DE866984C

DE866984C - Process for the production of protein-cholesterol compounds or their solutions

Info

Publication number: DE866984C
Application number: DESCH2065D
Authority: DE
Inventors: Adolf Dr Butenandt; Manfred Dr Oberdoerffer
Original assignee: Schering AG
Current assignee: Bayer Pharma AG
Priority date: 1940-06-13
Filing date: 1940-06-13
Publication date: 1953-02-12

Description

Verfahren zur Herstellung von Eiweiß-Cholesterin-Verbindungen bzw. deren Lösungen Es ist bekannt, daZ man wäßrige oder Pufferlösungsextrakte von Organen oder Körperfliissigli#citen bzw. Zubereitungen, wie Organbrei, mit Neutralsalzen fäll-en kann, um aus der Fällung oder aus dem Filtrat therapeutisch wertvolle- Substanzen zu isolieren. So hat man beispielsweise Hormone, Fermente, Antigene und Antikörper nach solchen Verfahren in weitgehend gereinigtem Zustand hergestellt.Process for the production of protein-cholesterol compounds or Their solutions It is known that aqueous or buffer solution extracts from organs are used or body fluids or preparations, such as organ pulp, with neutral salts Can precipitate in order to obtain therapeutically valuable substances from the precipitation or from the filtrate to isolate. For example, you have hormones, ferments, antigens and antibodies manufactured in a largely purified state using such processes.

Nach dem Stande der Technik war jedoch nicht bekannt, daß# man nach den oben angegebenen Verfahren die neue Körperklasse der Cholesterin-Eiweiß-Verbindungen erhalten kann.However, it was not known in the prior art that # one was after the method given above the new body class of cholesterol-protein compounds can get.

Es wurde gefunden, daß, man therapeutisch wertvolle Eiweiß#Cholesterin-Verbindungen bzw. deren Lösungen gewinnen kann, wenn man frische, eingefrorene oder getrocknete Organe oder Körperflüssigkeiten, die den Cholesterin-Eiweiß-Komplex enthalten"einer schon.endenExtraktion mitUsungsmitteln, die das Eiweiß nicht zu denaturieren vermögen, z. B. mit Wasser, bzw. Pufferlösungen unterwirft, wobei es empfehlenswert ist, daß der pH-Wert der Lösungen um den Neutralpunkt, also bei etwa 7 liegt. Man kann gegebenenfalls auch bei Auswahl geeigneter Lösungsmittel unter schwach sauren bzw. schwach alkalischen Bedingungen arbeiten. Das Optimum des p1,-Wertes der Lösungen liegt jedoch etwa zwischen 6 und 7,6. Es ist von Vorteil, wenn möglichst frische Organe zur Anwendung kommen. Als Ausgangsstoffe kommen insbesondere Nebennieren und Lebern, ferner Serum in Betracht. Derartige Organe sind z. B. von Warmblütern, wie Rindern, Pferden, Schafen, Schwein-en, Kaninchen usw., gut zugänglich. Außer den genannten Organen sind auch andere Organe verwendbar, und zwar läßt sich innerhalb einer Eiweißumfällungsserie durch den Hämolysehemmungstest verfolgen, ob die Organe zur Gewinnung des Cholesterin-Eiweiß#Komplexes geeignet sind. Auch menschliche I"'-örperflüssigMten können verwendet werden. Die Organe werden zweckmäßig in möglichst fein zerkleinertem Zustande angewandt und der erhaltene Brei gründlichst mit Wasser bzw. der Pufferlösung z. B. durch niehrstiindige Behandlung auf einem Schüttelapparat kalt extrahiert. Unter Umständen kann auch die Aufarbeitung bei Zimmertemperatur oder sogar bei Körpertemperatur vorteilhaft sein.It has been found that therapeutically valuable protein cholesterol compounds or their solutions can be obtained if fresh, frozen or dried organs or body fluids which contain the cholesterol-protein complex are extracted with solvents which contain the protein not able to denature, for example with water or buffer solutions, whereby it is recommended that the pH of the solutions is around the neutral point, i.e. around 7. If appropriate, one can also choose a suitable solvent under weakly acidic or slightly alkaline conditions. The optimum p1, value of the solutions is, however, between 6 and 7.6. It is advantageous if the organs that are used are as fresh as possible Such organs are readily accessible, for example, from warm-blooded animals such as cattle, horses, sheep, pigs, rabbits, etc. Except for those mentioned Other organs can also be used in organs, namely within a series of protein precipitation, the hemolysis inhibition test can be used to determine whether the organs are suitable for obtaining the cholesterol-protein complex. Human body fluids can also be used. The organs are expediently used in as finely crushed a state as possible and the resulting pulp is extracted very thoroughly with water or the buffer solution, e.g. by intensive treatment on a shaker Working up at room temperature or even at body temperature may be beneficial.

Als Pufferlösungen kommen z. B. 1/1o-inolare Phosphat-, Zitrat- oder Veronal-Puffer nach Michaelis in Betracht, wobei sich die genannten drei Pufferlösungen bei einem pli-Wert von 7 als gleichwertig erwiesen- haben. Ein Wechsel der Pufferlösungen, fälls die Behandlung der Fä4lungen mit den Puffergemischen wiederholt wird, ist gegeilüber der Beibehaltung eines Puffers ohne Bedeutung, jedoch erweist sich der pH-Wechsel mit den Pufferlösungen, z. B. den Phosphatpufferlö#ungen Pii 6,4, 7,0 und 7,6, innerhalb einer Fällungsserie als günstig, wobei es allerdings gleichgültig ist, in welcher Reihenfolge. die Lösungen mit den verschiedenen pn-Werten angewendet werden.As buffer solutions come z. B. 1 / 1o-inolar phosphate, citrate or veronal buffer according to Michaelis into consideration, the three buffer solutions mentioned have proven to be equivalent with a pli value of 7. Changing the buffer solutions, if the treatment of the precipitates with the buffer mixtures is repeated, is irrelevant compared to maintaining a buffer, but the pH change with the buffer solutions, e.g. B. the phosphate buffer solutions Pii 6.4, 7.0 and 7.6, within a series of precipitation as favorable, although it does not matter in which order. the solutions with the different pn values are applied.

Die f#Ür die Extraktion der Organe verwendeten Lösungen werden zweckmäßlIig mit einem geeigneten Desinfektionsmittel, beispielsweise - mit Phenylmercurinitrat in Verdünnung i : i ooo ooo, versetzt.The f # Ür the extraction of the organs solutions used are zweckmäßlIig with a suitable disinfectant, for example - with i phenylmercuric in dilution: offset i ooo ooo.

Mitunter ist es empfehlenswert, den Extraktionsflüssigkeiten wie den Pufferlösungen noch geeignete wasserlösliche organische Lösungsmittel,zuzusetzen, Z. B. Alkohol, Glycerin, Glykol, Dioxan u. dgl. Derartige Zusätze wendet man zweckmäßig in einer Menge von -nicht über io % der Pufferlösung an. Nach Entfernung der festen P rtik##l"b-eispielsweis-c durch Gießen der Flüssigkeitdurch ein grobes Sieb, wird die erhaltene Lösung mit einem neutralen Eiweißfällungsmittel, das in der Hauptsache den Eiweifl-Cholesterin-Komplex re!versibel fällt, behandelt, z. B. mit Ammoniumsulf at ausgesalzen, und die FlÜssigkeit nach mehrstütdigem Stehenlassen von den ausgeschiedenen Stoff-en z. B. durch Zentrifugieren abgetrennt. Diese letzteren können dann erneut durch Wiederaufnehmen, z. B. in Pufferlösungen, wobei das wirksame Prinzip in Lösung geht, ul während die Verunreinigungen zurückbleiben, und weiteres Umfällen gereinigt werden. Toxische wasserlösliche Bestandteile, die im Substrat je nach den zur Anwendung kommenden Organen vorhanden sein können, z. B. Adrenalin in der Nebenniere, Histamin z. B. in der Lunge, können in geeigneter Weise zweckmäßig durch Dialyse mittels Phosphatpuffer Pii 7 von mindestens 1/lou Molarität entfernt werden.It is sometimes advisable to add suitable water-soluble organic solvents to the extraction liquids such as the buffer solutions, e.g. alcohol, glycerine, glycol, dioxane and the like . After removing the solid p rtik ## l "b-for example-c by pouring the liquid through a coarse sieve, the solution obtained is treated with a neutral protein precipitating agent, which mainly reversibly precipitates the protein-cholesterol complex, e.g. Salted out with ammonium sulfate, for example, and the liquid, after standing for several hours, is separated from the excreted substances, e.g. by centrifugation.The latter can then be taken up again, e.g. in buffer solutions, the effective principle going into solution , ul while the impurities remain, and further reprecipitation is purified.Toxic water-soluble components which may be present in the substrate depending on the organs used, e.g. adrenaline in the adrenal gland, histamine e.g. in the lungs in a suitable manner expediently removed by dialysis using phosphate buffer Pii 7 of at least 1 / lou molarity.

Gegebenenfalls kann man auch in der Weise die Eiweiß-Cholesterin-Verbindungen isolieren, daß man aus dem Organbrei erst den Eiweißkomplex mit den beschriebenen Eiweißfällungsmitteln ausfällt und nunmehr die Eiwei(3-Cholesterin-Verbindäng aus den ausgefallenen Anteilen eluiert.If necessary, one can also use the protein-cholesterol compounds in the same way isolate that from the organ pulp you first get the protein complex with the described Protein precipitants fail and now the protein (3-cholesterol compounds the precipitated fractions eluted.

Die zur Ausfällung benötigten Ammonsulfatkonzentrationen liegen vorzugsweise zwischen 5 und 30 0/0. The ammonium sulfate concentrations required for precipitation are preferably between 5 and 30%.

Es wurde weiterhin gefunden, daß man die Abscheidung der Eimeiß#-Cholesterin-Verbindungen nicht nur durch Aussalzen, sondern auch in anderer Weise, z. B. durch geeignete Adsorptionsmittel, bewirken kann, wobei jedoch wiederum solche mit starker saurer oder alkalischer Reaktion nicht verwendbar sind. Weiterhin kann auch die Abscheidung in der Weise vollzogen -,verden, daß die abzuscheidende Verbindung in geeignete schwer- oder unlösliche Salze, z. B. in Erdalkalimetall- oder Schwerrnetallsalze übergeführt wird, die dann in bekannter Weise wieder zerlegbar sind, sa daß der metallfreie Eiweiß-Cholesterin-Komplex zurückerhalten wird.It has also been found that the deposition of the Eimeiß # cholesterol compounds not only by salting out, but also in other ways, e.g. B. by suitable Adsorbents, can effect, but in turn those with more acidic or alkaline reaction are not usable. Furthermore, the deposition carried out in such a way - verden that the connection to be separated in suitable poorly soluble or insoluble salts, e.g. B. in alkaline earth metal or heavy metal salts is transferred, which can then be dismantled again in a known manner, sa that the metal-free protein-cholesterol complex is recovered.

Endlich kann man auch aus den Organextrakten bzw. den Körperflüssigkeiten die neben der Eiweiß-Cholesterin-Verbindung enthaltenen Verunreinigungen bzw. schädlichen Stoffe fraktioniert ausfällen, so daißt die gesuchte Verbindung in Lösung bleibt. Gegegenenfalls können auch beide Verfahren miteinander kombiniert werden.Finally one can also use the organ extracts or the body fluids the impurities or harmful substances contained in addition to the protein-cholesterol compound Fractional precipitate substances, so that the sought-for compound remains in solution. If necessary, both methods can also be combined with one another.

Der Wirkungsgrad des erhaltenen Substrates kann im Leittest an der hämolysehemmenden Wirkung der Verbindung auf Saponine, z. B. Digitonin, abgelesen werden.The efficiency of the substrate obtained can be tested in the lead test on the hemolysis-inhibiting effect of the compound on saponins, e.g. B. Digitonin, read will.

Die Lösung der letzten Fällung in einem für Injektionen geeigneten Lösungsmittel kann zur parenteralen Behandlung solcher Erkrankungen benutzt werden, für die Zusammenhänge mit der membranabdichtenden Wirkung der nach obigem Verfahren dargestellten Cholesterin-Eiweiß-Verbindung angenommen oder erwiesen sind, z. B. der Lepra und der Tuberkulose.The solution of the last precipitation in one suitable for injections Solvent can be used for the parenteral treatment of such diseases for the connections with the membrane-sealing effect of the above procedure shown cholesterol-protein compound are accepted or proven, z. B. leprosy and tuberculosis.

Die erhaltenen Cholesterin-Eiwei:1-Verbindungen sind sehr empfindliche Substanzen; so scheidet sich aus den Lösungen bereits bei 12stündiger Dialyse gegen fließendes oder stehendes Wasser Eiweiß aus, und die noch stark eiweißhaltige, wasserklare Lösung zeigt im Hemmungstest keine Wirksamkeit mehr, während das abgeschiedene Eiweiß, das sich weder in Wasser nochmit iizll", oder iizl" Phosphatpuffer VOM PH 7 in Lösung bringen lädt, in suspendierter Form positive Hemmungsreaktion gibt.The cholesterol protein: 1 compounds obtained are very sensitive substances; so protein separates from the solutions already after 12 hours of dialysis against flowing or standing water, and the water-clear solution, which still contains a lot of protein, no longer shows any effectiveness in the inhibition test, while the separated protein, which is neither in water nor with iizll ", or iizl" Bringing phosphate buffer VOM PH 7 into solution loads, in suspended form gives positive inhibition reaction.

Ebensowenig vertragen die verfahrensgemäß herzustellenden Verbindungen Erhitzen oder eine Behandlung mit Eiweiß1 denaturierenden organischen Lösungsmitteln, wie Alkohol. Aus ihren wäßrigen Lösungen werden sie bei Zusatz von Salzen, insbesondere Ammoniumsulfat, gefällt.The compounds to be produced in accordance with the process are just as ill tolerated Heating or treatment with protein1 denaturing organic solvents, like alcohol. From their aqueous solutions, they are in particular when salts are added Ammonium sulfate, precipitated.

Beispiel i Man nimmt ikg rohe, am besten nicht eingefrorene frische Nebennieren bzw. Leber und dWeht sie nach Zerschneiden durch den Fleischwolf. In der Schüttelflasche werden 3 1 m/,()-PhosphatpufferlÖsung vom Pii 7 zugegeben und im Schüttelapparat 8 Stunden geschüttelt. Das ganze Substrat wird durch ein Sieb gegossen und dann mit l/. des Volumens in Gramm mit reinem Ammonsulfat versetzt.Example i You take ikg raw, preferably not frozen fresh adrenal glands or liver and blow them through the meat grinder after cutting. 3 1 ml () phosphate buffer solution from the Pii 7 is added to the shaker flask and shaken in the shaker for 8 hours. The whole substrate is poured through a sieve and then with l /. of the volume in grams with pure ammonium sulfate.

Man läßt 3 Stunden stehen, zentrifugiert 4o Minuten, gießt den Flüssigkeitsrest ab und t> nimmt den Niederschlag mit 1 1 PR-7-Pufferlösung unter Umrühren auf. Darauf wird erneut 40 Minuten zentrifugiert, die Flüssigkeit abgegossen und mit 2oo - Ammonsulfat versetzt. Nach 3stündi-em Stehen wird wiederum 40 Minuten zentrifuglert, der Flüssigkeitsrest abgegossen und die Fällung mit 1000 ccm PH-7-Pufferlösung aufgenommen, .Nun wird gegen 10 1 Pii-7-Pufferlösung 12 Stunden dialysiert. Der Standardpufferlösung wird i : i ooo ooo Phenylquecksilbernitrat beigegeben.It is allowed to stand for 3 hours, centrifuged 4o minutes, pour off the liquid residue, and t> takes the precipitate with 1 1 PR-7 buffer solution while stirring on. Then 40 minutes is centrifuged again, drained the fluid and 2oo - added ammonium sulphate. After standing for 3 hours, centrifugation is carried out again for 40 minutes, the remainder of the liquid is poured off and the precipitate is taken up with 1000 cc of PH-7 buffer solution, then dialyzed against 1 0 1 of Pii-7 buffer solution for 12 hours. The default buffer solution is i: i ooo ooo added phenylmercuric.

Das letzte Substrat wird auf seine Hämolysehemmung wie folgt geprüft: In zehn kleine Röhrchen wird je i ccm einer O,oIprozenti,-en Lösung von Digitoiliii in physiologischer Kochsalzlösung pipettiert. Dazu werden von dem Substrat fallende Mengen pipettiert, und zwar i, o,8, o,6, o,.4, 0,2, o,i, o,o5 cem. Die Röhrchen werden geschüttelt und in den niedrigen Fraktionen mit physiologischer Kochsalzlösung zu 2 ccm aufgefüllt. Nach 2Stündigem Stehenlassen fügt man je Röhrchen i ccm einer 51/oigen Aufschwemmung von defibriniertem Hammelblut in physiologischer Kochsalzlösung zu. -Us Hemmungswert wird diejenige Substratmengeaii.gegeben. die eine sichtbare Hämolyse nicht mehr erl,zeillien läßt.The final substrate is tested for its Hämolysehemmung as follows: ten small tubes of a O, oIprozenti, -en solution of Digitoiliii in physiological saline solution is ever i ccm pipetted. For this purpose, amounts falling from the substrate are pipetted, namely i, o, 8, o, 6, o, .4, 0.2, o, i, o, o5 cem. The tubes are shaken and the lower fractions are made up to 2 ccm with physiological saline solution. After standing for 2 hours, 1 ccm of a 51% suspension of defibrinated mutton blood in physiological saline solution is added to each tube. The amount of substrate used is given as the inhibition value. which no longer allows visible hemolysis to occur.

Beispiel 2 ioog Rinderleber werden wiederholt durch die Fleischmaschine getrieben; der entstehende Dünnbrei wird durch Schütteln mit 300ccm einer ijz./"-Phosphatpufferlösung vom Pii 7 extrahiert. Die Geweberückstände werden durch Abpressen durch Leinentücher entfernt; die Lösung wird zur Eiwei13ausfällung unter lebhaftem Schütteln mit ioog, festem Ammonsulfat versetzt, das zuvor fein '/2stündi,-em Stehenlassen llepulvert wurde. Nach wird abzentrifugliert, die Flüssigkeit verworfen, das abgeschiedene Eiweiß mit 300 ccm einer gleichen Pufferlösung wieder aufgenommen und wiederum zentrifugier t, um die nicht wieder in Lösung ge-,gangenen Bestandteile abzuscheiden. Die Lösung wird jetzt auf ihren Cholesteringehalt durch den Hämolysehemmungstest geprüft. Mehrfache in gleicher Weise ausgeführte Umfaällungen führen zu weiterer Reinigung und Aufhellung der anfangs trüben Lösung, wobei ein Wechsel des pa im Bereich von 6,4 bis 7,6 zweckrnäÜi- erscheint.Example 2 ioog beef liver are repeatedly passed through the meat machine; the resulting thin pulp is extracted by shaking with 300ccm of an ijz./"- phosphate buffer solution from the Pii 7. The tissue residues are removed by pressing through linen towels; Then it is centrifuged off, the liquid is discarded, the deposited protein is taken up again with 300 cc of an identical buffer solution and centrifuged again in order to separate out the constituents that have not gone into solution again Cholesterol content checked by the hemolysis inhibition test.Multiple reprecipitations carried out in the same way lead to further cleaning and lightening of the initially cloudy solution, a change in the PA in the range from 6.4 to 7.6 seems appropriate.

Bei bisherigen Versuchen ergab der Test einen Gehalt von etwa 75 Y Cholesterin je Kubikzentimeter in den nach dieser Vorschrift erhaltenen Lösungen. Dieser Gehalt blieb konstant bis zu fünf Unifällungen.In previous experiments, the test showed a content of about 75 % cholesterol per cubic centimeter in the solutions obtained according to this specification. This content remained constant up to five times.

Beispiel 3 loo 'g eines Dünnbreis von Rindernebennieren werden durch -Istündiges Schütteln mit 300ccm einer in/",-Phosphatpufferlösui-ig vom PH 7 unter Zusatz von 30ccm Glycerin extrahiert. Nach Ab- pressen durch Tücher wird die Lösung mit ioog feingepulvertem Ammonsulfat zur Ausfällung des Eiweißes versetzt. Der durch Zentrifugieren abgeschiedene Niederschlag wird mit 3ooccm Pufferlösung wieder aufgenommen. Die nicht in Lösung gegangenen Anteile werden durch Zentritugieren abgetrennt. Die Lösung zeigt im Hämolysehemmungstest einen Cholesteringehalt von 75 Je Kubikzentimeter. Dieser Gehalt bleibt bei-weiteren Umfällungen konstant, gleichgültig ob diese mit oder ohne Zusatz von Glycerin ausgeführt wurden. Beispiel 4 ioog eines Dünnbreis von Stierhoden werden durch 4stündiges Schütteln mit 300ccm einer nz/1.-Phosphatpufferlösung vom PH 7 extrahiert. Nach Abpressen durch Tücher wird die Lösung mit i oo g f eingepulvertem Ammonsulf at zur Ausf ällung des Eiweißes versetzt. Der durch Zentrifugieren abgeschiedene Niederschlag wird mit 300- cern Pufferlösung wieder aufgenommen. Die nicht in Lösung gegangenen Anteile werden durch Zentrifugieren abgetrennt. Die Lösung zeigt im Hämolyseliemmungstest einen Cholesteringehalt von 100 7' je Kubikzentimet-er. Dieser Gehalt bleibt bei weiteren Umfällungen konstant.Example 3 loo 'g of a Dünnbreis of bovine adrenal be -Istündiges shaking with 300ccm a in /. ", - extracted Phosphatpufferlösui-ig pH 7 with the addition of 30cc of glycerin After ex pressed through wipes the solution with ioog finely powdered ammonium sulfate to precipitate The precipitate separated by centrifugation is taken up again with 30 ounces of buffer solution. The fractions that have not gone into solution are separated off by centrifugation. In the hemolysis inhibition test, the solution shows a cholesterol content of 75 per cubic centimeter. This content remains constant with further reprecipitations, regardless of whether were carried out both with and without addition of glycerol. example 4 ioog a Dünnbreis of bull testicles are extracted by 4stündiges shaking with 300ccm a nz / 1 phosphate buffer solution of pH 7. After squeezing by towels, the solution is i oo gf eingepulvertem Ammonsulf at the Precipitation of the protein offset The precipitate that has separated out is taken up again with a 300- cer buffer solution. The fractions that have not gone into solution are separated off by centrifugation. In the hemolysis inhibition test, the solution shows a cholesterol content of 100 7 ' per cubic centimeter. This content remains constant with further reprecipitations.

Beispiel 5 ioog eines Dünnbreis von Schweineovarien werden durch -Istündiges Schütteln mit 300cc11) einer ni/",-Phosphatpufferlösung vom P117 extraliiert. Nach Abpressen durch Tücher wird die Lösung mit ioog feingepulvertem Ammonsulfat zur Ausfällung des Eiweißes versetzt. Der durch Zentrifugieren abgeschiedene Niederschlag wird mit 300,ccm Pufferlösung wieder aufgenommen. Die nicht in Lösung gegangenen Anteile werden durch Zentrifugieren abgetrennt. Die Lösung zeigt im Hämolysehernmungstest einen Cholesteringehalt von 75 7 je l,' ubil"zentimeter. Dieser Gehalt blieb bei weiteren Umfällungen konstant. EXAMPLE 5 10000 of a thin porridge from pig ovaries are extracted from the P117 by shaking for one hour with 300cc11) of a n / "phosphate buffer solution. After pressing through cloths, the solution is mixed with 10000 finely powdered ammonium sulfate to precipitate the protein resumed 300 cc of buffer solution. The non-solubilized fractions are separated by centrifugation. The solution shows Hämolysehernmungstest a cholesterol content of 75 7 per l 'ubil "centimeter. This content remained constant with further reprecipitations.

Beispiel 6 :270ccm defibriniertes und durch Zentrifugieren von Blutkörperchen befreites Schweineblut werden mit m/1.-Puffer vorn Pii 7 auf iooo ccm aufgefüllt und mit 300 g Ammonsulfat versetzt. Der ausgefallene Eiweißniederschlag wird abzentr - ifugiert, die überstehende Lösung abgegossen und der Rückstand in 250 ccm Puff-er wieder gelöst, Die Lösung wird nochmals mit 75 g Ammonsulfat gefällt, nach Zentrifugieren das Eiweiß, wiederum gelöst und die Fällung nochmals wiederholt.Example 6 : 270ccm defibrinated pig blood freed from blood cells by centrifugation is made up to 100 ccm with m / 1. Buffer from Pii 7 and mixed with 300 g of ammonium sulfate. The precipitated protein precipitate is abzentr - ifugiert, decanted the supernatant and the residue dissolved in 250 cc puff he redissolved, the solution is precipitated again with 75 g of ammonium sulphate, after centrifugation, the protein, dissolved again, and the precipitation repeated once.

Die so erhaltene Cholesterin-Eiweiß-Läsuliy hemmt im Hämolysetest mit o,4 ccm, entsprechend einem Gehalt von 7,5 mg'/0.The cholesterol-protein lesion thus obtained inhibits in the hemolysis test with 0.4 ccm, corresponding to a content of 7.5 mg / 0.

Claims

PATENT CLAIM: i. Process for the production of protein-cholesterol compounds or their solutions from organs, characterized in that organs which contain cholesterol-protein B compounds are used with solvents which cannot denature the protein, for example with water, or expediently extracted gently with buffer solutions at a p, 1 of about 7 and the cholesterol-protein compound isolated from the extract, optionally after further purification and removal of impurities, according to conventional methods.

2. The method according to claim i, characterized in that [one precipitates from the extracts obtained, the protein compound with agents which, such. B. ammonium sulfate, reversibly displace the cholesterol-protein compound from the aqueous solutions, elute the cholesterol-protein compound from the precipitate and, if necessary, repeat these measures. 3. The method according to claims i and 2, characterized in that body fluids, such as serum, are used instead of extracts from organs. 4. The method according to claims i to 3, characterized in that the organ extracts or body fluids are mixed with precipitants, expediently ammonium sulfate, the precipitations are then resumed and, if necessary, repeated several times for further purification of the precipitation and resumption process . 5. The method according to claims i to 4, characterized in that organs are used in the fresh state. 6. The method according to claims i to 5, characterized in that such as from Pu 7, in particular phosphate buffer solutions of 1/10 molarity, are used as the buffer solution. 7. The method according to claims i to 6, characterized in that suitable disinfectants which do not denature the protein, for example phenyl mercury nitrate, are added to the standard buffer solutions. 8. The method according to claims i to 7, characterized in that water-soluble interfering accompanying substances such. B. adrenaline, histamine, etc., in a suitable manner, e.g. B. by dialysis removed. 9. Embodiment of the method according to claims i to 8, characterized in that only the protein complex is deposited from the organ pulp and now the protein-cholesterol compound is eltfiert from the precipitated fractions.