DE4416393A1 - Verfahren zum Untersuchen von chromosomaler DNA - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Untersuchung von Abschnitten des Säugetiergenoms, insbesondere des menschlichen Genoms.

Die Klonierung von chromosomalen Subregionen bis zur Sättigung ist abhängig von der Komplexität und Qualität der für das Hybridisierungsscreening verwendeten, lange Klone enthaltenden Libraries. Bis heute waren Cosmide (Murray et al., 1983) und sogenannte "Yeast Artificial Chromosomes" (YACs, künstliche Hefechromosome; Burke et al., 1987) die bevorzugten Vektorsysteme, die routinemäßig für das Klonieren von DNA mit hohem Molekulargewicht verwendet wurden. Jedes dieser Systeme weist jedoch Nachteile auf. Da Cosmidvektoren keine DNA- Inserts größer als 40 kb aufnehmen (Whittaker et al., 1988), unterliegt ihre Verwendung für die Analyse einer großen Genregion Beschränkungen. Das YAC-Klonsystem läßt zwar viel größere Inserts zu (bis zu 1 Mbp); Untersuchungen haben jedoch gezeigt, daß YAC-Klone mit hoher Frequenz (z. B. Green et al., 1991) chimär sind, d. h. innerhalb eines Klones nicht-zusammengehörige Fragmente enthalten, und/oder Deletionen und interne Rearrangements zeigen.

Die bisher verfügbaren Klone sind auch in ihrem Einsatz bei Diagnoseverfahren, insbesondere nicht-radioaktiven in situ-Hybridisierungsmethoden, Beschränkungen unterworfen: Cosmidklon-Fragmente sind oft zu kurz, so daß die daran gebundene Markierung mitunter nicht ausreicht, auswertbare Signale zu erhalten; die YAC- Klone hingegen geben aufgrund ihrer großen Länge oft diffuse Signale.

Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, ein neues Verfahren auf der Grundlage einer nicht­ radioaktiven in situ-Hybridisierung bereitzustellen.

Für die Lösung der gestellten Aufgabe wurde zunächst eine humane P1-Library auf ihre Eignung für Hybridisierungsscreens, bezüglich derer bis heute keine Information vorliegt, getestet. Das P1-Klonierungssystem wurde als Alternative zu den Cosmid- und YAC- Klonierungssystemen konstruiert (Sternberg et al., 1990; Pierce und Sternberg, 1992); es verwendet als Vektor den Bakteriophagen P1, der die Klonierung von Inserts einer Größe bis zu 100 kbp ermöglicht. Zunächst wurde im Rahmen der vorliegenden Erfindung die humane P1-Library für Hybridisierungsscreenings verwendet, wobei 80 Mikroklonsonden aus der Chromosomenregion 1p36 für die Hybridisierung verwendet und dabei insgesamt 87 P1-Klone isoliert wurden. Mittels Fluoreszenz-in situ- Hybridisierung (FISH) wurden 46 P1-Klone auf humane Metaphase-Chromosomen kartiert. Aufgrund dieser umfangreichen Analyse war es möglich, die Qualität der verwendeten humanen P1-Library (erhältlich von der Reference Library Database, ICRF, London, UK) hinsichtlich Komplexität, Größe der Kloninserts und Chimärismusrate zu beurteilen. Das Ergebnis dieser Analyse stellt die Voraussetzung für den Einsatz von P1-Klonen für Verfahren dar, in denen markierte Hybridisierungssonden auf Chromosomenabschnitten und insbesondere im Interphasechromatin sichtbar gemacht werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Untersuchung von chromosomaler DNA mittels nicht­ radioaktiver in situ-Hybridisierung. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man als Hybridisierungssonde P1-Klon-DNA verwendet.

Das Verfahren kommt insbesondere für die Genomanalyse sowie für die Diagnose von Erkrankungen, die auf Chromosomenaberrationen zurückzuführen sind, zum Einsatz.

Als Verfahren eignen sich grundsätzlich alle bekannten Verfahren, in denen Nukleinsäuresonden, die mit einer nicht-radioaktiven Markierung versehen sind, nach Anlagerung an die genomische DNA sichtbar gemacht werden. Derartige Verfahren stehen in großer Auswahl zur Verfügung, eine Übersicht über solche Verfahren ist z. B. dem Artikel von Lichter et al., 1991, zu entnehmen; es wird auf die in diesem Übersichtsartikel zitierten Originalartikel verwiesen.

In einer bevorzugten Ausgestaltung wird das Verfahren als Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung eingesetzt. Das Prinzip dieser Methode ("FISH") besteht darin, DNA- Sonden auf Chromosomabschnitten mittels Fluoreszenzfarbstoffen sichtbar zu machen, entweder direkt, wobei die Hybridisierungssonde selbst die Fluoreszenzmarkierung trägt, oder indirekt, z. B. mittels immunologischer Methoden. Beispiele für Ausführungsformen der FISH-Methode werden u. a. von Lichter et al., 1992, beschrieben.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung konnte die effiziente und einfache Anwendung von P1-Klonen als Sonden für die Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung mit Metaphase-Präparaten und Interphasenkernen gezeigt werden. Die Intensität der Fluoreszenzsignale war sehr hoch, die Hybridisierungseffizienz aller ausgewerteten Klone betrug annähernd 100%.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde im Hinblick auf die Sättigungsklonierung einer begrenzten Genomregion von 20 bis 25 Mbp eine neue Methodenkombination, bestehend aus Mikroklonierung und einer Library aus P1-Klonen, eingesetzt. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist somit ein Verfahren zum Isolieren einer möglichst vollständigen Anzahl von Klonen aus einer P1-Klon-Library aus einem definierten Chromosomenabschnitt, bei dem man als Hybridisierungssonden Mikroklone aus diesem Abschnitt verwendet. Die Herstellung von Mikroklonen wurde u. a. von Weith et al., 1989, beschrieben.

Unter Verwendung von 80 Sonden aus einer 1p36- spezifischen Mikroklonlibrary wurde im großen Maßstab ein Hybridisierungsscreening mit einer P1-Library, die in hoher Klondichte auf Matrixfiltern plattiert war, vorgenommen. Eine detaillierte Charakterisierung der isolierten P1-Klone, insbesondere mittels FISH-Analyse, lieferte umfassende Informationen über die Verwendbarkeit des P1-Klonierungssystems sowohl für die Genomanalyse als auch für diagnostische Methoden. Während der im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten verschiedenen Hybridisierungsserien stellte sich heraus, daß die Hybridisierungssignale auf positiven P1-Kolonien bereits nach sehr kurzen Expositionszeiten deutlich über dem Signalhintergrund lagen; außerdem waren die Signale klar und eindeutig. (Die Ergebnisse der FISH-Analyse zeigten, daß alle getesteten P1-Klone in der untersuchten Zielregion 1p36 kartieren, was darauf hindeutet, daß kein falscher positiver Klon isoliert worden war.) Dies zeichnet das P1-Klonierungssystem gegenüber dem YAC-System aus, dessen Hybridisierungssignale aufgrund der größeren Länge mitunter diffus erscheinen. Die P1-Klone haben auch den Vorteil, daß die Inserts während des Wachstums und der Lagerung der Klone stabil zu sein scheinen, d. h. nicht deletieren oder reagieren. Die durchgeführten Untersuchungen erbrachten keinen chimären Klon. (Selbst wenn, bei Verwendung von Endfragmenten von P1-Inserts als Sonden, geringfügige Fälle von Chimärismus auftreten sollten, wäre das P1-System diesbezüglich dem YAC- System, das in der Region 1p36 eine beträchtliche Chimärismusrate aufweist, überlegen.)

Die Herstellung von Sonden von P1-Klon-DNA für FISH stellte sich als überraschend einfach heraus. Die Fluoreszenzsignale von direkt nick-translatierten P1-Klon-DNAs waren bemerkenswert stark und mit denen alphoider DNA-Sonden vergleichbar. Verglichen mit den Eigenschaften der Signale anderer Klontypen, wie Cosmiden, erwiesen sich die P1-Klonsignale als viel intensiver und, unter Verwendung von Standardfluoreszenzmikroskopie, wesentlich leichter auswertbar. Eine vergleichbar hohe Hybridisierungseffizienz kann nur mit Alu-PCR- amplifizierten YAC-Klonen erreicht werden (Lengauer et al., 1992a und 1992b); die Verwendung von P1-Klonen ist jedoch sowohl einfacher als auch weniger zeitaufwendig.

Die Nachweiseffizienz von P1-FISH-Sonden in den durchgeführten Versuchen betrug 84 bis 97% in Interphasenkernen; die Interphasenfluoreszenzsignale waren deutlicher als die von YAC-Klonen, welche häufig fleckig-diffuse Signale geben. Für die meisten Sonden konnte eine eindeutige Berechnung der Zahl der Signale pro Kern durchgeführt werden; dies ist eine weitere Voraussetzung für den diagnostischen Einsatz von P1-Klonen in der FISH-Diagnostik. Das mit P1-Klonen erhaltene Signal ist, bedingt durch deren Länge, stark genug, um ohne elektronische Hilfsmittel sichtbar gemacht werden zu können. Es kann eine Auswertung mit bloßem Auge in der normalen Auflichtfluoreszenz vorgenommen werden. Andererseits sind die Klone hinreichend klein, um ein begrenztes Signal zu liefern. Die Markierungsmenge ist jedenfalls groß genug, um eine hohe, den alphoiden DNA-Sonden gleichwertige Nachweiseffizienz zu erreichen. Diese Gleichwertigkeit in der Effizienz verleiht der Kombination von P1-Klonen mit centromerischen, hochrepetitiven Sonden in Mehrfarben-FISH-Experimenten einen hohen Aussagewert in der cytogenetischen Diagnostik.

Aufgrund dieser Eigenschaften von P1-Sonden, insbesondere der bemerkenswerten Signalintensität, stellen sie ein ideales Werkzeug für die Interphasenzytogenetik dar und sind daher wertvoll für klinische und pränatale Diagnostik sowie für andere diagnostische Systeme, z. B. für die Tumorinterphasen- Zytogenetik.

Die Erfindung betrifft in einem weiteren Aspekt Kits für die nicht-radioaktive in situ Hybridisierung, insbesondere für die Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung.

Ein FISH-Kit enthält in einer bevorzugten Ausführungsform jeweils in getrennten Behältern a) einen oder mehrere P1 Klon(e), der (die) mit der fraglichen Sequenz in der zu untersuchenden Chromosomenregion hybridisiert(en) und mit einer direkt oder indirekt mittels Fluoreszenzmikroskopie nachweisbaren Markierung, z. B. Biotin, versehen ist (sind); b) eine mit einer anderen sichtbar zu machenden Markierung, z. B. Digoxigenin, versehene Referenzsonde, z. B. alphoide DNA (die Referenzsonde enthält chromosomenspezifische repetitive DNA-Sequenzen, z. B. centromerische Sequenzen, und liefert somit mit hoher Effizienz locusspezifische Signale; derartige DNA-Sonden werden üblicherweise verwendet, um numerische Chromosomenaberrationen zu erfassen); c) gegebenenfalls Competitor-DNA, wie Cot1- DNA (z. B. erhältlich bei GIBCO-BRL), die aufgrund ihrer Zusammensetzung aus hochrepetitiven DNA-Fragmenten die auf dem Chromosom vorhandenen repetitiven Sequenzen absättigt (damit wird mit den markierten Sonden nur auf spezifischen Chromosomabschnitten ein Signal erhalten); d) handelsübliche Hybridisierungsreagentien, wie SSC, Formamid, Dextransulfat.

Das erfindungsgemäße Verfahren sowie die zu seiner Durchführung geeigneten Kits können für die Diagnose sämtlicher durch Chromosomenaberrationen verursachter Krankheiten eingesetzt werden. Beispiele dafür sind Neuroblastom (Weith et al., 1989), DiGeorge Syndrom (Carey et al., 1992), Malignes Melanom (Guan et al., 1992), Wilms′Tumor (Riccardi et al., 1978), Darmkrebs (Baker et al., 1989; Leister et al., 1990), Brustkrebs (Devilee et al., 1991), Hepatome (Fletcher et al., 1991; Simon et al., 1991) und Rhabdomyosarkome (Biegel et al., 1991).

Die Erfindung kann ferner eingesetzt werden, um als Kartierungswerkzeug Aberrationen, die mittels herkömmlicher zytogenischer Methoden gefunden wurden, näher einzuengen bzw. direkt nach einem aberranten Gen zu suchen. Die geeignete Auswahl von P1-Klon-Paaren, z. B. telomerisch und centromerisch zu Translokationsbruchpunkten, für FISH auf dem aberranten Karyotyp erlaubt die Eingrenzung des Bruchpunktes auf einen Genomabschnitt minimaler Größe. Beispielsweise können Sonden spezifisch für PAX-7, HSPG2, ENO1, CDC2L1 oder D1Z2 zur genauen Lokalisation Neuroblastom- spezifischer Translokationen oder Deletionen benutzt werden.

Figurenübersicht

Fig. 1 Sekundärer Hybridisierungsscreen von P1-Klonen,

Fig. 2 Größenbestimmung von P1-Kloninserts,

Fig. 3 Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele illustriert.

Beispiel 1 Hybridisierungsscreening von P1-Klonen

Um eine hohe Dichte von DNA-Markern für den distalen Abschnitt des kurzen Arms von Chromosom 1 zu erhalten, wurden mittels Mikrodissektion und Mikroklonierung der chromosomalen Region 1pter-p35 (Weith et al., 1989) und 1pter-p36.2 (Weith et al., 1989; es wurde die Zellinie der Bezeichnung KK 609, bezogen von der ECACC, verwendet) 3500 Lambda-Bakteriophagen-Klone hergestellt. Aus diesen Libraries wurden 80 nicht­ überlappende DNA-Mikroklonsonden (die Einzelkopie-DNA enthielten) mit einer Durchschnittsgröße von 2.3 kbp (Bereich 0.3 bis 9.0 kbp) zufällig ausgewählt. 43 der Bakteriophagen-Inserts waren in einen Bluescript-Vektor subkloniert worden, die Inserts der restlichen 37 Klone wurden mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung von Primern 5′ und 3′ zur Klonierungsstelle des Bakteriophagen-Vektors (Kuziel und Tucker, 1987) amplifiziert. Die Sonden wurden mittels Random Priming mit ³²P-dCTP markiert (Feinberg und Vogelstein, 1983).

Auf der Grundlage der Southern-Hybridisierungssignale der einzelnen Sonden wurden 10 Pools, bestehend aus je 8 DNA-Sonden, die ähnlich starke Hybridisierungsmuster liefern, zusammengestellt: um als Hybridisierungssonden für die P1-Matrix-Filter zu dienen. Um die Sonden radioaktiv zu markieren, wurden je 50 ng der acht Klon- DNAs innerhalb eines Pools mit ³²P-dCTP markiert (Feinberg und Vogelstein, 1983) und jede Probe für sich 30 min lang bei 68°C mit 4 µg gescherter Vektor-DNA (Größe: 300 bp, Bluescript, Stratagene) und, wenn nötig, d. h. wenn das Signal diffus war, mit titrierten Mengen von cot1-DNA (BRL/Life Technologies), prä-competiert. Anschließend wurden die Proben gepoolt und nach Standardvorschriften hybridisiert (Church und Gilbert, 1984). Das Waschen nach der Hybridisierung erfolgte mit 40 mM Natriumphosphat, 0.1% SDS bei 65°C für 2 × 40 min. Die Filter wurden dann auf einen Röntgenfilm (Kodak X-Omat AR) verschiedene Zeitspannen (4 h bei Raumtemperatur bis 3 Tage bei -70°C) lang belichtet.

Diese "Pools von acht" wurden als Sonden mit der humanen P1-Library von ICRF hybridisiert.

Es wurde von einer humanen P1-Library ausgegangen, die nach dem u. a. von Sternberg et al., 1990, und Pierce und Sternberg, 1992 beschriebenen Prinzip aus der lymphoblastoiden Zellinie GM1416B (Human Genetic Cell Repository, Camden, N.J.) hergestellt wurde und die beim Reference Library System des Genome Analysis Laboratory, ICRF, erhältlich ist (Zehetner und Lehrach, 1994). Die verwendete P1-Library besteht aus ca. 47 000 P1-Klonen, von denen 41 400 in hoher Dichte mittels Roboter nach der von Hoheisl et al., 1993 beschriebenen Methode auf zwei 22 × 22 cm große Membranen gespottet worden waren. Die 41.400 Klone entsprechen etwa einem Genom- Äquivalent: In Abhängigkeit von der Qualität der Membranen können bis zu acht Hybridisierungen pro Filter durchgeführt werden. Für die vorliegenden Ausführungsbeispiele wurden insgesamt fünf verschiedene Filtersets verwendet.

Im ersten Screening wurden 152 positive P1-Klone identifiziert. Die Zahl der positiven Signale pro "Pool von acht" schwankte zwischen 7 und 25 (Tabelle 1). 133 (von den 152) P1-Klonen wurden einem zweiten Screening unterworfen (19 Klone wurden verworfen, weil sie Probleme bei der Propagierung machten).

Für das zweite Screening wurden einzelne Klone der "Pools von acht" auf Filter hybridisiert, die lysierte Kolonien von allen P1-Klonen enthielten, die im jeweiligen ersten Screening nachgewiesen worden waren. Diejenigen positiven P1-Klone, die von jedem Screen durch Hybridisierung der "Pools von acht" gefunden worden waren, wurden als Einzelkolonien vom ICRF bezogen und jeder Klon für sich über Nacht in LB-Medium, enthaltend 25 µg/ml Kanamycin, bei 37°C kultiviert. Aliquots von 0.5 µl pro einzelner Kolonie wurden auf Reihen von kleinen Membranen (GreenScreen plus) gespottet und über Nacht auf LB und Kanamycin enthaltendem Agar bei 37°C gezüchtet. Nach Bindung der Kolonie-DNA an die Membran mittels Denaturierung und Renaturierung, durchgeführt nach Standardvorschriften, wie von Sambrook et al., 1989, beschrieben, wurden die einzelnen Filter mit Mikroklonsonden vom jeweiligen Hybridisierungspool hybridisiert, um die entsprechenden P1-Klone nachzuweisen. Die DNA jener P1-Klone, die in diesem Sekundärscreen positiv waren, wurde mittels einer modifizierten Version der alkalischen Lyse-Vorschrift (Pierce und Sternberg, 1992) präpariert.

Fig. 1 zeigt die Autoradiogramme von 6 (von insgesamt 8) Mikroklonsonden-Hybridisierungen von Pool Nr. 10. Die Mikroklonsonde der Bezeichnung p1-06 identifizierte keinen einzigen P1-Klon (Fig. 1f), ebensowenig die Sonden der Bezeichnung p1-07 und p1-08 (nicht in der Figur dargestellt). Die Sonde p1-01 und p1-02 identifizierten je zwei P1-Klone (Fig. 1a, b), während die Sonde p1-03 und p1-04 nur je einen Klon identifizierten (Fig. 1c, d). Die Hybridisierung der Mikroklonsonde p1-05 ergab sieben positive P1-Klone (Fig. 1e). Zwei (von 15) P1-Klonen, die im ersten Screening positiv gewesen waren, konnten durch keine der acht Mikroklonsonden im zweiten Screening nachgewiesen werden.

Insgesamt 36 P1-Klone (27%), die im ersten Screen positive Signale gaben, konnten im zweiten Screen nicht als positiv bestätigt werden. Es wurden schließlich 97 von den 133 untersuchten P1-Klonen bestätigt und durch 41 einzelne Mikroklonsonden identifiziert (Tabelle 1). Diese 41 DNA-Sonden wiesen zwischen 1 und 7 P1-Klone nach (durchschnittlich 2.4 P1-Klone pro DNA-Sonde), während mit den anderen 39 DNA-Sonden keine korrespondierenden P1-Klone gefunden werden konnten. Aus dem zweiten Screen ergab sich auch, daß von den 97 P1-Klonen zehn Klone durch Sonden von verschiedenen Pools zweimal nachgewiesen wurden, womit sich die Gesamtzahl an Positiven auf 87 reduziert.

Beispiel 2 Größenbestimmung der P1-Kloninserts

Für die Größenbestimmung der klonierten Inserts wurde die DNA von 50 P1-Klonen mit 20 Einheiten NotI 3 h lang bei 37°C verdaut und durch Feldinversionsgelelektrophorese ("Field Inversion Gel Electrophoresis", FIGE: 1% Agarosegel bei 200 V, 161 mA, 1) 12 sek vorwärts, 4 sek rückwärts 8 h lang; 2) 6 sek vorwärts, 2 sek rückwärts 13 h lang; 3) 3 sek vorwärts, 1 sek rückwärts 3 h lang) fraktioniert. Das Ergebnis der Fraktionierung ist in Fig. 2 dargestellt: Spur A: Lamda-Leiter (New England Biolabs); Spur B: Hochmolekulargewichtsmarker (Gibco BRL/Life Technologies). Die analysierten P1-Klone zeigten eine durchschnittliche Insertgröße von 73 kbp. Tatsächlich betrug die Größe zwischen 22 kbp und 95 kbp, wobei jedoch nur 5 Klone Inserts kürzer als 50 kbp waren.

Beispiel 3 Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH)

In diesem Beispiel wurde mittels FISH die Lage der P1-Klone in 1p36 überprüft und die Chimärismusrate bestimmt. Dabei wurde wenigstens ein P1-Klon pro einzelnem Mikroklon analysiert; auf diese Weise wurde eine möglichst umfangreiche Information über die positiven Klone erhalten. 46 Klone wurden mittels FISH-Analyse der Prometaphasenchromosomen kartiert.

Es wurden die folgenden Methoden verwendet. (Wenn nicht anders angegeben, wurde nach Vorschrift des Herstellers vorgegangen.)

i) Markierung der Sonden für FISH

Die P1-Klon-DNA wurde mit Bio-11-dUTP (Sigma) oder dig-11-dUTP (Boehringer Mannheim) durch Nicktranslation markiert (Lichter et al., 1992). Die Plasmidsonde pucl.77, die die perizentromere Region des humanen Chromosom 1 enthält (Cooke und Hindley, 1979), wurde mit dig-11-dUTP nicktranslatiert.

ii) Humane Metaphase-Präparate und Interphasenkerne

Humane Metaphase-Präparate und Interphasenkerne wurden aus Phytohämagglutinin-stimulierten normalen humanen Blutlymphozyten, aus der lymphoblastoiden Zellinie KK 609 (bezogen von der ECACC) und aus Knochenmarkbiopsiematerial von Neuroblastompatienten präpariert. Dabei wurden Standardtechniken (Colcemidbehandlung, hypotonische Behandlung, Methanol/Essigsäurefixierung und Ausstreichen auf Objektträger, wie von Cremer et al., 1988, beschrieben) verwendet. Die Präparate wurden in 70%igem Ethanol bei 4°C gelagert. Vor der Verwendung wurden die Objektträger mit RNase A (100 µg/ml) in 2×SSC 60 min lang bei 37°C vorbehandelt, gefolgt von einem Pepsinverdau (50 µg/ml) in 0.01 M HCl für 10 min bei 37°C, und einem Nachfixierungsschritt in 1% säurefreiem Formaldehyd in 1×PBS/50 mM MgCl₂ für 10 min bei Raumtemperatur (Wiegant et al., 1991).

iii) Hybridisierung

Hybridisierung und Nachweis der Sonden wurden durchgeführt, wie von Lichter et al., 1992, beschrieben, wobei die folgenden Modifikationen vorgenommen wurden: 50 bis 100 ng markierter P1-Klon-DNA zusammen mit verschiedenen Mengen (1 bis 5 µg) einer unmarkierten Cot1-DNA-Fraktion wurden in 10 µl 50% Formamid, 10% Dextransulfat und 2×SSC gelöst. Die DNA-Mischung wurde 5 min bei 75°C denaturiert und zum Prä-Annealen 30 min bei 37°C inkubiert. Für die Zwei-Farben-FISH-Experimente wurden der Hybridisierungsmischung als Referenzsonde 5 ng markierte und denaturierte (75°C während 5 min) Pericentromer-Sonden-DNA (gelöst in 50% Formamid, 10% Dextransulfat und 2×SSC) unmittelbar vor der Aufgabe auf den Objektträger beigegeben. Die Denaturierung der Zellen wurde bei 73°C in 50% Formamid 2×SSC (pH 7.0) durchgeführt. Die Hybridisierung fand bei 37°C während 15 h statt.

iv) Immunologischer Nachweis

Die Objektträger wurden 3 × in 50% Formamid, 2×SSC bei 45°C gewaschen, gefolgt von drei Waschvorgängen mit 0.1×SSC bei 60°C. Dann wurden die Objektträger 30 min bei 37°C in 4×SSC, 5% bovinem Serumalbumin vorinkubiert, gefolgt von drei Schichten immunologischen Nachweisreagentien: 1.: Avidin-FITC (VECTOR), 2.: Biotinyliertes Ziegen-anti-Avidin (VECTOR), 3.: Avidin- FITC. Zwischen den Wechseln wurden die überschüssigen Antikörper durch drei Waschschritte (37°C, 5 min) im selben Puffer wie für den immunologischen Nachweis entfernt (4×SSC, 0.1% Tween 20). Biotinylierte Sonden wurden mit Avidin (Vektor), konjugiert mit Fluoreszeinisothiocyanat (FITC), nachgewiesen. Die FITC- Signale wurden 1 × verstärkt (Pinkel et al., 1988). Digoxigenin-markierte Sonden wurden durch indirekte Immunfluoreszenz unter Verwendung von Maus-anti-Digoxin (Sigma) und Kaninchen-anti-Maus IgG-TRITC (Sigma) nachgewiesen. Nach dem Nachweis des Signals wurden die Zellen gegengefärbt mit 0.1 µg/ml 4,6-Diamidino-2- Phenylindol-Dihydrochlorid (DAP1) gegengefärbt. Die Zellen wurden in Fluoreszenz-anti-Fading-Puffer (1 mg p-Phenylendiamin in 1 ml Glyzerinpuffer, pH 8.0) eingedeckt (Lichter et al., 1992).

v) Konventionelle und digitale Fluoreszenzmikroskopie

Die Signale wurden mit einem Zeiss Axiophot Epifluoreszenzmikroskop, ausgestattet mit einer 100 W Quecksilberlampe, ausgewertet. Für die digitale Fluoreszenzmikroskopie wurde eine gekühlte CCD-Kamera (Photometrics, Tuscon, USA), ausgestattet mit einem Kodak KAF 1400 Chip, auf dem Mikroskop verwendet. Um eine digitale Bildumwandlung im "TIFF"-Format zu erhalten, wurde das Softwarepaket Nu200 2.0 (Photometrics) verwendet. Die Schwarz-Weiß- Fluoreszenzbilder wurden unter Verwendung des Zeiss- Filtersets 01 (BP 365, FT 395, LP 397) für die DAPI- Signale, des Filtersets 15 (BP 546, FT 580, LP 590) für die Rhodaminsignale und des Filtersets 09 (BP 450-490, FT 510, LP 515-565) für die FITC-Signale aufgezeichnet. Nach dem Formatwechsel von TIFF zu PICT wurde die weitere Verarbeitung der Bilder, einschließlich Überlagerung und Darstellung in Falschfarben mit dem Softwarepaket "Gene Join", wie von Ried et al., 1992, beschrieben, vorgenommen.

• a) Alle 46 P1-Klone, die für die FISH-Analyse von Metaphase-Präparaten aus normalen humanen Lymphozyten kartierten in der Chromosomenregion 1p36. Keiner dieser Klone erzeugte weitere Signale irgendwo anders im Genom; dies läßt vermuten, daß alle getesteten Klone nicht­ chimär sind. (Tatsächlich zeigten drei P1-Phagen Hybridisierungssignale auf den Telomeren verschiedener Chromosome, einschließlich des 1p Telomers. Da jedoch alle drei dieser Klone mit Hilfe derselben Mikroklonsonde identifiziert worden waren, wurde angenommen, daß die komplexen, Telomer-assoziierten Hybridisierungsmuster auf eine Kreuzhybridisierung von konservierten telomerischen oder subtelomerischen Sequenzen, die auch auf anderen Chromosomen vorhanden sind, zurückzuführen sind.) Nach FISH-Analyse der 46 biotinylierten P1-Klone auf je 50 Metaphasen aus normalen humanen Lymphozyten ergab sich, daß alle Metaphasen die erwarteten Signale auf beiden Chromatiden jedes der homologen Chromosomen zeigten; diese Signale waren bereits bei Standard-Auflichtfluoreszenz ohne Verwendung der CCD-Kamera sichtbar.
• b) Außerdem wurde die Effizienz der Fluoreszenz-in situ- Hybridisierung mit P1-Klonen hinsichtlich der Hybridisierung mit Interphasekernen untersucht, um die Eignung dieses Klontyps für klinisch anwendbare zytogenetische Diagnosen zu testen. Zu diesem Zweck wurden sieben zufällig ausgewählte P1-Klone biotinyliert oder mit Digoxygenin-11-dUTP markiert und sowohl mit normalen humanen Lymphozytenkernen als auch mit Kernen einer lymphoblastoiden Zellinie hybridisiert. Die biotinylierten Sonden wurden mit FITC, die mit Digoxygenin markierten mit TRITC nachgewiesen. Die Anzahl der erhaltenen Fluoreszenzsignale im Interphasekern wurde bezogen auf die theoretisch zu erwartende Zahl von Signalen. Diese Auswertung wurde durch die klaren, deutlichen Signale und das Fehlen von Backgroundfluoreszenz aufgrund der ausreichenden Unterdrückung von repetitiven Sequenzen erleichtert. Die erhaltenen Daten sind in Tabelle 2 zusammengefaßt. Die erwartete Zahl von zwei Signalen pro Kern konnte sogar ohne CCD-Kamera und Digitale Bildanalyse in 84 bis 97% der untersuchten Kerne nachgewiesen werden.
• c) Da alphoide DNA-Sonden im allgemeinen als die effizientesten FISH-Sonden angesehen werden, wurde die Hybridisierungseffizienz der P1-Klone mit diesem Sondentyp verglichen. Dazu wurden gleichzeitig ein P1-Klon, spezifisch für 1p36, und die repetitive Sonde puc1.77, welche die pericentromerische Region von Chromosom 1 markiert, mit Kernen aus humanen Knochenmarkszellen hybridisiert.

Fig. 3 zeigt repräsentative Beispiele der FISH-Analyse. Die mit einer CCD-Kamera aufgezeichneten Signale wurden mittels digitaler Bildanalyse verarbeitet und in Falschfarben dargestellt. In der Schwarz-Weißabbildung erscheint DAPI als diffuser Bereich und innerhalb dessen die FITC-Signale als kleine weiße Flecken und die TRITC- Markierungen (in Fig. 3b) als etwas größere dunkelgraue bis schwarze, hell umgrenzte Flecken). Das erhaltene R-Banden Muster, welches auf Gegenfärbung der Chromosomen mit DAPI zurückzuführen ist, zeigt die Kartierungsposition des P1-Klons in 1p36.2-3 an. Fig. 3a: Teil eines Metaphasenpräparats von normalen humanen Lymphozyten nach FISH eines biotinylierten P1- Klons, der mittels einer 1p36-spezifischen Mikroklonsonde isoliert worden war. Die Hybridisierungssignale waren deutlich auf 1p36 beschränkt und konnten auf beiden Chromatiden der zwei Chromosomen nachgewiesen werden.

Fig. 3b: Interphasenkerne von Knochenmarkszellen nach Zweifarben-FISH eines biotinylierten P1-Klons und der Digoxygenin-11-dUTP-markierten Sonde puc1.77. In allen Kernen konnten zwei deutliche gelbe Signale, die den P1- Klon darstellen, und zwei ausgedehntere rote Signale, die sich über die perizentromere Region des Chromosoms erstrecken, in allen Kernen nachgewiesen werden. Die Abbildungen zeigen, daß die Fluoreszenzsignale der P1-Klone im allgemeinen von bemerkenswerter Intensität und Spezifität waren; sie waren vergleichbar den Signalen, wie sie mit alphoiden DNA-Sonden erhalten werden.

Tabelle 2

Berechnung von FISH-Signalen in Interphasekernen

Literatur

Baker, S.J., Fearon, E.R., Nigro, J.M., Hamilton, S.R., Preisinger, A.C., Jessup, J.M., van Tuinen, P., Ledbetter, D., Barker, D.F., Nakamura, Y., White, R. und Vogelstein, B., 1989, Science 244, 217-221.

Biegel, J.A., Meek, R.S., Parmiter, A.H., Conrad, K. und Emanuel, B.S., 1991, Genes Chrom. Canc. 3, 483-484.

Burke, D.T., Carle, G.F. und Olson, M.V., 1987, Science 236, 806-812.

Carey, A.H., Claussen, U., Lüdecke, H.J., Horsthemke, B., Ellis, D., Oakey, H., Wilson, D., Burn, J., Williamson, R. und Scambler, P.J., 1992, Mamm. Genome 3, 101-105.

Church, G.M. und Gilbert, W., 1984, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 81, 1991-1995.

Cohen, D., Chumakov, I. und Weissenbach, J., 1993, Nature 366, 698-701.

Cooke, H.J. und Hindley, J., 1979, Nucl. Acids Res. 6, 3177-3197.

Cremer, T., Lichter, P., Borden, J., Ward, D.C. und Manuelidis, L., 1988, Hum. Genet. 80, 235-246.

Devilee, P., van Vliet, M., Bardoel, A., Kievits, T., Kuipers-Dÿkshoorn, N., Pearson, P.L. und Cornelisse, C.J., 1991, Cancer Res. 51, 1020-1025.

Feinberg, A.P. und Vogelstein, B., 1983, Anal. Biochem. 132, 6-13.

Fletcher, J.A., Kozakevich, H.P., Pavelka, K., Grier, H.E., Shamberger, R.C., Korf, B. und Morton, C.C., 1991, Genes Chrom. Canc. 3, 37-43.

Green, E.D., Riethman, H.C., Dutchik, J.E. und Olson, M.V., 1991, Genomics 11, 658-669.

Guan, X.Y., Meltzer, P.S., Cao, J. und Trent, J.M., 1992, Genomics 14, 680-684.

Hoheisel, J.D., Maier, E., Mott, R., McCarthy, L., Grigoriev, A.V., Schalkwyk, L.C., Nizetic, D., Francis, F. und Lehrach, H., 1993, Cell 73, 109-120.

Kuziel, W. und Tucker, P., 1987, Nucl. Acids Res. 15, 3181.

Leister, I., Weith, A., Brüderlein, S., Cziepluch, C., Schlag, P. und Schwab, M., 1990, Cancer Res. 50, 7232-7235.

Lengauer, C., Green, E.D. und Cremer, T., 1992a, Genomics 13, 826-828.

Lengauer, C., Riethman, H.C., Speicher, M.R., Taniwaki, M., Konecki, D., Green, E.D., Becher, R., Olson, M.V. und Cremer, T., 1992b, Cancer Res. 52, 2590-2596.

Lichter, P., Boyle, A.L., Cremer, T. und Ward, D.C., 1991, Genetic Analysis and Technical Appl. 8, 24-35.

Lichter, P. und Cremer T.: Rooney, D.E., Czepulkowksi, B.H. (eds.): Human Cytogenetics (Vol. I): A practical approach, 2nd edition, IRL Press, Oxford, 1992, 157-192.

Martinsson, T., Weith, A., Cziepluch, C. und Schwab, M., 1989, Genes Chrom. Cancer 1, 67-78.

Murray, N.E.: Hendrik, R.W., Roberts, J.W., Stahl, F.W. und Weisberg, R.A. (eds): Lambda II, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1983, 395-432.

Pierce, J.C. und Sternberg, N., 1992, Meth. in Enzymology 216, 549-574.

Pinkel, D., Landegent, J., Collins, C., Fuscoe, J., Segraves, R., Lucas, J. und Gray J., 1988, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 85, 9138-9142.

Riccardi, V.M., Sujansky, E., Smith, A.C. und Francke, U., 1978, Pediatrics 61, 604-610.

Ried, T., Baldini, A., Rand, T.C. und Ward, D.C., 1992, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 89, 1388-1392.

Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2.Auflage).

Simon, D., Knowles, B.B. und Weith, A., 1991, Oncogene 6, 765-770.

Sternberg, N., Ruether, J. und DeRiel, K., 1990, New Biol. 2, 151-162.

Weith, A., Martinsson, T., Cziepluch, C., Brüderlein, S., Amler, L.C., Berthold, F., und Schwab M., 1989, Genes Chrom. Cancer 1, 159-166.

Whittaker, P.A., Campbell, A.J., Southern, E.M. und Murray, N.E., 1988, Nucl. Acids Res. 16, 6725-6736.

Wiegant, J., Ried, T., Nederlof, P.M., van der Ploeg, M., Tanke, H.J. und Raap, A.K., 1991, Nucl. Acids Res. 19, 3237-3241.

Zehetner, G. und Lehrach, H., 1994, Nature 367, 489-491.

Claims (6)

1. Verfahren zur Untersuchung von chromosomaler DNA, insbesondere von Chromosomen-Aberrationen, mittels nicht-radioaktiver in situ-Hybridisierung, dadurch gekennzeichnet, daß man als Hybridisierungssonde P1- Klon-DNA verwendet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die P1-Klon-DNA eine Markierung aufweist, die ein mittels Fluoreszenzmikroskopie nachweisbares Signal gibt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Markierung der P1-Klon-DNA indirekt nachweisbar ist.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß man zusammen mit der P1-DNA- Sonde eine Vergleichssonde einsetzt, die alphoide Sequenzen enthält und die eine Markierung aufweist, die im Fluoreszenzmikroskop ein von der Markierung der P1-Klon-DNA verschiedenes Signal gibt.

5. Kit für die Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung, enthaltend neben üblichen Hybridisierungsreagentien in getrennten Behältern a) einen oder mehrere mit einer direkt oder indirekt mittels Fluoreszenzmikroskopie nachweisbare Markierung versehene P1-Klone, der bzw. die mit der fraglichen Sequenz in einer zu untersuchenden Chromosomenregion hybridisieren; gegebenenfalls b) eine mit einer im Fluoreszenzmikroskop unterschiedlich nachweisbaren Markierung versehene Referenzsonde; gegebenenfalls c) eine hoch-repetitive DNA-Sequenzen enthaltende Competitor-DNA.

6. Verwendung von P1-Klon-DNA-Sonden für die Diagnose von Erkrankungen des Menschen, die auf Chromosomenaberrationen zurückzuführen sind, mittels Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung.