DE4433130A1 - Identifizierung von DNA-schädigenden Substanzen durch Poly(ADP-Ribose)-Polymerase überexprimierende Zellinien - Google Patents
Identifizierung von DNA-schädigenden Substanzen durch Poly(ADP-Ribose)-Polymerase überexprimierende ZellinienInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein DNA-Konstrukt, das eine cDNA-Sequenz für
menschliche Poly (ADP-Ribose)-Polymerase enthält, Zellinien, die das DNA-Kon
strukt enthalten und ein Verfahren zur Identifizierung von DNA-schädigenden
Substanzen anhand dieser Zellinien, die Poly (ADP-Ribose)-Polymerase überexpri
mieren
Bisher wurden DNA-schädigende Substanzen (physikalische und chemische Kanze
rogene), die DNA-Strangbrüche herbeiführen durch die Messung der Strangbrüche
entweder in Zellysaten durch alkalische DNA-Denaturierungsverfahren (z. B. "Alkali
sche Elution") oder in situ anhand von Einzelzellen (sog. "Kometenassay) identifi
ziert. Die Lysat-Tests hatten aber den Nachteil, technisch relativ aufwendig zu sein
und eine hohe manuelle Geschicklichkeit des Experimentators zu erfordern. Bei
"Kometenassays" kommt hinzu, daß die Ablesung mikroskopisch erfolgt, was
einen hohen apparativen Aufwand bedingt.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht deshalb darin, ein Verfahren zur
schnellen, zuverlässigen Identifizierung von chemischen Kanzerogenen bereitzustel
len.
Das Prinzip der vorliegenden Erfindung beruht darauf, die zelluläre Poly (ADP-
Ribose)-Produktion als Indikator für in lebenden Zellen auftretende DNA-Strang
brüche nachzuweisen. Die Poly (ADP-Ribose) wird von der Poly (ADP-Ribose)-
Polymerase (PARP) in Anwesenheit von DNA-Strangbrüchen und unter Verbrauch
von NAD⁺ synthetisiert. Dies geschieht unter Einfluß von kanzerogenen Sub
stanzen fast in jeder kernhaltigen Zelle. Jedoch wird in einer solchen Zelle durch
Manipulation, d. h. durch Einbringung einer PARP-DNA-Sequenz in einer bestimm
ten Kombination mit einem Promotor, besonders viel Poly (ADP-Ribose) gebildet
und kann durch geeignete Meßmethoden, beispielsweise Immunfluoreszenz,
nachgewiesen werden.
Ein Beispiel für ein Konstrukt, das die PARP-DNA-Sequenz enthält, ist das bei der
DSM unter der Nummer DSM 9430 am 13. September 1994 hinterlegte Plasmid
pPARP31.
pPARP31 kann durch folgende Schritte erhalten werden:
- a) Ligierung einer cDNA, die den vollständigen offenen Leserahmen der Po ly(ADP-Ribose)-Polymerase aus menschlichen embryonalen Fibroblasten (HEF-Zellen) enthält, in pBluescript unter Erhalt des Plasmids pPARP 25 (Küpper, Dissertation Universität Heidelberg, 1990). Der vollständige offene Leserahmen einer der bekannten PARP-cDNAs ist z. B. in der GenBank/- EMBL-Datenbank, Zugangsnummer J 03473 (Kurosaki) veröffentlicht.
- b) Isolierung des Xho/Xba-Fragments aus pPARP25
- c) Herstellung des eukaryotischen Expressionsvektors pL15TK
Zuerst wird das 650 bp Hincll/Avall-Fragment des Humanen-Cytomegalie- Virus-Promotor/Enhancer (HCMV Prom), das über geglättete Enden verfügt, in die geglättete EcoRl-Schnittstelle von pUC19 ligiert, wodurch der "Zwi schenvektor" pL15 erhalten wird. In die geglättete Sphl-Schnittstelle und in die Hindlll-Schnittstelle von pL15 wird dann das 629 bp Smal/Hindlll-Frag ment des Poly-Adenylierungssignals des Herpes-Simplex-Virus-Thymidinki nase-Gens (TK poly A) ligiert, wodurch der Vektor pL15TK erhalten wird. Der Vektor pL15TK enthält das Resistenzgen für Ampicillin (Amp), einen bakteriellen Replikationsorigin (ori), sowie Teile des Lac-Operons (Z und i). Die Polylinker-Kassette von pUC 19 ist bis auf die EcoRl- und Sphl-Schnitt stellen intakt. - d) Ligierung des Xho/Xba-Fragments aus pPARP25 in den Vektor pL15TK (wie in Fig. 2 gezeigt) unter Erhalt des Plasmids pPARP31 (s. Fig. 3), wobei die Xhol-Schnittstelle des Inserts und die BamHl-Schnittstelle des Vektors zer stört werden. Die Xbal-Schnittstellen des Vektors und des Inserts bleiben intakt.
Zur Erzeugung von Zellinien wird die embryonale Hamsterzellinie CO60 (Lavi,
PNAS 78, S. 6144 ff (1981)) mit einem Plasmid, das eine Poly (ADP-Ribose)-
Polymerase exprimiert, vorzugsweise pPARP 31, stabil transfiziert. Die dabei
erhaltenen Zellklone (im Falle der Verwendung von pPARP31 wurden diese Zell
klone COCF1, -2, -4 genannt) überexprimieren die menschliche PARP. Diese Klone
produzieren bei gleicher gentoxischer Behandlung (z. B. γ-Strahlung oder Einwir
kung von kanzerogenen Chemikalien) deutlich mehr Poly (ADP-Ribose) als parallel
isolierte Kontrollklone (COCFN1, -2, -4), die keine Explosion der menschlichen
PARP aufweisen. Ähnliche PARP-überexprimierende Zellinien können natürlich
auch aus anderen bekannten Basis-Zellinien außer der verwendeten Hamsterzellinie
erzeugt werden. Desweiteren können PARP-überexprimierende Zellinien auch nach
transienter Transfektion mit einem PARP-exprimierenden Plasmid erhalten werden.
Die Hamsterzellklone COCF1, COCF2 und COCF4 sowie die Kontrollzellinie COC-
FN1 wurden bei der DSM unter den Nummern ACC2186, ACC2187, ACC2188
bzw. ACC2189 am 6. Sept. 1994 hinterlegt.
Durch die Verwendung der COCF-Klone bzw. dazu gleichartiger Klone aus anderen
Zellinien als Indikatorzellen wird die Empfindlichkeit eines Nachweisverfahrens für
Kanzerogene, die DNA-Strangbrüche erzeugen, deutlich gesteigert. Durch die
zelluläre Sythese von Poly (ADP-Ribose) kommt es gleichsam zu einer Signalver
stärkung, da ein einzelner DNA-Strangbruch zur Synthese von mehreren oder gar
vielen Polymermolekülen führt, die mit bis zu 200 monomeren Bausteinen eine
beträchtliche Komplexität erreichen. Durch Transfektion des die PARP-Sequenz
enthaltenden Expressionskonstrukts, vorzugsweise pPARP31, wird die Polymersy
these weiter gesteigert. Darüberhinaus kann die Empfindlichkeit des Nachweisver
fahrens dadurch weiter erhöht werden, daß die Zellen kurz vor der Einwirkung der
Testsubstanz einem definierten Hitzeschock, z. B. 30 Minuten 45°C, unterworfen
werden, wodurch der Abbau der Poly (ADP-Ribose), der mit der Synthese kon
kurrieren kann, gehemmt wird. Der Nachweis der zellulär gebildeten Poly (ADP-
Ribose) erfolgt vorzugsweise immunologisch. Dies hat den Vorteil, daß die Schritte
leicht ausführbar sind und die Methode mit einem Zeitaufwand von wenigen
Stunden schnell durchführbar ist. Vorzugsweise erfolgt der Test mittels Fluo
reszenzmikroskopie oder auf Mikrotiterplatten, wo sich die spezifische Antikörper
bindung im Sinne eines ELISAs durch automatisierte Vermessung auswerten läßt.
Jedoch eignen sich auch alle anderen gängigen immunologischen Detektionsver
fahren, wie z. B. Immunozytochemie oder Immunodotblot. Bei letzterem Verfahren
werden die Zellen nach Behandlung mit der DNA-schädigenden Testsubstanz
lysiert, die Lysate werden auf einen Träger, z. B. eine Filtermembran, aufgebracht
und die gebildete Poly (ADP-Ribose) wird mit einem Poly(ADP-Ribose)-spezifischen
Antikörper nachgewiesen, der Enzym-markiert sein kann. Andererseits kann
vorstehender Antikörper unmarkiert sein. Der Nachweis erfolgt dann durch einen
zweiten, gegen vorstehenden Antikörper gerichteten Antikörper, der markiert ist,
z. B. Enzym-markiert.
Beispielhaft sei der Nachweis von Poly (ADP-Ribose) durch Immunfluoreszenz
beschrieben. Zuerst läßt man die das PARP-DNA-Konstrukt enthaltenden Zellen
auf z. B. Deckgläschen oder Mikrotiterplatten auf eine übliche Zelldichte anwach
sen. Dann erfolgt die Behandlung der Zellen mit einer DNA-schädigenden Testsub
stanz. Die Behandlungszeit ist für einzelne Testsubstanzen unterschiedlich. Sie
kann vom Fachmann leicht bestimmt werden. Vielfach ist die Behandlungszeit 1-15 Minuten. Danach werden die Zellen an den Träger (z. B. Deckgläschen oder
Mikrotiterplatte) fixiert. Nach Waschen des Trägers, kurzem Trocknen und Rehy
drieren der Zellen in Puffer erfolgt die Inkubation mit einem Erst-Antikörper gegen
Poly (ADP-Ribose). Nach mehrmaligem Waschen mit Puffer erfolgt die Inkubation
mit einem markierten, gegen den Erst-Antikörper gerichteten Zweit-Antikörper.
Nach wiederholtem Waschen erfolgt die fluoreszenzmikroskopische Auswertung
oder die Detektion in einem ELISA-Lesegerät.
Als DNA-schädigende Testsubstanz eignen sich z. B. γ-Strahlung, Medikamente,
wie Zytostatika, UV-Licht, Nahrungsmittelzusatzstoffe oder Chemikalien wie Farb
stoffe, Lösungsmittel oder Reinigungsmittel.
Das beschriebene Prinzip der PARP-Überexpression läßt sich ohne weiteres auch
auf primäre Zellen aus Versuchstieren ausweiten, indem die Expressionskassette
für menschliche PARP mit Hilfe eines viralen Vektors transient oder stabil in solche
Primärzellkulturen eingeschleust wird. Dadurch stehen Zellen mit der vollen, gewe
bespezifischen Fremdstoff-Metabolisierungskapazität zur Verfügung. Einerseits
erlaubt dies die Detektion von Agentien, die erst nach der Metabolisierung die DNA
schädigen, andererseits läßt sich mit solchen Zellen ein organspezifisches Schädi
gungspotential abschätzen.
Die Erfindung wird anhand der Figuren weiter beschrieben, von denen
Fig. 1 den eukaryotischen Expressionsvektor pL15TK zeigt,
Fig. 2 das Klonierungsschema für pPARP31 zeigt und
Fig. 3 die Genkarte des Plasmids pPARP31 zeigt.
Die Abkürzungen in den Figuren bedeuten:
HCMV Prom: Humaner Cytomegalie-Promotor/Enhancer
AMP: Ampicillin-Resistenzgen
Z: Teil des Lac-Opernns
I: Teil des Lac-Operons
(TK) Poly A: Polyadenylierungssignal des Herpes-Simplex-Virus- Thymidinkinase-Gens
ori: bakterieller Replikationsursprung
D: DNA-Bindungsdomäne
A: Automodifikationsdomäne
N: NAD-Bindungsdomäne
ATG: Initiationskodon
Stop: Stopkodon
AMP: Ampicillin-Resistenzgen
Z: Teil des Lac-Opernns
I: Teil des Lac-Operons
(TK) Poly A: Polyadenylierungssignal des Herpes-Simplex-Virus- Thymidinkinase-Gens
ori: bakterieller Replikationsursprung
D: DNA-Bindungsdomäne
A: Automodifikationsdomäne
N: NAD-Bindungsdomäne
ATG: Initiationskodon
Stop: Stopkodon
Für die Restriktionsschnittstellen wurden die üblichen Abkürzungen verwendet.
Beispielhaft sei auf das nachfolgende Beispiel verwiesen, das die Erfindung weiter
erläutert.
COCF1-Zellen wurden über Nacht auf Deckgläschen angezüchtet. Die Zellen
wurden mit 2,8-20 Gray Gamma-Strahlung behandelt. Fünf Minuten nach Bestrah
lungsbeginn erfolgte die Fixierung der Zellen in 10% Trichloressigsäure (10 Min.
auf Eis). Die Deckgläschen wurden für jeweils 3 Minuten in 70%, 90% und
absolutem Ethanol gewaschen. Nach Lufttrocknen für 1 Minute wurden die Zellen
in PBS-Puffer (Phosphat-gepufferte Salzlösung) für 1 Minute rehydriert. Es erfolgte
die Zugabe des Erst-Antikörpers (Zellkulturüberstand des Hybridoms 10H [beschrie
ben von Kawamitsu et al., Biochemistry 23, 3771 ff.,1984], das einen monoklo
nalen, hochspezifischen Antikörper gegen Poly (ADP-Ribose) sezerniert). Danach
wurden die Deckgläschen dreimal 5 Minuten in PBS-Puffer gewaschen und der
Zweit-Antikörper (FITC-gekoppelte Ziegen-anti-Maus-Immunglobuline; Fa. Renner,
Dannstadt) wurde zugegeben und 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Dann wurde
wieder dreimal 5 Minuten mit PBS-Puffer gewaschen und die Deckgläschen wur
den in Polyvinylalkohol auf Objektträger eingebettet. Es erfolgte die fluoreszenzmi
kroskopische Auswertung.
Claims (10)
1) Plasmid pPARP31 (DSM 9430, hinterlegt am 13. Sept. 1994).
2) Poly (ADP-Ribose)-Polymerase überexprimierende Zellinie, umfassend ein
DNA-Konstrukt mit einer Nukleinsäuresequenz für menschliche PARP.
3) Zellinie nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäurese
quenz eine cDNA-Sequenz ist.
4) Zellinie nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß das DNA-
Konstrukt pPARP31 ist.
5) Zellinie nach einem der Ansprüche 2-4, dadurch gekennzeichnet, daß es
eine Hamster-Zellinie, insbesondere CO60 ist.
6) Zellinie nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um die
Zellklone COCF1 (DSM ACC2186, hinterlegt am 6. Sept. 1994), COCF2
(DSM ACC2187, hinterlegt am 6. Sept. 1994) und COCF4 (DSM
ACC2188, hinterlegt am 6. Sept. 1994) handelt.
7) Verfahren zur Identifizierung von DNA-schädigenden Substanzen, dadurch
gekennzeichnet, daß Zellen, die Poly (ADP-Ribose) überexprimieren, entwe
der (a) auf einem Träger wachsen gelassen werden, einer DNA-schädigen
den Testsubstanz ausgesetzt werden und die gebildete Poly (ADP-Ribose)
immunologisch nachgewiesen wird, oder (b) einer DNA-schädigenden
Testsubstanz ausgesetzt werden, lysiert werden und die Lysate auf einen
Träger aufgebracht werden sowie die gebildete Poly (ADP-Ribose) immunolo
gisch nachgewiesen wird.
8) Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um Zellen
der Zellklone COCF-1 (DSM ACC2186), COCF-2 (DSM ACC2187) oder
COCF-4 (DSM ACC2188) handelt.
9) Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger
in (a) ein Deckgläschen oder eine Mikrotiterplatte ist und in (b) eine Filter
membran ist.
10) Verfahren nach einem der Ansprüche 7-9, dadurch gekennzeichnet, daß der
immunologische Nachweis in (a) über Fluoreszenzmikroskopie geschieht.
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