DE60022168T2

DE60022168T2 - Verfahren zur synthese, reinigung und charakterisierung von kombinatorischen bibliotheken

Info

Publication number: DE60022168T2
Application number: DE60022168T
Authority: DE
Inventors: Yves Ribeill; Pierre Monnet; Azmi Jaleh ABEDI; David Henry SMITH; Marie Susan MCCOMB
Original assignee: Scynexis Inc
Current assignee: Scynexis Inc
Priority date: 1999-02-11
Filing date: 2000-02-11
Publication date: 2006-05-18
Anticipated expiration: 2020-02-12
Also published as: DE60022168D1; EP1159063B1; DE1159063T1; WO2000047540A3; JP2002536653A; EP1159063A2; WO2000047540A9; ATE302649T1; ES2186594T1; WO2000047540A2

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung liegt allgemein im Bereich eines neuen Verfahrens und einer neuen Vorrichtung für die Synthese, Aufbereitung, Charakterisierung und Analyse von kombinatorischen Bibliotheken von Verbindungen. Diese Anwendung bezieht sich auch auf Schnittstellen, die konzipiert sind, um an Mehrfachröhrengestellen (Mehrfachreagenzglasgestellen) angebracht zu werden, die eine Vielzahl von Röhren zur Durchführung chemischer Synthese, Aufbereitung und Ähnlichem enthalten, und auch um an einer Oberfläche auf einer in der automatisierten chemischen Synthese verwendeten Komponente angebracht zu werden. Diese Anwendung bezieht sich weiter auf Mehrfachröhrengestelle zum Einsetzen einer großen Anzahl von Röhren zur Durchführung von chemischer Synthese, Aufbereitung und Ähnlichem.
Hintergrund der Erfindung
Kombinatorische Chemie wird allgemein verwendet, um eine große Anzahl chemischer Verbindungen gleichzeitig anzusetzen, aufzubereiten, zu charakterisieren und/oder zu analysieren. Diese Vorgehensweise kann eingesetzt werden, um vielversprechende Verbindungen für die Weiterentwicklung zu identifizieren. In kombinatorischen chemischen Experimenten werden chemische Bibliotheken (große Sammlungen von Verbindungen verschiedenartiger Struktur) häufig hergestellt, indem eine Kernverbindung mit verschiedenen Anteilen (Hälften) zur Reaktion gebracht wird, um eine Vielzahl von Verbindungen mit derselben Kernstruktur, aber mit einer mehreren Substituenten bereitzustellen. Struktur-/Aktivitätsverhältnisse (SARs) können dann durch Auswerten der Verbindungen nach Aktivität bestimmt werden.
Eine Beschränkung bei der kombinatorischen Chemie besteht nicht nur bei der Erzeugung neuer Verbindungen, sondern auch in der Aufbereitung, der Analyse und der Sortierung (Screening) der Verbindungen. Häufig können so viele Verbindungen synthetisiert werden, dass in den Stadien der Aufbereitung, der chemischen Analyse und der Bioanalyse ein Engpass erzeugt wird.
Verschiedene Methodologien sind entwickelt worden, um kombinatorische Bibliotheken zu synthetisieren, aufzubereiten, zu analysieren und zu sortieren. Einige von diesen beinhalten das Ansetzen von Verbindungen in Platten mit mehreren Vertiefungen (Mehrfachvertiefungsplatten), und andere beinhalten Mehrfachröhrenanordnungen (Mehrfachröhrenkonfigurationen). Eine Beschränkung bei der Verwendung der Mehrfachvertiefungsplatten ist, dass die Größenordnung der Reaktionen aufgrund der Größe der Vertiefungen eher beschränkt ist und es schwierig sein kann, die chemische Ausbeute zu bestimmen, da es schwierig ist, das Gewicht der einzelnen Proben in einer Vielzahl von Vertiefungen zu erhalten. Das Synthetisieren von Verbindungen in Mehrfachröhrenanordnungen erlaubt es, die Synthese etwas auszuweiten, leidet jedoch an dem Nachteil, dass die Röhren keine feste Position haben, so dass menschliche Fehler auftreten können, wenn die Röhren falsch eingesetzt werden.
Weiter gibt es nur wenig Standardisierung auf dem Gebiet der kombinatorischen Chemie. Zum Beispiel beinhalten Mehrfachröhrenanordnungen oft 48 oder 96 Röhren. Jedoch sind die Geräte für die automatisierte Aufbereitung und chemische Analyse nicht notwendigerweise um die Anzahl der Röhren in den Mehrfachröhrenanordnungen herum konzipiert, die zum Ansetzen der Verbindungen verwendet werden. Dies macht es schwierig, die Identität und die Eigenschaften der Verbindungen zu verfolgen, während sie durch die Stadien der Synthese, Aufbereitung und chemischen Analyse fortschreiten.
Frühe Versuche, diese Beschränkungen zu überwinden, haben typischerweise das Platzieren von individuellen Etiketten, z.B. Barcodes auf jedem Rohr, bei einer Mehrfachröhrenanordnung, mit sich gebracht. Die Barcodes erlauben es einem, die Röhren, die vielleicht aufgrund von menschlichem Fehler falsch eingesetzt wurden, zu verfolgen, und auch die Röhren zu verfolgen, die zwischen verschiedenen Mehrfachröhrengestellen mit einer variierenden Anzahl von Röhren pro Gestell hin und her bewegt werden.
Ein Beispiel eines kombinatorischen Ansatzes, der Barcodes zum Verfolgen der Synthese, Aufbereitung und chemischen Analyse von Bibliotheken von Verbindungen verwendet, ist ein von MDS Panlabs entwickeltes System. Dieses System synthetisiert Verbindungen auf einer Skala von 1 Millimol in Mehrfachröhrenanordnungen, unterwirft diese Verbindungen einer präperativen HPLC (High Performance Liquid Chromatography), und analysiert die Verbindungen durch Flusseinspritz-Massenspektrometrie. Jede Röhre in der Anordnung wird mit einem Barcode identifiziert und wird von den Stadien der Synthese, Aufbereitung und chemischen Analyse unter Verwendung von Roboterarmen bewegt. Die Barcodes sind typischerweise unter Verwendung eines Klebstoffs angebracht, welcher zu jedem Stadium verdampfen kann, wenn die Röhren Bedingungen unterworfen werden, die erhöhte Temperaturen und/oder verringerte Drücke beinhalten.
Wegen der Größe vieler kombinatorischen Bibliotheken kann es ein unglaublicher Aufwand sein, individuelle Barcodes auf einer Vielzahl von Röhren zu platzieren und zu verfolgen. Es wäre vorteilhaft, neue Vorrichtungen und Verfahren zur Analyse und Sortierung großer Anzahlen von Verbindungen bereitzustellen, ohne Barcodes für jede Röhre erzeugen zu müssen, die zur Synthese, Charakterisierung oder anderweitigen Handhabung der Verbindungen verwendet wird. Die vorliegende Erfindung stellt solche Vorrichtungen und Verfahren bereit.
DeWitt et al, „Kombinatorische organische Synthese unter Verwendung der Parke-Davis-Diversomer-Methode", Accounts of Chemical Research, U.S., American Chemical Society, Washington, Band 29, Nr. 3, 1. Januar 1996, Seiten 114–122, offenbart ein organisches Festphasen-Syntheseverfahren sowie die Vorrichtung, bezeichnet als das DIVERSOMER-Verfahren und -Vorrichtung. Der DIVERSOMER-Ansatz zur Erzeugung fokussierter Bibliotheken zur Voroptimierung integriert verschiedene Technologien: organische Festphasensynthese, eine Vorrichtung, Anwendungen der Roboterautomatisierung, und Informationsmanagementwerkzeuge. DeWitt et al offenbart, dass die Bibliothekserzeugung effiziente Verfahren zur Isolierung der Zwischenreaktionsprodukte aus den Reagenzien, die sie erzeugt haben, erfordert und dass kein Projekt Erfolg haben wird, wenn jeder Schritt die Aufbereitung und die Entfernung von Lösungsmitteln durch Verdampfung erfordert, egal ob das Ziel die Erzeugung oder die Optimierung chemischer Leitstrukturen ist.
Schultz et al "Aufbereitung kombinatorischer Bibliotheken mit hohem Durchsatz", Bioorganic & Medical Chemistry Letters, Oxford, Band 8, Nr. 17, 8. September 1998, Seiten 2409–2414, offenbart eine Aufbereitung kombinatorischer Bibliotheken mit hohem Durchsatz. Das Verfahren, das zur Datenverfolgung offenbart ist, während Proben durch den Aufbereitungsprozess laufen, beinhaltet die Verwendung eines Bacodes. Entsprechend dem Verfahren von Schultz werden die Röhren mit Barcode versehen und tariert. Eine Tabelle mit Barcodezahl, Tariergewicht und Gestell ID/Position wird vorbereitet. Bei Vollendung jedes HPLC-Laufs werden Informationen über die Proben-ID und Gestell-ID/Position an das CTS (Compound Tracking System, Verbindungsverfolgungssystem) hochgeladen, um die Korrelation von Probenname und Barcodenummer zu ermöglichen.
Garr et al, "Lösungsphasensynthese chemischer Bibliotheken für die Entdeckung chemischer Leitstrukturen", J Biomolec Screening, Band 1, Nr. 4, 1996, Seiten 179–186, offenbart ein Ansetzen kombinatorischer Bibliotheken mit hohem Durchsatz. Beim offenbarten Verfahren werden die Reagenzgläser durch eine automatisierte Kapselungs-Etikettierungs-Arbeitsstation mit Barcodes etikettiert. Die Barcodes identifizieren eindeutig die Reaktionsprodukte in einer elektronischen Datenbank und werden zu Inventarzwecken verwendet, indem sie die Positionsbestimmung der Reagenzgläser in einem Archiv erleichtern.
Griffey et al, "Schnelle Dekonvolution kombinatorischer Bibliotheken unter Verwendung der HPLC-Fraktionierung", Tethrahedron, NL, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, Band 54, Nr. 16, 16. April 1998, Seiten 4067–4076, offenbart die schnelle Dekonvolution kombinatorischer Bibliotheken, die über gleichzeitige Lösungsphasenzugabe von Funktionalitäten unter Verwendung von HPLC hergestellt wurden, und die WO 98/22219 offenbart eine Synthese und Filtrationsvorrichtung mit mehreren Vertiefungen zum Durchführen von mehreren gleichzeitigen chemischen Reaktionen, Workups und Aufbereitungen auf einer Mikroskala.
Darstellung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung ist auf Verfahren zur Synthese, Aufbereitung und Analyse einer großen Anzahl von Verbindungen gerichtet, insbesondere von solchen, die zur Verwendung in kombinatorischen und/oder Leitstrukturerzeugungs- und/oder Leitstrukturoptimierungs-Bibliotheken erzeugt wurden.
Die Verfahren beinhalten die Erzeugung einer Reihe von Verbindungen in einer Mehrfachröhrenanordnung (-konfiguration), wobei die Position der individuellen Röhren in einer Computervorrichtung gespeichert wird, der Inhalt jeder Röhre an eine chromatographische Vorrichtung zur Aufbereitung/Charakterisierung übertragen wird, das Lösungsmittel von jeder die Verbindung von Interesse enthaltenden Eluentfraktion entfernt wird, die Verbindungen chemisch analysiert werden und dann optional der Bioanalyse unterworfen werden, während die Fähigkeit beibehalten wird, die Position der Röhren in der ursprünglichen Mehrfachröhrenanordnung mit der Position der Röhren zu korrelieren, die im nächsten Betriebsstadium erzeugt oder verwendet werden.
Die Vorrichtungen beinhalten eine oder mehrere Mehrfachröhrenanordnung, eine chromatographische oder anderweitige Aufbereitungsvorrichtung, Mittel zum Übertragen des Inhalts der Röhren zu einer Aufbereitungsvorrichtung, einen Lösungsmittelverdampfer, Mittel zum Zugeben von Lösungsmittel zu den Lösungsmittel-verdampften Röhren, analytische Instrumentierung, und ein Mittel zur Übertragung eines Teils oder des gesamten Inhalts an die analytische Instrumentierung und wahlweise von ihr zurück. Wahlweise beinhaltet die Vorrichtung ein Wiegeinstrument.
In einer Ausführungsform beinhalten die Mehrfachröhrenanordnung(en) eine Abdeckung, die auf die Anordnung mittels Computerkontrolle aufgesetzt oder von ihr entfernt werden kann. Dies erlaubt es dem Computer, Röhren aus der Mehrfachröhrenanordnung an andere Stellen zu bewegen, wie z.B. an eine Wiegestation, und schützt auch die Röhren davor, von Hand bewegt zu werden. Dadurch erübrigt sich die Notwendigkeit, eine Identifikation, z.B. einen Barcode, auf jeder Röhre anzubringen, um die Arten von menschlichem Fehler zu minimieren, die zu falsch platzierten Röhren führen, und minimiert den Fehler, der mit der Verdampfung von Klebstoffen auf dem Barcode-Etikett verbunden ist, welche oft mehr als 10% des Gewichts der Probe betragen kann.
In einigen Ausführungsformen ist die Anzahl der Röhren in den Mehrfachröhrenanordnungen bei jedem Schritt konstant.
Alternativ kann die Anzahl der Röhren von einem Stadium zum nächsten variieren. Jedoch kann eine Korrelation zwischen der Orientierung der Röhren von einem Stadium mit der Orientierung der Röhren in einem folgenden Stadium gemacht werden.
Durch die Korrelation der Orientierung der Röhren von einem Stadium zum nächsten ist es möglich, einen einzigen Barcode oder ein anderes Identifizierungszeichen für jede Mehrfachröhrenanordnung zu verwenden, anstatt für jede einzelne Röhre. Dies vereinfacht die Ansammlung von Daten für eine große Anzahl von Verbindungen.
Verbindungen, die unter Verwendung der hier beschriebenen Verfahren und Methoden ausgewertet werden können, beinhalten z.B. pharmazeutische Verbindungen und landwirtschaftliche Chemikalien, wie z.B. Insektizide, Pestizide und Herbizide.
In einer Ausführungsform sind die Verbindungen in der Mehrfachröhrenanordnung in der Form von Anordnungen verschiedener chemischer Verbindungen mit gemeinsamer Struktur angeordnet und werden jeweils auf kontrollierte Weise modifiziert, um eine kombinatorische Bibliothek strukturell verwandter Verbindungen zu erzeugen. Die gemeinsame Struktur hat bevorzugt eine und insbesondere bevorzugt mindestens zwei Stellen, die in der Lage sind, eine Reaktion zur Änderung der Struktur zu durchlaufen, gewöhnlich durch Hinzufügen anderer Moleküle.
In einer Ausführungsform werden die Verbindungen nicht unter Verwendung der hier beschriebenen Vorrichtungen und Verfahren synthetisiert, werden jedoch gereinigt, analysiert und wahlweise einer Bioanalyse unterworfen, nachdem sie zuvor angesetzt wurden.
Die oben beschriebenen Schritte können global an der Anordnung oder individuell an jeder Röhre durchgeführt werden. Während dem Synthetisierungsschritt können z.B. Reagenzien global jeder der Röhren hinzugefügt werden. Während dem Aufbereitungsschritt kann der Inhalt der Röhren individuell an eine Aufbereitungsvorrichtung übertragen werden. Wenn das Lösungsmittel von den Röhren entfernt wird, kann das gesamte Gestell in eine Lösungsmittelentfernungsvorrichtung gestellt werden. Wenn die Reaktionsprodukte charakterisiert werden, kann der Inhalt jeder Röhre individuell an analytische Instrumente gesendet werden. Abhängig von der jeweiligen eingesetzten Vorrichtung kann der Fachmann leicht das Verfahren optimieren, indem gewisse Schritte global durchgeführt werden und gewisse Schritte individuell an den Röhren in den Anordnungen durchgeführt werden.
Wenn die Verbindungen in Röhren zubereitet werden, sind die Verbindungen typischerweise als Lösung der Verbindung in einem Lösungsmittel, typischerweise einem organischen Lösungsmittel, vorhanden. Die Aufbereitung der Verbindungen kann durch Pipettieren des Inhalts der Röhren in ein HPLC und durch Sammeln der gereinigten Verbindung aus der HPLC Kolonne und nachfolgendes Verdampfen des Lösungsmittels durchgeführt werden. Das Lösungsmittel kann auf viele Arten verdampft werden. Eine Art ist die Zentrifugierung unter Vakuum. Eine andere Art ist das Heizen der Röhren, um das Lösungsmittel auszutreiben.
Erste Ausführungsform – Verfahren und Vorrichtung zur Synthese, Charakterisierung, Analyse von kombinatorischen Bibliotheken.
Die vorliegende Erfindung ist auf Vorrichtungen und Verfahren zur Synthese, Aufbereitung und Analyse einer großen Anzahl von Verbindungen gerichtet, insbesondere von solchen Verbindungen, die für kombinatorische Bibliotheken, Leitstrukturerzeugungs- und/oder Leitstrukturoptimierungs-Bibliotheken erzeugt wurden, unter Verwendung von Platten mit Mehrfachvertiefungen und/oder Mehrfachröhrenanordnungen. Wie hierin verwendet, ist eine kombinatorische Bibliothek eine Bibliothek von Verbindungen, die erzeugt wurden, um Leitstrukturverbindungen zu finden und/oder zu erzeugen, und eine Leitstrukturoptimierungs-Bibliothek ist eine Bibliothek von Verbindungen, die um eine zuvor identifizierte Leitstrukturverbindung herum aufgebaut wurde. Wie hierin verwendet, sind im Wesentlichen reine Komponenten mindestens 40–60% rein, bevorzugt 80% rein und besonders bevorzugt mehr als 80% rein. Wie hierin verwendet, ist eine Röhre jeder geeignete Behälter, der ungefähr 200 Mikrogramm bis ungefähr 1 Gramm an Verbindung und bevorzugt ungefähr 1 Milligramm bis ungefähr 100 Milligramm einer Verbindung während der hierin definierten Prozesse aufnehmen kann.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung beinhalten:

a) Synthetisieren einer Reihe von Verbindungen in einer ersten Mehrfachröhrenanordnung oder in Platten mit mehreren Vertiefungen,
b) Speichern der Position der einzelnen Röhren oder Vertiefungen in einer Computervorrichtung,
c) individuelles Übertragen des Inhalts jeder Röhre oder Vertiefung an eine Aufbereitungsvorrichtung,
d) Entfernen des Lösungsmittels aus jeder aufbereiteten Fraktion,
e) wahlweises Wiegen der einzelnen Röhren, nachdem das Lösungsmittel entfernt wurde, um Informationen in Bezug auf die Prozentausbeute zu erhalten,
f) Durchführen einer oder mehrerer chemischer Analysen an den aufbereiteten Verbindungen, wahlweise
g) Übertragen der Verbindung auf eine oder mehrere Platten mit mehreren Vertiefungen zur nachfolgenden Bioanalyse; und
h) wahlweises Durchführen von Bioanalysen an den aufbereiteten Verbindungen.

An jedem Stadium in dem Verfahren kann die Position der Röhre (oder der Vertiefung, wenn die Verbindungen in einer Mehrfachvertiefungsplatte synthetisiert werden) im vorherigen Stadium mit der Position der Röhre im nachfolgenden Stadium korreliert werden. Dies vermeidet die Notwendigkeit, einen Barcode auf jede einzelne Röhre zu platzieren. Stattdessen erlaubt das Verfahren, einen einzigen Code für jede Mehrfachröhrenanordnung oder jede Mehrfachvertiefungsplatte zu verwenden, wodurch das Erhalten von Daten für eine große Anzahl von Verbindungen vereinfacht wird.
Die Vorrichtung beinhaltet eine Mehrfachröhrenanordnung, eine chromatographische oder anderweitige Aufbereitungsvorrichtung, Mittel zum Transferieren des Inhalts der Röhren an die Aufbereitungsvorrichtung, einen Lösungsmittelverdampfer, wahlweise eine Mittel zum Wiegen der verdampften Proben, ein Mittel zum Zufügen von Lösungsmittel zu den Lösungsmittel-verdampften Röhren, analytische Instrumentierung und ein Mittel zum Übertragen eines Teils oder des gesamten Inhalts an die analytische Instrumentierung und wahlweise von ihr.
Die hierin beschriebenen Vorrichtungen und Verfahren ermöglichen die vollständige Kontrolle der Synthese, Aufbereitung und/oder Analyse von gesamten Verbindungsbibliotheken, ohne die Notwendigkeit, jede Teströhre mit einem Barcode zu identifizieren. Das Fehlen eines Barcodes als Identifikation erlaubt eine erhöhte Genauigkeit und eine verminderte Fehlerwahrscheinlichkeit. Dies kann insbesondere relevant sein, wenn die Menge der zu messenden Verbindung dieselbe Größenordnung aufweist wie die Menge des Klebstoffs, der während der Handhabung der Röhren aufgrund von Verdunstung verloren geht.
Da der Inhalt jeder einzelnen Röhre gewogen werden kann, kann die Menge jeder Verbindung, die angesetzt wird, bestimmt werden. Diese Information kann bei der Bestimmung von LC₅₀-Daten nützlich sein, sowie bei der Optimierung chemischer Synthesen.
Durch Ansetzen einer Lösung der Verbindungen und deren Platzierung in separate Mehrfachvertiefungsplatten zur nachfolgenden Bioanalyse können die Röhren nach Reinigung wiederverwendet werden, ohne Barcodes entfernen zu müssen. Die Röhren können en masse gereinigt werden und nochmals gewogen werden, oder es ist auch möglich, die Röhren einzeln zu reinigen und sie zu ihrer ursprünglichen Position in der Anordnung zurückzubringen, sodass das vorher gespeicherte, tarierte Gewicht der Röhre wiederverwendet werden kann, und so eine nochmalige Messung des Gewichts der Röhre vermieden werden kann.
I. Synthese der Verbindung
A. Arten von Verbindungen, die synthetisiert werden können
Jede Art von Verbindung kann entsprechend der hierin beschriebenen Verfahren synthetisiert werden. Insbesondere können Bibliotheken pharmazeutischer Verbindungen und landwirtschaftlicher Verbindungen synthetisiert werden. Typischerweise weisen die Verbindungen eine Kernstruktur auf, die an mindestens einer Position, bevorzugt zwei oder mehr Positionen mit einer Vielzahl von verschiedenen funktionellen Gruppen modifiziert werden kann, um eine Bibliothek, z.B. eine kombinatorische oder eine Leitstrukturoptimierungsbibliothek von Verbindungen zu erzeugen.
Landwirtschaftliche Verbindungen, die synthetisiert werden können, beinhalten z.B. Insektizide, Pestizide, Fungizide, Herbizide, Akarizide und Ähnliches. Beispiele von Insektizidfamilien beinhalten I-Arylpyradzole, Pyrole, Pyrolidone und Nikotinsäurederivate.
Pharmazeutische Verbindungen, die synthetisiert werden können, beinhalten, ohne Einschränkung, Stereoide, Hormone, Peptide, Proteine, Oligonucleotide, Oligoribonucleotide, Enzyme, Liganden, die an verschiedenen Rezeptoren anbinden, und Ähnliches.
Geeignete Kernstrukturen umfassen, ohne Beschränkung darauf, Peptide, Proteine, Oligonucleotide, Oligoribonucleotide, Oligosacharide, Alkaloide, Quinoline, Isoquinoline, Benzimidazole, Benzothiazole, Purine, Pyrimidine, Thiazolidine, Imidazopyrazinone, Oxazolopyridine, Pyrrole, Pyrrolidine, Imidazolidone, Guinolone, Aminosäuren, Makrolide, Peneme, Saccharide, Xanthine, Benzothiadiazine, Anthrazykline, Dibenzocycloheptadiene, Inositole, Porphyrine, Corrine und Kohlenstoffgerüste, die geometrische Feststoffe aufweisen (z.B. Dodekahedrane). Die Kernstrukturen können von natürlich auftretenden Verbindungen abgeleitet sein, oder können nicht natürliche Abwandlungen umfassen (d.h. nicht natürlich vorkommende Aminosäuren und Nukleotide).
Geeignete Modifizierungen für die Kernstruktur umfassen:

1) Aminosäurenderivate, die z.B. natürliche und synthetische Aminosäurenreste umfassen, inklusive aller natürlich auftretenden Alphaaminosäuren, Arten, die Derivate, Varianten oder Mimetiken der natürlich auftretenden Seitenketten aufweisen; N-substituierte Glycinreste; natürliche und synthetische Arten, von denen bekannt ist, dass sie Aminosäurenreste funktional imitieren, wie z.B. Statin, Bestatin usw.
2) Nukleotidderivate, die natürliche und synthetische Nukleotide umfassen, wie z.B. Adenosine, Thymine, Guanidine, Uridine, Cytosine, Derivate von diesen und Varianten und Mimetiken des Purinrings, des Zuckerrings, der Phosphatbrücke und Kombinationen einiger oder aller von diesen. Nukleotidproben (zwischen 2 und 25 Nukleotide) und Oligonukleotide (mehr als 25 Nukleotide) inklusive all der verschieden möglichen strukturellen Modifizierungen; homo- und hetero-synthetische Kombinationen und Permutationen der natürlich auftretenden Nukleotide; Derivate und Varianten, die synthetisches Purin oder Pyrimidinarten oder Imitationen dieser enthalten; verschiedene Zuckerring-Nachahmungen; und eine große Vielfalt alternativer Rückgratanalogien, umfassend ohne Beschränkung auf Phosphordiester, Phosphorothionat, Phosphorodithionat, Phosphoroamidat, Alcylphosphortriester, Sulfamat, 3'-Thioformacetal, Methylen (Methylimino), 3-N-Carbamat, Morpholinocarbanat und Peptidnukleinsäureanaloge.
3) ein Kohlenhydratderivat, das natürliche physiologisch aktive Kohlenhydrate umfasst; verwandte Verbindungen, wie z.B. Glucose, Galactose, sialische Säuren, Beta-D-Glucosylamin und Nojorimycin, die beide Inhibitoren der Glucosidase sind; Pseudozucker, wie z.B. 5a-carba-2-D-Galactopyranose, von der bekannt ist, dass sie das Wachstum der Klebsiella Pneumonie (n = 1) hindert; synthetische Kohlenhydratreste und deren Derivate (n = 1) und alle in der Natur vorhandenen komplexen oligomerischen Permutationen dieser, inklusive Oligosaccharide hoher Mannose, und das bekannte Antibiotikum Streptomycin (n > 1).
4) ein natürlich auftretendes oder synthetisches organisches Strukturmotiv. Der Begriff „Motiv" ist als organisches Molekül definiert, das eine spezifische Struktur aufweist oder enthält, welche biologische Aktivität zeigt, wie z.B. eine Molekül mit einer zu einer aktiven Enzymstelle komplementären Struktur. Dieser Begriff beinhaltet all die wohlbekannten grundlegenden Strukturen pharmazeutischer Verbindungen inklusive Pharmakophore oder ihre Metaboliten. Diese grundlegenden Strukturen beinhalten Betalaktame, wie z.B. Penicillin, von dem bekannt ist, dass es die bakterielle Zellwandbiosynthese hindert; Dibenzazepine, die bekannterweise an CNS-Rezeptoren anbinden und als Antidepressiva verwendet werden; Polyketidmakrolide, die bekannterweise an bakterielle Ribosyme anbinden usw. Von diesen Strukturmotiven ist allgemein bekannt, dass sie bestimmte erwünschte Bindungseigenschaften an Ligandakzeptoren aufweisen.
5) ein Reporterelement, wie z.B. ein natürlicher oder synthetischer Farbstoff oder ein zur photographischen Verstärkung fähiger Rest, der reaktive Gruppen besitzt, die synthetisch in die Sulfaminimidstruktur oder das Reaktionsschema inkorporiert werden können, und durch die Gruppen hindurch angebracht werden können, ohne die Berichterstattungsfunktionalität der Gruppe negativ zu beeinflussen oder in sie einzugreifen. Bevorzugte reaktive Gruppen sind Amino-, Thio-, Hydroxy-, Caroboxyl-Säuren, Ester der Carboxyl-Säure, insbesondere Methylester, Säurechloride, Isocyanatalkylhalide, Arylhalide und Oxirangruppen.
6) ein organischer Anteil, der eine polymerisierbare Gruppe wie z.B. eine Doppelbindung oder andere Funktionalitäten enthält, die in der Lage sind, Kondensationspolymerisierung oder Copolymerisierung durchzuführen. Geeignete Gruppen umfassen Venylgruppen, Oxirangruppen, Carboxylsäuren, Säurechloride, Ester, Amide, Azlaktone, Laktone und Laktame. Andere organische Anteile können verwendet werden, wie z.B. jene, die für R und R' definiert werden.
7) Eine makromolekulare Komponente, wie z.B. eine makomolekulare Oberfläche oder Strukturen, die an die Sulfaminimidmoleküle über die verschiedenen oben umrissenen reaktiven Gruppen angebracht werden können, auf eine Weise, wo die Bindung der angebrachten Spezies an ein Ligand-Rezeptormolekül nicht negativ beeinflusst wird und die interaktive Aktivität der angefügten Funktionalität von dem Makromolekül bestimmt oder beschränkt wird. Beispiele makromolekularer Komponenten umfassen poröse und nichtporöse anorganische Komponenten wie z.B. Silica, Alumina, Zirkionia, Titania und Ähnliches, wie sie gewöhnlich für verschiedene Anwendungen eingesetzt werden, wie z.B. die chromatographische Normal- und Kehrphasentrennung, Wasseraufbereitung, Pigmente für Farben usw.; poröse und nichtporöse organische makromolekulare Komponenten inklusive synthetischer Komponenten wie z.B. Styrenedivinyl-Benzenkügelchen, verschiedene Methacrylatkügelchen, PVA-Kügelchen und Ähnliches, die gewöhnlich für die Proteinaufbereitung, die Wasserenthärtung und eine Vielzahl anderer Anwendungen verwendet werden, natürliche Komponenten wie z.B. native und funktionalisierte Zellulosen, wie z.B. Agarose und Chitin, Flach- und Hohlfasermembranen aus Nylon, Polyethersulfon oder eines der oben genannten Materialien. Das Molekulargewicht dieser Makromoleküle kann von ungefähr 1.000 Daltons so hoch wie möglich reichen. Sie können die Form von Nanopartikeln (dp = 1000–5000 Angstroms), Latexpartikeln (dp = 1000–5000 Angstroms), porösen oder nichtporösen Kügelchen (dp = 0,5 bis 1000 Mikron), von Membranen, Gels, makroskopischen Oberflächen oder funktionalisierten oder beschichteten Versionen oder Verbunden annehmen.

Geeignete chemische Modifikationen umfassen auch chemische Verbindungen mit einem geeigneten organischen Anteil, einem radioaktiven Anteil, einem Wasserstoffatom, einem organischen Anteil, der eine geeignete elektrophile Gruppe enthält, wie z.B. ein Aldehyd, ein Ester, ein Alkylhalid, ein Keton, ein Nitril, ein Epoxid oder Ähnliches; eine geeignete nukleophile Gruppe, wie z.B. Hydroxyl, Amino, Carboxylat, Amid, Carbanion, Urea oder Ähnliches; oder eines der anderen strukturellen Verschiedenheitselemente, die unten definiert sind. Zusätzlich, kann die chemische Modifikation die Form eines Rings, eines bicyclischen oder tricyclischen Ringsystems haben; oder eine Struktur sein, die an den Enden der sich wiederholenden Einheit der Verbindung anschließt, die von der vorangegangenen Formel definiert ist, oder sie kann separat an anderen Anteilen angeschlossen sein.
B. Arten von Reaktionen, die durchgeführt werden können
Praktisch jede Art von Reaktion, die gewöhnlich in einem konventionellen kombinatorischen Chemieverfahren durchgeführt wird, sowie luftempfindliche Reaktionen können unter Verwendung der hierin beschriebenen Vorrichtungen und Verfahren durchgeführt werden. Die Skala der synthetischen Reaktionen befindet sich bevorzugt in dem Bereich von mehr als ungefähr 200 mg, besonders bevorzugt zwischen 1 und 100 mg, obwohl die Skala in Abhängigkeit der Menge der für die jeweilige Anwendung notwendigen Verbindung modifiziert werden kann.
Die chemischen Reaktionen können unter Verwendung von Festphasen- oder Lösungsphasenreaktionen durchgeführt werden. Die Lösungsphasenchemie ist vorteilhaft, da sie typischerweise eher für eine Vergrößerung des Reaktions-Umfangs zugänglich ist als die Festphasenchemie. Des Weiteren können eine größere Vielfalt von Reaktionen und Reaktionsbedingungen mit der Lösungsphasenchemie verwendet werden. Nichtsdestotrotz kann die Festphasenchemie eingesetzt werden, um Verbindungen von Interesse zu synthetisieren.
Beispiele von Reaktionen, die entweder in Fest- oder in Lösungsphasen durchgeführt werden können, umfassen z.B. luftempfindliche Reaktionen, Kondensationsreaktionen zur Zubereitung von Amiden, Estern, Urea, Iminen und Phosphorverbindungen. Verschiedene Kohlenstoff-Kohlenstoff- Bindungs-bildende Reaktionen können unter Verwendung der Fest- und Lösungsphasenchemie durchgeführt werden. Beispiele umfassen Suzuki-Reaktionen, Organozink-Reaktionen, Kopplungsreaktionen nach Stille, Heck-Reaktionen, Enolat-Alkcylationen, Wittig-Reaktionen, Homer-Wadsworth-Emmons-Reaktionen, Methathesereaktionen wie z.B. Rutheniumkatalysierte Methatesen von Polymer-gebundenen Olyphinen, Mitsunobu-Reaktionen, nukleophilische Verschiebung von trägergebundenen A-Bromoamiden in der Submonomerzubereitung von Peptoiden, Thiolalkylation, Anilidalkylation mit primären Alkylhaliden, Ein-Topf-Zyklisierung und Anilidalkylation in der Festphasensynthese von 1,4-Benzodiazepin-2,5-Dionen, sukzessive Amidalkylationen (die neue kominatorische Peptidbibliotheken aus bestehenden kombinatorischen Peptidbibliotheken erzeugen), Benzophenon-Imin-Alpha-Kohlenstoff-Alkylation, Alkylation oder Sulfonylation eines trägergebundenen Phenols, Enolat-Monoalkylation, Alkylation eines trägergebundenen 1,3-Diketons in der Festphasensynthese von Pyrazolen und Isoxazolen, Tosylverschiebung mit primären oder sekundären Aminen, Grignard-Reaktionen, SNAr-Reaktionen, Michael-Additionen, Iodoetherifikationsreaktionen, Oxidationen, Reduktionen wie z.B. reduktive Alkylation, Pictet-Spengler-Reaktionen und Ähnliches.
Die Arten von Reaktionen, die verwendet werden, um bestimmte Bibliotheken zu erzeugen, wird entsprechend den Arten der Verbindungen in den Bibliotheken sowie von den Arten der Substitutionen abhängen, die durchgeführt werden. Der Fachmann kann leicht geeignete Sätze von Reaktionen und Reaktionsbedingungen bestimmen, um die Bibliotheken von Interesse zu erzeugen.
C. Organisation der Verbindungsmodifikationen in Mehrfachröhrenanordnungen
Die Verbindungen können auf jede erwünschte Weise in Mehrfachröhrenanordnungen oder Mehrfachvertiefungsplatten in Form von Anordnungen chemischer Verbindungen angeordnet werden. Z.B. können die Verbindungen auf solche Weise angeordnet werden, dass die strukturelle Verschiedenheit maximiert wird.
D. Durchführen der Reaktionen
Um die chemischen Reaktionen durchzuführen, die nötig sind, um eine Bibliothek aus Verbindungen zu synthetisieren, wird eine Verbindung mit einem oder mehreren Reaktionsstellen zum Durchführen von chemischen Reaktionen in einer Anzahl von Röhren platziert. Geeignete Reagenzien zum Durchführen der erwünschten Chemie werden den Röhren hinzugefügt und man lässt die Reaktionen stattfinden. Roboterame und Multipipettenvorrichtungen können verwendet werden, um die geeigneten Reagenzien zu den richtigen Röhren hinzuzufügen. Wenn angebracht, können die chemischen Reaktionen in einer inerten Atmosphäre durchgeführt werden. Die Röhren können jeweils mit einem Gummiseptum abgedeckt werden, um Kontimination zu vermeiden, und die Reagenzien können mittels Injektion hinzugefügt werden.
Bevorzugt wird die Synthese mittels Computerkontrolle durchgeführt, wobei die Position jeder Röhre in einer Mehrfachröhrenanordnung oder jeder Vertiefung in einer Mehrfachvertiefungsplatte auf einem Computer gespeichert wird und die Identität der zu synthetisierenden Verbindung im Computer auf einer „Gedächtniskarte" oder einem anderen Mittel zur Korrelation der Daten für die Verbindung mit der Position der Röhre oder der Vertiefung gespeichert wird.
Alternativ kann die chemische Reaktion von Hand durchgeführt werden, bevorzugt in Mehrfachröhrengestellen oder Mehrfachvertiefungsplatten, und die Information kann auf einem Computer gespeichert werden. Die Verbindungen in den Röhren können in einander folgenden Stadien aufbereitet, chemisch analysiert und wahlweise der Bioanalyse unterzogen werden.
Bevorzugt ist die Anzahl der Röhren in der Mehrfachröhrenanordnung oder die Anzahl der Vertiefungen in der Mehrfachvertiefungsplatte im Synthesestadium dieselbe wie die Anzahl der Röhren im Mehrfachröhrengestell, das im Aufbereitungsstadium und allen nachfolgenden Stadien verwendet wird, inklusive der chemischen Analyse und der wahlweisen Bioanalyse. Jedoch kann in einer Ausführungsform die Anzahl der Röhren in jedem Stadium verschieden sein, solang eine Korrelation zwischen der Orientierung der Röhren aus einem Stadium mit der Orientierung der Röhren in jedem nachfolgenden Stadium durchgeführt wird. Diese Korrelation wird typischerweise unter Verwendung einer relationalen Datenbanksoftware durchgeführt, wo verschiedene Informationen in Bezug auf den Inhalt jeder Röhre in einer Datenbank gespeichert sind.
II. Die Vorrichtung
A. Mehrfachvertiefungsplatte oder Mehrfachröhrenanordnung
Jede Art von Mehrfachvertiefungsplatte oder Mehrfachröhrenanordnung, die gewöhnlich in der kombinatorischen Chemie verwendet wird, kann eingesetzt werden. Bevorzugt ist die Anzahl der Vertiefungen oder Röhren größer als 30 und es befindet sich eine Röhre in mindestens 60% der Positionen in jeder Mehrfachröhrenanordnung. Bevorzugt ist das Gestell quadratisch oder rechteckig und die Röhren werden unter Verwendung eines Cartesischen Koordinatensystems identifiziert.
Die Röhren können z.B. aus Plastik, Polymeren, Glas oder Metall, wie z.B. Edelstahl hergestellt werden, abhängig von der Art der chemischen Reaktionen, die in den Röhren stattfinden sollen. Die Röhren können wahlweise abgedeckt sein, z.B. mit einem Septum, welches es erlaubt, Reagenzien mittels einer Spritze hinzuzufügen, und auch den Verlust von Produkt minimiert, sollte die Röhre angerempelt oder anderweitig falsch behandelt werden und fast zerbrochen werden.
In einer Ausführungsform beinhaltet die Mehrfachröhrenanordnung eine Abdeckung, die durch Computerkontrolle auf die Anordnung gelegt werden kann oder von ihr entfernt werden kann. Die Abdeckung beinhaltet bevorzugt eine Vielzahl von Löchern oder anderen Räumen, die den Röhren in der Anordnung entsprechen. Die Löcher sind bevorzugt nicht groß genug, dass die Röhren aus Versehen entfernt werden, sind jedoch groß genug, um die Entfernung der Probe und die Zugabe von Lösungsmittel zu erlauben. Auf diese Weise kann der Computer die Zugabe und die Entfernung von Reagenzien aus den Röhren kontrollieren.
Das Anbringen oder das Entfernen der Abdeckung kann z.B. durch Einsetzen und Entfernen einer Schraube erreicht werden, die die Abdeckung in Position verriegelt, oder unter Verwendung anderer Verriegelungsmechanismen. Dies erlaubt es dem Computer, die Röhren aus der Mehrfachröhrenanordnung an andere Stellen zu bewegen, wie z.B. zu einer Wiegestation, und schützt auch die Röhren davor, von Hand bewegt zu werden. Dies erübrigt die Notwendigkeit, einen Barcode auf jede Röhre zu platzieren, um die Arten von menschlichem Fehler zu minimieren, die zu falsch platzierten Röhren führen.
Wenn eine Abdeckung über die Anordnung platziert wird und Septums über jede Röhre gelegt werden, ist es möglich, die Zugabe und die Entfernung von Reagenzien aus den Röhren sowie das Entfernen der Röhren aus der Anordnung unter Verwendung eines Computers zu kontrollieren. Die Möglichkeit eines menschlichen Fehlers wird wesentlich verringert.
B. Mittel zur Übertragung des Inhalts der Röhren
Jede Art von Roboterarm, der die Röhren und den Inhalt der Röhren von einem Stadium zum nächsten übertragen kann, z.B. von der Aufbereitungsvorrichtung zur Analysevorrichtung, kann eingesetzt werden. Geeignete Roboterarme und robotische Vorrichtungen sind dem Fachmann in kombinatorischer Chemie wohl bekannt und umfassen jene von Zymart, Gilson, Hamilton, Bodhan und Tecan. Ein bevorzugter Roboter ist der Gilson 215 Roboter. Die Verwendung von Roboterarmen, um Röhren in der kombinatorischen Chemie zu bewegen, ist dem Fachmann bekannt.
C. Aufbereitungsvorrichtungen
Jede Vorrichtung, die die Proben aus den einzelnen Röhren nehmen kann und die resultierenden Verbindungen aufbereiten kann, kann eingesetzt werden. Bevorzugt ist die Vorrichtung eine chromatographische Vorrichtung wie z.B. ein präparativer HPLC, ein GC, ein präparativer superkritischer Fluidchromatograph oder ein Säulenchrmomatograph, obwohl andere Vorrichtungen in Betracht gezogen werden können, abhängig von den durchgeführten chemischen Reaktionen.
Bevorzugt weist die Vorrichtung in jenen Ausführungsformen, bei welchen eine chromatographische Kolonne (HPLC, GC oder Säulenchromatographie) verwendet wird, die Fähigkeit auf, festzustellen, wann die interessierende Verbindung aus der Säule eluiert. Verschiedene Mittel sind herkömmlich verwendet worden, um festzustellen, wann Verbindungen von Interesse aus einer Säule eluieren, inklusive UV, IR, TLC, GC-MS, FID, NMR, ELSD, Stickstoffmessung und Ähnliches. Jedes dieser Mittel und andere dem Fachmann bekannte können alleine oder in Kombination verwendet werden.
Wenn UV-aktive Verbindungen angesetzt werden, wird das gesamte Eluent aus einer chromatographischen Säule durch einen UV-Detektor gesandt und dann weiter an ein Massenspektrometer. Die Probensammlung kann beginnen, wenn das UV- oder Massenspektrometrie-Signal das Vorhandensein der eluierten Verbindung anzeigt, und kann enden, wenn das UV-Signal anzeigt, dass die Verbindung nicht länger aus der Säule eluiert. Die Massenspektrometrie kann verifizieren, dass die eluierte Verbindung tatsächlich die Verbindung von Interesse ist.
In einer Ausführungsform kann die Position der Röhre vor der Aufbereitung mit mehreren Röhren nach der Aufbereitung korreliert werden, was die Analyse von verschiedenen Reaktionsprodukten aus einer einzelnen Reaktion erlaubt. Dementsprechend kann die Datenbank Informationen speichern, die zu den verwendeten Reaktionsbedingungen, dem Gewicht jedes der erhaltenen Produkte, der chemischen Analyse jedes der Produkte und wahlweise ebenso der Bioaktivität der Produkte in Beziehung steht.
Wenn ein chromatographischer Träger mit Molekülen ausgestattet ist, die spezifisch an eine Komponente der Reaktionsmischung anbinden, wird jene Komponente von der Mischung getrennt und kann daraufhin durch Änderungen der experimentellen Bedingungen (z.B. Puffer, Knappheit, usw) abgesondert werden. Diese Art von Trennung ist als „Affinitätschromatographie" bekannt und ist eine effektive und weitverbreitet angewendete Trenntechnik. Wenn es dementsprechend möglich ist, geeignete Bedingungen zur Durchführung der Affinitätschromatographie zu konzipieren, ist es bevorzugt, dass die Affinitätschromatographie eingesetzt wird, um die Verbindungen zu trennen.
Ein automatisches Sammeln der Proben wird verwendet, um die Eluentfraktionen zu sammeln, die die Verbindung von Interesse beinhalten. Unter Verwendung des Roboterarms können jene Fraktionen, die die Verbindung von Interesse enthalten, zu einer zweiten Mehrfachröhrenanordnung übertragen werden, wobei eine Korrelation zwischen der Position der Röhre in der ursprünglichen Mehrfachanordnung und der Röhre in der zweiten Mehrfachanordnung (Mehrfachkonfiguration) besteht.
Aufbereitungsvorrichtungen werden verwendet, um alle Verunreinigungen nach der Elution der Verbindung von Interesse aus der Säule (Kolonne) auszuspülen. Der Fachmann wird leicht Mittel zum Reinigen einer Aufbereitungsvorrichtung zwischen den Läufen bestimmen. Weiter ist es ebenso Routine auf dem Gebiet dieser Vorrichtungen, das geeignete Lösungsmittelsystem zum Aufbereiten der nächsten Art von aufzubereitender Verbindung wiederherzustellen.
Es ist bevorzugt, dass die Aufbereitungsvorrichtung die Fähigkeit besitzt, ein automatisches Sammeln der Probe durchzuführen, Verunreinigungen aus der Säule zu spülen, nachdem die interessante Verbindung eluiert wurde, und ein Lösungsmittelgleichgewicht wiederherzustellen, bevor die nächste Probe aufbereitet wird.
Bevorzugt können zwei oder mehr Aufbereitungsvorrichtungen hintereinander oder parallel betrieben werden, sodass, während eine Säule gereinigt wird, die andere Säule oder Säulen eine Reaktionsmischung aufbereiten können. Die Verwendung mehrerer Aufbereitungsvorrichtungen beschleunigt vorteilhaft das Aufbereitungsstadium.
Eine kommerziell erhältliche Aufbereitungsvorrichtung mit hohem Durchsatz ist die Biotage Parallex High Throughput Purification Station. Diese Vorrichtung umfasst vier präparative HPLC Säulen, die parallel betrieben werden. Es gibt vier Pumpen und einen einzelnen Injektor, der über ein Ventil mit vier Probenschleifen verbunden ist. Die Pumpen können z.B. mit graduierten Lösungsmittelmischungen für einen ersten Zeitraum, einem Waschzyklus für einen zweiten Zeitraum und einem Lösungsmittelausgleichszyklus für einen dritten Zeitraum betrieben werden. Das Biotagessytem umfasst einen intelligenten Fraktionssammler, der durch die Steigung und den Schwellenwert des Signal-Rauschabstands ausgelöst wird. Die Vorrichtung erlaubt das Sammeln von mehr als einer Verbindung aus jeder Röhre nach der chromatographischen Trennung.
D. Lösungsmittelentfernungsvorrichtung
Die Mehrfachröhrenanordnung, die die eluierten Fraktionen mit den verschiedenen interessanten Verbindungen enthält, kann einer gleichzeitigen Lösungsmittelentfernung unterzogen werden, indem die gesamte Mehrfachröhrenanordnung(en) Bedingungen unterworfen wird, die das Lösungsmittel entfernen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Lösungsmittel unter Verwendung einer Zentrifuge entfernt, die die Fähigkeit hat, eine Vielzahl von Mehrfachröhrengestellen aufzunehmen.
Zusätzliche Mittel zum Entfernen von Lösungsmittel aus den Röhren umfassen das Platzieren der Mehrfachröhrengestelle in einen Vakuumofen, oder das Platzieren einer Vorrichtung mit einer Vielzahl von Gebläsen, die konzipiert sind, um über die einzelnen Röhren zu passen, und das Blasen eines inerten Gases über den Inhalt der Röhren, bis das Lösungsmittel im Wesentlichen entfernt ist, oder kann andere dem Fachmann bekannte Mittel zur Entfernung des Lösungsmittels beinhalten.
E. Mittel zum Wiegen der Fraktionen
In eineigen Ausführungsformen ist es erwünscht, die einzelnen Röhren zu wiegen, um die Menge des in jeder Synthese erhaltenen Materials zu bestimmen. Dies kann leicht durch Übertragen der (zuvor vorgewogenen) Röhren auf eine Waage und dann zurück zur Ausgangsposition im Mehrfachröhrengestell erreicht werden. Diese Information kann z.B. in einer Computerdatenbank gespeichert werden. Jede Waage, die für die Größenordnung genau genug ist, in welcher die Verbindung vorhanden ist, kann verwendet werden. Bevorzugt wird eine Waage verwendet, die mit dem Roboterarm kompatibel ist, der eingesetzt wird, um die Röhren von einem Stadium zum nächsten zu bewegen.
F. Mittel zum Wiederauflösen der eluierten Fraktionen
Ein Roboterarm oder andere geeignete Mittel können verwendet werden, um den Lösungsmittel-verdampften Röhren ein geeignetes Lösungsmittel hinzuzufügen, um die verdampften Fraktionen in einem für die nachfolgende chemische Analyse geeigneten Lösungsmittel wiederaufzulösen. In einer Ausführungsform beinhaltet das Mittel Arme mit Mehrfachpipetten, wobei jeder von ihnen in der Lage ist, eine geeignete Menge von Lösungsmittel auf jede Röhre in dem Mehrfachröhrengestell zu verteilen.
Die Auswahl des Lösungsmittels hängt teilweise von der Art der an den interessanten Verbindungen durchzuführenden Analysen ab. Wenn z.B. die Verbindungen mittels NMR analysiert werden sollen, z.B. ¹H NMR oder ¹³C NMR, dann kann ein deuteriertes Lösungsmittel verwendet werden. Einige NMR Instrumente haben die Fähigkeit, Lösungsmittelpeaks zu subtrahieren, und die Verwendung von deuteriertem Lösungsmittel ist bei diesen Instrumenten kein Erfordernis. Jedoch ist dies kein Erfordernis, wenn die Verbindungen lediglich einer GC-MS, IR, UV oder anderen Analysen unterworfen werden sollen. Der Fachmann kann leicht ein geeignetes Lösungsmittel oder Lösungsmittelsystem zur Verwendung in einer bestimmten chemischen Analyse bestimmen.
Bevorzugt werden die interessanten Verbindungen in einem deuterierten Lösungsmittel gelöst und eine ungefähr 1 mg oder weniger enthaltende Fraktion wird mittels NMR analysiert. Wenn extrem leistungsfähige NMR-Instrumente verwendet werden, kann sogar noch weniger Probe ausgewertet werden. Wahlweise kann nach der NMR-Analyse die Probe aus dem NMR-Röhrchen oder der Flusszelle entfernt werden und in die ursprüngliche Röhre zurückgegeben werden, wodurch der Produktverlust minimiert wird.
Bevorzugt weist die NMR die Fähigkeit auf, die Lösungen der interessanten Verbindungen in ein NMR-Röhrchen zu übertragen, die NMR durchzuführen, die Lösung einer Verbindung aus dem NMR-Röhrchen heraus zu transferieren, das Röhrchen automatisch zu reinigen und eine Lösung der nächsten auszuwertenden Verbindung in das NMR-Röhrchen zu übertragen. Diese Fähigkeit ist in mindestens einem kommerziell erhältlichen NMR-Instrument von Varian^® vorhanden.
Bevorzugt werden die Verbindungen mittels NMR, GC-MS, LC, ELSD und UV analysiert. Nach der chemischen Analyse können die Gestelle der Verbindungen in eine Lagereinrichtung übertragen werden, bis die Bioanalysen durchgeführt werden. In einer Ausführungsform werden die Chemikalien unter einer ausreichend kalten Temperatur gelagert, z.B. –15 bis –20°C, sodass die Verbindungen vor der Bioanalyse nicht wesentlich degradieren.
G. Bioanalyse
Nach den chemischen Analysen kann es erwünscht sein, die Bioaktivität der interessanten Verbindungen auszuwerten. Es gibt eine Methodologie zum Durchführen von Bioanalysen an Mehrfachröhrengestellen. Dementsprechend können die interessanten Verbindungen in den z.B. mittels eines einzigen Barcodes für die Platte identifizierten Mehrfachröhrengestellen zur Bioanalyse gesendet werden, und jede Röhre im Gestell durch ihre Position auf der Platte identifiziert werden. Diese Information kann z.B. elektronisch auf einem Computersystem gespeichert werden.
Für eine bestimmte Klasse von Verbindungen nützliche Bioanalysen sind entweder wohlbekannt oder können in Abhängigkeit von der besonderen beabsichtigten Verwendung der Verbindungen leicht entwickelt werden. Wenn Verbindungen zum Anbinden an verschiedene Rezeptoren entwickelt werden, sind vielzählige Bindungsstudien entwickelt und in der Literatur beschrieben worden, die auf einfache Weise an einen kombinatorischen Ansatz angepasst werden können.
H. Computersystem und zugehörige Software
Die Vorrichtung umfasst ein Computersystem, das in der Lage ist, die relativen Positionen der Röhren in den Mehrfachröhrengestellen oder der Vertiefungen in den Mehrfachvertiefungsplatten sowie die für jede Röhre erhaltenen Daten zu speichern. Software zum Verwalten der Daten ist auf dem Computer gespeichert.
Eine relationale Datenbanksoftware kann verwendet werden, um die Position der Röhren in jedem Stadium des Verfahrens mit der Identität der einzelnen Verbindungen, der analytischen Daten jeder Verbindung, der Prozentausbeute der zum Erhalten der Verbindungen verwendeten chemischen Reaktionen und den optionalen Bioanalysedaten für jede Verbindung zu korrelieren. Verschiedene kommerziell erhältliche relationale Datenbanksoftwareprogramme sind z.B. von Oracle, Tripos, MDL, Oxford Molecular („Chemical Design"), IDBS („Activity Base") und anderen Softwarevertreibern erhältlich.
III. Verfahren zur Identifikation und Analyse
Die Mehrfachröhrengestelle oder Mehrfachvertiefungsplatten, die eine Vielzahl von verschiedenen, in einzelnen Röhren oder Vertiefungen gelegenen Verbindungen enthalten, werden der Aufbreitung und Analyse wie unten beschrieben unterzogen.
A. Aufbereitung der Verbindung
Unter Verwendung der oben beschriebenen Computersoftware und Hardware werden die relativen Positionen der einzelnen Röhren und daher der Verbindungen innerhalb jeder Röhre in einer Datenbank gespeichert.
Die Roboterarme mit den Mitteln zum Übertragen des Inhalts jeder Röhre werden verwendet, um individuell und schrittweise den Inhalt der Röhren nacheinander zu der Vorrichtung zu transferieren, die zur Aufbereitung der Verbindungen verwendet wird.
Nach der Aufbereitung werden die Eluentfraktionen, die die interessanten Verbindungen enthalten, von der Aufbereitungsvorrichtung zu den Röhren in einer zweiten Mehrfachröhrenanordnung übertragen, die die Position der Röhren in der zweiten Mehrfachröhrenanordnung mit der Position der Röhren oder der Vertiefungen in der ersten Mehrfachröhrenanordnung oder Mehrfachvertiefungsplatte korreliert. Bevorzugt ist das Gewicht jeder Röhre in der zweiten Mehrfachröhrenanordnung vorher in der Datenbank aufgezeichnet worden, sodass das Gewicht der Verbindung und dementsprechend die chemische Ausbeute nach Entfernung des Lösungsmittels und nachfolgendem Wiegen der Lösungsmittelverdampften Röhre bestimmt werden kann.
Sobald die Verbindungen in den Röhren in der ersten Mehrfachröhrenanordnung aufbereitet und zur zweiten Mehrfachröhrenanordnung transferiert wurden, kann die zweite Mehrfachröhrenanordnung dann einem Lösungsmittelverdampfungsschritt unterzogen werden.
Nach der Entfernung des Lösungsmittel können die aufbereiteten Verbindungen, bevorzugt mit einer Reinheit über ca. 80%, wahlweise gewogen werden und dann chemischen Analysen unterzogen werden. Das Gewicht des Materials und die Ergebnisse der chemischen Analyse werden bevorzugt in der Datenbank gespeichert.
B. Chemische Analysen
Der Inhalt der Röhren in der zweiten Mehrfachröhrenanordnung kann nach der Entfernung des Lösungsmittels wieder in einem geeigneten Lösungsmittel aufgelöst werden und chemischen Analysen unterzogen werden, indem der Inhalt der Röhren zu verschiedenen Vorrichtungen zur Analyse übertragen wird, wie z.B. NMR, UV, IR, GC, GC-MS und Ähnlichem. Die so erhaltenen analytischen Daten können vom Computer gespeichert und mit der betreffenden interessierenden Verbindung korreliert werden.
C. Bioanalyse
Die interessierenden Verbindungen in der zweiten Mehrfachröhrenanordnung, oder in einer dritten Mehrfachröhrenanordnung, an welche ein Teil der Verbindungen übertragen wurde, können in Bioanalysevorrichtungen analysiert werden, um ihre Bioaktivität für einen bestimmten Zweck zu analysieren.
In einer Ausführungsform beinhaltet die Analyse Bindungsaffinitätsstudien, wobei die Fähigkeit der Verbindungen ausgewertet wird, sich an eine bestimmte Stelle anzubinden. Solche Studien sind auf dem Gebiet Routine und involvieren typischerweise keine große Menge von Material. Durch Verwendung dieser Studien und durch Korrelation der Ergebnisse der Studien mit den Verbindungen unter Verwendung derselben Datenbank, die zur Identifikation und Charakterisierung der Verbindungen verwendet wurde, kann man eine große Menge von Bioaktivitätsdaten in einer relativ kurzen Zeit unter Verwendung einer relativ geringen Menge von Material erzeugen.
Allgemein bringen Bioanalysen in-vitro und in-vivo Screeningtests der so erzeugten Verbindungen mit sich, z.B. Insektizid-, Fungizid-, Herbizid-, pharmazeutische oder veleunäre Tests.
Die hierin beschriebene Vorrichtung und die Verfahren werden unter Bezug auf das folgende nicht beschränkende Beispiel besser verstanden werden.
Allgemeine Synthese-, Aufbereitungs-, Analyse- und Verteilungsprozedur:
Eine Bibliothek von 96 individuellen Verbindungen wird durch chemische Reaktionen in einer Platte mit 96 Vertiefungen synthetisiert, wobei die Vertiefungen in einer zweidimensionalen Anordnung mit Abszisse und Ordinate angeordnet sind. Der Inhalt jeder Vertiefung wird individuell einem System für die präparative Hochdruck-Flüssig-Chromatographie (HPLC) zugeführt. 96 aufbereitete Produkte (wie durch einen Massenspektograph gemessen) werden in eine Reihe von Röhren in Gestellen gesammelt, wobei jedes Gestell mit einem Barcode zur Identifizierung etikettiert ist. Die Identität des Inhalts jeder Röhre, seine Position in dem Gestell und der Barcode des Gestells werden in einer Datenbank auf einer computerisierten Datenbank aufgezeichnet. Die Gestelle werden in eine Analyse-HPLC übertragen und die Barcodes gelesen. Eine Analyse-HPLC-Spur wird unter Verwendung eines Ultraviolett-(UV) und Elektron-Lichtstreudetektors (ELSD) aufgezeichnet und diese Daten werden in der Datenbank gespeichert.
Die Gestelle werden an einen Zentrifugalverdampfer übertragen und das Lösungsmittel aus allen Röhren gleichzeitig entfernt. Die Gestelle werden dann an ein mit einem Roboterarm, einem Barcodeleser und einer Waage ausgestattetes System übertragen, sodass das Gewicht jeder Röhre aufgezeichnet werden kann. In einer anderen Ausführungsform kann dem Verdampfungsschritt das Wiegen jeder Röhre nachfolgen, um das Gewicht des Produkts in jeder Röhre zu bestimmen, und das Gewicht kann in einer Datenbank aufgezeichnet werden. Danach wird der Inhalt jeder Röhre auf eine vorbestimmte Konzentration verdünnt; und der Inhalt jeder Röhre wird durch geeignete Analysemittel analysiert, inklusive der kernmagnetischen Resonanzspektroskopie, der analytischen HPLC und der Massenspektrometrie. Diese Information wird an den zentralen Server übertragen, wo das Tariergewicht jeder Röhre bereits aufgezeichnet wurde, und dadurch kann das Gewicht des Materials in jeder Röhre berechnet werden. Die Gestelle werden an eine Flüssigkeitshandhabungsvorrichtung übertragen, der Barcode wird gelesen und der Inhalt der Röhren wird unter Verwendung des auf dem zentralen Server aufgezeichneten Materialgewichts auf eine vorbestimmte Konzentration verdünnt.
Das Gestell wird in ein NMR-Gerät übertragen, der Barcode wird gelesen und die ¹H NMR wird aufgezeichnet und auf dem zentralen Server gespeichert. Alle analytischen Daten werden angesehen und eine Entscheidung, welche biologischen Tests erforderlich sind, wird gemacht und auf dem zentralen Server aufgezeichnet. Die Gestelle werden an eine Verteilervorrichtung übertragen, der Barcode wird gelesen und Proben zum Testen werden basierend auf den auf dem zentralen Server aufgezeichneten Entscheidungen vorbereitet. Jegliches überschüssiges Material wird in ein Aufbewahrungsgefäß übertagen. Die Röhren in dem Gestell werden mit frischen Röhren ersetzt und das Gestell durch den Prozess recycelt.
Bei allen Transformationen verfolgt die Computerdatenbank die Bewegung der so synthetisierten Verbindung von der Platte mit 96 Vertiefungen bis zum Ende des Prozesses. Die Gestelle sind die einzigen Vorrichtungen, die zur Identifizierung mit einem Barcode versehen sind.

Claims

Verfahren zum Synthetisieren, Aufbereiten und Analysieren von mehreren Verbindungen, während diese Verbindungen hinsichtlich ihrer Position unter Verwendung einer relationalen Datenbank verfolgt werden, mit den folgenden Schritten: a) Synthetisieren einer Reihe von Verbindungen in einer ersten Mehrfachröhrenkonfiguration mit einzelnen Röhren, b) Aufbereiten der Verbindungen, wobei zumindest eine Eluentfraktion produziert wird, welche interessierende Verbindungen aufweist, c) Transferieren der zumindest einen Eluentfraktion zu zumindest einer Röhre in einer zweiten Mehrfachröhrenkonfiguration, und d) Analysieren der interessierenden Verbindungen, wobei die Röhren nicht einzeln gekennzeichnet sind, und wobei Informationen über die Verbindungen einschließlich der Analyse und der Synthese nachverfolgt werden und durch die Position jeder Röhre in den Mehrfachröhrenkonfigurationen unter Verwendung der relationalen Datenbank in Beziehung gesetzt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, weiter mit den folgenden Verfahrensschritten: a1) Speichern von Informationen über jede Synthese in der relationalen Datenbank gemäß der Position jeder Röhre in der ersten Mehrfachröhrenkonfiguration, b1) Transferieren der Verbindungen in der ersten Mehrfachröhrenkonfiguration zu einer Flüssigkeits-Chromatographie-Aufbereitungseinrichtung, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus der präparativen Skalen-HPLC und der Säulen-Chromatographie besteht, c1) Inbeziehungsetzen der Verbindungen in der zweiten Mehrfachröhrenkonfiguration zu den Verbindungen in der ersten Mehrfachröhrenkonfiguration unter Verwendung der Position der Röhren in den Mehrfachröhrenkonfigurationen unter Verwendung der relationalen Datenbank, e) Speichern von Informationen über die Analyse der Verbindungen in der relationalen Datenbank gemäß der Position der Verbindungen in der zweiten Mehrfachröhrenkonfiguration, und f) Inbeziehungsetzen der Informationen über die Analyse der Verbindungen in der zweiten Mehrfachröhrenkonfiguration zu den Verbindungen in der ersten Mehrfachröhrenkonfiguration unter Verwendung der Position der Röhren in den Mehrfachröhrenkonfigurationen unter Verwendung der relationalen Datenbank.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Lösungsmittel aus den Röhren anschließend an die Aufbereitung und den Transfer der zumindest einen Eluentfraktion zu den Röhren in der zweiten Mehrfachröhrenkonfiguration entfernt wird.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Röhren in der zweiten Mehrfachröhrenkonfiguration vor dem Aufnehmen der Eluentfraktion, und nachdem das Lösungsmittel entfernt worden ist, gewogen werden.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Gewicht jeder aufbereiteten Verbindung durch Subtrahieren des Gewichts der leeren Röhre von dem der Lösungsmittel-verdampften Röhre in der zweiten Mehrfachröhrenkonfiguration erhalten wird und diese Information in der Datenbank gespeichert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die erste und die zweite Mehrfachröhrenkonfiguration in Abszissen- und Ordinaten-Konfigurationen angeordnet werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die synthetisierten, aufbereiteten und analysierten Verbindungen weiter zumindest einem Bioversuch unterzogen werden.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Ergebnisse der Bioversuche des Inhalts jeder Röhre mit den Informationen in Beziehung gesetzt werden.
Verfahren für die automatisierte chemische Synthese einer kombinatorischen chemischen Bibliothek, welches folgende Schritte aufweist: a) Anordnen einer Konfiguration von Röhren, von denen jede zumindest eine Verbindung beinhaltet, auf einer festen Halterung, wobei jede Röhre sich in der Konfiguration an einer festen Stelle befindet, b) Speichern von Informationen über die Kernverbindung in einer relationalen Datenbank gemäß der Anordnung jeder Kernverbindung auf der starren Halterung, c) Ausführen einer chemischen Reaktion an den Kernverbindungen, um eine Konfiguration aus Reaktionsmischungen zu bilden, welche eine Konfiguration von Reaktionsprodukten beinhaltet, d) Speichern von Informationen über die chemische Reaktion und die Reaktionsmischungen in der relationalen Datenbank gemäß der Anordnung jeder Reaktionsmischung auf der starren Halterung, e) Aufbereiten der Reaktionsmischungen unter Verwendung der präparativen Skalen-HPLC oder der Säulen-Chromatographie und Isolieren der Reaktionsprodukte, f) Speichern von Informationen über die Reaktionsprodukte in der relationalen Datenbank gemäß der Anordnung jedes Reaktionsprodukts auf der starren Halterung, e) Kennzeichnen der Reaktionsprodukte mit zumindest einem analytischen Instrument, h) Speichern von Informationen über die Kennzeichnung jedes Reaktionsprodukts in der relationalen Datenbank gemäß der Anordnung jedes Reaktionsprodukts auf der starren Halterung, und i) optionales Wiederholen zumindest eines der Schritte a) bis h), wobei die Röhren nicht einzeln gekennzeichnet sind, zumindest einer der Schritte global an der Konfiguration ausgeführt wird und zumindest einer der Schritte einzeln an jeder Röhre vorgenommen wird, und die Information, die in der relationalen Datenbank gespeichert ist, nachverfolgt wird und in Beziehung gesetzt wird durch die Anordnung jeder Röhre auf der starren Halterung.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Menge des isolierten Reaktionsprodukts in jeder Röhre berechnet wird durch Beschaffen eines Taragewichts der Röhren, Beschaffen des Gewichts der zuvor ausgewogenen Röhren, nachdem die Verbindungen in den Röhren isoliert sind und alles Lösungsmittel entfernt ist, und Subtrahieren des Taragewichts der Röhren von dem Gewicht der Röhren, die die Reaktionsprodukte beinhalten.