DE572378C

DE572378C - Process for the production of effective thyroid preparations by salting out aqueous thyroid extracts

Info

Publication number: DE572378C
Application number: DEI37255D
Authority: DE
Inventors: Dr Ferdinand Blum
Original assignee: IG Farbenindustrie AG
Current assignee: IG Farbenindustrie AG
Priority date: 1929-03-01
Filing date: 1929-03-01
Publication date: 1933-03-16

Description

Verfahren zur Herstellung wirksamer Schilddrüsenpräparate durch Aussalzen wäßriger Schilddrüsenextrakte Die Richtigkeit der Annahme, daß das von Kendall isolierte und von Harington synthetisierte Thyroxin das wirksamste Prinzip der Schilddrüse sei, ist in neuerer Zeit verschiedentlich angezweifelt worden. Dieser Zweifel ist dadurch begründet, daß es nicht gelang, mit Thyroxin die Gesamtheit der Wirkungen zu erzielen, welche von natürlichem Hormon hervorgerufen werden. Die volle Schilddrüsenwirkung besitzen bisher nur aus der Drüse gewonnene eiweißhaltige Präparate (Zeitschrift f. gesamt. exp. Med. 58, 624; Koch, Journal of Biol. Chem. i4., 10I), wie beispielsweise das Thyreoglobulin O s w a 1 d s , das wirksamste bisher bekannte Präparat.Process for the production of effective thyroid preparations by salting out Aqueous Thyroid Extracts The correctness of assuming that isolated by Kendall and thyroxine synthesized by Harington, the most potent principle of the thyroid gland has been questioned several times in recent times. This doubt is due to the fact that it did not succeed with thyroxine the totality of the effects to achieve which are caused by natural hormone. The full thyroid effect so far only have protein-containing preparations obtained from the gland (magazine f. total. exp. Med. 58, 624; Koch, Journal of Biol. Chem. I4., 10I), such as Thyroglobulin O s w a 1 d s, the most effective preparation known so far.

Unsere Versuche haben nun ergeben, daß aus diesem seit O s w a 1 d als einheitlich angesehenen, Thyreoglobulin benannten Produkt eine Isolierung verschiedener Eiweißkörper und damit Herausschälung der wirksamsten Substanzen gelingt, wenn mali nicht, wie seit O s w a 1 d üblich, mit gleichen oder mehreren Volumenteilen der gesättigten Salzlösung auf einmal oder, wie in der Patentschrift 183:211 beschrieben, kontinuierlich fällt, sondern den Schilddrüsenextrakt einer fraktionierten Behandlung mit insgesamt weniger als dem gleichen Volumen einer gesättigten Salzlösung in folgenderWeise unterwirft: Der wäßrige Schilddrüsenextrakt wird zunächst mit einer beschränkten Menge einer gesättigten wäßrigen Lösung eines leicht löslichen, eiweißaussalzenden Salzes, z. B. Ammoniumsulfat, gemischt, und zwar beispielsweise in dem Verhältnis, daß etwa 6o Volumenteile der Lösung auf je ioo Volumenteile des Extraktes kommen. Der Niederschlag wird z. B. durch Filtration abgetrennt und das Filtrat mit einer weiteren Menge Salzlösung versetzt, bis insgesamt etwa 8o Volumenteile Salzlösung auf roo Volumenteile Extrakt vorhanden sind. Hierbei entsteht eine weitere Fällung, die abfiltriert wird. Die erhaltenen Niederschläge werden einzeln durch Dialyse von den zur Fällung verwandten Salzen getrennt und gegebenenfalls durch Lösen, erneutes Fällen und Dialysieren, das wiederholt vorgenommen werden kann, weiter gereinigt. Aus der Lösung wird dann der wirksame Stoff in bekannter Weise, beispielsweise durch Verdampfen des Dialysates im Vakuum, isoliert. An Stelle einer gesättigtenAmmoniumsulfatlösung lassen sich auch gesättigte Lösungen anderer leichtlöslicher, zu Eiweißfällungen verwandter Salze, wie beispielsweise Zinksulfat, Dimethylaminchlorhydrat, Diäthylaminchlorhydrat, andere Di-, Tri- oder Tetraalkylammoniumsalze ti. dgl., verwenden. Die Wasserstoffionenkonzentration der Salzlösungen kann verschieden sein, doch arbeitet man zweckmäßig bei der in den Extrakten vorliegenden Konzentration.Our experiments have now shown that since O s w a 1 d as a uniform, thyroglobulin named product is an isolation of different Protein bodies and thus the most effective substances can be peeled off if mali not, as has been customary since O s w a 1 d, with the same or more parts by volume of the saturated saline solution at once or, as described in patent specification 183: 211, falls continuously, but the thyroid extract of a fractionated treatment with a total of less than the same volume of saturated saline solution in the following manner Subjects: The aqueous thyroid extract is initially restricted to a Amount of a saturated aqueous solution of a readily soluble, salting-out protein Salt, e.g. B. ammonium sulfate, mixed, for example in the ratio that about 60 parts by volume of the solution come to every 100 parts by volume of the extract. The precipitate is z. B. separated by filtration and the filtrate with a a further amount of saline solution is added, up to a total of about 80 parts by volume of saline solution on roo parts by volume of extract are present. This creates another precipitate, which is filtered off. The precipitates obtained are individually dialyzed separated from the salts used for the precipitation and, if necessary, by dissolving again Felling and dialysis, which can be done repeatedly, further purified. The active substance is then extracted from the solution in a known manner, for example by Evaporation of the dialysate in vacuo, isolated. Instead of a saturated ammonium sulfate solution Saturated solutions of other easily soluble solutions can also be converted into protein precipitates related salts, such as zinc sulfate, dimethylamine chlorohydrate, diethylamine chlorohydrate, other di-, tri- or tetraalkylammonium salts ti. Like., Use. The hydrogen ion concentration the salt solutions can be different be, but one works purposefully at the concentration present in the extracts.

Es ist vorteilhaft, die Salzlösung zu dem Schilddrüsenextrakt zunächst nur in solchen Mengen zuzusetzen, daß die untere Fällungsgrenze des zuerst ausfallenden Eiweißkörpers gerade erreicht wird; dies ist z. B. bei Zugabe von etwa 4o bis 45 Volumenteilen gesättigter Ammoniumsulfatlösung zu ioo Volumenteilen Extrakt der Fall. Hierbei scheiden sich feste Teile ab, welche hauptsächlich aus Verunreinigungen bestehen und die leicht entfernt «-erden können, so daß auf diese Weise vermieden werden kann, daß diese Verunreinigungen bei der eigentlichen Eiweißfällung in den Niederschlag mitgerissen werden.It is beneficial to add the saline solution to the thyroid extract first only to be added in such amounts that the lower precipitation limit of the first precipitated Protein body is just reached; this is e.g. B. when adding about 4o to 45 Parts by volume of saturated ammonium sulfate solution to 100 parts by volume of extract Case. Solid parts are separated out, which are mainly made up of impurities and which can easily be removed, so that in this way avoided can be that these impurities in the actual protein precipitation in the Precipitation will be carried away.

Die erhaltenen Produkte unterscheiden sich, abgesehen von ihren voneinander verschiedenen Fällungsgrenzen, insbesondere in ihrem Jodgehalt. Beispielsweise beträgt der Jodgehalt der einzelnen Fraktionen bei Verwendung verschiedener Ausgangsmaterialien: Ausgangsmaterial 1. Fraktion Il. Fraktion Schweinedrüsen .... 0,54 0,34 Schweinedrüsen .... 0,59 0,35 Hammeldrüsen .... 1,0 o,61 Hammeldrüsen .... 0,82, o,63 Hammeldrüsen .... 0,73 0,48 Bezüglich der Wirksamkeit dieser Fraktionen haben vergleichende Versuche ergeben, daß im Stoffwechselversuch die erste Fraktion das Thyroxin,- auf gleichen Jodgehalt berechnet, bei weitem übertrifft; auch ist der Einfluß auf die Metamorphose, z. B. der Feuersalamanderlarve, bei der ersten Fraktion stärker als bei der zweiten Fraktion oder bei Thyroxin, so daß durch die Ausschaltung der geringer wirksamen und jodärmeren zweiten Fraktion aus dem Schilddrüsenjodeiweiß ein Körper herausgeschält werden - konnte, der eine wesentliche Verbesserung in seiner Wirkung gegenüber den früher durch eine Gesamtfällung des Thyreoglobulins erhaltenen Präparaten zeigt.The products obtained differ, apart from their different precipitation limits, in particular in their iodine content. For example, when using different starting materials, the iodine content of the individual fractions is: Source material 1st parliamentary group Il. fraction Pig glands .... 0.54 0.34 Pig glands .... 0.59 0.35 Mutton glands .... 1.0 o, 61 Mutton glands .... 0.82, o.63 Mutton glands .... 0.73 0.48 With regard to the effectiveness of these fractions, comparative tests have shown that in the metabolism test the first fraction far exceeds thyroxine, calculated on the same iodine content; also the influence on the metamorphosis, z. B. the fire salamander larva, with the first fraction stronger than with the second fraction or with thyroxine, so that by eliminating the less effective and iodine-poor second fraction from the thyroid iodine protein a body could be peeled out, which a substantial improvement in its effect compared to the shows preparations previously obtained by total precipitation of thyroglobulin.

Aus den Angaben der Patentschrift 183:2 r r war kein Hinweis darauf zu entnehmen, daß durch fraktionierte Fällung eines in üblicher Weise durch Extraktion der fein zerkleinerten Drüsen mit Wasser hergestellten Schilddrüsenextraktes verschiedene Fraktionen des Schilddrüsenjodeiweißes erhältlich sein würden. Denn die in der genannten Patentschrift gemachten Angaben beziehen sich auf die Lösung eines auf besonderem Wege hergestellten Präparates, welches durch Diffusion des Zellinhaltes durch das möglichst intakte Drüsengewebe gewonnen wird und dessen untere Fällungsgrenze für Ammoniumsulfat bereits wesentlich höher liegt als die obere Fällungsgrenze eines gewöhnlichen Schilddrüsenextraktes, wie er nach dem vorliegenden Verfahren verarbeitet wird. Beispiele r. In üblicher Weise gewonnene Schilddrüsenextrakte, z. B. durch Verwendung von 151 Wasser auf iooo zerkleinerte Drüsen, werden, nachdem ihre Wasserstoffionenkonzentration bestimmt ist, mit auf eine gleiche Wasserstoffionenkonzentration eingestellter gesättigter Ammoniumsulfatlösung im Verhältnis 4.5 Volumenteile auf ioo Volumenteile Extraktlösung versetzt; die hierbei leicht abtrennbar gewordenen Suspensoide, z. B. Zelltrümmer oder ähnliches, werden durch Abzentrifugieren entfernt. Zum klaren Filtrat wird so viel Ammoniumsulfatlösung gegeben, daß auf ioo Teile Stammlösung insgesamt 6o Volumenteile Ammoniumsulfatlösung kommen. Nach Abtrennung des hierbei entstehenden Niederschlages des wirksamen Körpers erhöht man im Filtrat die Ammoniumsulfatkonzentration auf 8o Volumenprozent (gesättigterLösung pro Stammlösung) und trennt den weiter entstandenen Niederschlag ab. Die einzelnen so gewonnenen Niederschläge werden durch Dialyse unter Verwendung von beliebigen Membranen, z. B. von Schweinsblasen, Pergament oder Cellulosehydratfolien, vom Ammoniumsülfat befreit, und aus den so gereinigten Lösungen werden die wirksamen Substanzen in bekannter Weise isoliert.From the information in patent specification 183: 2 rr there was no indication that various fractions of thyroid iodine protein could be obtained by fractional precipitation of a thyroid extract prepared in the usual way by extraction of the finely ground glands with water. This is because the information given in the cited patent relates to the solution of a preparation produced in a special way, which is obtained by diffusion of the cell content through the glandular tissue that is as intact as possible and whose lower precipitation limit for ammonium sulfate is already significantly higher than the upper precipitation limit of an ordinary thyroid extract, how it is processed according to the present process. Examples r. Thyroid extracts obtained in a conventional manner, e.g. B. by using 151 water to 10000 crushed glands, after their hydrogen ion concentration has been determined, mixed with saturated ammonium sulfate solution adjusted to the same hydrogen ion concentration in a ratio of 4.5 parts by volume to 100 parts by volume of extract solution; the suspensoids that have become easily detachable here, e.g. B. cell debris or the like are removed by centrifugation. Sufficient ammonium sulphate solution is added to the clear filtrate that there are a total of 60 parts by volume of ammonium sulphate solution for every 100 parts of stock solution. After separating off the precipitate of the active body formed in this way, the ammonium sulfate concentration in the filtrate is increased to 80 percent by volume (saturated solution per stock solution) and the precipitate formed is separated off. The individual precipitates obtained in this way are subjected to dialysis using any membrane, e.g. B. of pork bladders, parchment or cellulose hydrate films, freed from ammonium sulphate, and the active substances are isolated in a known manner from the solutions purified in this way.

2. 2o kg Schilddrüsen werden mit 401 Wasser bei Zimmertemperatur mehrere Stunden extrahiert. Durch Colieren wird ein trüber Saft gewonnen, der in der Zentrifuge geklärt wird. Dieser Saft wird mit neutraler' gesättigter Ammoniumsulfatlösung gefällt. Zunächst werden je nach Ausfall des Vorversuches 4o bis 45 Teile Lösung zu ioo Teilen Extrakt gegeben und die hierbei sich abscheidenden Verunreinigungen entfernt. Im Filtrat wird die Konzentration der Salzlösung so weit erhöht, daß insgesamt 6o Volumenteile gesättigter Ammoniumsulfatlösung auf ioo Teile Stammextrakt vorhanden sind. Der so erhaltene Niederschlag wird durch Dialyse, Umfällen und erneute Dialyse gereinigt und schließlich- aus dem Dialysat durch Fällung oder Eindampfen zur Trockne gebracht. Im Filtrat der Fällung mit 6o Volumenteilen Ammoniumsulfat bleiben noch Anteile des Jodeiweißes zurück, die weniger wirksam sind und die durch Erhöhung des Aminoniuinsulfatzusatzes auf etwa 8o Volumenteile gefällt werden können.2. 20 kg of thyroid glands become several with 40 liters of water at room temperature Hours extracted. A cloudy juice is obtained by coling, which in the centrifuge is clarified. This juice is precipitated with neutral, saturated ammonium sulfate solution. First, depending on the failure of the preliminary test, 40 to 45 parts of solution become 100 parts Given the extract and the impurities that are deposited in the process are removed. in the In the filtrate, the concentration of the salt solution is increased so that a total of 60 parts by volume saturated ammonium sulfate solution to 100 parts of the stock extract. Of the The precipitate obtained in this way is purified by dialysis, reprecipitation and renewed dialysis and finally - brought to dryness from the dialysate by precipitation or evaporation. In the filtrate from the precipitation with 60 parts by volume of ammonium sulphate, fractions still remain of iodine protein, which are less effective and which are caused by increasing the Aminoniuinsulfate additive can be precipitated to about 8o parts by volume.

3. 5 kg gefrorene Hammelschilddrüsen werden nach dem Mahlen mit io 1 Wasser von ungefähr io° unter Rühren einige Stunden extrahiert. Durch Colieren und Zentrifugieren wird der Extrakt gereinigt und mit gesättigter Zinksulfatlösung bis zum Beginnen der Niederschlagsbildung versetzt. Die sich abscheidenden Zellreste werden entfernt und dann zur Lösung erneut Zinksulfat hinzugefügt, so daß jetzt auf ioo Teile Stammlösung insgesamt 7o Teile Zinksulfatlösung kommen; der hierbei erhaltene Niederschlag wird isoliert. Nach Waschen, Dialyse und Umfällung bringt man die Substanz zur Trockne. Im Filtrat bleiben jodärmere und weniger wirksame Produkte zurück.3. 5 kg of frozen mutton thyroid glands are ground with io 1 water of about 10 ° extracted with stirring for a few hours. By Colieren and centrifugation, the extract is purified and washed with saturated zinc sulfate solution staggered until precipitation begins. The cell debris that is deposited are removed and then zinc sulfate added again to the solution so that now For every 100 parts of stock solution there are a total of 70 parts of zinc sulphate solution; the one here obtained precipitate is isolated. After washing, dialysis and reprecipitation brings to dry the substance. Less iodine and less effective remain in the filtrate Products back.

.4. 2o kg Schweineschilddrüsen ,werden einmal mit 4.01 Wasser, dann noch mit 2o 1 Wasser bei Temperaturen unter 15' extrahiert. Die Extrakte werden mit einer Lösung von Dimethylaminchlorhydrat in Wasser (4 : i) in der Weise versetzt, daß zunächst 2o Teile Lösung zu ioo Teilen Extrakt hinzugefügt «,erden. Die geringe Abscheidung von Verunreinigungen wird entfernt, und nun wird zum Filtrat so viel. Salzlösung hinzugefüg , daß insgesamt 6o Teile der konzentrierten Dimethylaminchlorhydratlösung auf ioo Teile Stammextrakt vorhanden sind. Die so gewonnene Fraktion des Thyreoglobulins wird isoliert. 5. 2o kg Rinderschilddrüsen werden mit kochsalzhaltigem Wasser wie in Beispiel 3 extrahiert und mit einer konzentrierten Lösung von Diäthylaminchlorhy drat versetzt. Die Abscheidung, die bei Zusatz von 2o bis 25 Teilen der Salzlösung eintritt, wird entfernt, zum Filtrat so viel der konzentrierten Salzlösung hinzugefügt, daß 7o Teile konzentrierter Lösung pro ioo Teile Stammextrakt zugegen sind und die Fällung wie oben beschrieben gereinigt und zur Trockne gebracht..4. 2o kg of pork thyroid gland, once with 4:01 of water, then extracted with 2o 1 water at temperatures below 15 '. The extracts are a solution of dimethylamine chlorohydrate in water (4: i) is added in such a way that that at first 20 parts of solution are added to 100 parts of extract ", earth. The minor one Separation of impurities is removed, and now there is so much of the filtrate. Brine added that a total of 60 parts of the concentrated dimethylamine chlorohydrate solution there are 100 parts of the stem extract. The fraction of thyroglobulin obtained in this way is isolated. 5. 2o kg of bovine thyroid glands are treated with saline water like extracted in Example 3 and treated with a concentrated solution of diethylamine chlorhy drat offset. The deposition that occurs with the addition of 2o to 25 parts of the saline solution enters, is removed, so much of the concentrated salt solution is added to the filtrate, that 70 parts of concentrated solution per 100 parts of stock extract are present and the Precipitation cleaned as described above and brought to dryness.

Claims

PATENT CLAIMS: i. Process for the production of effective thyroid preparations by salting out aqueous thyroid extracts, characterized in that the aqueous extract is subjected to a fractional precipitation with a total of less than the same volume of a saturated aqueous salt solution, preferably ammonium sulfate.

2. Embodiment of the method according to claim i, characterized in that one the aqueous extract first with a limited amount of saturated salt solution up to the beginning of the protein precipitation, which separates out in the process separates solid parts and then subjects the filtrate to fractional precipitation.