DE723530C

DE723530C - Process for the enrichment of gonadotropic agents

Info

Publication number: DE723530C
Application number: DEG98301D
Authority: DE
Inventors: Dr Fritz Benz
Original assignee: Chemische Ind Ges; GESELLSCHAFT fur CHEMISCHE INDUSTRIE; Gesellschaft fuer Chemische Industrie in Basel CIBA
Current assignee: Chemische Ind Ges; GESELLSCHAFT fur CHEMISCHE INDUSTRIE; BASF Schweiz AG
Priority date: 1938-06-10
Filing date: 1938-07-19
Publication date: 1942-08-06

Description

Verfahren zur Anreicherung gonadotroper Wirkstoffe Es wurde gefunden, daß es gelingt, gonadotrope Wirkstoffe anzureichern, wenn man die Anreicherung dieser Wirkstoffe durch- Messung des Zuckergehaltes kontrolliert und dabei die Fraktionen mit steigendem Zuckergehalt weiterverarbeitet.Process for the enrichment of gonadotropic active substances It was found that it is possible to enrich gonadotropic active ingredients, if you enrich this Active ingredients controlled by measuring the sugar content and the fractions further processed with increasing sugar content.

Als Ausgangsstoffe können sowohl Trokkenpräparate wie auch Flüssigkeiten, wie z. B. Körperflüssigkeiten, Organextrakte oder Preßsäfte, welche gonadotropes Hormon enthalten, wie z.'B. Hypophysenvorderlappen, Schwangerenharn, oder auch Blutserum schwangerer Individuen, Verwendung finden. Für'die Aufarbeitung kommen z. B. die Methoden der Adsorption, der Aussalzung, der Fällung oder der Dialys#e in Frage. Diese Methoden können beliebig oft wiederholt oder miteinander beliebig kombiniert werden.Both dry preparations and liquids, such as B. body fluids, organ extracts or pressed juices, which are gonadotropic Contain hormone such as Anterior pituitary lobes, pregnant woman's urine, or blood serum pregnant individuals. For work-up come z. B. the Methods of adsorption, salting out, precipitation or dialysis are in question. These methods can be repeated as often as required or combined with one another as required will.

- Wie gefunden wurde, weisen die gonadotrop wirksamen Präparate einen verhältnismäßig hohen Zuckergehalt auf. Die physiologische Wirksamkeit steigt mit zunehmendem Zuckergehalt. Der Zuckergehalt wird verfahrensgemäß z. B. kolorimetrisch bestimmt. Wie festgestellt wurde, handelt es sich um Mannose bzw. um ein mannosehaltiges Polysaccharid im Falle der Verwrndung von Hypophysenvorderlappen als Ausgangsstoff. Da der vorhandene Zuck-er nicht dialysierbar und auchnach den üblichen Methoden nicht ohne Vernichtung der physiologischen Wirksamkeit abspaltbar ist, muß angenommen werden, daß dieser Zucker ein Bestandteil des gonadotrop wirksamen Proteins ist. - As has been found, the gonadotropically active preparations have a relatively high sugar content. The physiological effectiveness increases with increasing sugar content. According to the method, the sugar content is e.g. B. determined colorimetrically. As has been established, it is mannose or a polysaccharide containing mannose if the anterior pituitary lobes are used as the starting material. Since the sugar present cannot be dialyzed and cannot be split off even by the usual methods without destroying the physiological effectiveness, it must be assumed that this sugar is a component of the gonadotropically active protein.

Bereits Fischer und Ertel (Zeitschr. physiol. Chem. 202, 92ff- [1931]) haben den Zuckergehalt von Zubereitungen des gonadotropen Hormons aus Schwangerenharn mit Hilfe eines Reduktionsverfahrens bestimmt, welches sich nach dem heutigen Stande des Wissens jedoch als - unzulänglich erweist. Auf Grund ihrer Ergebnisse kommen diese Forscher zum Schluß, daß sich in den untersuchten Präparaten zwischen Reduktionswerte und gonadotroper Wirksamkeit keine einfache Beziehung erkennen läßt. Der Erfinderin ist der Nachweis, daß der Zuckergehalt in einfacher Beziehung zum Hormongehalt steht, erstmals gelungen. Dies ist im Hinblick auf die gegenteiligen Befunde von Fischer und Ertel völlig überraschend. Das vorliegende Verfahren zur Anreicherung gonadotroper Wirkstoffe durch Kontrolle des Zuckergehaltes und Verarbeitung der Fraktionen mit steigendem Zuck-ergebalt ist somit neu und überraschend.Fischer and Ertel (Zeitschr. Physiol. Chem. 202, 92ff- [1931]) have the same sugar content as gonadotropic hormone preparations made from pregnant woman's urine determined with the help of a reduction process, which is according to the current state of knowledge, however, proves to be inadequate. Come on the basis of their results These researchers concluded that there were between reduction values in the preparations examined and gonadotropic efficacy none reveals a simple relationship. The inventor is the proof that the sugar content is in a simple relationship to Hormone content stands, succeeded for the first time. This is with regard to the opposite Findings by Fischer and Ertel completely surprising. The present procedure for Enrichment of gonadotropic active ingredients by controlling the sugar content and processing of the fractions with increasing sugar content is therefore new and surprising.

Beispiel i Eine wässerige Lösung eines gonadotrop wirksamen Hypophysenvorderlappenpräparates-, hergestellt durch alkalische Extraktion von Drüsentrockenpulver, wird bei niedriger Temperatur mehrere Tage gegen destilliertes Wasser dialysiert und hierauf die von dialysierbaren Stoffen befreite Hormonlösung vorsichtig im Vakuum zur Trockne verdampft. Der Mannosegehalt des Trockenrückstandes beträgt i,60,lo. Dieses Präparat wird in der 2ofachen Menge Wasser gelöst, die wässerige Lösung mit einigen Tropfen Natriumacetatlösung versetzt und hierauf der Wirkstoff durch Zusatz "von 5 Volumen Alkohol ausgefällt. Der entstehende Niederschlag wird wieder in Wasser gelöst und die Fällung mit Alkohol in gleicher Weise wiederholt. Der getrocknete Niederschlag stellt ein in Wasser leicht lösliches weißes Pulver dar, dessen Mannosegehalt 4,6% beträgt und das eine Wirksamkeit von 25ooRE/,- (Ratteneinheiten pro Gramm) aufweist.Example i An aqueous solution of a gonadotropically active anterior pituitary lobe preparation, prepared by alkaline extraction of dry glandular powder, is dialyzed against distilled water at low temperature for several days and then the hormone solution freed from dialyzable substances is carefully evaporated to dryness in vacuo. The mannose content of the dry residue is 1.60.10. This preparation is dissolved in twice the amount of water, a few drops of sodium acetate solution are added to the aqueous solution and the active ingredient is then precipitated by adding 5 volumes of alcohol. The resulting precipitate is redissolved in water and the precipitation with alcohol is repeated in the same way The dried precipitate is a white powder which is easily soluble in water, the mannose content of which is 4.6% and an effectiveness of 250RU /, - (rat units per gram).

Beispiel 2 Aus Schwangerenharn erhält man durch alkoholische Fällungg und durch mehrtägige Dialyse ein Präparat mit einer gonadotropen Wirksamkeit von 33ooRE,g und einem Zukkergehalt von 4,00,10 (als Mannose bestimmt). 5 g eines solchen Präparates werden in iooccm Wasser gelöst und die Lösungdurch Zugabe von verdünnter Essigsäure auf Pii 4,5 eingestellt. Man fÜgt 20 - Kaolin hinzu, rührt während 1/2 Stunde und trennt hierauf das Kaolin durch Schleudern ab. Der an Kaolin adsorbierte Wirkstoff wird durch zweimaliges Behandeln mit je So ccin io%iger Ammonphosphatlösung eluiert; die vereinigten Eluate dialysiert man 24 Stunden gegen destilliertes Wasser und dampft hierauf die salzfreie Hormonlösung bei niedriger Temperatur im Vakuum zur Trockne ein. Man erhält iß g eines Präparates, welches einen Zuckergehalt von 17,5 Oilo (auf Mannose berechnet) aufweist und im Tierversuch eine Wirksamkeit von etwa i2oooRE/g besitzt.EXAMPLE 2 A preparation with a gonadotropic activity of 3300RE g and a sugar content of 4.00.10 (determined as mannose) is obtained from pregnant woman's urine by alcoholic precipitationg and dialysis over several days. 5 g of such a preparation are dissolved in 100 cm of water and the solution is adjusted to Pii 4.5 by adding dilute acetic acid. 20 - kaolin is added, the mixture is stirred for 1/2 hour and the kaolin is then separated off by centrifugation. The active ingredient adsorbed on kaolin is eluted by treating twice with socine io% ammonium phosphate solution; the combined eluates are dialyzed against distilled water for 24 hours and the salt-free hormone solution is then evaporated to dryness at low temperature in a vacuum. 1 g of a preparation is obtained which has a sugar content of 17.5 oilo (calculated on mannose) and an efficacy of about 1200RU / g in animal experiments.

Beispiel 3 Ein Rohextrakt aus Schafshypophysen, der, auf den Trockenrückstand berechnet, einen kolorimetrisch bestimmten Mannosegehalt von weniger als o,5o,o und eine biologische Wirksamkeit von 25oRE je Gramm Trokkenpulver aufweist, wird unter ständigem Umrühren mit pulverisiertem Ammonsulfat versetzt. bis der Sättigungsgrad des Salzes in der Lösung 400/0 beträgt. Man trennt den ausfallenden Niederschlag durch Schleudern ab; er ist frei von Mannose und hat keine Wirkung auf die Ovarien juveniler Ratten. Die überstehende, Ammonsulfat enthaltende Lösung wird durch weiteren Zusatz des Salzes auf einen Sättigungs- rad voll 7 5 #f0 gebracht, wobei wiederum eine Fällung entsteht, die nunmehr die ganze gonadotrope C ZD Wirksamkeit des Ausgangsextraktes enthält, eine Aktivität von i RE je mg Trokkenpräparat und einen Mannosegehalt von annähernd dem fünffachen Wert des Aus-,gangsmaterials. EXAMPLE 3 A crude extract from sheep pituitary gland, which, calculated on the dry residue, has a colorimetrically determined mannose content of less than 0.50.0 and a biological effectiveness of 25oRE per gram of dry powder, is mixed with pulverized ammonium sulfate with constant stirring. until the degree of saturation of the salt in the solution is 400/0. The precipitate which has separated out is separated off by centrifugation; it is free of mannose and has no effect on the ovaries of juvenile rats. The supernatant solution containing ammonium sulfate is brought to a saturation wheel full of 7 5 # f0 by further addition of the salt, which in turn results in a precipitate which now contains the entire gonadotropic C ZD activity of the starting extract, an activity of i RE per mg dry preparation and a mannose content of approximately five times the value of the starting material.

Beispiel 4 Der nach Beispie13 durch fraktionierte Aussalzung von großen Mengen unwirksamen Begleitstoffen befreite, gonadotrop wirksame Niederschlag wird einer weiteren Reinigung durch Adsorption an Kaolin in saurer Lösung, gemäß Beispiel 2, unterworfen. Nach zweimaliger Elution des Adsorbates mit je der fünffachen Menge o,oi n-Natronlauge fällt man die wirksame Substanz aus dem mit Essigsäure schwach angesäuerten Eluat durch Zugabe des fünffachen Volumens Alkohol aus. Der ausgefallene Niederschlag stellt nach dem Waschen mit Alkohol und Äther ein fast weißes, in Wasser leicht lösliches Pulver dar, das eine Wirksamkeit von etwa 6 RE je mg aufweist und dessen kolorimetrische Prüfung einen Mannosegehalt von 8,50i'o ergibt.EXAMPLE 4 The gonadotropic precipitate freed from large amounts of inactive accompanying substances by fractional salting out according to Example 4 is subjected to further purification by adsorption on kaolin in acidic solution, according to Example 2. After the adsorbate has been eluted twice, each time with five times the amount of o, oi n sodium hydroxide solution, the active substance is precipitated from the eluate, which has been weakly acidified with acetic acid, by adding five times the volume of alcohol. After washing with alcohol and ether, the deposited precipitate is an almost white powder, easily soluble in water, which has an effectiveness of about 6 RE per mg and whose colorimetric test shows a mannose content of 8.50%.

Claims

PATENTAIXSPRUCH: Process for the enrichment of gonadotropic active ingredients according to processes known per se, characterized in that the enrichment these active ingredients controlled by measuring the sugar content and thereby the fractions further processed with increasing sugar content.