DE60019580T2

DE60019580T2 - Verwendung von biphosphonsäuren zur behandlung von angiogenese

Info

Publication number: DE60019580T2
Application number: DE60019580T
Authority: DE
Inventors: Tetsuji Okuno; Jonathan Green; Marjorie Jeanette WOOD
Original assignee: Novartis Erfindungen Verwaltungs GmbH; Novartis AG
Current assignee: Novartis Pharma GmbH; Novartis AG
Priority date: 1999-05-21
Filing date: 2000-05-19
Publication date: 2006-03-09
Anticipated expiration: 2020-05-20
Also published as: ES2240106T3; JP2003500352A; PL351674A1; EP1178810B8; HUP0201329A2; IL146520A0; US20020142996A1; US20040176327A1; PT1178810E; DK1178810T3; NO20015638D0; KR20010113830A; SK16682001A3; CA2374049A1; AU775079B2; WO2000071104A2; CN1202828C; BR0010808A; NO322212B1; WO2000071104A3

Description

Die Erfindung betrifft neue therapeutische Verwendungen von Bisphosphonaten.
Bisphosphonate werden verbreitet zur Hemmung der Osteoklastenaktivität in einer Vielzahl an sowohl benignen als auch malignen Erkrankungen verwendet, bei denen die Knochenresorption erhöht ist. Daher wurden Bisphosphonate kürzlich für eine Langzeittherapie von Patienten mit Multiplem Myelom (MM) verfügbar. Diese Pyrophosphatanaloga verringern nicht nur das Auftreten von Skelett-bedingten Ereignissen, sondern sorgen beim Patienten für einen klinischen Nutzen und verbessern die Überlebensrate. Bisphosphonate sind zur Verhinderung der Knochenresorption in vivo fähig, wobei die therapeutische Wirksamkeit von Bisphosphonaten bei der Behandlung der Paget's Erkrankung des Knochens, der Tumor-induzierten Hypercalzämie und neuerdings der Knochenmetastase und dem Multiplen Myelom (MM) gezeigt wurde (als Zusammenfassung siehe H. Fleisch, 1997, Bisphosphonates clinical, In Bisphosphonates in Bone Disease. From the Laboratory to the Patient. Herausgeber: The Panthenon Publishing Group, New York/London, Seiten 68–163). Die Mechanismen, durch die Bisphosphonate die Knochenresorption hemmen, sind immer noch wenig verstanden und scheinen in Abhängigkeit der untersuchten Bisphosphonate zu variieren. Von Bisphosphonaten wurde gezeigt, dass sie stark an die Hydroxyapatitkristalle des Knochens binden, um den Umsatz und die Resorption des Knochens zu verringern, um die Spiegel an Hydroxyprolin oder alkalischer Phosphatase im Blut zu verringern und zusätzlich sowohl die Aktivierung als auch die Aktivität von Osteoklasten zu hemmen.
MM ist eine Plasmazellmalignität, die durch die Proliferation und Akkumulation von malignen Plasmazellen im Knochenmark charakterisiert ist. Die hauptsächlichen klinischen Konsequenzen sind lytische Knochenläsionen, die mit pathologischen Frakturen und Knochenschmerz assoziiert sind. Diese Läsionen resultieren aus einer überschüssigen Knochenresorption, die häufig zu einer Hypercalzämie führt. Bisphosphonate wurden zur Langzeitbehandlung von MM in Kombination mit einer herkömmlichen Chemotherapie eingeführt. Es wurde kürzlich gezeigt, dass Bisphosphonate, wie Clodronat und Pamidronat, das Vorkommen der Skelett-bedingten Vorfälle verringern können, wie lytische Knochenläsionen und pathologische Frakturen, und den Knochenschmerz lindern und die Lebensqualität der Patienten verbessern können.
Es wurde nun überraschenderweise festgestellt, dass bestimmte Bisphosphonate einen embolischen Effekt auf die neu gebildeten Kapillarblutgefäße, die sich während der mit dem Tumorwachstum und der Tumorinvasion assoziierten Angiogenese bilden, und bestimmten anderen pathologischen Zuständen, wie Entzündung, rheumatoide Arthritis und Osteoarthritis haben. Darüberhinaus wurde festgestellt, dass bestimmte Bisphosphonate die durch Wachstumsfaktor induzierte Angiogenese und Endothelproliferation im Tiermodell und in Gewebekulturexperimenten hemmen.
Demnach liefert die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Bisphosphonats zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Myokardischämie, Osteoarthritis, Psoriasis, Hämangioblastom, Hämangiom oder Schmerz, worin das Bisphosphonat als Angiogenese hemmendes oder verhinderndes Mittel wirkt und aus den folgenden Verbindungen oder einem pharmazeutisch annehmbaren Salz hiervon oder einem Hydrat hiervon ausgewählt ist: 3-Amino-1-hydroxypropan-1,1-diphosphonsäure (Pamidronsäure), beispielsweise Pamidronat (APD), 3-(N,N-Dimethylamino)-1-hydroxypropan-1,1-diphosphonsäure, beispielsweise Dimethyl-APD, 4-Amino-1-hydroxybutan-1,1-diphosphonsäure (Alendronsäure), beispielsweise Alendronat, 1-Hydroxyethidenbisphosphonsäure, beispielsweise Etidronat, 1-Hydroxy-3-(methylpentylamino)propylidenbisphosphonsäure, Ibandronsäure, beispielsweise Ibandronat, 6-Amino-1- hydroxyhexan-1,1-diphosphonsäure, beispielsweise Aminohexyl-BP, 3-(N-Methyl-N-n-pentylamino)-1-hydroxypropan-1,1-diphosphonsäure, beispielsweise Methylpentyl-APD (= BM 21.0955), 1-Hydroxy-2-(imidazol-1-yl)ethan-1,1-diphosphonsäure, beispielsweise Zoledronsäure, 1-Hydroxy-2-(3-pyridyl)ethan-1,1-diphosphonsäure (Risedronsäure), beispielsweise Risedronat, einschließlich N-Methylpyridiniumsalze hiervon, beispielsweise N-Methylpyridiumiodide, wie NE-10244 oder NE-10446, 1-(4-Chlorphenylthio)methan-1,1-diphosphonsäure (Tiludronsäure) beispielsweise Tiludronat, 3-[N-(2-Phenylthioethyl)-N-methylamino]-1-hydroxypropan-1,1-diphosphonsäure, 1-Hydroxy-3-(pyrrolidin-1-yl)-propan-1,1-diphosphonsäure, beispielsweise EB 1053 (Leo), 1-(N-Phenylaminothiocarbonyl)methan-1,1-diphosphonsäure, beispielsweise FR 78844 (Fujisawa), 5-Benzoyl-3,4-dihydro-2N-pyrazol-3,3-diphosphonsäuretetraethylester, beispielsweise U 81581 (Upjohn), 1-Hydroxy-2-(imidazo[1,2-a]pyridin-3-yl)ethan-1,1-diphosphonsäure, beispielsweise YM 529 und 1,1-Dichlormethan-1,1-diphosphonsäure (Clodronsäure), beispielsweise Clodronat.
Die Anwendungen der vorliegenden Erfindung stellen eins Verbesserung gegenüber der existierenden Therapie von malignen Erkrankungen dar, worin die Bisphosphonate verwendet werden, um die Entwicklung von Knochenmetastasen oder übermäßige Knochenresorption zu vermeiden oder zu hemmen, und auch zur Therapie von Entzündungserkrankungen, wie rheumatoider Arthritis und Osteoarthritis. Es wurde festgestellt, dass die Verwendung von Bisphosphonaten zur Embolisierung neu gebildeter Blutgefäße zur Unterdrückung von Tumoren, beispielsweise fester Tumoren und Metastasen, beispielsweise Knochenmetastasen und sogar zur Verringerung der Größe von Tumoren, beispielsweise festen Tumoren und Metastasen, beispielsweise Knochenmetastasen nach einer geeigneten Behandlungsperiode führt. Es wurde durch die Verwendung von Angiographie beobachtet, dass neu gebildete Blutgefäße nach einer Bisphosphonatbehandlung verschwinden, aber dass normale Blutgefäße intakt bleiben. Ferner wurde beobachtet, dass die embolisierten Blutgefäße nach einem Absetzen der Bisphosphonatbehandlung nicht wiederhergestellt werden. Es wurde auch beobachtet, dass Patienten mit Knochenmetastasen, rheumatoider Arthritis und Osteoarthritis eine Schmerzlinderung nach einer Bisphosphonatbehandlung erleben.
Obwohl der Wirkmechanismus der Bisphosphonate als Mittel, die eine Embolie von neugebildeten Blutgefäßen verursachen, nicht bekannt ist, scheint es, dass neu gebildete Blutgefäße (Kapillaren) blockiert, partiell oder vollständig obliteriert werden oder die Angiogenese wird auf eine andere Art aufgehoben, was zu einem teilweisen oder vollständigen Verschwinden der neu gebildeten Blutgefäße (Kapillaren) führt, beispielsweise wenn der Tumor oder die Erkrankungsstelle, beispielsweise die Entzündungsstelle, mittels Angiographie betrachtet wird. Zum Zweck der vorliegenden Beschreibung beziehen sich die Ausdrücke "embolische Behandlung der Angiogenese" oder "embolische Wirkung" auf diese beobachteten Phänomene.
Gemäß einem weiteren Aspekt liefert die Erfindung die Verwendung eines Bisphosphonats zur Herstellung eines wie oben definierten Arzneimittels zur embolischen Behandlung der Angiogenese.
Wie dies hierin in den Beispielen beschrieben ist, wurde zusätzlich festgestellt, dass bestimmte Bisphosphonate die durch Wachstumsfaktor induzierte Angiogenese in einem Tiermodell hemmen und auch die Endothelzellproliferation in einem Gewebekulturmodell hemmen. Es scheint, dass eine solche Hemmung der Angiogenese nicht vom Schwund an aktivierten Makrophagen abhängt, sondern dass das Bisphosphonat auf die Stärke der Endothelzellaktivierung und/oder Endothelzellproliferation zu wirken scheint. Daher können Bisphosphonate vorteilhafterweise auch zur prophylaktischen oder präventiven Behandlung von Erkrankungen und medizinischen Zuständen verwendet werden, die Angiogenese umfassen, indem sie das Auftreten oder die Entwicklung der Angiogenese einschließlich der oben angegebenen Erkrankungen und medizinischen Zustände hemmen.
Demnach liefert ein weiter Aspekt der Erfindung:

– Die Verwendung eines Bisphosphonats zur Herstellung eines wie oben definierten Arzneimittels zur prophylaktischen oder präventiven Behandlung der Angiogenese.

Insbesondere liefert die Erfindung eine wie unmittelbar oben definierte Verwendung, die nicht vom Schwund an aktivierten Makrophagen abhängt oder diesen miteinbezieht.
Daher beziehen sich in der vorliegenden Beschreibung die Ausdrücke "Behandlung" oder "behandeln" sowohl auf die prophylaktische als auch präventive Behandlung wie auch auf die heilende oder Krankheits-modifizierende Behandlung, einschließlich der Behandlung von Patienten, die einem Risiko ausgesetzt sind, die Krankheit zu erwerben oder im Verdacht stehen, die Krankheit erworben zu haben, wie auch Patienten, die krank sind oder eine Diagnose erhalten haben, dass sie an einer Erkrankung oder einem medizinischen Zustand leiden.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Bisphosphonate sind oben definiert. Pharmazeutisch annehmbare Salze der in der Erfindung verwendeten Bisphosphonate sind vorzugsweise Salze mit Basen, bequemerweise Metallsalze, die aus den Gruppen Ia, Ib, IIa und IIb des Periodensystems der Elemente stammen, einschließlich Alkalimetallsalze, beispielsweise Kalium- und speziell Natriumsalze oder Erdalkalimetallsalze, vorzugsweise Calcium- oder Magnesiumsalze und auch Ammoniumsalze mit Ammoniak oder organischen Aminen.
Speziell bevorzugte pharmazeutisch annehmbare Salze sind die, worin ein, zwei, drei oder vier, insbesondere ein oder zwei Säurewasserstoffe der Biphosphonsäure durch ein pharmazeutisch annehmbares Kation, insbesondere Natrium, Kalium oder Ammonium, vor allem Natrium ersetzt sind.
Eine sehr bevorzugte Gruppe an pharmazeutisch annehmbaren Salzen ist dadurch charakterisiert, dass sie einen Säurewasserstoff und ein pharmazeutisch annehmbares Kation, speziell Natrium, in jeder der Phosphonsäuregruppen aufweisen.
Alle oben erwähnten Bisphosphonsäurederivate sind aus der Literatur gut bekannt. Dies umfasst ihre Herstellung, (siehe EP 0 513 760 A , Seiten 13–48). Beispielsweise wird 3-Amino-1-hydroxypropan-1,1-diphosphonsäure hergestellt wie dies in US 3 962 432 A beschrieben ist, wie auch das Dinatriumsalz in US 4 639 338 A und US 4 711 880 A und 1-Hydroxy-2-(imidazol-1-yl)ethan-1,1-diphosphonsäure wird wie beispielsweise in US 4 939 130 A beschrieben hergestellt.
Eine bestimmte Ausführungsform der Erfindung wird durch die Verwendung eines Bisphosphonsäurederivats, das aus 3-Amino-1-hydroxypropan-1,1-diphosphonsäure, 3-(N,N-Dimethylamino)-1-hydroxypropan-1,1-diphosphonsäure, 4-Amino-1-hydroxybutan-1,1-diphosphonsäure, 6-Amino-1-hydroxyhexan-1,1-diphosphonsäure, 3-(N-Methyl-N-n-pentylamino)-1-hydroxypropan-1,1-diphosphonsäure, 1-Hydroxy-2-(imidazol-1-yl)ethan-1,1-diphosphonsäure, 1-Hydroxy-2-(3-pyridyl)ethan-1,1-diphosphonsäure und N-Methylpyridiniumsalze hiervon, 1-(4-Chlorphenylthio)-methan-1,1-diphosphonsäure, 3-[N-(2-Phenylthioethyl)-N-methylamino]-1-hydroxypropan-1,1-diphosphonsäure, 1-Hydroxy-3-(pyrrolidin-1-yl)-propan-1,1-diphosphonsäure, 1-(N-Phenylaminothiocarbonyl)methan-1,1-diphosphonsäure, 5-Benzoyl-3,4-dihydro-2H-pyrazol-3,3-diphosphonsäuretetraethylester, 1-Hydroxy-2-(imidazo[1,2-a]pyridin-3-yl)ethan- 1,1-diphosphonsäure oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes hiervon und allen Hydraten hiervon dargestellt.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung wird durch die Verwendung eines Bisphosphonsäurederivats, das ausgewählt ist aus 3-Amino-1-hydroxypropan-1,1-diphosphonsäure, 3-(N,N-Dimethylamino)-1-hydroxypropan-1,1-diphosphonsäure, 4-Amino-1-hydroxybutan-1,1-diphosphonsäure, 6-Amino-1-hydroxyhexan-1,1-diphosphonsäure, 3-(N-Methyl-N-n-pentylamino)-1-hydroxypropan-1,1-diphosphonsäure, 1-Hydroxy-2-(imidazol-1-yl)ethan-1,1-diphosphonsäure, 1-Hydroxy-2-(3-pyridyl)ethan-1,1-diphosphonsäure, 3-[N-(2-Phenylthioethyl)-N-methylamino]-1-hydroxypropan-1,1-diphosphonsäure, 1-Hydroxy-3-(pyrrolidin-1-yl)-propan-1,1-diphosphonsäure, 1-Hydroxy-2-(imidazo[1,2-a]pyridin-3-yl)ethan-1,1-diphosphonsäure oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes hiervon und allen Hydraten hiervon dargestellt.
Eine sehr bevorzugte Ausführungsform der Erfindung wird durch die Verwendung eines Phosphonsäurederivats, das ausgewählt ist aus Pamidronsäure, Alendronsäure, 3-(N-Methyl-N-n-pentylamino)-1-hydroxypropan-1,1-diphosphonsäure, 1-Hydroxy-2-(imidazol-1-yl)ethan-1,1-diphosphonsäure, Risedronsäure und Tiludronsäure oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes hiervon und allen Hydraten hiervon dargestellt.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der Erfindung wird durch die Verwendung eines Bisphophonsäurederivats, das ausgewählt ist aus 1-Hydroxy-2-(imidazol-1-yl)ethan-1,1-diphosphonsäure und 3-Amino-1-hydroxypropan-1,1-diphosphonsäure oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes hiervon und allen Hydraten hiervon dargestellt.
Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung von 3-Amino-1-hydroxypropan-1,1-diphosphonsäure oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes hiervon oder eines Hydrats hiervon, beispielsweise Pamidronat-Dinatrium oder Pamidronat.
Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung von 1-Hydroxy-2-(imidazol-1-yl)ethan-1,1-diphosphonsäure oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes hiervon oder eines Hydrats hiervon, beispielsweise Zoledronsäure.
Es wurde im Tiermodell gemäß der vorliegenden Erfindung festgestellt, dass Zoledronsäure (1-Hydroxy-2-(imidazol-1-yl)ethan-1,1-diphosphonsäure) vorzugsweise die durch den basischen Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) induzierte Angiogenese im Vergleich zur Hemmung der durch den vaskulären Endothelwachstumsfaktor (VEGF) induzierten Angiogenese hemmt, wie dies hierin später in den Beispielen beschrieben ist.
Gemäß besonders bevorzugter Ausführungsformen liefert die Erfindung eine wie oben definierte Verwendung

– worin das Bisphosphonat Zoledronsäure oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon oder ein Hydrat hiervon ist und worin die Angiogenese die durch bFGF induzierte Angiogenese umfasst, oder
– worin das Bisphosphonat Zoledronsäure oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon oder ein Hydrat hiervon ist und das Bisphosphonat in Kombination mit einem VEGF Inhibitor verwendet wird.

Die Bisphosphonate (hierin später als erfindungsgemäße Mittel bezeichnet) können in Form eines Isomers oder eines Isomerengemisches verwendet werden, wo dies geeignet ist, typischerweise als optische Isomere, wie Enantiomere oder Diastereomere oder geometrische Isomere, typischerweise cis- trans-Isomere. Die optischen Isomere werden in Form der reinen Antipoden und/oder als Razemate erhalten.
Die erfindungsgemäßen Mittel können auch in Form ihrer Hydrate verwendet werden oder umfassen andere für ihre Kristallisation verwendete Lösemittel.
Die erfindungsgemäßen Mittel (die Bisphosphonate) werden vorzugsweise in Form von pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet, die eine therapeutisch wirksame Menge an Wirkstoff, wahlweise zusammen mit oder im Gemisch mit anorganischen oder organischen, festen oder flüssigen pharmazeutisch annehmbaren Trägern enthalten, die zur Verabreichung geeignet sind.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können beispielsweise Zusammensetzungen zur enteralen, wie oralen, rektalen, nasalen oder Aerosolinhalationsverabreichung, Zusammensetzungen zur parenteralen, wie intravenösen oder subkutanen Verabreichung oder Zusammensetzungen zur transdermalen Verabreichung (beispielsweise passiv oder iontophoretisch) sein.
Vorzugsweise werden die pharmazeutischen Zusammensetzungen an eine orale oder parenterale (speziell intravenöse, intraarterielle oder transdermale) Verabreichung angepasst. Intraarterielle und orale, zuerst und vor allem intraarterielle Verabreichung werden als besonders bedeutend betrachtet. Vorzugsweise liegt der Bisphosphonatwirkstoff in Form einer parenteralen, am bevorzugtesten einer intraarteriellen Form vor.
Der besondere Verabreichungsweg und die Dosierung kann durch den Fachmann ausgewählt werden, indem er die Einzelheiten des Patienten in Betracht zieht, speziell Alter, Gewicht, Lebensstil, Aktivitätsausmaß, Hormonstatus (beispielsweise postmenopausal) und Knochenmineraldichte, wie dies geeignet ist. Am bevorzugtesten wird jedoch das Bisphosphonat intraarteriell in eine Arterie verabreicht, die zu der Stelle der neu gebildeten Blutgefäße führt.
Daher liefern besonders bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung:

– Die Verwendung eines Bisphosphonats zur Herstellung eines wie oben definierten Arzneimittels zur intraarteriellen embolischen Behandlung der Angiogenese

Die Dosierung des erfindungsgemäßen Mittels kann von verschiedenen Faktoren abhängen, wie der Wirksamkeit und Wirkdauer des Wirkstoffs, der Verabreichungsart, der Art des Warmblüters und/oder dem Geschlecht, dem Alter, dem Gewicht und dem einzelnen Zustand des Warmblüters.
Normalerweise ist die Dosierung so, dass eine einzelne Dosis des Bisphosphonatwirkstoffs von 0,002 bis 3,40 mg/kg, speziell 0,01 bis 2,40 mg/kg an einen Warmblüter verabreicht wird, der etwa 75 kg wiegt. Falls gewünscht, kann die Dosis auch in mehreren, wahlweise gleichen Teildosen eingenommen werden.
"mg/kg" meint mg Arzneimittel pro kg Körpergewicht des Säugers, einschließlich des Menschen, der behandelt wird.
Die oben erwähnte Dosis, die entweder als einzelne Dosis (was bevorzugt ist) oder in mehreren Teildosen verabreicht wird, kann wiederholt werden, beispielsweise einmal täglich, einmal wöchentlich, einmal pro Monat, einmal alle drei Monate, einmal alle sechs Monate oder einmal im Jahr. Mit anderen Worten können die pharmazeutischen Zusammensetzungen in Verabreichungsplänen verabreicht werden, die von einer kontinuierlichen täglichen Therapie bis zu einer intermittierenden cyclischen Therapie reichen.
Vorzugsweise werden die Bisphosphonate in Dosen verabreicht, die in derselben Größenordnung liegen, wie die, die zur Behandlung der Erkrankungen verwendet werden, die klassisch mit Bisphosphonsäurederivaten behandelt werden, wie Paget Erkrankung, durch Tumore induzierte Hypercalzämie oder Osteoporose. Mit anderen Worten werden die Bisphosphonsäurederivate in Dosen verabreicht, die auch bei der Behandlung der Paget Erkrankung, der durch Tumor induzierten Hypercalzämie oder der Osteoporose therapeutisch wirksam wären, das heißt sie werden vorzugsweise in Dosen verabreicht, die zur Hemmung der Knochenresorption ähnlich wirksam wären.
Formulierungen in Einheitsdosierungsform enthalten vorzugsweise etwa 1 % bis etwa 90 % und Formulierungen, die nicht in Einzeldosierungsform vorliegen, enthalten vorzugsweise etwa 0,1 % bis etwa 20 % des Wirkstoffs. Einzelne Einheitsdosierungsformen, wie Kapseln, Tabletten oder Dragees enthalten beispielsweise etwa 1 mg bis etwa 500 mg des Wirkstoffs.
Pharmazeutische Präparationen zur enteralen und parenteralen Verabreichung sind beispielsweise die in Einheitsdosierungsformen, wie Dragees, Tabletten oder Kapseln und auch Ampullen. Diese werden auf eine Weise hergestellt, die an sich bekannt ist, beispielsweise durch herkömmliche Misch-, Granulier-, Konfektionier-, Löse- oder Lyophilisierverfahren. Beispielsweise können pharmazeutische Zusammensetzungen zur oralen Verabreichung daher durch Kombination des Wirkstoffs mit festen Trägern, falls geeignet Granulierung eines erhaltenen Gemisches und Verarbeitung des Gemisches oder Granulats falls gewünscht oder erforderlich nach der Zugabe von geeigneten Hilfsstoffen zu Tabletten oder Drageekernen erhalten werden.
Geeignete Träger sind insbesondere Füllstoffe, wie Zuckerarten, beispielsweise Lactose, Saccharose, Mannit oder Sorbit, Cellulosepräparationen und/oder Calciumphosphate, beispielsweise Tricalciumphosphat oder Calciumhydrogenphosphat und auch Bindemittel, wie Stärkepasten, wobei beispielsweise Mais-, Weizen-, Reis- oder Kartoffelstärke verwendet werden, Gelatine, Tragacanth, Methylcellulose und/oder Polyvinylpyrrolidon und/oder falls gewünscht Zerfallshilfsmittel, wie die oben erwähnten Stärkearten und auch Carboxymethylstärke, quervernetztes Polyvinylpyrrolidon, Agar oder Alginsäure oder ein Salz hiervon wie Natriumalginat. Hilfsstoffe sind speziell Fließregulatoren und Gleitmittel, beispielsweise Kieselsäure, Talkum, Stearinsäure und Salze hiervon, wie Magnesiumstearat oder Calciumstearat und/oder Polyethylenglycol. Drageekerne können mit geeigneten Ummantelungen bereitgestellt werden, die gegenüber Magensäften resistent sein können, indem man unter anderem konzentrierte Zuckerlösungen verwendet, die wahlweise Gummi Arabicum, Talkum, Polyvinylpyrrolidon, Polyethylenglycol und/oder Titandioxid, Beschichtungslösungen in geeigneten organischen Lösemitteln oder Lösemittelgemischen oder zur Herstellung von Ummantelungen, die gegenüber Magensäften resistent sind, Lösungen geeigneter Cellulosepräparationen, wie Acetylcellulosephthalat oder Hydroxypropylmethylcellulosephthalat enthalten. Farbstoffe oder Pigmente können zu den Tabletten- oder Drageebeschichtungen gegeben werden, beispielsweise zur Identifizierung oder zur Anzeige der unterschiedlichen Dosierungen des Wirkstoffs.
Andere oral verabreichbare pharmazeutische Präparationen sind trocken gefüllte Kapseln, die aus Gelatine bestehen, und auch weiche, verschlossene Kapseln, die aus Gelatine und einem Weichmacher bestehen, wie Glycerin oder Sorbit. Die trocken gefüllten Kapseln können den Wirkstoff in Form eines Granulats enthalten, beispielsweise im Gemisch mit Füllstoffen, wie Lactose, Bindemitteln, wie Stärkearten und/oder Gleitmitteln, wie Talkum oder Magnesiumstearat und geeigneterweise Stabilisato ren. In Weichkapseln ist der Wirkstoff vorzugsweise gelöst oder in geeigneten Flüssigkeiten suspendiert, wie fetten Ölen, Paraffinöl oder flüssigen Polyethylenglykolen, zu denen auch Stabilisatoren zugegeben werden können.
Parenterale Formulierungen sind speziell injizierbare Flüssigkeiten, die auf verschiedene Arten wirksam sind, wie intravenös, intramuskulär, intraperitoneal, intranasal, intradermal, subkutan oder vorzugsweise intraarteriell. Solche Flüssigkeiten sind vorzugsweise isotonische wässrige Lösungen oder Suspensionen, die vor der Verwendung zubereitet werden können, beispielsweise aus lyophilisierten Präparationen, die den Wirkstoff alleine oder zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger enthalten. Die pharmazeutischen Präparationen können sterilisiert werden und/oder können Hilfsstoffe enthalten, beispielsweise Konservierungsstoffe, Stabilisatoren, Netzmittel und/oder Emulgiermittel, Löslichkeitsvermittler, Salze zur Regulierung des osmotischen Drucks und/oder Puffer.
Geeignete Formulierungen für die transdermale Anwendung enthalten eine wirksame Menge des Wirkstoffs mit Träger. Vorteilhafte Träger umfassen absorbierbare pharmakologisch annehmbare Lösemittel, um den Durchgang durch die Haut des Patienten zu erleichtern. Charakteristischerweise liegen Transdermalvorrichtungen vor in Form einer Bandage, die umfasst eine Trägerschicht, ein Reservoir, das die Verbindung wahlweise mit Trägern enthält, wahlweise eine geschwindigkeitslimitierende Barriere zur Abgabe des Wirkstoffs auf die Haut des Patienten mit einer kontrollierten und vorbestimmten Rate über einen längeren Zeitraum und ein Mittel zur Sicherung der Vorrichtung auf der Haut.
Die folgenden Beispiele erläutern die hierin vorher beschriebene Erfindung und das Beispiel 5 bezieht sich auf die Figuren:
Die 1 besteht aus Angiogrammen der linken Bronchialarterien eines Brustkrebspatienten vor (a) und nach (b) einer Behandlung mit Pamidronatdinatrium.
Die 2 besteht aus Angiogrammen der rechten Bronchialarterien desselben Brustkrebspatienten vor (a) und nach (b) der Behandlung mit Pamidronatdinatrium.
Die 3 besteht aus Angiogrammen des rechten Knies des Kniegelenks eines Osteoarthritispatienten vor (a) und nach (b) der Behandlung mit Pamidronatdinatrium.
In den folgenden Beispielen soll der Ausdruck 'Wirkstoff' so verstanden werden, dass er eines der oben erwähnten Bisphosphonsäurederivate ist, die gemäß der vorliegenden Erfindung brauchbar sind. Beispiel Beispiel 1: Kapseln, die beschichtete Wirkstoffspellets enthalten, beispielsweise mit Dinatriumpamidronatpentahydrat als Wirkstoff: Pelletkern:

Wirkstoff (gemahlen) 197,3 mg

Mikrokristalline Cellulose (Avicel^® PH 105) 52,7 mg

250,0 mg

+ innere Beschichtung:

Cellulose HP-M 603 10,0 mg

Polyethylenglycol 2,0 mg

Talkum 8,0 mg

270,0 mg

+ Magensaft-resistente äußere Beschichtung:

Eudragit^® L 30 D (fest) 90,0 mg

Triethylcitrat 21,0 mg

Antifoam^® AF 2,0 mg

Wasser

Talkum 7,0 mg

390,0 mg

Ein Gemisch aus Dinatriumpamidronat mit Avicel^® PH 105 wird mit Wasser befeuchtet und geknetet, extrudiert und zu Kugeln geformt. Die trockenen Pellets werden dann nacheinander in der Wirbelschicht mit einer inneren Beschichtung, die aus Cellulose HP-M 603, Polyethylenglycol (PEG) 8000 und Talkum besteht und der Magensaft-resistenten Beschichtung beschichtet, die aus Eudragit^® L 30 D, Triethylcitrat und Antischaum^® AF besteht. Die beschichteten Pellets werden mit Talkum bestäubt und mittels einer im Handel erhältlichen Kapselfüllmaschine, beispielsweise Höflinger und Karg, in Kapseln gefüllt (Kapselgröße 0). Beispiel 2: Monolithisches Transdermaladhäsivsystem, das als Wirkstoff beispielsweise 1-Hydroxy-2-(imidazol-1-yl)-ethan-1,1-diphosphonsäure enthält: Zusammensetzung:

Polyisobutylen (PIB) 300 (Oppanol B1, BASF)	5,0 g
PIB 35000 (Oppanol B10, BASF)	3,0 g
PIB 1200000 (Oppanol B100, BASF)	9,0 g
Hydriertes Kohlenwasserstoffharz (Escorez 5320, Exxon)	43,0 g
1-Dodecylazacycloheptan-2-on (Azone, Nelson Res., Irvine/CA)	20,0 g
Wirkstoff	20,0 g
Gesamt	100,0 g

Herstellung:
Die obigen Komponenten werden zusammen in 150 g einer Erdölfraktion 100–125 mit speziellem Siedepunkt durch Rollen auf einem Rollerbett gelöst. Diese Lösung wird auf einen Polyesterfilm (Hostaphan, Kalle) durch eine Verteilungsvorrichtung mittels einem 300 mm Streichmesser aufgetragen, was eine Beschichtung von etwa 75 g/m² ergibt. Nach dem Trocknen (15 Minuten bei 60°C) wird ein mit Silicon behandelter Polyesterfilm (Dicke 75 mm, Laufenberg) als Trennschicht aufgetragen. Die fertigen Systeme werden in der gewünschten Form in Größen von 5 bis 30 cm² mittels eines Stanzwerkzeugs ausgestanzt. Die fertigen Systeme werden einzeln in Taschen aus Aluminium-bedampftem Papier eingeschweißt.
Beispiel 3:
Gläschen, das 1,0 mg trockene, lyophilisierte 1-Hydroxy-2-(imidazol-1-yl)ethan-1,1-diphosphonsäure enthält (gemischte Natriumsalze hiervon). Nach der Verdünnung mit 1 ml Wasser wird eine Lösung (Konzentration 1 mg/ml) für eine i.v. Infusion erhalten. Zusammensetzung:

Wirkstoff (freie Diphosphonsäure) 1,0 mg

Mannit 46,0 mg

Trinatriumcitrat × 2 H₂O etwa 3,0 mg

Wasser 1 ml

Wasser zur Injektion 1 ml
Der Wirkstoff wird in 1 ml Wasser mit Trinatriumcitrat × 2 H₂O bis pH 6,0 titriert. Dann wird Mannit zugegeben und die Lösung wird lyophilisiert und das Lyophilisat wird in ein Gläschen gefüllt.
Beispiel 4:
Wirkstoff enthaltende Ampulle, beispielsweise in Wasser gelöstes Dinatriumpamidronatpentahydrat. Die Lösung (Konzentration 3 mg/ml) ist nach der Verdünnung zur i.v. Infusion geeignet. Zusammensetzung:

Wirkstoff 19,73 mg (entspricht 5,0 mg wasserfreiem Wirkstoff)

Mannit 250 mg Wasser zur Injektion 5 ml
Beispiel 5: Behandlung von Patienten
Es werden mehrere Patienten, die an Krebs und assoziierten Metastasen leiden und ein Patient, der an Osteoarthritis leidet, mit Bisphosphonatinfusionen intraarteriell über Arterien behandelt, die zum Krebs, den Metastasen oder den Osteoarthritisstellen führen. Die Stellen mit Krebs, den Metastasen und Osteoarthritis werden mittels angiographischer Standardtechniken sowohl vor als auch nach einer Bisphosphonatinfusion untersucht. In allen Fällen beobachtet man einen deutlichen embolischen Effekt auf die neu gebildeten Kapillaren und die anderen Blutgefäße in der Region, in der die Erkrankung beobachtet wird. Die Behandlungspläne werden später im Detail beschrieben.

i) Patientennummer: 1676

Geschlecht: Weiblich

Alter: 68 Jahre und 6 Monate

Diagnose: Brustkrebs, mehrfache Lungenmetastasen

Therapeutische Zugänge: Die beidseitigen Bronchialarterien

Es werden insgesamt 75 mg an Pamidronat-Dinatrium (Aredia^®) in die bilateralen Bronchialarterien infundiert, um ihre Tumoransammlungen zu zerstören. Die 1 und 2 zeigen Angiogramme der linken (1) und rechten (2) Lungenbereiche vor (a) und nach (b) der Behandlung.

ii) Patientennummer:	2022
Geschlecht:	Weiblich
Alter:	57 Jahre und 1 Monat
Diagnose:	Brustkrebs, Knochenmetastasen, mehrfache Lungenmetastasen
Therapeutische Zugänge:	1. Die beidseitig höchsten Intercostalarterien bis zu 12. Intercostalarterie 2. Die beidseitigen Bronchialarterien 3. Lateral innere Thorakalarterie 4. vr. laterale Thorakalarterie

Es werden insgesamt 75 mg Pamidronat-Dinatrium (Aredia^®), 100 mg Etoposid, 10 mg BLM und 500 mg Impr as-Liprodol verwendet, um die Tumoransammlungen zu zerstören, die entlang dieser Gefäße liegen (für Knochenmetastasen wird nur Pamidronat verwendet)

iii) Patientennummer:	1441
Geschlecht:	Weiblich
Alter:	63 Jahre und 11 Monate
Diagnose:	Brustkrebs, mehrfache Knochenmetastasen, mehrfache Lungenmetastasen
Therapeutische Zugänge:	1. Beidseitig die Obturatorarterien 2. Beidseitig L 4/5 bis L1 Lumbararterien 3. Rechte s, 6, 7, 8 subergemenale Leberarterien

Es werden insgesamt 45 mg Pamidronat-Dinatrium (Aredia^®), 10 mg ADM (für die Leber) und 500 mg Impr as-Liprodolemulsion verwendet, zum die Tumoransammlungen zu zerstören, die entlang der Gefäße liegen (für Knochenmetastasen werden nur 45 mg Pamidronat verwendet und für Lebermetastasen werden zusätzlich 10 mg ADM mit 500 mg Impr as-Liprodol verwendet).

iv) Patientennummer: 1840

Geschlecht: Männlich

Alter: 43 Jahre und 11 Monate

Diagnose: Zungenkrebs, colaterale Vibo, Diaphragmametastase

Therapeutische Zugänge: 1. Die 7., 8., 9. und 10. Intercostalarterien 2. Linke ing. Phrenia 3. Linke obere Intercostalarterie 4. Linke Subscapulararterie

Es werden insgesamt 60 mg Pamidronat-Dinatrium (Aredia^®) in die obigen Arterien zur Zerstörung ihrer Tumoransammlungen infundiert, die entlang dieser Gefälle liegen.

v) Patientennummer:	1835
Geschlecht:	Weiblich
Alter:	34 Jahre und 8 Monate
Diagnose:	Brustkrebs, mehrfache Lungenmetastasen, mehrfache Knochenmetastasen, mehrfache Lebermetastasen
Therapeutische Zugänge:
	Linke Ileolumbar-, Ileosacral-, Lateralsacralarterien Rechte Ileolumbar-, tiefe Ileoorumgalarterien beidseitig L4, links L3, beidseitig L2, linke Thorakalartherien, rechte Thorakal-Intercostalarterien, Bronchialarterie, rechte Leberarterie

Es werden insgesamt 90 mg Pamidronat-Dinatrium (Aredia^®), 100 mg Etoposid, 10 mg ADM, 6,0 CE an OK-432 und 500 mg an Impr as-Liprodolemulsion verwendet, um die Tumoransammlungen zu zerstören, die entlang dieser Gefäße liegen.

i) Patientennummer:	2013
Geschlecht:	Weiblich
Alter:	73 Jahre und 7 Monate
Diagnose:	Rechte Kniegelenksosteoarthritis (als ischämische, angiogene Knochenstörung interpretiert)
Therapeutische Zugänge:	1. Rechte absteigende Kniegelenksararterie Rechte Sulararterie

Es werden insgesamt 30 mg Pamidronat-Dinatrtum (Aredia^®) verwendet, um die angiogenen Ansammlungen zu zerstören, die entlang dieser Gefäße liegen. Angiogramme des Bereichs des rechten Kniegelenks sind in 3 vor (a) und nach (b) der Behandlung gezeigt.

vii) Patientennummer:	2026
Geschlecht:	Weiblich
Alter:	49 Jahre
Diagnose:	Brustkrebs, thorakale Rückenmarks- und Knochenmetastasen
Therapeutische Zugänge:	1. Die beidseitig obersten Intercostalarterien 2. Beidseitig 1–4 Lumbararterien 3. Mediansakralarterie

Es werden insgesamt 30 mg Pamidronat-Dinatrum (Aredia^®) in die Tumoransammlungen infundiert, um sie zu zerstören.

viii) Patientennummer:	1985
Geschlecht:	Weiblich
Alter:	49 Jahre und 8 Monate
Diagnose:	Brustkrebs, mehrfache Knochenmetastasen, nach BCT
Therapeutische Zugänge:	1. Die beidseitig obersten bis zu den 12. Intercostalarterien 2. Die beidseitigen Lumbararterien (L1 bis L4) 3. Die mediane Sakralarterie

Es werden insgesamt 90 mg Pamidronat-Dinatrtum (Aredia^®) verwendet, um die Tumoransammlungen zu zerstören, die entlang dieser Gefäße liegen.

i) Patientennummer:	1063
Geschlecht:	Männlich
Alter:	80 Jahre und 10 Monate
Diagnose:	Lungenkrebs, Krebs der squamösen Zellen
Therapeutische Zugänge:	1. Die rechte, oberste Intercostalarterie 2. Der gemeinsame Stamm der beidseitigen Bronchialarterien

Es werden insgesamt 45 mg Pamidronat-Dinatrtum (Aredia^®) alleine in den Tumor infundiert, um die Tumoransammlungen der zuführenden Gefäße zu zerstören.
Beispiel 6: Wirkung von Zoledronsäure auf die Angiogenese bei Mäusen, die durch die mit Wachstumsfaktor imprägnierten, subkutanen Implantate induziert wird
Verfahren Tiere
Weibliche Mäuse (Tiflbm: MAG), die 17 bis 20 g wiegen, werden verwendet. Sie werden über Ohrmarkierungen identifiziert und in Gruppen (6 Tiere pro Käfig) unter normalen Bedingungen gehalten und täglich beobachtet. Es werden sechs Mäuse pro Behandlungsgruppe in jedem Experiment verwendet.
Alle Experimente werden zumindest zweifach ausgeführt.
Herstellung der Kammer
Es werden poröse Gewebekammern verwendet, die aus Perfluoralkoxy-Teflon (Teflon^®-PFA, 21 mm × 8 mm Durchmesser, 550 μl Volumen) hergestellt wurden und mit 80 Löchern in regelmäßigem Abstand von 0,8 mm perforiert wurden. Beide Enden werden mit entfernbaren Kappen aus demselben Material verschlossen. Es werden 4 bis 6 Kammern in einen Siliconschlauch (12 mm Durchmesser) inseriert. Beide Enden des Schlauchs werden dann mit Silicongummi verschlossen und 24 Stunden später wird der Schlauch, der die Kammern enthält, durch Autoklavieren sterilisiert (121 °C, 15 Minuten).
Wachstumsfaktoren
Die Kammern werden unter sterilen Bedingungen während sie im Siliconschlauch enthalten sind mit 0,8 % G/V Agar (BBL^® Nr. 11849, Becton Dickinson, Meylan, France) gefüllt (Gesamtvolumen 0,5 ml), worin 20 E/ml Heparin (Novo Nordisk A/S, 2880 Bagsvaerd, Dänemark) mit oder ohne Wachstumsfaktor (2 μg/ml humaner VEGF oder 0,3 μg/ml humaner bFGF) enthalten sind. Die Agarlösung wird vor dem Füllverfahren auf 42°C gehalten.
Kammerimglantierung
Es wird eine Betäubung der Mäuse durch die Inhalation von 3 % Isofluran (Forene^®, Abott AG, Cham, Schweiz) in Sauerstoff hervorgerufen. Die Kammer wird unter aseptischen Bedingungen durch einen kleinen Schnitt am Rücken des Tieres implantiert. Der Hautschnitt wird durch Wundklammern verschlossen (9 mm Autoclip, Clay Adams).
Kammerentfernung
Fünf Tage nach der Implantierung werden die Tiere betäubt (3 % Isofluran) und mittels einer Überdosis Pentobarbiton (210 mg/kg i.p., Vetanacrol, Veterinaria AG, Zürich, Schweiz) getötet. Die Kammern werden dann aus dem Tier entnommen, das vaskularisierte, fibroide Gewebe, das sich um jedes Implantant gebildet hat, wird sorgfältig entfernt, gewogen und die Gesamtmenge an Blut wird durch eine colorimetrische Bestimmung der Hämoglobinkonzentration quantifiziert.
Quantifizierung der angiogenen Reaktion
Nach der Zugabe von 2 ml destilliertem Wasser werden die Gewebeproben für 1 Minute bei 24 000 Upm homogenisiert (Ultra Turrax T25). Die Proben werden dann für 1 Stunde bei 7000 Upm zentrifugiert. Der Überstand wird durch einen 0,45 μm GHP Spritzenfilter (Acrodisc^® GF, Gelman Sciences, Ann Arbor, Michigan, USA) filtriert, um eine Fettkontamination zu vermeiden. Die Menge an Hämoglobin, die im Filtrat vorhanden ist, wird durch eine spektrophotometrische Analyse bei 540 nm mittels des Drabkin-Reagenzkits bestimmt (Sigma Hämoglobin Nr. 525, Sigma Chemical Co. Ltd., Poole, Dorset, England). Ein Aliquot des Filtrats (100 μl) wird zu 1 ml Drabkin's Lösung gegeben und das Gemisch wird für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Absorption bei 540 nm (Uvikon 810 P) ist proportional zur Hämoglobinkonzentration. Die Hämoglobinmessungen werden dann mittels einer Kalibrierkurve in eine Blutvolumenmessung (μl) umgewandelt, die vorher mit Gesamtblutproben unterschiedlicher Volumina aus einer Donormaus erhalten wurde.
Arzneimittelbehandlung
Die Zoledronsäureverabreichung wird einen Tag vor der Implantierung der Kammern gestartet und die Kammern werden 24 Stunden nach der letzten Dosis 5 Tage nach der Implantierung entfernt. Die Tiere werden in Gruppen für die Dauer des Experiments gehalten. Die Zoledronsäure wird in Dosen von 1, 10 und 100 μg/kg/Tag s.c. (Dosisvolumen 25 ml/kg) verabreicht, wobei die Injektionsstellen wechseln. Die Verbindung wird zuerst in destilliertem Wasser gelöst und dann mit destilliertem Wasser verdünnt, das Mannit enthält (Endkonzentration: 5 % Mannit). Die Kontrolltiere erhalten nur Träger. Jedes Expertment wird zumindest zweimal ausgeführt und die Daten werden für die Endbewertung zusammengefasst.
Berechnungen und Statistiken
Die prozentuale Hemmung der angiogenen Reaktion (Erhöhung des Gewebegewichts oder des Gesamtbluts) wird in einzelnen Tieren wie folgt berechnet: (A-B)/(C-D) × 100A = Gewicht (oder Blutvolumen) des Gewebes aus einer mit Arzneimittel behandelten Maus mit einer Wachstumsfaktor enthaltenden Kammer
B = Mittleres Gewicht (oder Blutvolumen) des Gewebes aus der Gruppe an Arzneimittel-behandelten Mäusen mit Kammern, die keinen Wachstumsfaktor enthalten.
C = Mittleres Gewicht (oder Blutvolumen) des Gewebes aus der Gruppe der mit Träger behandelten Mäuse mit Kammern, die Wachstumsfaktor enthalten.
D = Mittleres Grundgewicht (oder Blutvolumen) des Gewebes aus der Gruppe mit Träger behandelten Mäuse mit Kammern, die keinen Wachstumsfaktor enthalten.
Die statistischen Vergleiche zwischen Gruppen (mit der Verbindung behandelten gegen die nicht behandelten Tiere) werden mit den absoluten Werten für das Gewebegewicht und dem Blutvolumen mittels des Mann-Whitney Rangsummentests (SigmaStat 2.0 Software, Jandel Scientific, Deutschland) durchgeführt. Die Signifikanzgrenze wird bei p < 0,05 gesetzt.
Ergebnisse
Die Zoledronsäure hemmt dosisabhängig die angiogene Reaktion, die durch bFGF induziert wird, wie dies durch Gewicht und Blutgehalt gemessen wird, mit ungefähren HK₅ ₀ Werten von jeweils 2,5 und 3,1 μg/kg. Bei der höchsten getesteten Dosis (100 μg/kg/Tag) tritt eine signifikante Hemmung der durch VEGF-induzierten Erhöhung des Blutgehalts, aber nicht des Gewichts auf.
Die Untersuchungen zeigen, dass Zoledronsäure die durch bFGF aber nicht die durch VEGF induzierte Angiogenese in einem Dosisbereich hemmt, der therapeutische Effekte beim Knochenumsatz in mehreren Tierkrankheitsmodellen zeigt. Bei höheren Dosen beobachtet man auch eine partielle Hemmung der VEGF Reaktion. Daher scheint Zoledronsäure eine Selektivität für die Hemmung der durch bFGF vermittelten Reaktion zu haben.
Beispiel 7: Wirkungen von Zoledronat auf die Zellgroliferation und Zellmigration in vitro
Verfahren
Testverbindungen und Lösungen
Die Untersuchungen, die in diesem Bericht beschrieben sind, werden mit dem hydratisierten Dinatriumsalz von Zoledronat ausgeführt. Es werden Stammlösungen aus Zoledronat (10 mM) und EDTA (5 mM) in PBS hergestellt. Die Stammlösungen werden dann im optimalen Medium für jede Zelllinie verdünnt.
Zellen und Zellkulturbedingungen
Humane Endothelzellen aus der Nabelschnurvene (HUVEC) werden von Promo Cell (BioConcept AG, Allschwil, Schweiz) erhalten. Die humane Tumorzelllinie A431 (Epithelcarzinom), die in dieser Studie verwendet wird, wird von der American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA) erhalten. Alle Zelllinien werden in vitro gemäß den Empfehlungen des Herstellers kultiviert.
Endothelzellgroliferationstest
Als Test auf die Fähigkeit von Zoledronat eine funktionelle Reaktion auf VEGF zu hemmen, wird ein Endothelzellproliferationstest basierend auf dem BrdU Einbau verwendet (Biotrak Cell Proliferation Elisa System V.2, Amersham, England). Um die Spezifität der Reaktion zu testen, werden die Wirkungen von Zoledronat und EDTA (als Kontrolle für die Ionenchelateffekte von Zoledronat) auf die durch bFGF und Serum induzierte Proliferation von HUVEC getestet. Subkonfluente HUVEC werden in einer Dichte von 5 × 10³ Zellen pro Vertiefung in Platten mit 96 Vertiefungen angeimpft, die mit 1,5 % Gelatine beschichtet sind und dann bei 37°C und 5 % CO₂ in Wachstumsmedium inkubiert (Endothelzellwachstumsmedium, PromoCell Nr. C-22110, BioConcept AG, Allschwil, Schweiz). Nach 24 Stunden wird das Wachstumsmedium durch Basalmedium (Endothelzellbasalmedium, PromoCell Nr. C-22210, BioConcept AG, Allschwil, Schweiz) ersetzt, das den humanen VEGF₁₆₅ (10 ng/ml), bFGF (0,5 ng/ml) oder 5 % FCS in Gegenwart oder Abwesenheit der Testverbindung enthält. Als Kontrolle werden Zellen ohne Wachstumsfaktor ebenfalls einbezogen. Nach 24 Stunden Inkubation wird die BrdU Markierungslösung zugegeben und die Zellen werden weitere 24 Stunden vor der Fixierung, der Blockierung und der Zugabe von Peroxidase-markiertem anti-BrdU Antikörper inkubiert. Der gebundene Antikörper wird dann mittels 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidinsubstrat detektiert, das ein gefärbtes Produkt bildet, das spektrophotometrisch bei 450 nm quantifiziert wird.
Tumorzellproliferationstest
Um ferner die Spezifität von Zoledronat und EDTA zu testen werden ihre Wirkungen auf die Proliferation einer humanen Tumorzelllinie getestet (A431, Epithelcarzinom). Die Zellen werden mit 1,5 × 103 Zellen/Vertiefung in Platten mit 96 Vertiefungen angeimpft und über Nacht inkubiert. Die Testverbindung wird dann in Reihenverdünnungen zugegeben und die Platten werden dann für 3 Tage inkubiert, wonach die Zellen mit 3,3 % V/V Glutaraldeyhd fixiert, mit Wasser gewaschen und mit 0,05 % G/V Methylenblau gefärbt werden. Nach dem Waschen wird der Farbstoff mit 3 % V/V HCl eluiert und die optische Dichte wird bei 665 nm mit einem Dynatech 7000 Spektrophotometer gemessen. Die prozentuale Verringerung des Zellwachstums von Zellen, die gegenüber einer Verbindung exponiert sind im Vergleich zu Kontrollen wird durch ein computerisiertes System mittels der Formel (OD Test – OD Start)/(OD Kontrolle – OD Start) × 100 bestimmt. Die HK₅ ₀ wird als die Arzneimittelkonzentration definiert, die zu einer Verringerung um 50 % der Anzahl an Zellen pro Vertiefung im Vergleich zu Kontrollkulturen (100 %) am Ende der Inkubationsperiode führt.
Endothelzellmigrationstest
Als Test für die Fähigkeit von Zoledronat zur Hemmung einer funktionellen Reaktion auf VEGF wird ein Endothelzellmigrationstest verwendet. Es werden Platten (mit 24 Vertiefungen) mit 1,5 % Gelatine beschichtet und mit kreisförmigen Zäunen als Barriere ausgestattet, um das Wachstum der Zellen im Zentrum der Vertiefung zu verhindern. Es werden subkonfluente HUVEC in den äußeren Bereich mit einer Dichte von 1 × 10⁵ Zellen pro Vertiefung angeimpft und dann bei 37°C und 5 % CO₂ in Wachstumsmedium inkubiert (Endothelzellwachstumsmedium, PromoCell Nr. C-22110, BioConcept AG, Allschwil, Schweiz). Nach 24 Stunden werden die Zäune entfernt und das Wachstumsmedium wird durch Basalmedium (Endothelzellbasalmedium, PromoCell Nr. C 22210, BioConcept AG, Allschwil, Schweiz), worin humaner VEGF₁₆₅ (10 ng/ml) oder 5 % FCS enthalten sind, in Gegenwart oder Abwesenheit der Testverbindung ersetzt. Um die Zellproliferation zu hemmen werden 50 μg/ml Fluoruracil (Roche, Basel, Schweiz) zugegeben. Als Kontrolle werden auch Vertiefungen ohne Wachstumsfaktor einbezogen. Nach einer Inkubation von 60–70 Stunden werden die Zellen fixiert und mit Diff-Quik (Dade Behring AG, Nr. 130832, Düdingen, Schweiz) gefärbt. Die Platten mit den 24 Vertiefungen werden unter ein Binokularmikroskop gestellt und die Anzahl an migrierten Zellen wird gezählt, wobei die Software KS-400 (Carl Zeiss Jena, Jena, Germany) und ein speziell entworfenes Makro (Migration.mcr) verwendet werden.
Statistik
Die Daten werden durch eine Einwegsanalyse der Varianz, gefolgt vom Dunnett's Test analysiert, um die Signifikanz der Unterschiede zwischen den mit Zoledronat oder EDTA behandelten Gruppen und der Kontrolle zu ermitteln. Der Bonferroni-Test wird verwendet, um die Signifikanz der Unterschiede zwischen jedem Paar der mit Zoledronat und EDTA behandelten Gruppen bei einer spezifischen Konzentration zu ermitteln. Alle Analysen werden mit der Instat^® Software (GraphPad Inc., San Diego, USA) ausgeführt.
Ergebnisse
Zoledronat hemmt dosisabhängig die durch Serum induzierte HUVEC Proliferation mit einem HK₅ ₀ Wert von 4,1 t 0,6 μM. Es hat auch einen ähnlichen Effekt auf die durch VEGF induzierte (HK₅₀: 6,9 t 0,4 μM) und die durch bFGF induzierte (HK₅₀: 4,2 ± 0,4 μM) Proliferation. Der hemmende Effekt von Zoledronat auf die Proliferation unterscheidet sich bei den höheren Konzentrationen signifikant von der Kontrolle. Für alle Stimuli beobachtet man Veränderungen der Zellmorphologie bei der höchsten getesteten Zoledronatkonzentration (30 μM).
Da Bisphosphonate mit divalenten Kationen Chelate bilden wird EDTA als Kontrolle in Parallelexperimenten verwendet. EDTA hemmt bei 30 μM die durch FCS, VEGF und bFGF induzierte HUVEC Proliferation um jeweils 23,7 %, 55,6 % und 49,5 %. Für alle Stimuli ist die Wirkung von EDTA geringer als die von Zoledronat und erreicht nicht die statistische Signifikanz für die durch Serum induzierte Proliferation im getesteten Konzentrationsbereich, während dies bei einer VEGF und bFGF Stimulierung bei ED-TA Konzentrationen von 3 μM und mehr der Fall ist. Für eine Stimulierung mit Serum oder bFGF ist der hemmende Effekt von Zoledronat signifikant größer als der von EDTA bei Konzentrationen von 3 μM und mehr, aber bei der VEGF Stimulierung sind nur die 30 μM Werte signifikant unterschiedlich.
Die Proliferation der humanen Tumorzelllinie A431 wird durch Zoledronat mit einer HK₅ ₀ von 1,35 μM gehemmt. EDTA hat keinen signifikanten Effekt auf die A431 Proliferation in dem getesteten Dosisbereich, obwohl eine leichte Hemmung (8,8 %) bei 30 μM sichtbar wird.
Zoledronat stimuliert bei Konzentrationen von bis zu 10 μM die HUVEC Migration im Basalmedium, wie auch im Medium, das Serum oder VEGF enthält. Bei 30 μM wird die Migration vollständig gehemmt und es wird eine Veränderung in der Zellmorphologie beobachtet. EDTA hat keine konsistente Wirkung auf die Migration.
Diese Studien zeigen, das Zoledronat die Proliferation von humanen Endothelzellen hemmt, die durch Serum, VEGF und bFGF induziert wird.

Claims

Verwendung eines Bisphosphonats zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Myokardischämie, Osteoarthritis, Psoriasis, Hämangioblastom, Hämangiom oder Schmerz, worin das Bisphosphonat als Angiogenese hemmendes oder verhinderndes Mittel wirkt und aus den folgenden Verbindungen oder einem pharmazeutisch annehmbaren Salzes hiervon oder einem Hydrat hiervon ausgewählt ist: 3-Amino-1-hydroxypropan-1,1-diphosphonsäure (Pamidronsäure), beispielsweise Pamidronat (APD), 3-(N,N-Dimethylamino)-1-hydroxypropan-1,1-diphosphonsäure, beispielsweise Dimethyl-APD, 4-Amino-1-hydroxybutan-1,1-diphosphonsäure (Alendronsäure), beispielsweise Alendronat, 1-Hydroxyethidenbisphosphonsäure, beispielsweise Etidronat, 1-Hydroxy-3-(methylpentylamino)propylidenbisphosphonsäure, Ibandronsäure, beispielsweise Ibandronat, 6-Amino-1-hydroxyhexan-1,1-diphosphonsäure, beispielsweise Aminohexyl-BP, 3-(N-Methyl-N-n-pentylamino)-1-hydroxypropan-1,1-diphosphonsäure, beispielsweise Methylpentyl-APD (= BM 21.0955), 1-Hydroxy-2-(imidazol-1-yl)ethan-1,1-diphosphonsäure, beispielsweise Zoledronsäure, 1-Hydroxy-2-(3-pyridyl)ethan-1,1-diphosphonsäure (Risedronsäure), beispielsweise Risedronat, einschließlich N-Methylpyridiniumsalze hiervon, beispielsweise N-Methylpyridiumiodide, wie NE-10244 oder NE-10446, 1-(4-Chlorphenylthio)-methan-1,1-diphopshonsäure (Tiludronsäure) beispielsweise Tiludronat, 3-[N-(2-Phenylthioethyl)-N-methylamino]-1-hydroxypropan-1,1-diphosphonsäure, 1-Hydroxy-3-(pyrrolidin-1-yl)-propan-1,1-diphosphonsäure, beispielsweise EB 1053 (Leo), 1-(N-Phenylaminothiocarbonyl)methan-1,1-diphosphonsäure, beispielsweise FR 78844 (Fujisawa), 5-Benzoyl-3,4-dihydro-2H-pyrazol-3,3-diphosphonsäuretetraethylester, beispielsweise U 81581 (Upjohn), 1-Hydroxy-2-(imidazo[1,2-a]pyridin-3-yl)ethan-1,1-diphosphonsäure, beispielsweise YM 529 und 1,1-Dichlormethan-1,1-diphosphonsäure (Clodronsäure), beispielsweise Clodronat.
Verwendung nach Anspruch 1, worin das Bisphosphonat zu Herstellung eines Arzneimittels zur embolischen Behandlung der Angiogenese verwendet wird.
Verwendung nach Anspruch 1, worin das Bisphosphonat zur Herstellung eines Arzneimittels zur prophylaktischen oder präventiven Behandlung der Angiogenese verwendet wird.
Verwendung nach Anspruch 1, worin das Bisphosphonat zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung der Angiogenese bei einem Patienten verwendet wird, der an einer Myokardischämie oder Osteoarthritis leidet.
Verwendung nach Anspruch 1, worin das Bisphosphonat Pamidronsäure oder Zoledronsäure oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon oder ein Hydrat hiervon ist.
Verwendung nach Anspruch 1, worin das Bisphosphonat zur Herstellung eines Arzneimittels zur intraarteriellen, embolischen Behandlung der Angiogenese verwendet wird.
Verwendung nach Anspruch 6, worin das Bisphosphonat Pamidronsäure oder Zoledronsäure ist oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon oder ein Hydrat hiervon.