DE4425445A1

DE4425445A1 - Verfahren zur Messung der Permeationskinetik und des Transportes von Substanzen durch Hautschichten

Info

Publication number: DE4425445A1
Application number: DE4425445A
Authority: DE
Inventors: Herbert Reinl; Anton Dr Dr Hartinger; Peer Dr Dettmar; Thomas Prof Dr Bayerl
Original assignee: Individual
Current assignee: Reinl Herbert 84069 Schierling De Hartinger An
Priority date: 1994-07-19
Filing date: 1994-07-19
Publication date: 1996-01-25

Description

Stand der Technik

Eine wesentliche Funktion der Haut tierischer Organismen im allgemeinen und des menschlichen Organismus im besonderen ist die Abschirmung des Organismus nach außen. Diese Barrierefunktion der Haut wird durch ihren einzigartigen Schichtaufbau erreicht, der u. a. durch einen unterschiedlichen Differenzierungsgrad der Hautzellen (Keratinozyten) in den einzelnen Schichten gekennzeichnet ist (siehe z. B. H. Green, "Zellkulturen für Transplantate" in Spektrum der Wissenschaft, Januar 1992, Verlag Chemie Weinheim).

Ein zentrales Anliegen gegenwärtiger pharmazeutischer Forschung ist die effektive Durchdringung der Permeationsbarriere der Haut für die transdermale Applikation von Wirkstoffen. Diese Wirkstoffe haben im allgemeinen ein hohes Molekulargewicht und sind deshalb unter normalen Bedingungen inpermeabel bezüglich der Haut. Deshalb sind Transportsysteme in Form von Verkapselungen der Wirkstoffe (sogenannte Drug Delivery Systeme) notwendig, die die Überwindung der Permeationsbarriere ermöglichen. Als derzeit aussichtsreichste technische Realisierung eines solchen Transportsystems werden Liposomen angesehen. Die Zusammensetzung der Liposomen ist hierbei entscheidend für ihr Potential zur Überwindung der Permeationsbarriere. Eine Entscheidung, welche Zusammensetzung die höchste Effizienz bei der Durchdringung der Haut bietet, ist nur durch die quantitätive und qualitative Messung der Permeationskinetik der Liposomen durch die Haut möglich. Derartige Messungen sind bisher unter realistischen Bedingungen nur in vivo im Tierversuch möglich. Hierbei werden hauptsächlich isotopenmarkierte Substanzen (meist radioaktive Tracer) verwendet, deren Konzentration nach erfolgter Permeation in Organismus bestimmt werden kann. Der technische und finanzielle Aufwand (Herstellung und Verwendung radioaktiver Tracer) für derartige Messungen ist dementsprechend hoch.

Ein häufig angewandtes in-vitro Verfahren ist die sogenannte Franz-Diffusions- Zelle (sh. z. B. Egabria, K. and Weiner, N. in "Liposome Dermatics", Braun-Falco, O., Korting, H. C. and Maibach, H. I. (Eds.) pp 172-181, Springer-Verlag Berlin, Heidelberg 1992). Hier trennt ein eingespanntes Stück Haut das Volumen einer Meßzelle (z. B. aus Teflon) in zwei völlig getrennte Kompartimente, von denen mindestens das zur dermalen Hautseite orientierte Kompartiment (Kompartiment 1) mit Nährlösung gefüllt ist. Im zweiten, zur epidermalen Seite orientierten Kompartiment (Kompartiment 2) erfolgt die Applikation der auf Permeation zu untersuchenden Substanz entweder in gelöster Form oder durch direkte Auftragung und bei Exposition dieser Hautseite zur Luft. Auch hier werden radioaktiv markierte Substanzen verwendet deren Konzentration in Kompartiment 1 zu verschiedenen Zeiten nach der Zugabe der (mit den Tracern angereicherten) Substanz in Kompartiment 2 mittels Standardmethoden bestimmt wird. Ein gravierender Nachteil der Methode ist, neben der bereits oben erwähnten Notwendigkeit des Einsatzes von radioaktiven Tracern, die geringe Zeitauflösung bei der Bestimmung vollständiger Permeationskinetiken.

Beschreibung des Verfahrens

Grundlage des neuen Verfahrens ist die etablierte Technik der abgeschwächten Totalreflektion der Infrarotspektroskopie (Griffith, P. R. and deHaseth, J. A., "Fourier Transform Infrared Spectrometry", Wiley Series in Chemical Analysis Vol. 83, John Wiley and Sons, Inc. New York). Als ATR Platte wird ein im Bereich 1000-3000 cm^-1 transparentes Material verwendet (z. B. Silizium). Das Verfahren wird auf der Basis dieser Methode erfindungsgemäß wie folgt realisiert.

Auf der Oberseite der horizontal orientierten ATR Platte wird im einfachsten Fall ein der Plattengröße entsprechend großes Stück Haut, mit der dermalen Seite zur Plattenoberfläche orientiert, aufgebracht. Die Unterseite der ATR Platte ist an eine Einrichtung zur Thermostatierung (z. B. Wasserbad oder Peltierelemente) gekoppelt, die die Temperatur des Aufbaus bei physiologisch sinnvollen Werten (37°C) konstant hält. Bei der verwendeten Haut kann es sich je nach Aufgabenstellung entweder um tierisches Material (sh. Beispiel 1), um menschliche Spenderhaut oder aber um ausdifferenzierte Keratinozytenschichten (sh. Beispiel 2) handeln. Die ATR Platte ist hierbei in eine Nährlösung so eingebettet, daß die dermale Seite der auf der Platte befindlichen Haut von der Lösung umspült wird und dadurch eine Aufrechterhaltung der biologischen Funktion und strukturellen Integrität der Haut über den Zeitraum der Messung gewährleistet ist. Die epidermale Seite der Haut wird dagegen zur Umgebung (Luft) exponiert. Auf dieser Seite wird nun eine Lösung einer auf Penetrationskinetik zu untersuchenden Substanz aufgebracht (epicutane Applikation). Voraussetzung ist, daß die zu untersuchende Substanz im Wellenzahlbereich 1000-3000 cm^-1 IR Absorptionsbanden aufweist. Diese Bedingung ist für fast alle organischen Moleküle und auch für Wasser erfüllt. Die Messung der Permeationskinetik der Substanz erfolgt durch zeitaufgelöste Fourier-Transform Infrarotspektroskopie im evaneszenten IR-Feld der ATR Platte. Die effektive Dicke d_eff (auch Eindringtiefe) des evaneszenten Feldes ist durch eine Vielzahl von Parametern bestimmt (u. a. der Brechungsindex des ATR Plattenmaterials, die Wellenlänge des IR-Lichts sowie die Plattengeometrie). Sie kann unter keinen physikalisch sinnvollen Bedingungen einen Wert von 1.0 µm überschreiten und damit nicht weiter als dieses Limit in die auf der ATR Platte befindliche Haut von der dermalen Seite aus eindringen. Die Dicke D tierischer oder menschlicher Haut ist hingegen größer als 100 µm. Hierin liegt nun die entscheidende Erkenntnis für die erfindungsgemäße Umsetzung des Verfahrens: wegen d_eff « D kann das evaneszente IR Feld mit der epicutan applizierten Substanz zunächst nicht in Wechselwirkung treten. Dies bedeutet, die auf der ATR-Platte gemessene IR Absorption ändert sich durch die epicutane Applikation zunächst nicht. Der unmittelbar nach der Applikation beginnende Permeationsprozeß der Substanz durch die Haut bringt sie jedoch schließlich in den Bereich des evaneszenten Feldes, wo sie durch ihre IR Absorption detektiert wird. Sobald die Substanz soweit durch die Haut diffundiert ist, daß sie im Bereich des evaneszenten Feldes (d. h. in den untersten Schichten der Haut, auf der unmittelbaren Kristalloberfläche) angelangt, wird es somit zu einer Erhöhung der IR Absorption kommen. Kommerziell verfügbare FT-IR Spektrometer gestatten die Messung derartiger Absorptionsveränderungen mit außerordentlicher Empfindlichkeit innerhalb von 5-10 Sekunden. Durch die zeitaufgelöste Messung kann die Veränderung der Absorption als Funktion der Inkubationszeit (d. h. nach der epikutanen Applikation der Liposomenlösung) aufgezeichnet werden. Gleichgewicht ist erreicht, wenn keine Veränderungen der Absorption mit der Zeit mehr detektiert werden können. Eine graphische Darstellung der Absorptionsänderung über die Inkubationszeit gibt dann die Kinetik der Permeation der Substanz durch die Haut. Eine quantitative Bestimmung der durch die Haut permeierten Substanzmenge ist durch eine vorherige Eichmessung möglich, bei der die Absorption der gesamten, epikutan applizierten Substanzmenge auf derselben ATR Platte vor dem Aufbringen der Haut gemessen wird. Dieser Wert kann dann mit der durch Permeation erreichten Veränderung der Absorption ins Verhältnis gesetzt und daraus die Gesamtmenge an durch die Haut diffundierter Substanz bestimmt werden.

Das beschriebene Verfahren hat gegenüber allen im Abschnitt "Stand der Technik" beschriebenen Verfahren die folgenden Vorteile.

a) Wegen der hohen Empfindlichkeit der IR Spektroskopie werden nur sehr geringe Probenmengen (mg-Bereich) und Hautmengen (ca. 1 cm²) benötigt.
b) Die hohe Zeitauflösung der Methode gestattet eine genaueste Untersuchung der Permeationskinetik.
c) Permeationsuntersuchungen können in Abhängigkeit von der Temperatur der Haut durchgeführt werden.
d) Die epidermale Seite der Haut kann mit Luft in Berührung sein. Damit ist ein realistisches Modellsystem geschaffen, welches insbesondere den asymmetrischen Aspekt der Hauffunktion, die Trennung zwischen einem wäßrigen Kompartment (Organismus) und der Luft, widerspiegelt.
e) Die Verwendung radioaktiv markierter Substanzen entfällt.

Beispiele 1. Messung der Permeation einer DMPC Liposomendispersion durch die Haut

Für die Messung wird ein kommerziell verfügbarer horizontaler ATR Aufbau (Fa. LOT Darmstadt) mit einem Silizium Kristall der Dimension 80 × 10 × 3 mm³ als ATR Platte verwendet. Die Temperaturregelung der Platte wird durch einen von unten an die Platte befestigten wasserdurchströmten Kupferblock erreicht, der wiederum an einen Wasserbad-Thermostaten angeschlossen ist und auf 37°C gehalten wird. Die Oberseite der ATR Patte ist wasserdicht in einen rechteckigen Teflontrog der Größe L × B × H = 150 × 90 × 15 (Maße in mm) so angeordnet, daß die Plattenoberseite bündig in den Boden des Teflontrogs eingelassen ist. Dieser Trog wird mit Nährlösung (z. B. Ringer Puffer) ca. 1-2 mm hoch gefüllt. Dann wird ein ca. 70 × 10 mm großes Stück Haut mit der epidermalen Seite nach oben in den Trog auf die ATR Platte gelegt. Das Hautstück wird dabei vollständig von der Nährlösung umschlossen. Anschließend wird auf die Haut von oben ein kleiner Teflonrahmen L × B × H = 55 × 8 × 10 (Maße in mm) gelegt und durch geeignete Klemmen fixiert, der nun ein Stück Hautoberfläche (epidermale Seite) wasserdicht von der Umgebung seitlich abtrennt. Die noch in dem gebildeten Kompartiment befindliche Nährlösung kann nun abgesaugt werden, der Teflonrahmen verhindert ein Nachsickern von außerhalb des Kompartiments befindlicher Nährlösung und sorgt gleichzeitig für eine Fixierung der Haut auf der Oberfläche der ATR Platte. Danach ist die innerhalb des Kompartiments befindliche Hautoberfläche direkt zur Luft exponiert und ist nun für die Aufbringung der zu testenden Liposomendispersion bereit. Eine schematische Darstellung des experimentellen Aufbaus ist in Abb. 1 gezeigt.

Als Liposomendispersion werden kleine unilamellare Vesikel aus Dimyristoyl- Phosphatidylcholine mit perdeuterierten Fettsäureketten (DMPC-d54) in Wasser (Konzentration 10 mg DMPC pro ml) verwendet. Von dieser Dispersion werden 200 µl auf der zur Luft exponierten Hautoberfläche (epidermale Seite) im Kompartiment aufgebracht (= Zeitnullpunkt für den Beginn der Permeationsmessung).

Die Messung der Permeationskinetik erfolgt mittels eines kommerziell verfügbaren FT-IR Spektrometers (z. B. Nicolet 60 SXR), welches zur Erhöhung der Empfindlichkeit mit einem MCT Detektor ausgerüstet ist, bei einer Auflösung von 4 cm^-1. Pro Meßintervall werden 500 Interferogramme akkumuliert und im Computersystem abgespeichert. Dies entspricht einer Meßzeit von ca. 2 Minuten Es werden insgesamt 200 derartige Meßintervalle hintereinander aufgenommen und separat abgespeichert. Die pro Meßintervall durch Fourier-Transformation erhaltenen Spektren werden im Bereich 2000-2300 cm^-1 auf Absorptionsbanden untersucht. In diesem Bereich liegen außer den Deuteromethylen Streckschwingungsbanden der perdeuterierten Fettsäureketten des DM PC-d54 keine anderen Absorptionsbanden, wodurch eine Zuordnung besonders einfach ist. In den Spektren, die unmittelbar nach der Applikation der Liposomendispersion gewonnen wurden, ist in diesem Wellenzahlbereich noch keinerlei Signal nachweisbar. Mit zunehmender Inkubationszeit wächst hier ein Signal durch jene DMPC-d54 Vesikel, die bereits durch die Haut bis in den Bereich des evaneszenten IR-Feldes permeieren konnten. Für jedes Spektrum wird die Intensität der symmetrischen CD₂ Streckschwingung bestimmt und gegen die Inkubationszeit (ergibt sich aus Anzahl der vorangegangenen Meßintervalle und der Meßzeit pro Intervall) graphisch aufgetragen. Das Ergebnis ist die Permeationskinetik der DMPC-d54 Dispersion durch die verwendete Haut bei 37°C. In einer separaten Messung wird nach Entfernen der Haut von der ATR Patte die Absorptionsintensität von 200 µl der DMPC-d54 Dispersion (symmetrische CD₂ Streckschwingung) bestimmt. Diese Intensität kann mit den im Permeationsexperiment bestimmten Intensitäten ins Verhältnis gesetzt werden, woraus sich absolute Menge an permeierten Material ergibt.

2. Messung der DMPC Liposomenpermeation durch ein Modellsystem für menschliche Haut

Hierzu wird analog zu dem unter 1. aufgeführten Beispiel vorgegangen. Der wesentliche Unterschied liegt darin, daß nun statt eines Stückes Haut eine auf der ATR Platte in Zellkultur gezüchtete Schicht aus ausdifferenzierten menschlichen Keratinozyten, den eigentlichen Hautzellen, verwendet wird. Das Wachstum einer Keratinozytenschicht in Zellkultur auf einem festen Substrat (in diesem Beispiel die Silizium ATR Platte) innerhalb weniger Tage auf die erforderliche Größe (ca. 2-3 cm²) und mit einer Dicke von ca. 20 µm ist Stand der Technik (H. Green, "Zellkulturen für Transplantate" in Spektrum der Wissenschaft, Januar 1992, Verlag Chemie Weinheim).

Die mit der geschlossenen Keratinozytenschicht bedeckte ATR Platte wird analog zu obigen Beispiel angeordnet und durch Auflegen des Teflonrahmens wird ein Teil der Oberfläche zur Luft exponiert. Die Messung der DMPC-d54 Liposomen permeation erfolgt dann analog zum Beispiel 1. Eine typische, auf diese Weise bei 37°C erhaltene Permeationskinetik ist in Abb. 2 dargestellt. Der Vorteil der Verwendung von Keratinozytenschichten anstelle von intakter Haut liegt einerseits in deren praktisch unbegrenzter Verfügbarkeit durch Vermehrung in Zellkulturen und weiterhin in der aus ihrer geringeren Dicke und dem Fehlen des Stratum Corneum resultierenden höheren Permeabilität für die Liposomen im Vergleich zu Haut. Letzteres reduziert die Meßzeit beträchtlich, bei gleichzeitiger weitgehender Erhaltung der typischen funktionellen Eigenschaften einer Hautschicht und prädestiniert die Keratinozytenkulturen als Modellsystem für rasche screening Tests bezüglich der Permeabilität von Liposomen und anderen Wirkstoffen.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung der Permeationskinetik und des Transportes von Substanzen durch Hautschichten, dadurch gekennzeichnet, daß

a) ein Stück Haut auf einer horizontal orientierten ATR Platte fixiert wird und
b) eine Lösung oder Dispersion einer auf Permeation durch die Haut zu untersuchenden Substanz, die IR Absorption im mittleren IR Bereich (1000-4000 cm^-1) aufweist, auf die der Plattenoberfläche abgewandten Hautseite aufgetragen wird und
c) die etablierte Technik der abgeschwächten Totalreflektion (ATR) der Infrarotspektroskopie in Kombination mit zeitaufgelöster Fourier-Transform IR Detektion zur Messung der Permeation und ganz speziell der Permeationskinetik der Substanz durch die Haut eingesetzt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1a, dadurch gekennzeichnet, daß anstelle der Haut andere flächenhaft ausgedehnte organische oder anorganische Schichtsysteme und ganz speziell solche mit biologischer Relevanz wie z. B. Fibroblastenschichten, Keratinozytenschichten, Lipidschichten oder andere aus dem pflanzlichen, tierischen und ganz speziell menschlichen Organismus entstammenden Gewebeschichten verwendet werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1b, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der zu untersuchenden Substanz um organische Moleküle und ganz speziell um Alkohole, Zuckerverbindungen, Fettsäuren, Tenside, Lipide, Steroide, Peptide, Proteine, Nukleinsäuren oder Mischungen aus diesen Substanzen handelt.

4. Verfahren nach Anspruch 1b, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der zu untersuchenden Substanz um Wasser oder schweres Wasser (Deuteriumoxid) handelt.

5. Verfahren nach Anspruch 1b, dadurch gekennzeichnet, daß die zu untersuchende Substanz in einer kolloiden Formulierung (z. B. mizellare Lösung, Mikroemulsion, Makroemulsion oder Liposomen) vorliegt oder als solche auf der Hautoberfläche aufgebracht wird.

6. Verfahren nach Anspruch 1c, dadurch gekennzeichnet, daß die Permeationskinetik durch Differenzbildung der Spektren aufeinander folgender Meßintervalle bestimmt wird, d. h. die Differenz der Intensitäten der jeweils von der permeierenden Substanz hervorgerufenen Signale im Meßintervall n abzüglich der im Meßintervall n-1 wird als Maß für die in der Zeitdifferenz zwischen beiden Intervallen erfolgte Permeation der Substanz interpretiert.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als ATR Plattenmaterial Kristalle aus Silizium, Zinkselenid oder Germanium verwendet werden.

8. Verfahren nach mindestens einem der vorausgegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die auf der zur Messung verwendeten ATR Platte in Zellkultur gezüchteten Keratinozyten schichten menschlichen oder tierischen Ursprungs als ein Modellsystem für die Untersuchung des Permeationsverhaltens von Substanzen durch Hautschichten und ganz speziell zur Bestimmung der Liposomenpermeation angewandt werden.

9. Verfahren nach mindestens einem der vorausgegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die zu untersuchenden Substanzen teilweise oder vollständig isotopensubstituiert und ganz speziell teilweise oder vollständig deuteriert sind.