JP2002501757A - ストレス応答性キナーゼのモジュレーターの特定方法 - Google Patents

ストレス応答性キナーゼのモジュレーターの特定方法

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JP2002501757A JP2000529455A JP2000529455A JP2002501757A JP 2002501757 A JP2002501757 A JP 2002501757A JP 2000529455 A JP2000529455 A JP 2000529455A JP 2000529455 A JP2000529455 A JP 2000529455A JP 2002501757 A JP2002501757 A JP 2002501757A
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stress
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ある種のストレス応答性キナーゼのモジュレーターとして有用な化合物の特定方法に関する。より詳しくは、そのようにして特定された化合物は、例えば異常な骨吸収または血管新生に媒介される疾患または状態の治療または予防に有用である。これらの化合物は、骨粗鬆症の治療または予防、および血管再発性狭窄症、糖尿病性網膜症、黄斑変性、血管新生、アテローム性動脈硬化症、炎症および腫瘍増殖の抑制に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の簡単な記載） 本発明は、ある種のストレス応答性キナーゼのモジュレーター（特に、アクチ
ベーター）として有用な化合物の特定方法に関する。より詳しくは、そのように
して特定された化合物は、例えば異常な骨吸収または血管新生により媒介される
疾患または状態の治療または予防に有用である。これらの化合物は、骨粗鬆症の
治療または予防、および血管再発性狭窄症、糖尿病性網膜症、黄斑変性、血管新
生、アテローム性動脈硬化症、炎症および腫瘍増殖の抑制に有用である。
【０００２】 （発明の背景） 少なくとも１２種類のストレス応答性キナーゼ（すなわち、ストレスに応答す
るキナーゼ）が種々の哺乳類細胞内に存在すると考えられている。これらのキナ
ーゼの１つである哺乳類不妊２０様キナーゼ（Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｓｔｅｒｉ
ｌｅ ２０−ｌｉｋｅ Ｋｉｎａｓｅ）が、最近、科学文献に記載された。哺乳
類不妊２０様キナーゼの少なくとも２つのアイソフォームが公知であり、以下、
それらを「Ｍｓｔ１」および「Ｍｓｔ２」と称することにする。Ｔａｙｌｏｒら
，“Ｎｅｗｌｙ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｓｔｒｅｓｓ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ
ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅｓ，Ｋｒｓ−１ ａｎｄ Ｋｒｓ−２”，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９３（１９９６）， ｐ
ｐ．１００９９−１０１０４；Ｃｒｅａｓｙら，“Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｃ
ｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋ
ｉｎａｓｅ ｗｉｔｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｔｏ Ｓｔｅ２０，”Ｔｈｅ Ｊ．
ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２７０，Ｎｏ．３
７（１９９５），ｐｐ．２１６９５−２１７００；Ｃｒｅａｓｙら，“Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｅｍｂｅｒ
ｏｆ ｔｈｅ ＭＳＴ ｓｕｂｆａｍｉｌｙ ｏｆ Ｓｔｅ２０−ｌｉｋｅ
ｋｉｎａｓｅｓ”，Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．１６７（１９９５），ｐｐ．３０３−３
０６；Ｃｒｅａｓｙら，“Ｔｈｅ Ｓｔｅ ２０−ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ
ｋｉｎａｓｅ，ｓｔ １，ｄｉｍｅｒｉｚｅｓ ａｎｄ ｃｏｎｔａｉｎｓ ａ
ｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｔｙ ｄｏｍａｉｎ”，Ｔｈｅ Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇ
ｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２７１，Ｎｏ．３５（１９９６），ｐ
ｐ．２１０４９−２１０５３；およびＷａｎｇおよびＥｒｉｋｓｏｎ，“Ａｃｔ
ｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ
ｋｉｎａｓｅｓ ｐ４２，ｐ６３，ａｎｄ ｐ８７ ｉｎ Ｒｏｕｓ ｓａｒｃ
ｏｍａ ｖｉｒｕｓ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｃｅｌｌｓ： ｓｉｇｎａｌ
ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ／ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎ
ｔ ＭＢＰ ｋｉｎａｓｅｓ”，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ，３，ｐｐ．１３
２９−１３３７（１９９２）（これらの全体を参照により本明細書に組み入れる
こととする）を参照されたい。本発明の一部において、ゲル内（ｉｎ−ｇｅｌ）
キナーゼアッセイを用いて、他の３つのキナーゼを同定した。これらのキナーゼ
は約３４ｋＤａ、５０ｋＤａおよび１３０ｋＤａの分子量を有し、本発明におい
てはこれらをそれぞれ「３４ｋＤａキナーゼ」、「５０ｋＤａキナーゼ」および
「１３０ｋＤａキナーゼ」と称することにする。Ｍｓｔ１、Ｍｓｔ２、３４ｋＤ
ａキナーゼ、５０ｋＤａキナーゼおよび１３０ｋＤａキナーゼは、破骨細胞など
の種々の哺乳類細胞の調節および血管新生などの細胞過程の調節において中心的
な役割を果たしている。
【０００３】 多種多様な病態および状態がＭｓｔ１、Ｍｓｔ２、３４ｋＤａキナーゼ、５０
ｋＤａキナーゼおよび１３０ｋＤａキナーゼまたはそれらの組合せの調節（例え
ば、活性化）により媒介されうると考えられる。また、これらのキナーゼのいわ
ゆるモジュレーターは、新規かつ有用な治療用クラスの薬物を代表すると考えら
れる。そのようなモジュレーターは、骨粗鬆症、骨減少症およびページェット病
を含む疾患の治療および予防、ならびに血管再発性狭窄症、糖尿病性網膜症、黄
斑変性、血管新生、アテローム性動脈硬化症、炎症および腫瘍増殖の抑制に有用
であろう。
【０００４】 本発明の１つの態様において、本発明のアクチベーター化合物は骨吸収の抑制
に有用である。骨吸収は、破骨細胞として公知の細胞の作用により媒介される。
破骨細胞は、脊椎動物において石灰化組織を吸収する約４００μｍまでの直径の
大きな多核細胞である。破骨細胞は、骨表面に沿って移動する活発に運動する細
胞であり、骨に結合し、必要な酸およびプロテアーゼを分泌し、それにより骨の
石灰化組織の実際の吸収を引き起こしうる。より詳しくは、破骨細胞は、少なく
とも２つの生理学的状態（すなわち、活性／分泌状態および移動性または運動性
状態）で存在すると考えられる。分泌状態では、破骨細胞は平坦であり、強固な
結合の領域（すなわち、明帯）を介して骨マトリックスに結合し、高度に極性化
し、波状縁を形成し、リソソーム酵素およびプロトンを分泌して骨を吸収する。
骨表面に対する破骨細胞の付着は、骨吸収における重要な開始段階である。移動
性または運動性状態においては、破骨細胞は骨マトリックスを越えて移動し、そ
れが再び骨に結合するまでは吸収に関与しない。Ｍｓｔ１、Ｍｓｔ２、３４ｋＤ
ａキナーゼ、５０ｋＤａキナーゼおよび１３０ｋＤａキナーゼなどのキナーゼは
、破骨細胞の機能の調節に関与すると考えられる。したがって、これらのキナー
ゼを標的化することにより、破骨細胞に媒介される病態（例えば、骨粗鬆症）が
治療されうる。
【０００５】 本発明において、予想外にも、破骨細胞の機能を改変することが知られている
或る種の化合物がストレス応答性キナーゼを活性化することを見出した。これら
の活性化化合物としては、ビスホスホネート、アレンドロネート、蛇毒ディスイ
ンテグリン、エキスタチン、抗β３インテグリンモノクローナル抗体（Ｐｈａｒ
ｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから商業的に入手可能）、天然に存在
するポリペプチドであるカルシトニン、およびエキスタチンＲＧＤ（すなわち、
アルギニン、グリシン、アスパラギン酸）模擬体である３（Ｓ）−（２−（２−
オキソ−３−（Ｓ）−［５，６，７，８−テトラヒドロ−［１，８］−ナフチリ
ジン−２−イルメチル）−アミノ］−ピロリジン−１−イル）−アセチルアミノ
）−４−キノリン−３−イル−酪酸三塩酸塩（以下、「ＲＧＤ Ｉ」と称される
）および（２−［Ｎ−（３，４，５，６−テトラヒドロピリミジン−２−イル）
アミノ］エチルオキシフェン−４−イル）カルボニル−２（Ｓ）−フェニルスル
ホンアミド−β−アラニン（以下、「ＲＧＤ ＩＩ」と称される）が挙げられる
。この予想外の知見は、これらのキナーゼを活性化する化合物の同定方法を得る
ことに関する更なる知見、およびそのようにして同定された他の化合物が、これ
らのキナーゼに媒介される種々の状態または病態の治療に有用であるという認識
につながった。
【０００６】 したがって、Ｍｓｔ１、Ｍｓｔ２、３４ｋＤａキナーゼ、５０ｋＤａキナーゼ
および１３０ｋＤａキナーゼならびにそれらの混合物よりなる群から選ばれるス
トレス応答性キナーゼを調節する化合物の特定方法を提供することが、本発明の
目的である。
【０００７】 Ｍｓｔ１、Ｍｓｔ２、３４ｋＤａキナーゼ、５０ｋＤａキナーゼおよび１３０
ｋＤａキナーゼならびにそれらの混合物よりなる群から選ばれるストレス応答性
キナーゼを哺乳類細胞において活性化する方法を提供することが、本発明のもう
１つの目的である。
【０００８】 Ｍｓｔ１、Ｍｓｔ２、３４ｋＤａキナーゼ、５０ｋＤａキナーゼおよび１３０
ｋＤａキナーゼならびにそれらの混合物よりなる群から選ばれるストレス応答性
キナーゼの活性化効果を哺乳動物において惹起する方法を提供することが、本発
明のもう１つの目的である。
【０００９】 Ｍｓｔ１、Ｍｓｔ２、３４ｋＤａキナーゼ、５０ｋＤａキナーゼおよび１３０
ｋＤａキナーゼならびにそれらの混合物よりなる群から選ばれるストレス応答性
キナーゼを調節（例えば、活性化）することにより哺乳動物における疾患または
状態の治療または予防方法を提供することが、本発明のもう１つの目的である。
【００１０】 Ｍｓｔ１、Ｍｓｔ２、３４ｋＤａキナーゼ、５０ｋＤａキナーゼおよび１３０
ｋＤａキナーゼならびにそれらの混合物よりなる群から選ばれるストレス応答性
キナーゼを調節（例えば、活性化）するに有用な化合物を提供することが、本発
明のもう１つの目的である。
【００１１】 これらの化合物を含む医薬組成物を提供することが、本発明のもう１つの目的
である。
【００１２】 これらの及び他の目的は、以下の詳細な説明から容易に理解されるであろう。
【００１３】 （発明の概要） 本発明は、 ａ）推定活性修飾性化合物（すなわち、活性を修飾すると推定される化合物
）を、破骨細胞生成性（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ）細胞培養物、
精製された破骨細胞、部分的に精製された破骨細胞、未精製の破骨細胞、精製さ
れた破骨細胞前駆体（ｐｒｅ−ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｓ）、部分的に精製された
破骨細胞前駆体、未精製の破骨細胞前駆体、精製された破骨細胞様細胞、部分的
に精製された破骨細胞様細胞、未精製の破骨細胞様細胞およびそれらの混合物と
接触させること、および ｂ）該細胞培養のキナーゼ活性を測定し、該キナーゼ活性を、該推定活性修
飾性化合物に接触していない細胞培養と比較することを含んでなる、Ｍｓｔ１、
Ｍｓｔ２、３４ｋＤａキナーゼ、５０ｋＤａキナーゼおよび１３０ｋＤａキナー
ゼならびにそれらの組合せよりなる群から選ばれるストレス応答性キナーゼを調
節する化合物の特定方法に関する。
【００１４】 さらに別の実施形態においては、本発明は、Ｍｓｔ１、Ｍｓｔ２、３４ｋＤａ
キナーゼ、５０ｋＤａキナーゼおよび１３０ｋＤａキナーゼならびにそれらの組
合せよりなる群から選ばれるストレス応答性キナーゼを哺乳類細胞において活性
化または調節する方法であって、該細胞を、本発明の方法に従い特定された化合
物の活性化量または調節量と接触させることを含んでなる方法に関する。
【００１５】 さらに別の実施形態においては、本発明は、Ｍｓｔ１、Ｍｓｔ２、３４ｋＤａ
キナーゼ、５０ｋＤａキナーゼおよび１３０ｋＤａキナーゼならびにそれらの組
合せよりなる群から選ばれるストレス応答性キナーゼの活性化または調節効果を
哺乳動物において惹起する方法であって、本発明の方法に従い特定された化合物
の活性化量を該哺乳動物に投与することを含んでなる方法に関する。
【００１６】 さらに別に実施形態においては、本発明は、Ｍｓｔ１、Ｍｓｔ２、３４ｋＤａ
キナーゼ、５０ｋＤａキナーゼおよび１３０ｋＤａキナーゼならびにそれらの組
合せよりなる群から選ばれるストレス応答性キナーゼにより媒介される哺乳動物
における疾患または状態の治療または予防方法であって、本発明の方法に従い特
定された化合物の医薬上有効な量を該哺乳動物に投与することを含んでなる方法
に関する。
【００１７】 さらに別の実施形態においては、本発明は、Ｍｓｔ１、Ｍｓｔ２、３４ｋＤａ
キナーゼ、５０ｋＤａキナーゼおよび１３０ｋＤａキナーゼならびにそれらの組
合せよりなる群から選ばれるストレス応答性キナーゼを活性化または調節するの
に有用な化合物に関する。
【００１８】 さらに別の実施形態においては、本発明は、これらの化合物を含んでなる医薬
組成物に関する。
【００１９】 （発明の詳細な記載） 図１は、抗β３インテグリンモノクローナル抗体（ｍＡｂ）およびエキスタチ
ンによるストレス応答性キナーゼの活性化に関する時間経過を示す。骨髄および
骨芽細胞（ＭＢ１．８）の共存培養からの破骨細胞前駆体（ＰＯＣ）を、コラゲ
ナーゼ不感受性ＥＤＴＡ感受性細胞（純度８０〜９０％）として単離した。精製
の約２０時間後、該細胞を抗β３インテグリン（ｍＡｂ）（２μｇ／ｍｌ）（上
、図１Ａ）またはエキスタチン（３０ｎＭ）（下、図１Ｂ）で、示されている時
間にわたり処理した。ミエリン塩基性タンパク質を基質として使用するゲル内キ
ナーゼアッセイ法を用いて、キナーゼの活性を測定した。約６０ｋＤａのキナー
ゼの二重線が、抗β３インテグリンｍＡｂおよびエキスタチンの両方により、強
く活性化されている。また、これらの処理により同様に活性化された約５０ｋＤ
ａのキナーゼに関するシグナルが認められる。
【００２０】 図２は、エキスタチンによる５０〜６０ｋＤａキナーゼの活性化に関する用量
反応関係を示す。骨髄および骨芽細胞（ＭＢ１．８）の共存培養からの破骨細胞
前駆体を、コラゲナーゼ不感受性ＥＤＴＡ感受性細胞（純度８０〜９０％）とし
て単離した。精製の約２０時間後、示されているとおりの種々の濃度のエキスタ
チンで細胞を処理した。標準的な（すなわち、一晩の）フィルム露出（左パネル
、図２Ａ）は、濃度＞１０ｎＭにおける約６０ｋＤａキナーゼの二重線の活性化
を示す（最大活性は約３０ｎＭにおいて認められる）。延長した（すなわち、約
３〜４日間の）露出（右パネル、図２Ｂ）は、３０および１００ｎＭの用量にお
ける約５０ｋＤａキナーゼの活性化を示す。
【００２１】 図３は、哺乳類不妊２０様（Ｍｓｔ）キナーゼの２つのアイソフォームとして
の約６０ｋＤａキナーゼの二重線の特定を示す。骨髄および骨芽細胞（ＭＢ１．
８）の共存培養からの破骨細胞前駆体を、コラゲナーゼ不感受性ＥＤＴＡ感受性
細胞（純度８０〜９０％）として単離した。精製の約２０時間後、示されている
とおりのエキスタチンで細胞を処理した（プラスの記号「＋」は処理を示し、マ
イナスの記号「−」は無処理を示す）。細胞ライセートを、商業的に入手可能な
抗ＭｓｔおよびＫｒｓ抗体のカクテルならびにプロテインＡ−アガロースビーズ
での処理に付し、該サンプルからＭｓｔを免疫枯渇（ｉｍｍｕｎｏｄｅｐｌｅｔ
ｅ）させた。抗体の不存在下での対照枯渇は、６０ｋＤａキナーゼの二重線を減
少させなかったが（レーン１および２）、Ｍｓｔ／Ｋｒｓ抗体カクテルでの処理
は、これらの活性の＞９０％を消失させた（レーン３および４）。プロテインＡ
−アガロースビーズに結合した対応する活性は、該抗体カクテルが該混合物中に
存在する場合にはキナーゼが免疫沈降し（レーン７および８）、該抗体カクテル
が存在しない場合にはそれが免疫沈降しない（レーン５および６）ことを示した
。
【００２２】 図４は、エキスタチンＲＧＤ模擬体であるＲＧＤ Ｉ（１０ｎＭ）およびＲＧ
Ｄ ＩＩ（１０μＭ）によるＭｓｔ１、Ｍｓｔ２および５０ｋＤａキナーゼの活
性化を示す。骨髄および骨芽細胞（ＭＢ１．８）の共存培養からの破骨細胞前駆
体を、コラゲナーゼ不感受性ＥＤＴＡ感受性細胞（純度８０〜９０％）として単
離した。精製の約２０時間後、細胞をエキスタチンまたはエキスタチンＲＧＤ模
擬体で処理した。該細胞を処理するためにエキスタチンを使用した場合の時間経
過（示されている時点における処理およびサンプリング）は、２０分の処理の後
に最大活性を示している（左パネル、図４Ａ）。右パネルの図４Ｂは、エキスタ
チンＲＧＤ模擬体ＲＧＤ ＩおよびＲＧＤ ＩＩもまた、Ｍｓｔ１、Ｍｓｔ２お
よび５０ｋＤａキナーゼの活性化に有効であることを示している。
【００２３】 図５は、ＨＥＫ２９３細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎが販売しているヒト胎児腎２９３細胞ＡＴＣＣ ＣＲＬ
１５７３）におけるαｖβ３インテグリンの発現が、Ｍｓｔ１、Ｍｓｔ２および
５０ｋＤａキナーゼの基礎キナーゼ活性を減少させることを示している。この効
果は、エキスタチンおよびＲＧＤ ＩＩでの処理により逆転するが、Ａｒｇ−Ｇ
ｌｙ−Ａｓｐ配列がＡｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐに変化している突然変異エキスタチ
ン（Ａｌａ２４エキスタチン（Ａｌａ２４Ｅｃｈｉ））では逆転しない。ヒトα
ｖβ３インテグリンを発現するＨＥＫ ２９３トランスフェクト体を、エキスタ
チン（３０ｎＭ、図５Ａ）またはＲＧＤ ＩＩ（１０μＭ、図５Ｂ）で０分間（
レーン１）、１０分間（レーン２）、２０分間（レーン３）、３０分間（レーン
４）および６０分間（レーン５）処理した。これらの処理は、Ｍｓｔ１（約５９
ｋＤａ）、Ｍｓｔ２（約６０ｋＤａ）および５０ｋＤａキナーゼの活性の増加を
もたらした。αｖβ３インテグリンをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞（
図５Ｄ、レーン１）と親ＨＥＫ２９３細胞（図５Ｄ、レーン２）との直接的な比
較は、αｖβ３インテグリンの過剰発現がＭｓｔ１、Ｍｓｔ２および５０ｋＤａ
キナーゼの基礎活性を減少させることを示している。エキスタチンまたはＲＧＤ ＩＩでの処理に応答して生じた図５Ａおよび５Ｂで認められる最大活性は、親
ＨＥＫ ２９３対照細胞において認められる基礎活性に匹敵する（図５Ｄ，レー
ン２、図５Ｅ，レーン１および図５Ｆ，レーン１）。トランスフェクト化細胞の
場合とは異なり、エキスタチンでの親ＨＥＫ２９３細胞の１０分間（レーン３）
、２０分間（レーン４）、３０分間（レーン５）または６０分間（レーン６）の
処理は、Ｍｓｔ１、Ｍｓｔ２および５０ｋＤａキナーゼの活性に対して有意な影
響を及ぼさなかった。エキスタチンの代わりにＲＧＤ ＩＩ（図５Ｅ）を１０分
間（レーン２）、２０分間（レーン３）、３０分間（レーン４）および６０分間
（レーン５）使用した場合に、同様の結果を得た。トランスフェクト化ＨＥＫ２
９３細胞（図５Ｃ）も親ＨＥＫ２９３細胞（図５Ｆ）も、Ａｌａ２４エキスタチ
ン（３０ｎＭ）での０分間（レーン１）、１０分間（レーン２）、３０分間（レ
ーン３）および６０分間（レーン４）の処理に応答しなかった。
【００２４】 図６は、アレンドロネート 一ナトリウム三水和物に対する３４ｋＤａキナー
ゼの優先的な応答を示す。破骨細胞様細胞を、３０μＭおよび１００μＭのアレ
ンドロネート 一ナトリウム三水和物、エチドロネート二ナトリウムまたはチル
ドロネート二ナトリウムで約１７時間処理した。ゲル内キナーゼアッセイを用い
て、キナーゼ活性を分析した。数日間のフィルム露出の後、オートラジオグラフ
が現像された。これらのデータは、３０μＭ（レーン３）または１００μＭ（レ
ーン４）のアレンドロネートによる３４ｋＤａキナーゼの活性化を示す。同等用
量のエチドロネート二ナトリウム（レーン５および６）またはチルドロネート二
ナトリウム（レーン７および８）は、このキナーゼを活性化せず、未処理対照（
レーン１および２）と同様であった。
【００２５】 図７は、３０μＭアレンドロネート 一ナトリウム三水和物での破骨細胞様細
胞の活性化に対する１０μＭゲラニルゲラニオールの効果を示す。レーン１は未
処理対照を示す。レーン２はアレンドロネートによる３４ｋＤａキナーゼの活性
化を示す。レーン３は、ゲラニルゲラニオールがこの活性化を打ち消すことを示
している。レーン４はゲラニルゲラニオールのみでの処理対照である。
【００２６】 図８は、３００μｍより大きな細胞（１つの寸法における測定）の形成に関す
る、１０、１５および６０μＭアレンドロネート 一ナトリウム三水和物、１０
μＭゲラニルゲラニオール、１ｍＭメバロネート、１０、１５および６０μＭア
レンドロネート 一ナトリウム三水和物と１０μＭゲラニルゲラニオールとの組
合せ、ならびに１０、１５および６０μＭアレンドロネート 一ナトリウム三水
和物と１ｍＭメバロネートとの組合せの、破骨細胞様細胞に対する効果を示す。
該化合物を該培養の樹立の５日後および６日後の両方の時点で与え、３００μｍ
の細胞の形成を、１０倍対物レンズを有する倒立顕微鏡を使用して計数し、未処
理対照に対して定量した。
【００２７】 図９は、アレンドロネート 一ナトリウム三水和物に対する３４ｋＤａキナー
ゼの優先的応答、およびアレンドロネート 一ナトリウム三水和物をカスパーゼ
阻害剤Ｚ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ２Ｆ（以下、Ｚ−ＶＡＤ−
ＦＭＫと称する）の存在下で破骨細胞を処理するために使用した場合に該アレン
ドロネート 一ナトリウム三水和物が３４ｋＤａキナーゼを活性化する能力を有
さないことを示す。破骨細胞様細胞を、１０μＭおよび３０μＭのアレンドロネ
ート 一ナトリウム三水和物で１７時間処理した。ゲル内キナーゼアッセイを用
いて、キナーゼの活性を分析した。数日間のフィルム露出の後、オートラジオグ
ラフが現像された。これらのデータは、１０μＭ（レーン２）または３０μＭ（
レーン３）のアレンドロネートによる３４ｋＤａキナーゼの活性化を示している
。アレンドロネートは、Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫの存在下で共インキュベート（ｃｏ
ｉｎｃｕｂａｔｅ）した場合（レーン８）には３４ｋＤａキナーゼを活性化しな
い。より高い用量のエチドロネート二ナトリウム（すなわち１００μＭ（レーン
４）および３００μＭ（レーン５））またはチルドロネート二ナトリウム（すな
わち１００μＭ（レーン６）および３００μＭ（レーン７））は、このキナーゼ
を活性化せず、未処理対照（レーン１）と同様であった。Ｊ．Ｄ．Ｇｒａｖｅｓ
ら，“Ｃａｓｐａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉ
ｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｂｙ ｔｈｅ ｍａｍｍａｌｉ
ａｎ Ｓｔｅ２−ｌｉｋｅ ｋｉｎａｓｅ Ｍｓｔ１”，Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊ ｏｕｒｎａｌ ，ｖｏｌ．１７，ｎｏ．８，ｐｐ．２２２４−２２３４（１９９８
）（その全体を参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい。
【００２８】 図１０は、アレンドロネート 一ナトリウム三水和物（３０μＭ）により活性
化された３４ｋＤａキナーゼの、Ｍｓｔのアミノ末端切断産物としての特定を示
す。破骨細胞様細胞を単離し、アレドロネート 一ナトリウム三水和物で処理し
た。細胞ライセートを、Ｍｓｔキナーゼのアミノ末端を認識する商業的に入手可
能な抗Ｍｓｔおよび抗Ｋｒｓ抗体のカクテルならびにプロテインＡ−アガロース
ビーズでの処理に付して、該サンプルからＭｓｔを免疫沈降させた。これらを、
ゲル内キナーゼアッセイを用いて分析した。これらのデータは、抗Ｍｓｔおよび
抗Ｋｒｓ抗体カクテルが、未処理破骨細胞（レーン２）およびアレンドロネート
処理破骨細胞（レーン３）において、完全長の５９および６０ｋＤａ Ｍｓｔキ
ナーゼならびに３４ｋＤａ Ｍｓｔキナーゼ切断産物を免疫沈降させることを示
している。抗Ｍｓｔおよび抗Ｋｒｓ抗体の不存在下では（レーン１）、キナーゼ
活性は全く免疫沈降しない。また、これらのデータは、抗Ｍｓｔおよび抗Ｋｒｓ
抗体カクテルにより免疫沈降する３４ｋＤａキナーゼがアレンドロネート 一ナ
トリウム三水和物により活性化されることを示している（レーン３）。
【００２９】 哺乳動物において破骨細胞の活性を抑制する（特に、骨粗鬆症を治療するため
の）いくつかの方法が公知である。これらの方法には、ビスホスホネート［例え
ば、アレンドロネート（特に、アレンドロネート 一ナトリウム三水和物）、シ
マドロネート、クロドロネート、チルドロネート、エチドロネート、イバンドロ
ネート、ネリドロネート、オルパンドロネート、リセドロネート、ピリドロネー
ト、パミドロネート、ゾレンドロネート、それらの医薬上許容される塩、および
それらの混合物］、エストロゲンなどのホルモン、カルシトニンなどの或る種の
ペプチドでの治療が含まれる。
【００３０】 本発明においては、これら及び他の物質での処理中に破骨細胞系において活性
が変化するキナーゼを特定するために、ゲル内キナーゼアッセイを用いるアプロ
ーチを採用した。哺乳類不妊２０様（Ｍｓｔ）キナーゼの２つのアイソフォーム
（Ｍｓｔ１およびＭｓｔ２）の同定ならびに３４ｋＤａキナーゼ、５０ｋＤａキ
ナーゼおよび１３０ｋＤａキナーゼの同定は、これらの薬物に応答するシグナル
伝達およびストレス応答経路の最初の読み出しをもたらした。この初期の研究は
、これらのキナーゼを活性化する有用な化合物の特定が可能であるという、およ
びそのようなアクチベーター化合物が、そのようなキナーゼにより媒介される病
態の治療または予防に有用であるという、予想外の知見につながった。
【００３１】 本発明においては、活性化されるキナーゼ、すなわち、Ｍｓｔ１、Ｍｓｔ２、
３４ｋＤａキナーゼ、５０ｋＤａキナーゼおよび１３０ｋＤａキナーゼを、実施
例２に示すとおり、ゲル内キナーゼアッセイで特定する。また、Ｍｓｔ１および
Ｍｓｔ２の更なる特定において、標準的な免疫沈降技術を用いている。本発明の
１つの態様は、これらのキナーゼを調節（好ましくは、活性化）する化合物の特
定のためのアッセイである。これは、推定活性修飾性化合物を、破骨細胞生成性
細胞培養と接触させ、該細胞培養物のキナーゼ活性を、そのキナーゼ活性を対照
細胞培養（すなわち、該活性修飾性化合物に接触していない細胞培養）と比較す
ることにより測定する工程を含む。当業者に公知の多種多様な細胞培養物を使用
することができる。好ましくは、該培養物は、破骨細胞生成性細胞培養物、精製
された破骨細胞、部分的に精製された破骨細胞、未精製の破骨細胞、精製された
破骨細胞前駆体、部分的に精製された破骨細胞前駆体、未精製の破骨細胞前駆体
、精製された破骨細胞様細胞、部分的に精製された破骨細胞様細胞、未精製の破
骨細胞様細胞、およびそれらの混合物よりなる群から選ばれる。好ましい細胞培
養物は、哺乳類骨髄細胞を含有するものである。例えば、マウス骨髄細胞とマウ
ス頭蓋冠骨芽細胞とを共存培養することにより得た精製された（すなわち、約８
０〜９０％）破骨細胞前駆細胞を使用することができる。あるいは、トリの骨に
由来する同様の細胞を使用することができる。
【００３２】 キナーゼ活性を測定するために、当業者に公知の多種多様な技術を用いること
ができる。好ましい方法は、適当な固定化キナーゼ基質の存在下でサンプルを電
気泳動に付し、その基質に対するキナーゼ活性を測定するゲル内キナーゼアッセ
イを含む。この方法は、複数のサンプルをアッセイし電気泳動されたキナーゼの
活性を迅速に定量するための簡便な技術を与える。
【００３３】 キナーゼ活性を定量するために用いうる他の技術には、免疫沈降、クロマトグ
ラフィー、所望のキナーゼの活性のみを保有させるための選択的阻害剤の添加、
および選択的基質の使用が含まれるが、これらに限定されるものではない。これ
らのアッセイにおいては、一般に、キナーゼの活性は、ゲル内ではなく溶液中で
アッセイされる。
【００３４】 哺乳類細胞においてストレス応答性キナーゼを調節するための方法 本発明はまた、Ｍｓｔ１、Ｍｓｔ２、３４ｋＤａキナーゼ、５０ｋＤａキナー
ゼおよび１３０ｋＤａキナーゼならびにそれらの組合せよりなる群から選ばれる
ストレス応答性キナーゼを哺乳類細胞において調節（例えば、活性化）するため
の方法に関する。これらの方法は、有機ビスホスホネート、エキスタチン、抗β
３インテグリンモノクローナル抗体、カルシトニン、３（Ｓ）−（２−（２−オ
キソ−３−（Ｓ）−［５，６，７，８−テトラヒドロ−［１，８］−ナフチリジ
ン−２−イルメチル）−アミノ］−ピロリジン−１−イル）−アセチルアミノ）
−４−キノリン−３−イル−酪酸三塩酸塩、（２−［Ｎ−（３，４，５，６−テ
トラヒドロピリミジン−２−イル）アミノ］エチルオキシフェン−４−イル）カ
ルボニル−２（Ｓ）−フェニルスルホンアミド−β−アラニンおよびそれらの混
合物の活性化量と該細胞とを接触させることを含む。
【００３５】 理論に拘束されるものではないが、該有機ビスホスホネートのサブクラスとし
て、該窒素含有ビスホスホネートは、タンパク質のプレニル化（最も重要なのは
ゲラニルゲラニル化）を阻害することにより作用すると考えられる。窒素含有ビ
スホスホネート（例えば、アレンドロネート、リセドロネートおよびパミドロネ
ート）は、３４ｋＤａ Ｍｓｔキナーゼの活性化を誘導する。クロドロネート、
およびより低度ではあるがエチドロネート（共に非窒素含有ビスホスホネート）
もまた、３４ｋＤａ Ｍｓｔキナーゼを誘導する。メバロン酸経路はロバスタチ
ンで阻害され、それによりイソプレニルおよびコレステロール前駆体の生成が遮
断されることが判明している。ロバスタチンでの１７〜２４時間の処理は３４ｋ
Ｄａ Ｍｓｔ１の活性を増加させ、このことは、タンパク質のプレニル化または
コレステロールの生合成の遮断がＭｓｔ１の切断を引き起こしうることを示して
いる。アレンドロネートおよびリセドロネートにより誘導されるＭｓｔ１切断は
、ゲラニルゲラニオールにより実質的に完全に阻止され、一方、ファルネソール
およびメバロン酸ラクトンは切断を約５０％減少させることが判明している。ロ
バスタチンの作用は、メバロン酸またはゲラニルゲラニオールにより遮断される
が、ファルネソールによっては遮断されない。クロドロネートの作用はゲラニル
ゲラニオールによっては遮断されず、このことは、クロドロネートがタンパク質
のプレニル化の阻害により作用するのではないことを示唆している。これらの知
見は、Ｍｓｔキナーゼが、精製された破骨細胞において窒素含有および非窒素含
有ビスホスホネートにより活性化されるストレス応答経路の一部をなすことを示
唆している。ゲラニルゲラニル化は、窒素含有ビスホスホネートの作用メカニズ
ムにおいては非常に重要な役割を果たすが、非窒素含有ビスホスホネートの作用
メカニズムにおいてはそうではないらしい。Ｍｓｔ１の切断は、アポトーシス、
細胞骨格および小胞輸送を調節する低分子量Ｇタンパク質を含む一群であるゲラ
ニルゲラニル化タンパク質の下流のカスパーゼにより媒介される。しかしながら
、窒素含有ビスホスホネートが、異なる作用メカニズムにより作用しうるとして
も、これらの知見は、何ら、本発明をそのようなビスホスホネートに限定するも
のではない。
【００３６】 有機ビスホスホネート 本発明の方法および組成物は、活性なビスホスホネートを含むものであっても
よい。本発明のビスホスホネートは、化学式
【００３７】
【化１】
【００３８】 （式中、ｎは０〜７の整数であり、ＡおよびＸは、独立して、Ｈ、ＯＨ、ハロゲ
ン、ＮＨ２、ＳＨ、フェニル、Ｃ１−Ｃ３０アルキル、Ｃ３−Ｃ３０分枝状また
はシクロアルキル、Ｃ１−Ｃ３０置換アルキル、Ｃ１−Ｃ１０アルキルで置換さ
れたＮＨ２、Ｃ３−Ｃ３０分枝状またはシクロアルキルで置換されたＮＨ２、Ｃ
１−Ｃ１０ジアルキルで置換されたＮＨ２、Ｃ３−Ｃ３０分枝状またはシクロア
ルキルでジ置換されたＮＨ２、Ｃ１−Ｃ１０アルコキシ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル
で置換されたチオ、チオフェニル、ハロフェニルチオ、Ｃ１−Ｃ１０アルキルで
置換されたフェニル、ピリジル、フラニル、ピロリジニル、イミダゾリル、イミ
ダゾピリジニルおよびベンジルよりなる群から選ばれ、ｎが０の場合には、Ａお
よびＸは共に、ＨまたはＯＨからは選ばれない；あるいは、ＡおよびＸは、それ
らが結合している炭素原子と一緒になって、Ｃ３−Ｃ１０環を形成している）に
対応する。
【００３９】 前記化学式においては、該アルキル基は、該化学式に十分な原子が選ばれる場
合には、直鎖状、分枝状または環状となりうる。該Ｃ１−Ｃ３０置換アルキルに
は、多種多様な置換基が含まれうる。その非限定的な具体例には、フェニル、ピ
リジル、フラニル、ピロリジニル、イミダゾニル、ＮＨ２、Ｃ１−Ｃ１０アルキ
ルまたはジアルキル置換ＮＨ２、ＯＨ、ＳＨおよびＣ１−Ｃ１０アルコキシより
なる群から選ばれるものが含まれる。
【００４０】 前記化学式はまた、Ａおよび／またはＸ置換基に関して、複雑な炭素環、芳香
族およびヘテロ原子構造を含むと意図され、その非限定的な具体例には、ナフチ
ル、キノリル、イソキノリル、アダマンチルおよびクロロフェニルチオが含まれ
る。
【００４１】 本発明で有用な構造の非限定的なクラスは、Ａが、Ｈ、ＯＨおよびハロゲンよ
りなる群から選ばれ、Ｘが、Ｃ１−Ｃ３０アルキル、Ｃ１−Ｃ３０置換アルキル
、ハロゲン、およびＣ１−Ｃ１０アルキルまたはフェニルで置換されたチオより
なる群から選ばれ、ｎが０であるものである。
【００４２】 本発明で有用な構造の非限定的なサブクラスは、Ａが、Ｈ、ＯＨおよびＣｌよ
りなる群から選ばれ、Ｘが、Ｃ１−Ｃ３０アルキル、Ｃ１−Ｃ３０置換アルキル
、Ｃｌおよびクロロフェニルチオよりなる群から選ばれ、ｎが０であるものであ
る。
【００４３】 本発明で有用な構造のサブクラスの非限定的な具体例としては、ＡがＯＨであ
り、Ｘが３−アミノプロピル部分であり、ｎが０である場合に生じる化合物であ
る４−アミノ−１−，ヒドロキシブチリデン−１，１−ビスホスホネート（すな
わち、アレンドロネート）が挙げられる。
【００４４】 本発明においては、該ビスホスホネートの医薬上許容される塩および誘導体も
有用である。塩の非限定的な具体例には、アルカリ金属、アルカリ性金属、アン
モニウム、およびモノ−、ジ−、トリ−またはテトラ−Ｃ１−Ｃ３０−アルキル
−置換アンモニウムよりなる群から選ばれるものが含まれる。好ましい塩は、ナ
トリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムおよびアンモニウム塩よりなる
群から選ばれるものである。誘導体の非限定的な具体例には、エステル、水和物
およびアミドよりなる群から選ばれるものが含まれる。
【００４５】 本発明の治療剤に関して本発明で用いる「ビスホスホネート」なる語は、ジホ
スホネート、ビホスホン酸およびジホスホン酸ならびにこれらの物質の塩および
誘導体をも包含する意であることに注意すべきである。特に示さない限り、ビス
ホスホネートに関する特定の名称の使用は本発明の範囲を限定するものではない
。混合名称が当業者により現在使用されているため、本発明におけるビスホスホ
ネート化合物の特定の重量または割合に対する言及は、本明細書において特に示
さない限り、活性な酸の重量に基づくものである。例えば、「アレンドロネート
、その医薬上許容される塩およびその混合物よりなる群から選ばれるビスホスホ
ン酸約５ｍｇ」なる表現は、選ばれたビスホスホネート化合物の量が、アレンド
ロン酸（ａｌｅｎｄｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）５ｍｇに基づいて計算されることを
意味する。他のビスホスホネートに関しては、ビスホスホネートの量は、対応す
るビスホスホン酸に基づいて計算される。
【００４６】 本発明で有用なビスホスホネートの非限定的な具体例には以下のものが含まれ
る。
【００４７】 アレンドロン酸、４−アミノ−１−ヒドロキシブチリデン−１，１−ビスホス
ホン酸。
【００４８】 アレンドロネート（アレンドロネートナトリウムまたはアレンドロネート 一
ナトリウム三水和物としても公知である）、４−アミノ−１−ヒドロキシブチリ
デン−１，１−ビスホスホン酸 一ナトリウム三水和物。
【００４９】 アレンドロン酸およびアレンドロネートは、１９９０年５月１日付け発行のＫ
ｉｅｃｚｙｋｏｗｓｋｉらの米国特許第４，９２２，００７号、、１９９１年５
月２８日付け発行のＫｉｅｃｚｙｋｏｗｓｋｉらの米国特許第５，０１９，６５
１号、１９９６年４月２３日付け発行のＤａｕｅｒらの米国特許第５，５１０，
５１７号、１９９７年７月１５日付け発行のＤａｕｅｒらの米国特許第５，６４
８，４９１号（それらの全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に
記載されている。
【００５０】 １９９０年１１月１３日付け発行のＩｓｏｍｕｒａらの米国特許第４，９７０
，３３５号（その全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載さ
れているシクロヘプチルアミノメチレン−１，１−ビスホスホン酸，ＹＭ １７
５，Ｙａｍａｎｏｕｃｈｉ（シマドロネート）。
【００５１】 １，１−ジクロロメチレン−１，１−ジホスホン酸（クロドロニン酸）および
その二ナトリウム塩（クロロドロネート、Ｐｒｏｃｔｅｒ ａｎｄ Ｇａｍｂｌ
ｅ）は、ベルギー国特許第６７２，２０５号 （１９６６）およびＪ．Ｏｒｇ．
Ｃｈｅｍ ３２，４１１１ （１９６７）（それらの全体を参照により本明細書
に組み入れることとする）に記載されている。
【００５２】 １−ヒドロキシ−３−（１−ピロリジニル）−プロピリデン−１，１−ビスホ
スホン酸（ＥＢ−１０５３）。
【００５３】 １−ヒドロキシエタン−１，１−ジホスホン酸（エチドロン酸）。
【００５４】 １−ヒドロキシ−３−（Ｎ−メチル−Ｎ−ペンチルアミノ）プロピリデン−１
，１−ビスホスホン酸（ＢＭ−２１０９５５，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎ
ｈｅｉｍ（イバンドロネート）としても公知である）は、１９９０年５月２２日
付け発行の米国特許第４，９２７，８１４号（その全体を参照により本明細書に
組み入れることとする）に記載されている。
【００５５】 ６−アミノ−１−ヒドロキシヘキシリデン−１，１−ビスホスホン酸（ネリド
ロネート）。
【００５６】 ３−（ジメチルアミノ）−１−ヒドロキシプロピリデン−１，１−ビスホスホ
ン酸（オルパドロネート）。
【００５７】 ３−アミノ−１−ヒドロキシプロピリデン−１，１−ビスホスホン酸（パミド
ロネート）。
【００５８】 ［２−（２−ピリジニル）エチリデン］−１，１−ビスホスホン酸（ピリドロ
ネート）は、米国特許第４，７６１，４０６号（その全体を参照により本明細書
に組み入れることとする）に記載されている。
【００５９】 １−ヒドロキシ−２−（３−ピリジニル）−エチリデン−１，１−ビスホスホ
ン酸（リセドロネート）。
【００６０】 Ｂｒｅｌｉｅｒｅらの米国特許第４，８７６，２４８号（１９８９年１０月２
４日）（その全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されて
いる（４−クロロフェニル）チオメタン−１，１−ジホスホン酸（チルドロネー
ト）。
【００６１】 １−ヒドロキシ−２−（１Ｈ−イミダゾール−１−イル）エチリデン−１，１
−ビスホスホン酸（ゾレンドロネート）。
【００６２】 本発明で有用なビスホスホネートの非限定的なクラスは、アレンドロネート、
シマドロネート、クロドロネート、チルドロネート、エチドロネート、イバンド
ロネート、ネリドロネート、オルパンドロネート、リセドロネート、ピリドロネ
ート、パミドロネート、ゾレンドロネート、それらの医薬上許容される塩および
それらの混合物よりなる群から選ばれる。
【００６３】 この場合における前記クラスの非限定的なサブクラスは、アレンドロネート、
その医薬上許容される塩およびそれらの混合物よりなる群から選ばれる。
【００６４】 該サブクラスの非限定的な具体例としては、アレンドロネート 一ナトリウム
三水和物が挙げられる。
【００６５】 本発明を更に例示するために、以下に実施例を記載する。
【００６６】 実施例１ 骨髄／頭蓋冠細胞共存培養からの破骨細胞前駆体および破骨細胞様細胞の調製 以下の方法は、Ｗｅｓｏｌｏｗｓｋｉら（１９９５， Ｅｘｐ． Ｃｅｌｌ
Ｒｅｓ． ２１９：６７９−６８６；その全体を参照により本明細書に組み入れ
ることとする）の変法である。６週齢のマウスの脛骨および大腿骨からの骨髄細
胞を、ウシ胎仔血清（１０％）および１，２５ジヒドロキシビタミンＤ３（１０
ｎＭ）を含有するα−ＭＥＭ（最少必須培地）内の培養皿内に予め播かれたＭＢ １．８マウス頭蓋冠骨芽細胞の単層上に加えることにより、共存培養を調製す
る。培地を４８時間毎に交換しながら共存培養を６日間維持する。コラゲナーゼ
Ｉ（リン酸緩衝食塩水［ＰＢＳ］中１ｍｇ／ｍｌ）で共存培養を処理することに
より、非破骨細胞を除去する。ＰＢＳで洗浄することにより、コラゲナーゼ感受
性細胞を除去する。破骨細胞前駆体を、ＥＤＴＡ（ＰＢＳ中０．２ｇ／Ｌ）を使
用して該皿から拾い上げ、培養皿に移し、ウシ胎仔血清（１０％）、１，２５ジ
ヒドロキシビタミンＤ３（１０ｎＭ）およびｍ−コロニー刺激因子（５ｎｇ／ｍ
ｌ）を含有するα−ＭＥＭ内に維持する。元の共存培養皿に付着したままの破骨
細胞様細胞（コラゲナーゼ不感受性ＥＤＴＡ不感受性細胞）を、ウシ胎仔血清（
１０％）、１，２５ジヒドロキシビタミンＤ３（１０ｎＭ）およびｍ−コロニー
刺激因子（５ｎｇ／ｍｌ）を含有するα−ＭＥＭ内に維持する。
【００６７】 実施例２ 阻害剤での破骨細胞様細胞の処理に応答したＭｓｔ１、Ｍｓｔ２および５０ｋ Ｄａキナーゼにおける活性の変化を調べる方法 実施例１に記載のとおりに、破骨細胞前駆体を調製し、精製する。細胞を３７
℃で１〜２時間回収した後、細胞をエキスタチン（典型的には３０ｎＭであるが
、１ｐＭ〜１μＭの範囲を用いることができる）で処理する。未処理細胞を分析
に加え、キナーゼ活性に関する陰性対照として使用する。ついで細胞を収穫し、
ＨＥＰＥＳ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンス
ルホン酸））またはＴｒｉｓバッファー［以下を含有するもの：β−グリセロリ
ン酸（５０ｍＭ）；Ｎａ３ＶＯ４（１ｍＭ）；ＮａＦ（１ｍＭ）；ミクロシスチ
ンＬＲ（１μＭ）；ロイペプチン（１０μｇ／ｍｌ）；アプロチニン（１０μｇ
／ｍｌ）；フェニルメチルスルホニルフルオリド（１ｍＭ）］中で溶解する。タ
ンパク質濃度を各ライセートに関して測定し、５０〜４００μｇ／ｍｌの濃度で
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
）ゲル内に重合しているミエリン塩基性タンパク質またはその他のキナーゼ基質
を含有する該ゲルの各レーン内に、５〜２０μｇをローディングする。また、該
ゲルの１以上のレーン内に分子量標準をローディングする。Ｋａｍｅｓｈｉｔａ
およびＦｕｊｉｓａｗａ，１９８９（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８３：１３
９−１４３）ならびにＧｏｔｏｈら，１９９０（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
１９３：６６１−６６９）（それらの両方の参照文献の全体を参照により本明細
書に組み入れることとする）に基づく標準的な方法に従い、ゲル内キナーゼアッ
セイを行なう。該タンパク質を前記ゲル内で電気泳動する。ついで該ゲルを、順
次、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．６；５ｍＭ ２−メルカプトエタノールお
よび以下のそれぞれ（各洗浄用）に浸ける：（ａ）２０％イソプロパノール；（
ｂ）無添加；（ｃ）尿素（６Ｍ）；（ｄ）尿素（３Ｍ）；（ｅ）尿素（０．７５
Ｍ）；およびＴｗｅｅｎ ２０（０．０５％ ｖｏｌ：ｖｏｌ）。ついで、該ゲ
ルを、まず、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．６；２０ｍＭ ＭｇＣｌ２；２ｍ
Ｍ ＤＴＴ中に浸け、ついで約１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌの３２Ｐ−γ−ＡＴＰ
と共に０．０２Ｍ ＡＴＰ（非放射性）を含有する同じバッファー中に浸けるこ
とにより、キナーゼ反応を行なう。ついで該ゲルを５％トリクロロ酢酸および１
％ピロリン酸塩で６回洗浄する。ついで該ゲルを、５０％メタノール、１０％酢
酸中のクーマシーブリリアントブルー色素（０．１２５％）で染色し、３０％メ
タノール、１０％酢酸で脱染色し、２％グリセロールに浸け、ゲル乾燥器を使用
して乾燥する。ついで該ゲルを、数時間〜数週間、オートラジオグラフィーフィ
ルムにさらす。該ゲルを表すオートラジオグラフ中に認められるバンドは、キナ
ーゼの活性を反映している。それらの移動度を分子量標準の移動度と比べること
により、ＭｓｔＩ（見掛け分子量約５９ｋＤａ）、Ｍｓｔ２（見掛け分子量約６
０ｋＤａ）および５０ｋＤａキナーゼが観察され、同定される。オートラジオグ
ラフィーフィルム上のバンドの強度をデンシトメトリーにより定量する。未処理
対照からのバンドとエキスタチン処理細胞からのバンドとの比較は、該分析の基
礎を与える。
【００６８】 アレンドロネート、カルシトニン、抗β３インテグリンモノクローナル抗体、
ＲＧＤ ＩおよびＲＧＤ ＩＩについて、同様のアプローチを用いる。
【００６９】 また、３４ｋＤａキナーゼおよび１３０ｋＤａキナーゼに関してアッセイする
ために、同様のアプローチを用いる。
【００７０】 実施例３ 破骨細胞様細胞においてＭｓｔ１、Ｍｓｔ２、３４ｋＤａキナーゼ、５０ｋＤ ａキナーゼおよび１３０ｋＤａキナーゼを活性化する化合物を同定するための一 般的方法 実施例１に記載のとおりに、破骨細胞様細胞を調製する。評価する化合物を、
種々のいずれかの時間（１分間〜数時間）にわたり、所望の濃度で該破骨細胞様
細胞に加える。標準的な技術を用いて細胞ライセートを調製し、実施例２に記載
のとおりにゲル内キナーゼアッセイを行なう。破骨細胞の機能を阻害する化合物
を、それらがＭｓｔ Ｉ、Ｍｓｔ ２、３４ｋＤａキナーゼ、５０ｋＤａキナー
ゼおよび／または１３０ｋＤａキナーゼの活性を刺激する能力により同定する。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、抗β３インテグリンモノクローナル抗体（ｍＡｂ）およびエキスタチ
ンによるストレス応答性キナーゼの活性化に関する時間経過を示す。
【図２】 図２は、エキスタチンによる５０〜６０ｋＤａキナーゼの活性化に関する用量
反応関係を示す。
【図３】 図３は、哺乳類不妊２０様（Ｍｓｔ）キナーゼの２つのアイソフォームとして
の約６０ｋＤａキナーゼの二重線の特定を示す。
【図４】 図４は、エキスタチンＲＧＤ模擬体であるＲＧＤ Ｉ（１０ｎＭ）およびＲＧ
Ｄ ＩＩ（１０μＭ）によるＭｓｔ１、Ｍｓｔ２および５０ｋＤａキナーゼの活
性化を示す。
【図５ａ】 図５は、ＨＥＫ２９３細胞におけるαｖβ３インテグリンの発現が、Ｍｓｔ１
、Ｍｓｔ２および５０ｋＤａキナーゼの基礎キナーゼ活性を減少させることを示
している。
【図５ｂ】 図５は、ＨＥＫ２９３細胞におけるαｖβ３インテグリンの発現が、Ｍｓｔ１
、Ｍｓｔ２および５０ｋＤａキナーゼの基礎キナーゼ活性を減少させることを示
している。
【図６】 図６は、アレンドロネート 一ナトリウム三水和物に対する３４ｋＤａキナー
ゼの優先的な応答を示す。
【図７】 図７は、３０μＭアレンドロネート 一ナトリウム三水和物での破骨細胞様細
胞の活性化に対する１０μＭゲラニルゲラニオールの効果を示す。
【図８】 図８は、３００μｍより大きな細胞（１つの寸法における測定）の形成に関す
る、１０、１５および６０μＭアレンドロネート 一ナトリウム三水和物、１０
μＭゲラニルゲラニオール、１ｍＭメバロネート、１０、１５および６０μＭア
レンドロネート 一ナトリウム三水和物と１０μＭゲラニルゲラニオールとの組
合せ、ならびに１０、１５および６０μＭアレンドロネート 一ナトリウム三水
和物と１ｍＭメバロネートとの組合せの、破骨細胞様細胞に対する効果を示す。
【図９】 図９は、アレンドロネート 一ナトリウム三水和物に対する３４ｋＤａキナー
ゼの優先的応答、およびアレンドロネート 一ナトリウム三水和物をカスパーゼ
阻害剤Ｚ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ２Ｆ（以下、Ｚ−ＶＡＤ−
ＦＭＫと称する）の存在下で破骨細胞を処理するために使用した場合に該アレン
ドロネート 一ナトリウム三水和物が３４ｋＤａキナーゼを活性化する能力を有
さないことを示す。
【図１０】 図１０は、アレンドロネート 一ナトリウム三水和物（３０μＭ）により活性
化された３４ｋＤａキナーゼの、Ｍｓｔのアミノ末端切断産物としての特定を示
す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 9/00 Ａ６１Ｐ 9/00 9/10 9/10 19/10 19/10 27/02 27/02 29/00 29/00 35/00 35/00 43/00 １１１ 43/00 １１１ Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 33/50 33/50 Ｚ 33/68 33/68 (31)優先権主張番号 ９８０７９３６．１ (32)優先日 平成10年４月15日(1998．4．15) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ６０／０８５，４５２ (32)優先日 平成10年５月14日(1998．5．14) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ９８２３０８９．９ (32)優先日 平成10年10月21日(1998．10．21) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ６０／１０６，２８７ (32)優先日 平成10年10月30日(1998．10．30) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／１０８，３０６ (32)優先日 平成10年11月13日(1998．11．13) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＤ，ＧＥ，Ｈ Ｒ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 ロダン，ギデオン・エイ アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカー ン・アベニユー・126

Claims (14)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ａ）推定活性修飾化合物を細胞培養物と接触させること、 ｂ）該細胞培養物のキナーゼ活性を測定し、該キナーゼ活性を、該活性修飾お
    よび化合物に接触していない細胞培養物と比較すること を含んでなるストレス応答性キナーゼを活性化する化合物の特定方法。
  2. 【請求項２】 該ストレス応答性キナーゼが、Ｍｓｔ１、Ｍｓｔ２、３４ｋ
    Ｄａキナーゼ、５０ｋＤａキナーゼおよび１３０ｋＤａキナーゼならびにそれら
    の組合せよりなる群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 該細胞培養物が、破骨細胞生成性細胞培養物、精製された破
    骨細胞、部分的に精製された破骨細胞、未精製の破骨細胞、精製された破骨細胞
    前駆体、部分的に精製された破骨細胞前駆体、未精製の破骨細胞前駆体、精製さ
    れた破骨細胞様細胞、部分的に精製された破骨細胞様細胞、未精製の破骨細胞様
    細胞およびそれらの混合物よりなる群から選ばれる、請求項２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 該キナーゼ活性を、ゲル内キナーゼアッセイを用いて測定す
    る、請求項３に記載の方法。
  5. 【請求項５】 哺乳類細胞においてストレス応答性キナーゼを活性化する方
    法であって、該細胞を、請求項１に従い特定された化合物の活性化量と接触させ
    ることを含んでなる方法。
  6. 【請求項６】 哺乳動物においてストレス応答性キナーゼの活性化効果を惹
    起する方法であって、請求項１に従い特定された化合物の活性化量を該哺乳動物
    に投与することを含んでなる方法。
  7. 【請求項７】 ストレス応答性キナーゼに媒介される哺乳動物における疾患
    または状態の治療または予防方法であって、請求項１に従い特定された化合物の
    医薬上有効な量を該哺乳動物に投与することを含んでなる方法。
  8. 【請求項８】 哺乳動物における骨粗鬆症、血管再発性狭窄症、糖尿病性網
    膜症、黄斑変性、血管新生、アテローム性動脈硬化症、炎症または腫瘍増殖の治
    療または予防方法であって、請求項１に従い特定された化合物の医薬上有効な量
    を該哺乳動物に投与することを含んでなる方法。
  9. 【請求項９】 請求項１に従い特定された化合物。
  10. 【請求項１０】 請求項９に記載の化合物を含んでなる医薬組成物。
  11. 【請求項１１】 Ｍｓｔ１、Ｍｓｔ２、３４ｋＤａキナーゼ、５０ｋＤａキ
    ナーゼおよび１３０ｋＤａキナーゼならびにそれらの組合せよりなる群から選ば
    れるストレス応答性キナーゼを哺乳類細胞において活性化する方法であって、有
    機ビスホスホネート、エキスタチン、抗β３インテグリンモノクローナル抗体、
    カルシトニン、３（Ｓ）−（２−（２−オキソ−３−（Ｓ）−［５，６，７，８
    −テトラヒドロ−［１，８］−ナフチリジン−２−イルメチル）−アミノ］−ピ
    ロリジン−１−イル）−アセチルアミノ）−４−キノリン−３−イル−酪酸三塩
    酸塩、（２−［Ｎ−（３，４，５，６−テトラヒドロピリミジン−２−イル）ア
    ミノ］エチルオキシフェン−４−イル）カルボニル−２（Ｓ）−フェニルスルホ
    ンアミド−β−アラニンおよびそれらの混合物よりなる群から選ばれる化合物の
    活性化量と該細胞とを接触させることを含んでなる方法。
  12. 【請求項１２】 該有機ビスホスホネートが、アレンドロネート、シマドロ
    ネート、クロドロネート、チルドロネート、エチドロネート、イバンドロネート
    、ネリドロネート、オルパンドロネート、リセドロネート、ピリドロネート、パ
    ミドロネート、ゾレンドロネート、それらの医薬上許容される塩、およびそれら
    の混合物よりなる群から選ばれる、請求項１１に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 該有機ビスホスホネートがアレンドロネートおよびその医
    薬上許容される塩である、請求項１１に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 該有機ビスホスホネートがアレンドロネート 一ナトリウ
    ム三水和物である、請求項１１に記載の方法。
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