DE688850C

DE688850C - Process for obtaining the anterior pituitary hormone from human or animal body fluids with simultaneous separation of the ovarian hormone present

Info

Publication number: DE688850C
Application number: DE1927I0031943
Authority: DE
Inventors: Dr Fritz Laquer; Dr Hermann Weyland
Original assignee: IG Farbenindustrie AG
Current assignee: IG Farbenindustrie AG
Priority date: 1927-08-18
Filing date: 1927-08-18
Publication date: 1940-03-08

Description

Verfahren zur Gewinnung des Hypophysenvorderlappenhormons aus menschlichen oder tierischen Körperflüssigkeiten unter gleichzeitiger Trennung von vorhandenem Ovarialhormon Es ist bekannt, daß man durch Injektion des Harns schwangerer Frauen an Versuchstieren Wirkungen auslösen kann, die den durch das (auf die Geschlechtsfunktionen wirkende) Hypophysenvorderlappenhormon und durch das Ovarialhormon ausgeübten Wirkun,gen gleichen. Es ist jedoch nichts darüber bekannt, ob die die genannten Hormonwirkungen ausübenden Stoffe im Harn schwangerer Frauen in der gleichen Form ausgeschieden werden, in der sie in den Organen erzeugt werden.Process for obtaining the anterior pituitary hormone from human or animal body fluids with simultaneous separation of existing ones Ovarian hormone is known to be obtained by injecting the urine of pregnant women can trigger effects on experimental animals that affect the sexual functions anterior pituitary hormone and effects exerted by the ovarian hormone same. However, nothing is known about whether the said hormone effects substances excreted in the urine of pregnant women in the same form in which they are generated in the organs.

Es wurde gefunden, daß man aus tierischen oder menschlichen Körperflüssigkeiten,die sowohl das Hypophysenvorderlappenhormon wie das Ovarialhormon enthalten, beide Horrnone unter gleichzeitiger Trennung voneinander gewinnen kann. Man verfährt dabei so, daß man, gegebenenfalls nach einer Konzentrierung undReinigungde3Ausgangsmaterials el unter Bedingungen, die das Hormon nicht schädigen, mit einem großen Überschuß von Alkohol, k' Aceton oder einer ähnlichen organischen Flüssigkeit das Hormon mit dem entstehenden Niederschlag ausfällt und diesen Rohniederschlag danach weiter zerlegt und die Hormonfraktion weiteren Reinigungsverfahren unterwirft. Das Ovarialhormon bleibt entweder in dem Filtrat von der Hypophysenvorderlappenhormonfällung oder kann auch vor dieser Fällung dem Ausgangsmaterial mit organischen Lösungsmitteln, die mit Wasser nicht mischbar sind, wie z. B. Äther und Chloroform, entzogen werden. Die so erhaltenen Extrakte werden ebenfalls einer weiteren Reinigung unterzogen.It has been found that from animal or human body fluids that contain both the anterior pituitary hormone and the ovarian hormone, both horronones can win while separating from each other. One proceeds in this way that, if necessary after a concentration and purification of the starting material el under conditions that do not harm the hormone, with a large excess of alcohol, k 'acetone, or a similar organic liquid, the hormone with the resulting precipitate precipitates and this raw precipitate then continues decomposed and the hormone fraction subjected to further purification processes. The ovarian hormone either remains in the filtrate from the anterior pituitary hormone precipitation or can also be used with organic solvents before this precipitation, which are immiscible with water, such as B. ether and chloroform, are withdrawn. The extracts obtained in this way are also subjected to further purification.

Daß auf diese Weise eine glatte Trennung der beiden Hormone zu erreichen sein würde, war nicht zu erwarten-, weil einerseits gar nichts darüber bekannt war, ob die Wirkstoffe Z. B. im Harn schwangerer Frauen in der gleichen Form ausgeschieden werden, in der sie in den Organen gebildet werden, weil andererseits die leichte Adsorbierbarkeit des Ovarialhormons an Niederschläge bekannt war. Wenn auch der normale Schwangerenharn im allgemeinen im Gegensatz zu anderen Körperflüssigkeiten und Organextrakten eiweißfrei ist und daher auch das Ovarialhormon an beim Versetzen mit eiweißfällenden Mitteln entstehende Eiweißn#ederschläge nicht adsorbiert werden kann, so war eine solche Adsorption sehr wohl beim Versetzen des Harns mit wasserlöslichen organischen Flüssigkeiten möglich, weil dabei starke Niederschläge, hauptsächlich von anorga-: nischen Salzen, entstehen.It was not to be expected that a smooth separation of the two hormones could be achieved in this way, because on the one hand nothing was known about whether the active substances, for example, are excreted in the urine of pregnant women in the same form in which they are excreted are formed in the organs because, on the other hand, the easy adsorbability of the ovarian hormone on precipitates was known. Even if normal pregnant woman's urine, in contrast to other body fluids and organ extracts, is generally free of protein and therefore the ovarian hormone cannot be adsorbed on protein precipitates that arise when the urine is mixed with protein-precipitating agents, such adsorption was very likely when the urine was mixed with water-soluble organic substances Liquids possible because heavy precipitation occurs, mainly of inorganic salts.

Man hat schon den Hypophysenvorderlappen selbst mit Alkohol verschiedener Konzentration behandelt, teils um eine Sterilisierung dadurch herbeizuführen, teils um eine Fraktionierung der Wirkstoffe zu erzielen. Im letzteren Falle hat man Wirkstoffe teils in den Extrakten, teils irf den Fällungen wiedergefunden, ohne daß sich aus den bekannten Tatsachen klare Richtlinien hinsichtlich der Abtrennung der im Hypophysenverderlappen selbst- enthaltenen Wirkstoffe ergeben hätten, Noch viel weniger ließen die über den Hypophysenvorderlappen selbst bekannten Tatsachen voraussehen, in welcher Weise das im Schwangerenharn nachgewiesene, die Wirkung des Hypophysenvorderlappenhormons zeigende wirksame Prinzip daraus 'gewonnen und wie es von etwa gleichzeitig vorhandenem Ovarialhormon getrennt werden könnte. . Beispiel i iool Schwangerenharn, der zweckmäßig bei schwach alkalischer Reaktion mit :2oVolumprozent Alkohol oder mit Kresol o.dgl. konserviert aufbewahrt wird, werden bei 40' im Vakuum auf i:ol eingeengt und mit der fünffachen Menge Äthylalkohol gefällt. Man erhält eine Rohfällung und ein Rohfiltrat, die zweGkmäßig nach mehrtägigem Stehen getrennt werden.The anterior pituitary itself has already been treated with alcohol of various concentrations, partly to achieve sterilization and partly to achieve a fractionation of the active ingredients. In the latter case, active ingredients were found partly in the extracts, partly in the precipitates, without the known facts giving clear guidelines with regard to the separation of the active substances contained in the pituitary lobe itself. The facts known about the anterior pituitary itself leave much less Foresee in what way the active principle, which has been demonstrated in the pregnant woman's urine and which shows the effect of the anterior pituitary hormone, can be obtained and how it can be separated from the ovarian hormone which may be present at the same time. . Example iool pregnant woman's urine, which is expedient in the event of a weakly alkaline reaction with: 20 percent by volume alcohol or with cresol or the like. is preserved preserved, are concentrated at 40 'in vacuo to i: ol and precipitated with five times the amount of ethyl alcohol. A crude precipitate and a crude filtrate are obtained, which are separated in two ways after standing for several days.

Die Rohfällung wird mit der fünffachen Menge Wasser aufgenommen, wobei man die Lösung schwach alkalisch hält, vom Unlöslichen abzentrifugiert und das Filtrat mit der fünffachen Menge Äthylalkohol (bezogen auf die Rohfällung) gefällt, Dieses Verfahren wird zweckmäßig mindestens einmal wiederholt. Das Hypophysenvorderlappenhormon bleibt hierbei im Filtrat. Durch Einengen desselben bei 4o' erhält man einen mehr oder weniger gelblich bis bräunlich gefärbten Sirup, der durch Trocknen im Vakuum über Chlorcaleium und durch nachfolgendes Zerreiben mit absolutem Alkohol in ein trockenes Pulver verwandelt wird. In dem trockenen Pulver bleibt das Hormon unverändert. Die wirksame Substanz ist hitzeempfindlich und dialysabel. Das Trockenpulver ist hygroskopisch. Die wäßrige Lösung gibt keine Biuretreaktion, reduziert Fehlingsche Lösung nicht und fällt nicht mit Pikrolonsäure, Gerbsäure,- Quecksilberchlorid, Kaliumquecksilberjodid, Jodjodkalium; Uranylacetat und Cadmiumchlorid, wohl aber beispielsweise mit Phosphorwolframsäure, Bleiacetat und Bleiessig sowie Bariumhydr-oxyd.The crude precipitation is taken up with five times the amount of water, whereby the solution is kept slightly alkaline, the insolubles are centrifuged off and the filtrate with five times the amount of ethyl alcohol (based on the crude precipitation), this The procedure is expediently repeated at least once. The anterior pituitary hormone remains in the filtrate. By narrowing it down at 4o 'one gets one more or less yellowish to brownish colored syrup, obtained by drying in vacuo via chlorcaleium and by subsequent trituration with absolute alcohol dry powder is transformed. In the dry powder, the hormone remains unchanged. The active substance is heat-sensitive and dialysable. The dry powder is hygroscopic. The aqueous solution does not give a biuret reaction, says Fehling's reduction Solution does not and does not fall with picrolonic acid, tannic acid, - mercury chloride, Potassium mercury iodide, iodine iodine potassium; Uranyl acetate and cadmium chloride, but they do for example with phosphotungstic acid, lead acetate and lead acetic acid and barium hydroxide.

Das Rohfiltrat wird vom A lkoliol befreit, weiter eingeengt und mit Kieselgur vermischt, bis eine krümelige Masse entstanden ist. Aus dieser wird das Ovarialhormon mit Äther extrahiert. Dermit Wasser aufgenommene filtrierteExtrakt wirdweitergereinigt, indem man ihn längere Zeit am Rückflußkühler mit Alkohol erhitzt oder ihn mit Alkalien verseift, worauf man aus der verseiften Lösung das Hormon mit Äther extrahiert, oder indem man das Hormon durch Fällungsmittel, wie z. B. Bleitssig und Ammoniak, niederreißt und den Niederschlag mit Alkohol, Äther o. dgl.. extrahiert.The crude filtrate is freed from A lkoliol, further concentrated and mixed with diatomaceous earth, arose until a crumbly mass. The ovarian hormone is extracted from this with ether. The filtered extract taken up with water is further purified by heating it for a long time in the reflux condenser with alcohol or saponifying it with alkalis, whereupon the hormone is extracted from the saponified solution with ether, or by the hormone by precipitating agents, such as. B. lead acid and ammonia, tears down and the precipitate with alcohol, ether or the like .. extracted.

Die Einstellung des Hormonpräparats auf die gewünschte Wirkungsstärke erfölgt auf Grund des Tierversuchs. » Beispiel 2, ioo 1 frischer Schwangerenharn werden bei 40' im Vakuum auf io 1 eingeengt und mit der vierfachen Menge Aceton gefällt. Man erhält eine Rohfällung und ein Rohfiltrat.The adjustment of the hormone preparation to the desired potency is based on animal experiments. " Example 2, 100 1 fresh pregnant woman's urine are concentrated at 40 'in a vacuum to 10 1 and precipitated with four times the amount of acetone. A crude precipitate and a crude filtrate are obtained.

Die Rohfällung wird mit der fünffachen Menge Wasser aufgenommen, vom Unlöslichen abzentrifugiert und das Filtrat mit der vierfachen Menge Alkohol (bezogen auf die Rohfällung) gefällt. Das Hypophysenvorderlappenhormon bleibt hierbei im Filtrat -und kann durch fraktionierte Fällung mit Alkoholen, Aceton o. dgl. weiter gereinigt werden. Das Produkt hat die gleichen Eigenschaften wie das in Beispiel i beschriebene.The crude precipitation is absorbed with five times the amount of water, vom The insolubles are centrifuged off and the filtrate with four times the amount of alcohol (based on on the raw felling). The anterior pituitary hormone remains in the Filtrate - and can by fractional precipitation with alcohols, acetone or the like. Further getting cleaned. The product has the same properties as the one in the example i described.

DasdasOvarialhormonenthaltendeRohfiltrat wirdvomAcetonbefreitunddiehinterbleibende Flüssigkeit erschöpfend mit Chloroform extrahiert. Der mit Wasser aufgenommene und filtrierte Extrakt wird weiter gereinigt, indem man ihn vorsichtig mit geeigneten Metallsalzen, Metalloxyden oder -hydroxyden oder Metallkolloiden, wie z. B. mit neutraler Bleiacetatlösung oder mit dialysierter Eisenhydroxydlösung versetzt und den Überschuß mit Schwefelwasserstoff wieder entfernt. Hierbei erhält man eine verdünnte Lösung des Ovarialhormons. Will man die für die therapeutische Anwendung wichtigeren konzentrierten Hormonlösungen erhalten, so muß man die Lösung zum Sirup eindampfen und ihn in einem nicht wasserlöslichen Mittel aufnehmen. Beispiel 3 Rinderplazenta wird gemahlen und in der Buchnerpresse abgepreßt, der Preßsaft wird, gegebenenfalls nach Verdünnen mit Wasser, mit der vierfachen Menge Alkohol versetzt und die auf 4o' erwärmte Mischung einige Stunden gerührt. Die Flüssigkeit wird durch Zentrifugieren abgetrennt und der unlösliche Rückstand ein zweites und drittes Mal mit 8o'/oigem Alkohol erwärmt und ausgerührt.The crude filtrate containing the ovarian hormone is freed from acetone and the remaining liquid is exhaustively extracted with chloroform. The extracted with water and filtered extract is further purified by carefully treating it with suitable metal salts, metal oxides or hydroxides or metal colloids, such as. B. with neutral lead acetate solution or with dialyzed iron hydroxide solution and the excess is removed again with hydrogen sulfide. This gives a dilute solution of the ovarian hormone. If the concentrated hormone solutions, which are more important for therapeutic use, are to be obtained, the solution must be evaporated into a syrup and absorbed in a water-insoluble agent. EXAMPLE 3 Cattle placenta is ground and pressed in the Buchner press, four times the amount of alcohol is added to the pressed juice, optionally after dilution with water, and the mixture, heated to 40 ', is stirred for a few hours. The liquid is separated off by centrifugation and the insoluble residue is heated a second and third time with 80% alcohol and stirred.

Die vereinigten alkoholischen Flüssigkeiten enthalteri das Ovarialhormon und werden nach den in den Beispielen i und 2 angegebenen Verfahren weiter verarbeitet.The combined alcoholic liquids contain the ovarian hormone and are further processed according to the procedures given in Examples i and 2.

Die festen Rückstände enthalten das Hypophysenvorderlappenhormon. Siewerden ebenfalls nach den in den Beispielen i und 2 angegebenen Verfahren weiter verarbeitet.The solid residues contain the anterior pituitary hormone. You will also proceed according to the procedures given in Examples i and 2 processed.

Claims

PATENT CLAIMS: i. A process for the recovery of the Hypophysenvorderlappenhdrmons from inenschlichen or animal body fluids sub simultaneous separation of existing Ovarialbormon, characterized denotes Ge, that one of said liquids, optionally after harmless purification and concentration, the anterior pituitary hormone water-soluble by the addition of organic liquids in the resulting precipitation separates, the ovarian hormone optionally obtained by extraction of the starting material before this precipitation or by extraction of the filtrate of this precipitation with water-immiscible organic liquids and the crude hormone fraction obtained in this way is further purified and enriched. : 2. An embodiment of the method according to claim 1, characterized in that the crude precipitation (the component acting on the sexual functions) of the anterior pituitary lobe hormones obtained from the urine of pregnant women, expediently after harmless purification and concentration, by adding multiple volumes of acetone or a water-soluble alcohol separates, takes up in water, optionally separates from insoluble constituents and effects a further purification of the anterior pituitary hormone contained in the aqueous solution by fractional precipitation and reprecipitation using acetone or a water-soluble alcohol.