en una temperatura constante de 20 °C. Estos datos demuestran que la estructura de los dominios cristalinos de monohidrato de colesterol (34.0 Á) no están afectados por los cambios en la temperatura o humedad, como es comparado a la región pobre en esterol circundante de la membrana. La Figura 3 muestra el patrón de difracción de rayos X de las bicapas de líquido de membrana orientadas que contienen niveles elevados de colesterol (relaciones en mol de 1.1:1 y 1.2:1 de colesterol a fosfolípido) preparado en ausencia o presencia de la combinación AML/AT a 5°C. En una relación en mol de 1.1:1 de colesterol a fosfolípido, los máximos marcados 1, 2 y 4 corresponde a los valores de espacio de 54.2 Á y 53.0 Á, respectivamente, para las muestras de control y que contienen el fármaco. En una relación en mol de 1.2:1 de colesterol a fosfolípido, los máximos marcados 1 y 2 correspondieron a los valores de espacio d de 55.5 A- y 53.5 A, respectivamente, para las muestras de control y que contienen fármaco. Esta figura demuestra que en una concentración baja (30 nM) , la combinación de AML y AT bloqueó completamente la agregación de colesterol en los dominios de colesterol discretos. La Figura 4 muestra los patrones de difracción de rayos X de las bicapas de lípido de membrana orientadas que contienen niveles elevados de colesterol (relación en mol de 1.2:1 de colesterol a fosfolípido) preparados en la ausencia o presencia de AML solo, AT solo, combinación de AML/AT, combinación de AT/nifedipina, y combinación de AML/lovastatina a 5°C. Los máximos marcados 1, 2 y 4 corresponden a la región pobre en esterol de la membrana mientras que los máximos marcados 1' y 2 ' corresponden a la estructura de los dominios de monohidrato de colesterol dentro de la membrana (34.0 Á) . Las dimensiones de las regiones pobres en esterol circundantes fueron como sigue: control (55.5 Á) , AML solo (57.8 A), AT solo (56.8 A), AML/AT (53.5 A), AT/nifedipina (56.5 Á) y AML/lovastatina (54.4 Á) . Estos experimentos demostraron que la habilidad de la combinación de AML/AT para interferir con la formación del dominio de colesterol de membrana podría no ser reproducido por los fármacos separadamente u otras combinaciones de CCB/estatina. La Figura 5 muestra los patrones de difracción de rayos X de las bicapas de lípido de membrana orientadas que contienen niveles elevados de colesterol (relación en mol de 1.2:1 de colesterol a fosfolípido) preparados en la ausencia o presencia de AML solo, AT solo, y combinación de AML/AT a 5°C. Los máximos marcados 1, 2 y 4 corresponden a la región pobre en esterol de la membrana mientras que los máximos marcados 1' y 2 ' corresponden a la estructura de los dominios de monohidrato de colesterol dentro de la membrana (34.0 A). Las dimensiones de las regiones pobres en esterol circundantes fueron como sigue: control (52.4 Á) , AML solo (54.4 A), AT solo (554.8 A), AML/AT (53.9 A). Estos experimentos demostraron que la combinación de AML/AT fue capaz de interferir con la formación de dominio de colesterol de membrana en una manera que podría no ser producida por los fármacos separadamente. La Figura 6 muestra las curvas de respuesta de dosis para la liberación de NO estimulada por la amlodipina, atorvastatina (Compuesto T) , y una mezcla de amlodípina con concentraciones variantes de atorvastatina (Compuesto T) . La Figura 7 representa el efecto de la amlodipina, atorvastatina ya sea solas o en combinación sobre la síntesis de NO. Descripción Detallada de la Invención Esta invención se relaciona al efecto de la amlodipina y la atorvastatina, solas o en combinación entre sí, o entre sí más un agente terciario, sobre la producción y liberación de óxido nítrico (NO) de las células endoteliales.

Una modalidad de la presente invención se dirige a una composición farmacéutica para mejorar la producción de NO que comprende cantidades terapéuticamente efectivas de amlodipina, atorvastatina y un compuesto terciario que mejora el NO. En un aspecto de esta modalidad, la atorvastatina puede ser ya sea atorvastatina sola o su metabolito hidroxilado. En todavía otro aspecto, el agente terciario que aumenta el NO puede ser, por ejemplo, L-arginina, tetrahidrobiopterina, un inhibidor de ACE, un antioxidante, un ß-bloqueador, un antagonista receptor de tipo 1' de angiotensina II y los similares. Estudios se condujeron para examinar el efecto para combinar amlodipina y atorvastatina. El protocolo y los resultados se exponen enseguida. Preparación de muestras de membrana reconstituidas.

Fosfolípido cardíaco porcino disuelto en cloroformo de grado HPLC (10.0 mg/ml) se obtuvo de Avanti Polar Lipids Inc. (Alabaster, AL) y se almacenó a -80 °C. La composición de ácido graso de los lípidos fosfatidilcolina se determinó mediante el análisis cromatográfico de gas-líquido. La relación completa de los ácidos grados saturados a insaturados fue 0.8:1, con los constituyentes primarios que son 18:2 de ácido linoleico (30%), 16:0 de ácido palmítico (22%), 18:1 de ácido oleico (13%), y 20:4 de ácido araquidonico (11%) - El polvo de colesterol también se adquirió de Avanti Polar Lipids Inc. El besilato de amlodipina (AML) se obtuvo de Pfizer Central Research (Groton, CT) mientras que el calcio de atorvastatina (AT) se proporcionó por Parke Davis (Ann Arbor, MI) . Los efectos de los fármacos sobre la organización y estructura del colesterol de membrana se estimaron en vesículas de lípido bien definidas que contienen niveles equimolares de colesterol y fosfolípido. Este sistema de membrana reconstituido se utilizó para las siguientes razones: 1) este sistema reproduce cambios en la estructura de membrana observados en las membranas de células de macrófago aterosclerótico, enriquecido de colesterol y del músculo liso, 2) la preparación de la membrana no contiene canales de calcio, y 3) estas muestras se pueden preparar en una forma altamente reproducible. Las vesículas de lípido se formaron de fosfolípido y colesterol disueltos en cloroformo en una relación molar fija y se adicionaron a tubos de prueba de 13 x 100-mm de vidrio individuales. El solvente de cloroformo se removió mediante el secado de cubierta bajo una corriente permanente de gas de N2. El solvente residual se removió bajo vacío mientras que las muestras se cubrieron de luz. Las vesículas de membrana se produjeron para el análisis de difracción al mezclar rápidamente los lípidos secos a temperatura ambiente después de la adición de la solución salina regulada (0.5 mmol/L de HEPES y 154.0 mmol/L de NaCl, pH, 7.2). La concentración de fosfolípido final fue 5.0 mg/mL. Las muestras de membrana se orientaron para el análisis de difracción mediante la centrifugación y luego se colocaron en frascos herméticamente sellados que controlaron la temperatura y la humedad relativa, como previamente se describe . Análisis de difracción de rayos x de ángulo pequeño . Los procedimientos de difracción de rayos x de ángulo pequeño se utilizaron para examinar directamente los efectos de varios fármacos sobre la organización de colesterol en la membrana. Los experimentos de difracción de rayos x se condujeron al alinear las muestras en la incidencia rasante con respecto a una fuente de rayos x monocromática filtrada con níquel, colimada (CuKa = 1.54 A) producida mediante un generador de microfoco de ánodo de rotación de alta brillantez (Rigaky Rotaflex RU-200, Danvers, MA) . Los datos de difracción se recolectaron sobre un detector electrónico sensible de posición, unidimensional (Innovative Technologies, Newburyport MA) colocado en una distancia de 150 mm de la muestra. Además de la calibración directa del sistema detector, los cristales de monohidrato de colesterol se utilizaron para verificar la calibración, como previamente se describe. La periodicidad de la célula unitaria, o d, de la bicapa de lípido de membrana es la distancia medida del centro entre una bicapa a la siguiente, que incluye la hidratación de superficie, y calculada de la Ley de Bragg. Mediciones de liberación de NO. Todas las mediciones presentadas se registraron in vitro. La liberación de NO se midió directamente a partir de una célula endotelial sola en la aorta de conejo. Las mediciones se hicieron en solución de balance de Hank a 37 °C. Un sensor porfirínico (diámetro de 0.2±0.1 µm) se colocó cerca de la superficie (10+5 µm) de las células endoteliales utilizando un micromanipulador controlado por computadora. El sensor se operó con un sistema de 3 electrodos [electrodo contador de alambre de platino, de electrodo de trabajo de sensor (0.1 mm) , y electrodo de calomel saturado (electro de referencia SCE] ) . Los tres electrodos se conectaron a un potensiostato/galvanostato PAR273. Los datos fueron exactos con el uso de una computadora IBM con un software adecuado. La corriente proporcional a la concentración No se midió mediante el sensor porfirínico, el cual se operó en un modo a peramétrico en potencial constante de 0.63 V contra SCE. La liberación de NO se inhibió mediante la inyección de agonistas potenciales de NO sintasa endotelial (eNOS) utilizando un temtoinyector colocado en la distancia controlada de la célula endotelial. Los dos agonistas diferentes se probaron: amlodipina y atorvastatina. También se probaron las tres concentraciones diferentes de estos dos compuestos aplicadas simultáneamente. Las membranas similares a a teroscleróticas tienen distintos dominios de esterol similares cristalinos : Los dominios ricos en esterol de membrana pueden representar un sitio de nucleación importante para la formación de cristal de colesterol libre, una característica importante de la placa inestable. Los efectos separados y combinados de AML y AT sobre la formación de monohidrato de colesterol en membranas reconstituidas de fosfolípidos nativos aislados de tejido cardíaco se evaluaron. El fosfolípido compuesto de cadenas de acilo heterogéneas se utilizó para estos análisis. Estos dominios ricos en esterol discretos reproduciblemente formados de sistema de membrana en niveles previamente observados en estudios de aterosclerosis bajo condiciones experimentales similares. El análisis de difracción de rayos X de membranas enriquecidas con colesterol producidas de órdenes de difracción reproducibles, fuertes que corresponden a regiones de membrana ricas y pobres de esterol estructuralmente distintas. La medición del espacio d se refiere al espacio promedio del centro de una bicapa de membrana a la siguiente, que incluye la hidratación de superficie. El espacio d de la región rica en esterol fue 34.0 A, indicativa de una estructura de bicapa de colesterol como una molécula de monohidrato de colesterol individual tiene un eje largo de 17 A (Fig. 1) . Las regiones pobres de esterol circundantes, mientras tanto, tuvieron un ancho promedio de 65.9 A a 20°C y 95% de humedad relativa. El ancho mucho más grande (>90%) de los dominios pobres de esterol es atribuido a la abundancia de fosfolípido en la región de membrana circundante. Los dominios de colesterol estuvieron invariablemente presentes sobre un intervalo amplio de temperaturas (5-37°C) y niveles de humedad relativos (74-93%), consistentes con el análisis de difracción de rayos x previo sobre muestras de membrana similares ateroscleróticas. En la Fig. 1, los máximos de difracción que corresponden a los dominios ricos y pobres de esterol se pueden distinguir claramente a 20°C. Los máximos marcados 1' y 2' corresponden al dominio rico en esterol (d = 34.0 Á) mientras que el área pobre de esterol circundante de la membrana tuvo un valor de espacio d de 60.7 Á, que corresponde a los máximos marcado 1, 2 y 4. Los máximos que describen la fase de monohidrato de colesterol son muy agudos, como es esperado par una estructura similar cristalina. En cada muestra que se evaluó, se observó que las dimensiones de la región pobre de esterol de la membrana se modularon mediante temperatura y humedad relativa debido a su composición química heterogénea y la movilidad dinámica de la mezcla binaria de fosfolípido-colesterol . En humedad relativa a 93%, el espacio d de la región pobre del esterol disminuyó por 5.5 Á (9%) conforme la temperatura de la muestra se incrementó de 15°C (64) a 40°C (58.5 Á) , consistente con las isomeraciones trans-gauche incrementadas (Fig. 2) . Sobre este mismo intervalo de temperatura, sin embargo, la fase de monohidrato de colesterol permaneció sin cambio a 34.0 A, como es esperado para una estructura similar cristalina. Además, la estructura de 43.0 A altamente reproducible se inafectó por grandes cambios en la humedad relativa (52 a 93%) a 20°C mientras que la región pobre de esterol cambió por 19% o 10 A (52 a 62 A) sobre este mismo intervalo. Inhibición sinergística de la formación del dominio de esterol con amlodipina y atorvastatina : La adición de 'tanto AML como AT a las muestras de membrana enriquecidas con colesterol previnieron la formación de dominio de esterol en una forma sinergística. En una concentración reguladora acuosa de 30 nM, la combinación de AML y AT bloqueó completamente la formación de los dominios de colesterol en las muestras de membrana que contienen colesterol y fosfolípido en relaciones en mol de 1.1:2 y 1.2:1 de colesterol : fosfolípido . En la presencia de dos fármacos, únicamente los máximos que corresponden a la bicapa de fosfolípido podrían ser observados bajo una variedad de condiciones experimentales, como es comparado al control (Fig. 3). En una relación en mol de 1.1:1, los valores de espacio d para las muestras que contienen la combinación de control y fármaco fueron 54.2 y 53.9 Á, respectivamente, a 74% de humedad relativa y 5°C. En una relación en mol de 1.2:1, los valores de espacio d para las muestras que contienen la combinación de control y fármaco fueron de 55.5 y 53.5 A, respectivamente, a 74% de humedad relativa y 5°C. Cuando el AML o AT se adicionaron separadamente a las muestras de membrana, los dominios de colesterol pudieron ser claramente detectados bajo condiciones idénticas con procedimientos de difracción de rayos x de ángulo pequeño. Por otra parte, la combinación de AML y AT con otros fármacos no tuvo efecto inhibitorio sobre la formación de cristal de colesterol. Tanto la combinación de AML con lovastatina de inhibidor de HMG-CoA de reductasa como la combinación de AT con la nifedipina CCB no lograron interferir con la formación de dominio de colesterol, como es comparado a las muestras de control (Fig. 4) . Los dominios de colesterol fueron muy prominentes en estas muestras con una periodicidad de célula unitaria de 34.0 A. Estas estructuras discretas coexisten con la región pobre de esterol circundante de la membrana. A 5°C y 74% de humedad relativa, la región pobre de esterol circundante de las muestras de membrana tuvieron los siguientes valores de espacio d: control (55.5 A), AML/lovastatina (54.4 A), y AT/nifedipina (56. Á) . Finalmente, cuando la AML y AT se adicionaron separadamente a las muestras de membrana enriquecidas de colesterol, ellas no interfirieron con la formación del dominio. El efecto sinergístico de la AML y AT sobre la formación del dominio de colesterol también se observó en una concentración más baja de colesterol. En una relación en mol de colesterol a fosfolípído de 1.1:1, la combinación de fármaco interfirió efectivamente con la cristalización del cplesterol dentro de las muestras de membrana (Fig. 5) . En contraste, cuando se utilizaron separadamente, los fármacos no tuvieron efecto sobre la formación del dominio, aun en este nivel más bajo de colesterol de membrana. A 5°C y 74% de humedad relativa, la región pobre de esterol circundante de las muestras de membrana tuvo los siguientes valores de espacio d: control (55.5 A), AML sola (54.4 A), AT sola (55.8 Á) y AML/AT (53.9 A) . Una explicación para el efecto sinergístico de AML y AT sobre la organización de colesterol puede ser sus propiedades químicas. 'La AML tiene lipofilicidad muy alta como es comparada a otras CCBs y una carga positiva en pH fisiológico. En una interacción electrostática entre la AML y AT así como la región de grupo principal de fosfolípido de la membrana contribuye a la afinidad alta de este agente para la bicapa de lípido. Por otra parte, la función aminoetoxi cargada de la AML dirige el fármaco a una región de la membrana que sobrepone el núcleo de esteroide de las moléculas de colesterol, un efecto que puede conducir directamente a una interrupción en la autoasociación de las moléculas de colesterol en la membrana. Del mismo modo, se ha observado que la AT se divide a una ubicación similar en la membrana como AML. El descubrimiento clave fue la observación de que la combinación de que AML y AT inhibieron la formación de los dominios de colesterol separados en las membranas similares ateroscleróticas en una forma sinergistica . Este efecto biofísico de la combinación de fármaco se caracterizó directamente con los procedimientos de difracción de rayos x de ángulo pequeño utilizando membranas de lípido enriquecida con colesterol. Como los agregados de colesterol dentro de la membrana pueden servir como sitios de nucleación para la - formación de cristal de colesterol libre extracelular en la pared del vaso, la habilidad de la combinación de ALM/AT para bloquear tal formación de dominio de colesterol indica un mecanismo antiaterosclerótico novedoso de acción. Este efecto observado parece que es distinto para estos grupos como otras combinaciones no logradas para reproducir este cambio en las propiedades de agregación de colesterol libre. En la aterosclerosis, la incidencia de la ruptura de la lesión y trombosis es afectada por la composición de lípido de la placa aterosclerótica . El componente de lípido de las lesiones ateroscleróticas consiste principalmente de colesterol y fosfolípido, con cantidades menores de ácido graso y triacilglicerol . A través del tiempo, el colesterol forma estructuras cristalinas' en el ateroma humano, un evento que contribuye a la inestabilidad de masa y placa de la lesión completa. Una vez cristalizado, el colesterol dentro de la lesión es esencialmente inerte y no se puede remover efectivamente por los aceptores de lípoproteína en el plasma. En contraste, el colesterol no cristalizado asociado con las membranas de célula en espuma o almacenamiento intracelulares se puede agotar por el HDL de plasma y las intervenciones farmacológicas, conduciendo a la regresión de la lesión. Reportes recientes indican que la membrana celular es un sitio celular para la acumulación de colesterol libre, conduciendo a los dominios ricos en esterol discretos y eventualmente al cristal. En las células en espuma macrófagas, por ejemplo, una masa crítica de colesterol 'se logra después de la captación de lipoproteína (nativa u oxidada) y/o fagocitosis de lípido liberada de células en la espuma necróticas adyacentes. Finalmente, un evento de nucleación ocurrirá en una concentración crítica de enriquecimiento de colesterol, conduciendo al desarrollo del dominio de colesterol dentro de la membrana. Al interferir con la formación de los agregados de colesterol altamente organizados dentro de la membrana, la combinación de AML y AT puede significantemente desacelerar o aun prevenir el desarrollo de cristal subsecuente en la pared del vaso, y de 99 esta manera bloquear la progresión de una etapa de otra manera irreversible en la aterosclerosis. Por otra parte, estos agentes pueden trabajar sinergísticamente con la terapia de HDL y disminución de lípido en la reducción de la acumulación de cristales de colesterol en la pared de la arteria enferma al mantener el colesterol en un estado no cristalino y dinámico en las membranas celulares. El mecanismo por el cual el AML y AT interfieren con la agregación de colesterol en los dominios discretos se puede relacionar a sus interacciones de membrana moleculares. En el pH fisiológico, más del 90% de la función de la aminoetoxi asociada con la posición #2 del anillo de dihidropiridina de la AML está en el estado cargado. Esta carga positiva contribuye a las interacciones electrostáticas específicas de la AML con los grupos de fosfato asociados con la superficie de bicapa de fosfolípido. Los resultados de la difracción de rayos x de ángulo pequeño previa, la calorimetría de exploración diferencial y el análisis de resonancia magnético nuclear soportan un modelo molecular que coloca la función del amino cargado de AML cerca de los grupos opuestamente cargados en la región del grupo principal de fosfolípido. Simultáneamente, la porción hidrofóbica de la molécula de dihidropiridina se entíerra dentro del núcleo de hidrocarbono de membrana, adyacente a la región del grupo principal. Estas mediciones biofísicas indican que la ubicación promediada en tiempo de la estructura del anillo para el AML se sobrepone al núcleo de esterol del colesterol en la membrana, donde luego puede modular ciertos efectos biofísicos de la molécula, e interferir con su autoasociacíón. Del mismo modo, los procedimientos de difracción de rayos x de ángulo pequeño demuestran que la AT se dividió a una ubicación discreta en la bicapa de la membrana . Así, este efecto sinergístico, inesperado puede ser atribuido a las interacciones moleculares de estos compuestos con los constituyentes de lipido de membrana. Este descubrimiento tiene relevancia importante para el tratamiento de la enfermedad de la arteria coronaria (CAD) ya que este desorden se caracteriza por la acumulación anormal del colesterol libre en los dominios de membrana, separados (espacio d de 34.0 A) . Estos dominios interrumpen la función celular y conducen a la formación de cristal extracelular, una característica importante de la placa aterosclerótica inestable. Los análisis de difracción de rayos x de ángulo pequeño demostraron, por la primera vez, que la combinación de AML y AT bloquearon la agregación de colesterol libre en los dominios celulares cristalinos en concentraciones nanomolares, bajas. En contraste, la combinación de estos agentes con otros fármacos relacionados no mostró efecto inhibitorio sobre la formación de cristal de colesterol.

Estos descubrimientos indican que la combinación de AML y AT produce un efecto antiaterosclerótico novedoso al interrumpir • la formación de cristal de colesterol en las membranas similares ateroscleróticas. Al interrumpir la formación de los cristales de colesterol en la pared del vaso, la combinación de AML/AT reduciría la inestabilidad de placa mientras que facilita la afluencia de colesterol a las partículas aceptoras de esterol, tal como HDL. Este mecanismo antiaterosclerótico nuevo de acción para la combinación de AML/AT complementaría las actividades separadas de estos agentes en el tratamiento efectivo de la enfermedad cardiovascular . Liberación de NO de las células endoteliales de la aorta : La Figura 6 muestra las curvas de respuesta de dosis para la liberación de NO estimulada por la amlodipina, atorvastatina, y la mezcla de 5 µmol/L de amlodipina y concentraciones variables (de 1 - 5 µmol/L) de atorvastatina. Basado en los datos representados en la Fig. 6, existe un efecto sinergístico significante observado después de la estimulación de la liberación de NO de las células endoteliales por la combinación de la amlodipina y atorvastatina sobre un intervalo de dosis. Por lo tanto, los resultados de estos análisis demostraron un efecto sinergístico poderoso para la combinación de amlodipina y atorvastatina sobre la inhibición de formación de cristal de colesterol y la liberación de óxido nítrico de las células endoteliales de la aorta de conejo. Los resultados de este estudio proporcionan soporte científico convincente para el uso combinado de AML y AT en el tratamiento de desórdenes cardiovasculares. Estos efectos antiateroscleróticos novedosos de la combinación de AML/AT complementan las actividades separadas de estos agentes en el tratamiento de la enfermedad cardiovascular, incluyendo CAD. La presente invención describe métodos para incrementar sinergísticamente la liberación de óxido nítrico (NO) presente en una vasculatura del sujeto al administrar una cantidad efectiva de amlodipina y metabolito de atorvastatina con por lo menos otro agente terciario que aumenta el NO que aumenta la biodisponibilidad de NO de las células endoteliales. El óxido nítrico (NO) se produce mediante la conversión enzimática de el aminoácido L-arginina a L-citrulina mediante Ja acción enzimática de una NO sintasa dependiente de NADPH (NOS) . La enzima NOS requiere Ca2+/calmodulina, FAD, FMN, y tetrahidrobiopterina (BH4) como factores (Moneada y Higgs, 1993, N. Engl j Med. 329:2002-2012; Nathan y Xie, 1994, J Biol Chem, 269:13725-28, las enseñanzas completas de las cuales se incorporan en la presente por referencia) . En los vasos sanguíneos, el NO se produce a partir del endotelio mediante la expresión constitutiva de la isoforma endotelial de NOS (eNOS) , que se activa por la tensión mecánica tal como esfuerzo cortante sanguíneo y la estimulación con agonistas tales como radiquinina y acetilcolina. El NO tiene una variedad de funciones, pero su acción como el factor de relajamiento derivado de endotelio (EDRF) es el más importante para el mantenimiento , de la homeostasis vascular (Moneada y Higgs, ' 1993) Un deterioro de las relajaciones dependientes de endotelio (EDR) está presente en los vasos ateroscleróticos aun antes de los cambios estructurales vasculares que ocurren y representan la biodisponibilidad de NO derivado de eNOS reducida. La disfunción endotelial como es caracterizado por un deterioro de EDR, y la bioactividad de NO derivada de eNOS de esta manera reducida, es la etapa crítica para la aterogénesis. Entre varios mecanismos responsables para la EDR deteriorada, el rompimiento de NO incrementado por el superóxido es importante, y existe la producción aumentada de superóxido en los vasos ateroscleróticos. Bajo ciertas circunstancias, el eNOS llega a ser disfuncional y produce superóxido antes que NO. La función patofisiológica del eNOS disfuncional ha atraído atenciones en los desórdenes vasculares, que incluyen aterosclerosis. Como es previamente- mencionado, bajo condiciones normales, el NO se genera por el óxido nítrico sintasa de endotelio vascular (eNOS) en respuesta a la activación de los receptores mecanoquí icos asociados con el flujo vascular incrementado y los agonistas naturales tales como acetilcolina, bradiquinina y la sustancia P. La disfunción endotelial, que incluye pérdida de la producción de NO normal, se asocia con varios desórdenes cardiovasculares que incluyen aterosclerosis, hipertensión, falla del corazón y diabetes melitus (ver, Drexier H, Hayoz D, Munzel T, Homig B, Just H, Brunner HR, Zeus R. , Endothelial function in chronic congestive heart failure, Am. J. Cardiol. 1992;69:1596-1601; Gilligan DM, Panza JA, Kilcoyne CM, Waclawiw MS, Casion PR, Quyyumi AA. , Contribution de endothelium-derived nitric oxide to exercise-induced vasodilation. Circulation. 1994 ; 90 : 2853-2858; Panza JA, Quyyumi AA, Brush JE, Epstein SE. Abnormal endothelium-dependent vascular relaxation in patients with essential hypertension. N. Engl. J. Med. 1990;323:22-27; Cardillo C, Kicoyne CM, Quyyumi AA, Cannon RO, Panza JA. Selective defect in nitric oxide synthesis may explain the impaired endothelium-dependent vasodilation in patients with essential hypertension. Circulation. 1998/97:85 1-856; Drexier U, Hornig B. Endothelial dysfunction in human disease. J. Mol. Ceil. Cardiol. 1999;3:51-60, las enseñanzas completas las cuales se incorporan en la presente por referencia) . En los pacientes con hipertensión documentada, la producción de NO disminuida da por resultado la pérdida de la vasodilatación normal. Durante el desarrollo de la falla del corazón, la disfunción endotelial da por resultado los cambios inadaptivos en la vasculatura periférica y el músculo esquelético, conduciendo a síntomas de intolerancia de ejercicio (Drexier H, Hayoz D, Munzel T, Homig B, Just II, Brunner HR, Zelis R. Endothelial function in chronic congestive heart failure. Am. J. Cardiol. 1992;69:1596-1601; Gilligan DM, Panza JA, Kilcoyne CM, Waclawiw MS, Casion PR, Quyyumi AA. Contribution de endothelium-derived nitric oxide to exercise-induced vasodilation. Circulation. 1994 ; 90 : 2853-2858, las enseñanzas completas las cuales se incorporan en la presente por referencia) . La producción de NO parece que es una actividad esencial en el endotelio para mantener una superficie no trombogénica, lisa. Durante la aterosclerosis, sin embargo, una deficiencia en la síntesis de NO tiene consecuencias adversas sobre las hemodinámicas vasculares y la inflamación (Libby P. Changing concepts in atherogenesis . J. Intem. Med. 2000;247:349-358; Ross R. Atherosclerosis — An inflammatory disease. N. Engi . J. Mcd. 1999;340:1 15-126, las enseñanzas completas las cuales se incorporan en la presente por referencia). Estos efectos nocivos incluyen: 1) daño radical libre incrementado, 2) agregación de la plaqueta, 3) hiperadhesividad incrementada de leucocitos, 4) vasocontracción aumentada, y 5) producción incrementada del vasocontracción, endotelina. Así, una deficiencia en la disponibilidad de NO podría ser un evento temprano clave que promueva la aterogénesis en la vasculatura humana. Los agentes farmacológicos que aumentan la síntesis de NO tienen efectos . favorables sobre pacientes con hipertensión - y enfermedad aterosclerótica (es decir, enfermedad de la arteria coronaria) al incrementar los niveles constitutivos de eNOS (Wiemer G, Linz W, Hatrik S, Scholkens BA, Malinski T. Angíotensin converting enzyme • inhibition alters nitric oxide and superoxide reléase in normotensive and hypertensive rats. Hypertension. 1997;30:1183-1190; Treasure CB, Klein JL, Weintraub WS, Talley ID, Stillabower ME, Kosinski AS, Zhang J, Boccuzzi SJ, Cedarholm JC, Alexander RW. Beneficial effects de cholesterol-lowering therapy on the coronary endothelium in patients with coronary artery disease. N. Engl. J. Mcd. 1995;332:481-487, las enseñanzas completas las cuales se incorporan en la presente por referencia) sorprendentemente, la combinación de amlodipina y atorvastatina aumentan la producción de NO de las células endoteliales humanas en una manera altamente sinergística. Este descubrimiento tiene amplias implicaciones para el uso de estos agentes en el tratamiento de enfermedades cardiovasculares. En un aspecto, los métodos para incrementar la liberación de óxido nítrico (NO) presente en una vasculatura del sujeto al administrar una cantidad efectiva de amlodipina y metabolito de atorvastatina con por lo menos otro agente que aumenta la b'iodisponibilidad de NO de las células endoteliales se describen. Ejemplos de agentes terciarios que aumentan el NO adecuados incluyen pero no se limitan a, L-arginina (sustrato para NOS), tetrahidrobiopterina (BH4, un cdeactor de NOS) , inhibidores de ACE (ramipril, enalapril, quinapril), antioxidantes (por ejemplo, vitamina E, probucol, vitanima C) , ß-bloqueadores (nebivolol, . carvedilol, metoprolol) y agonistas receptores de tipo 1 (ATI) de angiotensina II (irbesartan, candesartan, valsartan, losartan) . Un aspecto de la presente modalidad se dirige hacia la administración de una cantidad efectiva de amlodipina/metabolito de atorvastatina con agonistas receptores activados con proliferador de peroxisoma (PPAR?) (por ejemplo, rosiglitozona) . Estos agentes se utilizan para el tratamiento de diabetes al aumentar la sensibilidad de las células a la insulina. Sin embargo, estos agentes han mostrado beneficios vasculares adicionales más allá de la regulación genómica, dando por resultado la presión sanguínea y función del vaso mejoradas consistente con la mejora endotelial (Ryan y colaboradores 2004 Hypertension, 43:661:666, la enseñanza completa de la cual se incorpora en la presente por referencia) . Un aspecto particular de la presente modalidad se dirige hacia un método para tratar un sujeto que tiene una disfunción de la célula endotelial. La disfunción de la célula endotelial causa o contribuye a uno o más desórdenes cardiovasculares. En un aspecto adicional, el desorden vascular se selecciona del grupo que consiste de aterosclerosis, hipertensión, dislipidemia, diabetes melitus, falla del corazón, obesidad, tabaquismo y falla renal. A estos sujetos se les puede administrar una cantidad efectiva de una cantidad efectiva de una combinación de amlodipina, atorvastatina, y un tercer agente, tal como aquellos descritos en lo anterior. Cualquiera de los compuestos identificados de la presente invención se pueden administrar a un sujeto, incluyendo un humano, por sí mismo, en composiciones farmacéuticas donde se mezclan con portadores o excipientes adecuados en dosis terapéuticamente efectivas para prevenir, tratar o mejorar una variedad de desórdenes que incluyen aquellos caracterizador por esos resumidos en la presente. Una dosis terapéuticamente efectiva además se refiere a aquella cantidad del suficiente compuesto que da por resultado la prevención o mejora de los síntomas asociados con tales desórdenes. Las técnicas para la formulación y administración de los compuestos de la invención actual se pueden encontrar en Goodman and Gilman' s The Pharmacological Basis de Therapeutics, Pergamon Press, última edición. Los compuestos de la presente invención se pueden dirigir a sitios específicos mediante la inyección directa en aquellos sitios. Los compuestos diseñados para el uso en el sistema nervioso central deben ser capaces de cruzar la barrera del cerebro sanguínea o ser adecuados para la administración mediante la inyección localizada. Las composiciones farmacéuticas adecuadas para el uso en la presente invención incluyen composiciones en donde los ingredientes activos están contenidos en una cantidad efectiva para lograr su propósito propuesto. Más específicamente, una cantidad terapéuticamente efectiva significa una cantidad efectiva para prevenir el desarrollo de o aliviar los síntomas existentes y la patología subyacente del sujeto que se trata. La determinación de las cantidades efectivas está bien dentro de la capacidad de aquellos expertos en la técnica. Para cualquier compuesto utilizado en los métodos de la presente invención, la dosis terapéuticamente efectiva se puede estimar inicialmente a partir de los ensayos de cultivo celular. Por ejemplo, una dosis se puede formular en modelos animales para lograr un intervalo de concentración circulante que incluye el IC50 (la dosis donde 50% de las células muestran los efectos deseados) como se determina en el cultivo celular. Tal información se puede utilizar para determinar más con exactitud las dosis útiles en humanos. Una dosis terapéuticamente efectiva se refiere a aquella cantidad del compuesto que da por resultado la atenuación de los síntomas o una prolongación de supervivencia en un sujeto. La toxicidad y eficacia terapéutica de tales compuestos se puede determinar mediante los procedimientos farmacéuticos estándares en los cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, para determinar la LD50 (la dosis letal a 50% de una población dada) y la ED50 (la dosis terapéuticamente efectiva en 50% de una población dada) . La relación de dosis entre los efectos tóxicos terapéuticos es el índice terapéutico se puede expresar como la relación entre LD50 y ED50. Son preferidos los compuestos que exhiben índices terapéuticos altos. Los datos obtenidos a partir de estos ensayos de cultivo celular y estudios animales se pueden utilizar en la formulación de un intervalo de dosificación para el uso en humanos. La dosificación de tales compuestos yace preferiblemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen el ED50 con poca o nada de toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y la ruta de administración utilizada. La formulación exacta,, ruta de administración y dosificación se pueden elegir por el médico individuo en vista de una condición del paciente. La cantidad de dosificación e intervalo se pueden ajustar individualmente para proporcionar niveles de plasma de la porción activa que son suficientes para mantener los efectos deseados. En el caso de la administración local o captación selectiva, la concentración local efectiva del fármaco no se puede relacionar a la concentración de plasma. La cantidad de composición administrada, por supuesto, será dependiente sobre el sujeto que se trata, sobre el peso del sujeto, la severidad de la enfermedad, la manera de administración y la valoración del médico que prescribe . Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden manufacturar en una manera que es conocida por sí misma, por ejemplo, por medio de procesos de mezclado convencionales, disolución, granulación, levigación, emulsificación, encapsulación, atrapamiento o lideilización. Las composiciones farmacéuticas para el uso de acuerdo a la presente invención así se pueden formular en la manera convencional utilizando uno o más portadores fisiológicamente aceptables que comprenden excipientes y auxiliares que facilitan el procesamiento de los compuestos activos en las preparaciones que se pueden utilizar farmacéuticamente. La formulación apropiada es dependiente en la ruta de administración elegida.

Para la inyección, los agentes de la invención, se pueden formular en soluciones acuosas, preferiblemente en soluciones reguladoras fisiológicamente compatibles tales como solución de Hank, solución de Ringer, o solución reguladora salina fisiológica. Para la administración transmucosal, los penetrantes apropiados a las barreras para ser penetradas se utilizan en la formulación. Tales penetrantes son generalmente conocidos en la técnica. Para la administración oral, los compuestos se pueden formular fácilmente al combinar los compuestos activos con portadores farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica. Tales portadores permiten los compuestos de la invención ser formulados como tabletas, pildoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, pastas aguadas, suspensiones y los similares, para la ingestión oral por un sujeto a ser tratado. Las preparaciones farmacéuticas para el uso oral se pueden obtener excipientes sólidos opcionalmente moliendo una mezcla resultante, y procesando la mezcla de granulos después de la adición de auxiliares adecuados, sí se desea, para obtener tabletas o núcleos de grageas. Los excipientes adecuados son, en particular, rellenadores tales como azúcares, que incluyen lactosa, sacarosa, manitol, sorbitol; las preparaciones de celulosa tales como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de papa, gelatina, goma de tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio, y/o polivinil-pirrolidona (PVP) . Si se desea, se pueden adicionar agentes desintegrantes, tales como la polivinilpirrolidona reticulada, agar, o ácido algínico o una sal del mismo tal como alginato de sodio. Los núcleos de grageas se proporcionan con recubrimientos adecuados. Para este propósito, las soluciones de azúcar concentradas se pueden utilizar, las cuales pueden opcionalmente contener goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel de carbopol, polietilenglicol, y/o dióxido de titanio, soluciones de laca, y solventes orgánicos adecuados o mezclas de solventes. Materias colorantes o pigmentos se pueden adicionar a los recubrimientos de tabletas o grageas para identificación o para caracterizar las combinaciones diferentes de las dosis de compuesto activo. Las preparaciones farmacéuticas que se pueden utilizar oralmente incluyen cápsulas de ajuste suave hechas de gelatina, así como cápsulas selladas, suaves hechas de gelatina y un plastificante, tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas de ajusta suave pueden contener los ingredientes activos en ' mezcla con el rellenador tal como lactosa, aglutinantes tales como almidones, y/o lubricantes tales como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizantes. En las cápsulas suaves, los compuestos activos se pueden disolver o suspender en líquidos adecuados, tal como aceites grasos, parafina líquida, o polietilenglicoles líquidos. Además, se pueden adicionar estabilizantes. Todas las formulaciones para la administración oral deben ser en dosificaciones adecuadas para tal administración. Para la administración bucal, las composiciones pueden tomar la forma de tabletas o pastillas formuladas en la manera convencional. Para la administración por inhalación, los compuestos para el uso de acuerdo a la presente invención se suministran convencionalmente en la forma de una presentación de rocío de aerosol de empaques presurizados o un nebulizador, con el uso de un propelente adecuado, por ejemplo, diclorodiflurometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluorometano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado la unidad de dosificación se puede determinar al proporcionar una válvula para una cantidad dosificada. Cápsulas y cartuchos de por ejemplo, gelatina para el uso en un inhalador o insuflador se pueden formular conteniendo una mezcla del polvo del compuesto y una base de polvo adecuada tal como lactosa o almidón . Los compuestos se pueden formular para la administración parenteral por inyección, por ejemplo, mediante la inyección de bolus o infusión continua. 'Las formulaciones para la inyección pueden estar presentes en dosificación unitaria para, por ejemplo, en ampolletas o en contenedores de multidosis, con conservadores adicionados. Las composiciones pueden tomar tales formas como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos aceitosos o acuosos, y pueden contener agentes formulatorios tales como agentes de suspensión, de estabilización y/o de dispersación. Las formulaciones farmacéuticas para la administración parenteral incluyen soluciones acuosas de los compuestos activos en forma soluble en agua. Adicionalmente, las suspensiones de los compuestos activos se pueden preparar como suspensión de inyección aceitosa apropiada. Los solventes o vehículos - lipohílicos adecuados incluyen aceites grasos, tales como aceite de ajonjolí, o esteres de ácido graso sintéticos, tal como oleato de etilo o triglicéridos o liposomas. Las suspensiones de inyección acuosas pueden contener sustancias que incrementan la viscosidad de la suspensión, tal como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol, o dextrano. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizantes o agentes adecuados que incrementan la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas. Alternativamente, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo para la constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua libre de pirógeno estéril, antes del uso. Los compuestos también se pueden formular en composiciones rectales tales como supositorios o enemas de retención, por ejemplo, que contienen bases de supositorios convencionales tales como mantequilla de cacao u otros glicéridos . Además de las formulaciones previamente descritas, los compuestos también se pueden formular como una preparación de depósito. Tales formulaciones de larga acción se pueden administrar mediante la implantación (por ejemplo subcutáneamente o intramuscularmente) o mediante la inyección intramuscular. Así, por ejemplo, los compuestos se pueden formular con materiales poliméricos o hidrofóbicos adecuados (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio de iones, o como derivados pocos solubles, por ejemplo, como una sal poco soluble. Un portador farmacéutico para los compuestos hidrofóbicos de la invención es un sistema cosolvente que comprende alcohol bencílico, un surfactante no polar, un polímero orgánico miscible en agua, y una fase acuosa. Naturalmente, las proporciones de un sistema cosolvente pueden ser variadas considerablemente sin destruir sus características de solubilidad y toxicidad. Además, la identidad de los componentes cosolventes puede ser variada.

Alternativamente, otros sistemas de suministro para los compuestos farmacéuticos hidrofóbicos se pueden emplear. Las liposimas o emulsiones son ejemplos bien conocidos de vehículos o portadores de suministro para fármacos hidrofóbicos. Ciertos solventes orgánicos tal como dimetiisulfóxido también se pueden emplear, aunque usualmente en el costo de mayor toxicidad. Adicionalmente, los compuestos se pueden suministrar utilizando un sistema de liberación sostenida, tal como matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el agente terapéutico. Varios de los materiales de liberación sostenida han sido establecidos y son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Las cápsulas de liberación sostenida pueden, dependiendo de su naturaleza química, liberar los compuestos durante pocas semanas hasta más de 100 días. Dependiendo de la naturaleza química y la estabilidad biológica del reactivo terapéutico, las estrategias adicionales para la estabilización de la proteína se pueden emplear. Las composiciones farmacéuticas también pueden comprender portadores o excipientes de fase sólida o de gel adecuados. Ejemplos de tales portadores o excipientes incluyen pero no se limitan a, carbonato de calcio, fosfato de calcio, varios azúcares, almidones, derivados de celulosa, gelatina, y polímeros tales como polietílenglicoles .

Muchos de los compuestos de la invención se pueden proporcionar como sales con counteriones farmacéuticamente compatibles. Las sales farmacéuticamente compatibles se pueden formar con muchos ácidos, que incluyen pero no se limitan a clorhídrico, sulfúrico, acético, láctico, tartárico, málico, succínico, etc. Las sales tienden a ser más solubles en solventes acuosos u otros protónicos que son las formas de base libre correspondientes. Las rutas adecuadas de administración pueden, por ejemplo, incluir administración oral, rectal, transmucosal, transdérmica o intestinal; suministro parenteral, que incluye inyecciones intramusculares, subcutáneas, intramedularmente, así como inyecciones intratecales, intraventricular directas, intravenosas, intraperitoneales, intranasal, o intraocular. Alternativamente, se puede administrar el compuesto en una manera local antes que sistémica, por ejemplo, por la vía de inyección del compuesto directamente en un área afectada, frecuentemente en una formulación de liberación de depósito o sostenida. Además, se puede administrar el compuesto en un sistema de suministro de fármaco dirigido, por ejemplo, en un liposoma recubierto con un anticuerpo específico para las células afectadas. Los liposomas serán dirigidos a y tomados selectivamente por las células. Las composiciones pueden, si se desean, ser presentadas en un paquete o dispositivo dispensador que puede contener una o más formas de dosificación unitarias que contienen el ingrediente activo. El paquete puede, por ejemplo, comprender metal o lámina delgada de plástico, tal como un paquete de ampolletas. El paquete o dispositivo de dispensador se puede acompañar por la instrucción para la administración. Las composiciones que comprenden un compuesto de la invención formulada en un portador farmacéutico compatible también se pueden preparar, colocar en un contenedor apropiado, y marcar para tratamiento de una condición indicada. Las condiciones adecuadas indicadas sobre la etiqueta pueden incluir tratamiento de una enfermedad tal como se describe en la presente. EJEMPLO Lo siguiente es un experimento que demuestra la producción de óxido nítrico estimulada con la combinación de amlodipina y atorvastatina de las células endoteliales humanas en una forma sinergística como es comparada a la de control. Estos datos demuestran un efecto sinergístico de esta combinación única de compuestos en el tratamiento del estado enfermo de aterosclerosis, que es el proceso de enfermedad subyacente para varios desórdenes cardiovasculares, que incluyen enfermedad de la arteria coronaria y falla del corazón. Como se discute en lo anterior, una deficiencia en la producción de óxido nítrico es asociada con la disfunción endotelial, una causa principal de hipertensión y aterosclerosis. El protocolo empleado se expone enseguida. Mediciones de Nanosensor de Óxido Nítrico: 1. Los nanosensores se prepararon de fibras de carbono. El tamaño de la punta de la fibra de carbono se redujo de 6 µm a menos de 1 µm mediante el quemado controlado en temperatura. Los sensores se hicieron sensibles al NO mediante la deposición de porfirina polimérica eléctricamente conductiva y se cubrió con una capa delgada de Nafión de acuerdo a los procedimientos previamente descritos (Malinski T, Taha Z. Nitric oxide reléase from a single ceil measured in situ by a porphyrinic-based microsensor. Nature. 1992;358:676-678, la enseñanza completa de la cual se incorpora en la presente por referencia. 2. Las mediciones de NO se hicieron en la solución del medio de crecimiento. El nanosensor se colocó en una distancia de aproximadamente 5±2 µm de la superficie de la célula endotelial con una ayuda de un icromanipulador de computadora motorizado. El nanosensor opera como un componente de un sistema de tres electrodos: nanosensor (electrodo de trabajo) , electrodo de calomel saturado (electrodo de referencia) y alambre de platino (electrodo contrario, 0.5 mm de diámetro). Los amperogramas (curvas de corriente contra tiempo) se registraron con un femtostato Guniry FAS1 (Warminster, PA) . 3. Las células HUVEC se obtuvieron de American Type Culture Collection (Manassas, VA) y se desarrollaron en el medio F12K de Ham con 2 mM de L-glutamina ajustada para contener 1.5 g/L de bicarbonato de sodio y suplementada con 0.1 mg/ml de parina y 0.03 - 0.05 mg/mL de suplemento de crecimiento de célula endotelial (ECGS) + 10% de suero bovino fetal. Las células HUVEC se mantuvieron en atmósfera de la concentración de C02 elevada (5%). 4. Para las mediciones las cavidades de células se transfirieron a una jaula Faraday y, con la ayuda de microscopio invertido (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania) y el micromanipulador, el nanosensor se colocó cerca de la superficie de la HUVEC. La línea base se estabilizó después de aproximadamente 20 segundos. 5. La amlodipina, Atorvastatina o la mezcla de los dos fármacos se inyectó con la ayuda de un nanoinyector . La concentración de NO se midió durante aproximadamente 60 segundos . 6. El nanosensor para el NO se calibró utilizando la solución saturada (concentración de 1.82 mmol/L verificada con el método caulométrico) . 7. Soluciones de extracto preparadas: A) Amlodipina: Peso = 51.5 mg, MW = 567.1 Solución de Extracto: 10 µM en etanol tomar 5.7 mg y disolver en 1 mL de etanol. B) Atorvastatina: Peso = 53.6 mg, MW = 585.68 Solución de Extracto: 10 µM en metanol tomar 5.9 mg y disolver en 1 L de metanol. 8. Las soluciones de muestra de la amlodipina y la atorvastatina se prepararon como sigue. Se probaron nueve concentraciones separadas de Amlodipina y de Atorvastatina se probaron: 0.25; 0.75; 1.00; 1.50; 2.00; 2.50; 3.00 y 5.00 10 µM. Las' soluciones de trabajo se prepararon mediante la dilución de las soluciones de extracto con agua destilada. El esquema de pipeteo fue como sigue: A) Amlodipina y Atorvastatina (ambas µM de extracto) Tabla 1: Amlodipina y Atorvastatina (ambas µM de extracto) B) Las soluciones de trabajo tuvieron una concentración de 200 x veces más alta que la requerida (final) ya que el volumen de la cavidad de célula fue 2 L mientras que el volumen inyectado fue 10 µL (dilución de 200 x) . 9. El efecto sinergístíco se probó en una concentración constante (5 µM) de Amlodipina (A) y las concentraciones variables de Atorvastatina (T) . La siguiente serie de experimentos probaron este efecto en relaciones constantes de ambos compuestos de acuerdo a las formulaciones (A:T) : 1 µM de A: 1 µM de T; 2 µM de A: 2 µM de T; 2.5 µM de A: 2.5 µM de T ; 3.0 µM de A : 3.0 µM de T; 5.0 µM de A: 5.0 µM de T .

. Se calculó el pico de la concentración de NO máxima. 11. Se integró el área bajo la curva de corriente contra tiempo (amperograma) (coulometría) y se calculó la cantidad de NO detectada por el nanosensor. Se analizaron las siguientes muestras de HUVEC en triplicado a 37 °C. Se describió el método utilizado en lo anterior. Tabla 2 : Amlodipina 0 µM - Control #1 0 µM - Control #2 0 µM - Control #3 0.25 µM - 1 de 3 0.25 µM - 2 de 3 0.25 µM - 3 de 3 0.75 µM - 1 de 3 0.75 µM - 2 de 3 0.75 µM - 3 de 3 1.0 µM - 1 de 3 1.0 µM - 2 de 3 1.0 µM - 3 de 3 1.5 µM - 1 de 3 1.5 µM - 2 de 3 1.5 µM - 3 de 3 2.0 µM - 1 de 3 2.0 µM - 2 de 3 2.0 µM - 3 de 3 2.5 µM - 1 de 3 2.5 µM - 2 de 3 2.5 µM - 3 de 3 3.0 µM - 1 de 3 3.0 µM - 2 de 3 3.0 µM - 3 de 3 .0 µM - 1 de 3 .0 µM - 2 de 3 5.0 µM - 3 de 3 Atorvastatina Los datos de la Atorvastatina se registraron en una manera similar como los datos de la amlodipina. Tabla 3: Mezcla: Amlodipina (5 µM) + Atorvastatina (varía) ) Atorvastatina 0.25 µM - 1 de 3 0.25 µM - 2 de 3 0.25 µM - 3 de 3 0.75 µM - 1 de 3 0.75 µM - 2 de 3 0.75 µM - 3 de 3 1.0 µM - 1 de 3 1.0 µM - 2 de 3 1.0 µM - 3 de 3 1.5 µM - 1 de 3 1.5 µM - 2 de 3 1.5 µM - 3 de 3 2.0 µM - 1 de 3 2.0 µM - 2 de 3 2.0 µM - 3 de 3 2.5 µM - 1 de 3 2.5 µM - 2 de 3 2.5 µM - 3 de 3 3.0 µM - 1 de 3 3.0 µM - 2 de 3 3.0 µM - 3 de 3 5.0 µM - 1 de 3 5.0 µM - 2 de 3 5.0 µM - 3 de 3 Tabla 4: Mezcla ¡mismas relaciones, en concentraciones equimolares) Los datos - se presentaron como medio±SEM para cada uno de las mediciones de triplicado. Los datos (cálculo y graficación) se transfirieron al Software de Origen Microcal (OriginLab Corp., Northampton, MA) . Tabla 5: Mediciones del Máximo de NO.

Amlodipina (5.00) + Atorvastatina (0.75) 242.20 ± 24.00 Amlodipina (5.00) + Atorvastatina (1.00) 274.94 ± 22.06 Amlodipina (5.00) +Atorvastatina (1.50) 271.33 ± 15.20 Amlodipina (5.00) + Atorvastatina (2.00) 247.00 ± 6.11 Amlodipina (5.00) + Atorvastatina (2.50) 231.60 + 7.80 Amlodipina (5.00) + Atorvastatina (3.00) 208.71 ± 30.74 Amlodipina (5.00) + Atorvastatina (5.00) 130.50 ± 15.12 Amlodipina (1.00) + Atorvastatina (1.00) 126 ± 18 Amlodipina (2.00) + Atorvastatina (2.00) 178 + 7 Amlodipina (2.50) + Atorvastatina (2.50) 201 ± 11 Amlodipina (3.00) + torvastatina (3.00) 219 ± 6 Amlodipina (5.00) + Atorvastatina (5.00) 160 ± 71 La Figura 7 representa los efectos separados y combinados de la amlodipina (cuadros abiertos) , la atorvastatina (círculos sombreados), o la liberación de NO (nM) de células endoteliales humanas como una función de la concentración del fármaco (µM) . En concentraciones equimolares de amlodipina y atorvastatina, se observó un efecto sinergístico pronunciado sobre un intervalo de concentraciones micromolares (1.0 hasta 3.0 µM) . La liberación del NO se midió electrónicamente con un sensor porfirínico sensible colocado en proximidad cercana a la superficie de la célula cultivada. La combinación del fármaco causó la liberación de NO de las células endoteliales humanas en niveles que exceden los efectos aditivos esperados de los fármacos, y. así, indicó un efecto sinergístico claro. Ahora será evidente para aquellos expertos en la técnica que se pueden hacer otras modalidades, mejoras, detalles, y usos que son consistentes con el texto y espíritu de la descripción anterior y dentro del alcance de esta patente y las reivindicaciones adjuntas.

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES 1. Una composición farmacéutica para aumentar la producción de NO, caracterizada porque comprende: (a) una cantidad terapéuticamente efectiva de amlodipina: (b) una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de atorvastatina seleccionado del grupo que consiste de atorvastatina y metabolito de atorvastatina hidroxilado; y (c) una cantidad terapéuticamente efectiva de uno o más agentes terciarios que aumentan el NO.
2. 2. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la amlodipina comprende un derivado terapéuticamente efetivo de amlodipina.
3. 3. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el derivado terapéuticamente efectivo de amlodipina comprende besilato de amlodipina .
4. 4. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el compuesto de atorvastatina comprende un derivado terapéuticamente efectivo del compuesto de atorvastatina.
5. 5. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque el derivado terapéuticamente efectivo del compuesto de atorvastatina es una sal de hemicalcio.
6. 6. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el agente terciario que aumenta el NO se selecciona del grupo que consiste de L-arginina, tetrahidrobiopterina, inhibidor de ACE, antioxidante, ß-bloqueador, antagonista de receptor de tipo 1 de angiotensina II.
7. 7. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque el inhibidor de ACE se selecciona del grupo que consiste de ramipril, enalapril, quinapril, y los similares.
8. 8. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque el antioxidante se selecciona del grupo que consiste de vitamina E, probucol, vitamina C y los similares.
9. 9. La • composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque el ß-bloqueador se selecciona del grupo que consiste de carvedilol, metoprolol y los similares.
10. 10. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque el antagonista de receptor de tipo 1 de angiotensina II se selecciona del grupo que consiste de irbesartan, candesartan, valsartan, losartan y los similares .
11. 11. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la composición farmacéutica reduce el riesgo de enfermedad arterial y relacionada al corazón.
12. 12. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque la enfermedad arterial y relacionada al corazón se selecciona del grupo que consiste de hipertensión, hiperlipdemia, aterosclerosis, arteriosclerosis, enfermedad de arteria coronaria, infarto al miocardio, falla del corazón congestiva, apoplejía y angina de pecho.
13. 13. Un método para incrementar sinergísticamente la producción de óxido nítrico mediante las células endoteliales, caracterizado porque comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de una combinación de amlodipina, un compuesto de atorvastatina seleccionado del grupo que consiste de atorvastatina y metabolito de atorvastatina hidroxilado y un agente terciario que aumenta el NO.
14. 14. Un método para tratar enfermedad arterial y relacionada al corazón, caracterizado porque comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de ' una combinación de amlodipina, un compuesto de atorvastatina seleccionado del grupo que consiste de atorvastatina y metabolito de atorvastatina hidroxilado y un agente terciario que aumenta el NO.