DE4428569A1 - Verfahren und Vorrichtung für die Substanzen und Strukturen erhaltende Mikrowellendenaturierung frischen Gewebes - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung für die Substanzen und Strukturen erhaltende Mikrowellendenaturierung frischen Gewebes.

In DE 34 33 133 C2 wurde bereits über eine gesteuerte Wärme­ energiedenaturierung für die Histologie von Probeexzisionen bzw. frischem Gewebe auch durch Mikrowellen berichtet. Im Jahre 1987 erschien von Boon and Kok Microwave Cookbook of Pathology, die Kunst der mikroskopischen Sichtbarmachung, Coulomb Press Leyden, Leiden, Niederlande. Im 9. Kapitel dieser Monographie wird bei Nennung von Marani et al. über die für sehr wesentlich gehaltene Mikrowellenstabilisation von unfixiertem Gewebe durch Mikrowellen berichtet. "Aber von Marani wurde der Begriff der Stabilisation eingeführt, wenn keine chemischen Fixativa in die Mikrowellenmethode einbezogen sind". Auf die Benutzung der Temperaturgrade von etwa 50-70°C wird hingewiesen. In DE P 39 09 038.8 wurde die direkte Aufheizung des frischen Ge­ webes/Probeexzisionen zur Wärmedenaturierung durch Mikrowellen in hyperbarem Wasserdampf in Anwendung der nun erweiterten Stabilisation ohne chemischen Zusatz zum Gewebe mit sehr guten histologisch-mikroskopischen Ergebnissen beschrieben. Der hyperbare Wasserdampf wurde zur Vermeidung des Verlustes originären Zell- und Kernwassers im Mikrowellengerät eingesetzt. In dieser Weise verblieben praktisch alle originären Substanzen mit daran ge­ bundenen Strukturen im histologisch zu begutachtendem Gewebe.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, in Berücksichtigung der Prinzipien der Stabilisation schonend für die Histologie und Grenzgebiete/das Gewerbe frisches Gewebe vor allem für mikroskopische Begutachtungen zu denaturieren bzw. für Gewebsschnittherstellungen zu verfestigen.

Diese Aufgabe wird bei einer gattungsgemäßen Einrichtung durch die kennzeichnenden Merkmale des Patentanspruches 1 gelöst. Die wei­ tere Ausgestaltung der Erfindung ist den Unteransprüchen, der Zeich­ nung und deren Beschreibung zu entnehmen.

Bekanntlich bewirken die Mikrowellen Schwingungen der Wasser­ moleküle, wodurch Wärme als eine besondere Energie entsteht, die aber im allgemeinen nicht so gut steuerbar ist wie die im Kochtopf von außen zugeführter Hitze; der Siedepunkt des Wassers mit immer genau 100°C ist in diesem Zusammenhang als Glücksfall aufzufassen. Bei der Mikrowellenaufheizung können - und das ist auch bekannt - im gleichen Behälter mit heißem Wasser recht unter­ schiedliche Temperaturen vorhanden sein. Der Siedepunkt des Wassers kann im Mikrowellenofen ohne weiteres mit Gasbläschenentstehung übersprungen werden; erfolgt das im Plasma einer Körperzelle, so kann dort eine später mikroskopisch erkennbare bläschenför­ mige Laesion entstehen, die als Mikrokunstprodukt aufzufassen ist. Dennoch hat die Mikrowellenmethode in der Histologie eine größere Bedeutung als die Kochmethode von Roulet (1948) und derartige Nachfolgebestrebungen erlangt.

Die mit der Erfindung erzielten Vorteile bestehen insbesondere darin, daß in der beschriebenen Wirkung der Mikrowellen im durch Wärme zu denaturierendem Gewebe die Tendenz der physika­ lischen Expansion der verschiedenen Substanzen einschließlich, ja bevorzugt des Wassers besteht, welche in den Körperzellen und somit in ihren Kernen vorhanden sind. In diesem wünschenswerten Zustand (trotz feinster Kunstprodukte manchmal durch Gasbläschen­ entstehung) erfolgt durch die Wärmeentwicklung und Eiweißgerinnung die Verfestigung und zugleich Denaturierung des gesamten Gewebes so­ wie gleichartig jeder Körperzelle mit ihren für die Diagnosen so wichtigen Kernen. Die einwirkenden Kräfte zur für die Histologie in der Regel erforderlichen Denaturierung mit Gewebsverfestigung sind durchaus und ganz im Sinne der Stabilisation gering. Chemische Fixativa, insbesondere Formalin mit nachfolgender Wässerung sind bei dem beschriebenen verbesserten Mikrowellen­ verfahren überflüssig. Toxische Einflüsse im Labor sind eleminiert. Diese Mikrowellenmethode für die Histologie im weiten Sinne, bei der sich die frische Probeexzision nur in wenig isotoner Lö­ sung, ggf. sogar in homologem Gewebsbrei befindet, ist nicht aufwendig. Befinden sich das Reagenzglas oder die geschlossenen neuen Gewebskapseln mit den zu denaturierenden Gewebsproben zu­ gleich in einem Becherglas im Mikrowellenofen, so ist sogar eine Kobinationswirkung von Mikrowellen und herkömmlicher Wärme­ einleitung vom aufgeheizten umgebenden Wasser anzunehmen (Fig. 2). Zur Vermeidung von Eiweißverklumpungen, Herauslösung von Lipiden sollten in den Laboratorien möglichst geringe Temperaturen über Minuten bei Verwendung von Mikrowellenöfen zur Stabilisation frischen Gewebes gesteuert eingesetzt werden. Hierfür werden Temperaturen um 60°C genannt.

In dieser Weise können mit einfachen Mitteln die bei hohen Hitzegra­ den der "Kochmethode" entstehenden Kernschrumpfungen verhindert werden, welche Beeinträchtigungen der Histologie allgemein wie der Histochemie, auch für die Histo-Cytometrie zur Folge haben.

Wortlaut über die Stabilisation: "Beständigkeit eines beliebig zusammengesetzten Systems auch bei äußeren Einwirkungen, sofern diese eine bestimmte Stärke nicht überschreiten", in Meyers Enzyklopädisches Lexikon (1978), Bd. 22, Bibliographisches Insti­ tut Mannheim-Wien-Zürich.

Es zeigen

Fig. 1 für die gesteuerte Wärmedenaturierung ein Reagenzglas 2 deine ähnliche Vorrichtung im Mikrowellenofen 1, die Haltevorrichtung 5 für dieses Reagenzglas 2, so daß es im Mikrowellenofen 1 annähernd senkrecht steht, im Reagenzglas die frischen Gewebsprobeexzisionen 3, welche sich in wenig isotoner Lösung wie Tris 4 befinden, die Einwirkung gesteuerter relativ schwacher Mikrowellen auf dieses dargelegte System mit der schonenden direkten Aufheizung des frischen Gewebes 3 zur Stabilisation für mannigfache histologisch­ mikroskopische Begutachtungen, wobei sich auch kaum der Verlust originären Zell-und Kernwassers strukturerhaltend in den PE 3 er­ geben kann.

Fig. 2 ein gleiches, aber nun ergänztes Verfahren wieder in Anwen­ dung eines Reagenzglases 2, welches in ein zum Teil mit Wasser 9 gefülltes Standgefäß 8 mittels Bleikugel 6 und Haltevorrichtung 7 eingetaucht ist zur Wärmedenaturierung frischer Probeexzisionen 3, desgleichen in isotoner Lösung 4 befindlich. Die Erhitzung der PE 3 erfolgt bei diesem Vorgehen sowohl vom gesteuert erwärmten Wasser 9 als zugleich durch Mikrowellen (nicht gezeichnet).

Fig. 3 eine spritzenförmige Gewebskapsel 10 im Innenraum des Mikro­ wellengerätes 1 zur Wärmedenaturierung frischer PE 3, die sich desgleichen in wenig isotoner Lösung, ggf. in homologem Gewebsbrei 4 befinden, den vorderen Verschluß 11, den verschiebbaren Kolben 12, den dadurch variablen Gewebskapselraum 13, in welchem sich neben der isotonen Lösung 4 zugleich die frischen PE 3 befinden.

Fig. 4 das von Histologen sehr geschätzte Körperzellmuster nach der Gewebsfixierung mit dem toxischen Formalin, welches Wässerung im histologischen Labor erforderlich macht, insgesamt zur Gewebs­ verquellung führt.

Fig. 5 Zellkernverdichtung bzw. nicht besonders geschätzte Kernpyk­ nose nach der Wärmedenaturierung im Wasserbad besonders bei höheren Temperaturen, die im Bereich des Siedepunktes liegen.

Fig. 6 fortschrittliche noch nicht eigentlich bekannt gewordene Zell- und Kernstrukturen nach der Wärmedenaturierung im hyperbaren Wasserdampf durch gesteuerte, schwach dosierte Mikrowellenein­ wirkung; verbliebene Substanzen und originäre Strukturen mit nun bereits lichtmikroskopisch offenbar erkennbaren Zellkernmembranen und darin eingeschlossenem hellen, da wäßrigen Kernplasma. KM = Zellkernmembran, KP = Kernplasma.

Fig. 7 den Querschnitt durch die Vorrichtung/das System zur schonendeng die Stabilisation im weiteren Sinne berücksichti­ gende Wärmegewebsdenaturierung im gesteuerten Mikrowellenofen 1, das frische Gewebe 3 im Inneren der Vorrichtung, von wenig iso­ toner Lösung 4 bzw. von homologen Gewebsbrei 4 im Reagenzglas 2 umgeben, die auch hier (geschwächt) eingedrungenen Mikrowellen 1, das um das Reagenzglas 2 herum befindliche Wasser 9 im Standgefäß 8, welches zunächst vorgegeben vorgewärmt zusätzlich durch die Mikrowellen 1 aufgeheizt wird und durch Wärmeleitung über die isotone Lösung 4 mit zur gesteuerten Wärmedenaturierung der frischen Probeexzisionen 3 im Sinne der Stabilisation beiträgt, die Temperaturmeßvorrichtungen bzw. Thermoelemente 20 und 20a, die erstere im äußeren Gefäß ins Wasser, das zweite Thermoelement zumindest in die isotone Lösung 4 eintauchend.

Fig. 8 den Schnitt durch den Zellkern 22 einer Körperzelle während der Wärmedenaturierung durch Mikrowellen 1, welche im wäßrigen Zellkernplasma KP nicht nur Wärme erzeugen, sondern auch im Kern­ plasma (im Sinne der örtlichen Überhitzung) Gasbläschen (30) entstehen lassen mit einer mehrweniger Expansion in Dehnung der Kernmembran KM. Im Kernplasma befinden sich außerdem noch aus Kernsubstanz bestehende Chromatinkörperchen 22a.

Claims (11)

1. Verfahren und Vorrichtung für die Substanzen und Strukturen erhaltende Mikrowellendenaturierung frischen Gewebes, dadurch gekennzeichnet,
daß bei der gesteuerten schonenden Wärmedenaturierung (1) frischen Gewebes (3) im Mikrowellenofen (1) die für die Stabilisation gegebenen Richtlinien befolgt werden, indem die Ein­ wirkungen auf das frische Gewebe bzw. die Probeexzisionen PE (3) gering sind,
daß während der gesteuerten Wärmedenaturierung bei geringen Temperaturen von etwa 60°C über Minuten nur wenig isotone Lösung (4) wie Tris oder besser homologer Gewebsbrei (4) mit dem zu denaturierenden Gewebe (3) in Berührung kommt,
daß zur Nutzung des hierfür engen Raumes (13) um die frischen PE (3) und zugleich wenig isotoner Lösung (4) Reagenzgläser verschiedener Größe/Form (2) oder besondere Gewebskapseln (10) mit variabel herstellbarem Innenraum (13) vorhanden sind,
daß bei diesem Vorgehen in Laboratorien im biologisch-histolo­ gischen Bereich oder in Betrieben des Gewerbes beispielsweise zur Geschmackserhaltung aus dem zu denaturierenden Gewebe (3) bei ver­ festigtem Gewebe praktisch keine originären Substanzen verloren gehen und an die verschiedenen Substanzen gebundenen Strukturen reproduzierbar mit Isomorphie insbesondere für mikroskopische Begutachtungen erhalten bleiben.

2. Verfahren und Vorrichtung für die Substanzen und Strukturen erhaltende Mikrowellendenaturierung frischen Gewebes nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein geräumiger, sicher auch gegen Mikrowellenaustritt verschließbarer Mikrowellenofen (1) vor­ handen ist, in welchem steuerbar relativ geringe Wellenenergie (1) für die schonende Wärmedenaturierung frischen Gewebes (3) mit Temperaturkontrollen (20, 20a) erzeugt werden kann, ohne daß in starkem Maße Gasbläschen (wie beim Eigaren im Mikrowellengerät) entstehen.

3. Verfahren und Vorrichtung für die Substanzen und Strukturen er­ haltende Mikrowellendenaturierung frischen Gewebes nach Patent­ anspruch 1-2, dadurch gekennzeichnet, daß zur Sicherstellung ge­ eigneter/geringer Temperaturen im frischen Gewebe (3) zur Denatu­ rierung Thermoelemente (20, 20a), auch sogenannte Thermofühler (20, 20a) im Inneren des Mikrowellengerätes (1) vorhanden sind welche auch zur Kontrolle in mehrere Medien wie in Wasser (9), isotone Lösung (4), in das zu denaturierende Objekt (3) einge­ bracht werden können.

4. Verfahren und Vorrichtungen für die Substanzen und Strukturen erhaltende Mikrowellendenaturierung frischen Gewebes nach Patent­ anspruch 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß möglichst bruchsichere Reagenzgläser (2) verschiedenen Durchmessers, verschiedener Länge, Gestaltung für die Wärmedenaturierung vorhanden sind, in deren Basis als Gewicht auch eine Bleikugel eingeschmolzen sein kann oder befestigt werden kann.

5. Verfahren und Vorrichtung für die Substanzen und Strukturen er­ haltende Mikrowellendenaturierung frischen Gewebes nach Patent­ anspruch 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß hitzebeständige Becher­ gläser (8) verschiedener Größe und Form für die gesteuerte Wärme­ denaturierung im Mikrowellenofen (1) vorhanden sind.

6. Verfahren und Vorrichtung für die Substanzen und Strukturen er­ haltende Mikrowellendenaturierung frischen Gewebes nach Patentan­ spruch 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß sich im Bereich des Mikrowellenofens (1) bzw. einer Spüle im Labor ein offener Behälter mit kaltem Wasser zur Abkühlung denaturierten, noch erhitzten Gewebes/Probeexzisionen (3) zur Verhinderung der Austrocknung des Gewebes befindet.

7. Verfahren und Vorrichtung für die Substanzen und Strukturen er­ haltende Mikrowellendenaturierung frischen Gewebes nach Patentan­ spruch 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß bei der physikalisch im Sinne der Stabilisation bewirkten Wärmedenaturierung frischen Gewebes (3) und Gasbläschenentstehung (3) dabei für mikroskopische Begut­ achtungen vorteilhafte Strukturaufbesserungen entstehen wie die Differenzierung/Verdeutlichung des Zellkernaufbaus (22, 22a, 30, 31).

8. Verfahren und Vorrichtung für die Substanzen und Strukturen erhaltende Mikrowellendenaturierung frischen Gewebes nach Patent­ anspruch 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß in Verwendung der ge­ steuerten schonenden Mikrowellendenaturierung (1) in Berücksichti­ gung der Stabilisation und Erwärmung der frischen PE (3) in nur wenig isotoner Lösung (4) bereits lichtmikroskopisch bei verbliebenen originären Wasser im Kernplasma KP bzw. (31) die Zellkernmembranen KM vom umschlossenen (durch Gasbläschenentstehung) expandierten Kernplasma KP bzw. (30) meist deutlich unterscheidbar sind.

9. Verfahren und Vorrichtung für die Substanzen und Strukturen er­ haltende Mikrowellendenaturierung frischen Gewebes nach Patent­ anspruch 1-8, dadurch gekennzeichnet, daß sich die durch Mikro­ wellen (1) bewirkte Stabilisation von frischem Gewebe (3) allgemein gegen die das histologische Gewebsbild beeinträchtigende Zell­ kernpyknose, somit Zellkernschrumpfung (Fig. 5), auch gegen die Schrumpfung von Gewebszügen verschiedener Gewebsarten richtet.

10. Verfahren und Vorrichtung für die Substanzen und Strukturen erhaltende Mikrowellendenaturierung frischen Gewebes nach Patent­ anspruch 1-9, dadurch gekennzeichnet daß zur weitgehend und über­ all reproduzierbaren physikalischen Stabilisation von frischem Gewebe (3)/Probeexzisionen (3) nicht/kaum Formalin, Xylol, Benzol, konzentrierter Alkohol oder andere Lösungsmittel, chemische Mittel, auch keine Wässerung zur Substanzerhaltung benötigt werden.

11. Verfahren und Vorrichtung für die Substanzen und Strukturen erhaltende Mikrowellendenaturierung frischen Gewebes nach Patentanspruch 1-10, dadurch gekennzeichnet, daß bei der ge­ steuerten Wärmedenaturierung im Mikrowellenofen (1) sich kein Substanzverlust strukturerhaltend ergeben kann, wenn die frischen Probeexzisionen (3) sich in homologen Gewebsbrei (4) befinden.