JPH06507785A - 染色体異常を確認する分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 染色体異常を確認する分析方法 本発明は分析法及び診断法に関するものである。特に本発明は生体のゲノム中の 染色体の異常の存在を確認する方法に関するものである。その他の態様では、本 発明は生体中における染色体異常の存在及び局在場所を決定する方法に関するも のである。さらに他の態様においては、本発明は特異的染色体異常の存在を確認 する方法に関するものである。なお本発明は、得られた情報を用い、染色体異常 の存在及び局在場所の決定に本発明の技術を適用して、実際の病態及び発生期の 病態を診断する方法に関するものである。

〔発明の背景〕

染色体の一貫した特異的トランスロケーションは白血病、リンパ腫、固型がんな どの多くのヒトの悪性疾患と関係している。このようなトランスロケーションは 関連する疾患の分子病因論と緊密に関与していると思われる。

したがって染色体のトランスロケーションを分析する迅速で効果的な方法は実際 の病態あるいは発生期の病態の診断において回層な補助手段であると思われる。

固型がんにおけるトランスロケーションの分子学的研究は、組織サンプルの染色 体を分析する技術的困難さから、白血病の研究に遅れをとっている。しかしなが ら慢性骨髄性白血病や急性リンパ芽球白血病と関連のあるトランスロケーション （ｔ　（９：２２）（（１３４：ｑｌｌ　）　；　Ｈｅｒｍｅｎｅｓら、Ｃａｎ ｃｅｒ　Ｃｅ１ｌｓ、　７　：　２　１　′　２　６　（１９８９）及びＳｈｔ ｉｖｅｌｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ　３１５：５５０〜５５４　（１９８５）を参 照）及びバーキットリンパ腫と関連のあるトランスロケーション（ｔ　（８；２ ２）（ｑ２　４　；　ｑ　Ｉ　２）　；　Ｈａｌｕｐｋａ　ら、Ａｎｎ、Ｒｅｖ 、Ｇｅｎｅｔ、：　２　１：３２１〜３４５（ｊ９８６）参照〕と類似している ことから、固型がんにおける一貫したトランスロケーションは細胞増殖の調節に 関係のある正常遺伝子の異常発現、又はゆがんだ生理機能を有するキメラ転写ユ ニットの発現を引き起こす２個の細胞遺伝子の転位につながる可能性があるとい うことが考えられる。

例えばヒト染色体１１は、Ｂ細胞慢性リンパ球白血病、Ｂ細胞非ホジキンリンパ 腫及び多発生骨髄腫に存在するｂｃｌ　−１（ブレークポイント　クラスター１ ）遺伝子座を含むｔ　（ＩＩ；２２）（ｑ１３；１３）転位；乳児の急性リンパ 芽球白血病と関係のあるｔ（４：Ｉｆ）（（１２１；２３）転位、及び急性単球 白血病の場合のｔ（９；１１）（ｐ２２：ｑ２３）及びｔ（１１；１９）（ｑ２ ３；ｐ１３）転位などの腫瘍と関係のある染色体転位部位を数個所有することが 知られている。

ユーイング肉腫（ＥＳ）　、末梢神経上皮Ｍｌ　（ＰＮＥ）及びアスキン腫瘍の ｔ　（１１；２２）　（Ｑ２４　；ｑ１２）トランスロケーションは細胞遺伝学 的に同じであると思われ、固型腫瘍と関係のある現在最もよく記載され最も不変 の染色体異常を代表するものと思われる。ＥＳ及びＰＮＥは両者とも小さな円形 の細胞腫であり、神経外胚葉的に誘導された細胞のトランスフォーメーションに よって体幹や四肢に発生する。ＥＳ培養細胞は神経外胚葉関連抗原を発現するこ とが報告されている。さらにＥＳＩＩ瘍は神経堤から誘導される他の腫瘍と多く の組織学的、免疫細胞化学的類似点を持っている。さらにＥＳとＰＮＥの種々の プロトオンコシンの発現パターンは区別し難く、両者はよく分化した神経外胚葉 細胞タイプ（ＰＮＥ）から分化の少ない神経外胚葉細胞タイプ（ＥＳ）に至る範 囲の腫瘍細胞タイプのスペクトルの両端を代表するものかも知れない。

正確な位置を確認するのに十分な分子プローブの密度が得られなかったため、従 来はＥＳ及びＰＮＥのトランスロケーションの分子分析はできなかった。またト ランスロケーション部位の分子クローニングができる程十分ブレークポイントの 近くに位置しているクローン化された遺伝子が不足していたために分子分析かで きなかった。

限られた数の無作為に選択された局所分子プローブを用いてのパルスフィールド ゲル分析はこれまでトランスロケーションの部位を示すことができなかったＣ　 Ｂｕｄｏｒｆら。

Ａｍ、　Ｊ、　Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　４５　：　１２　Ｂ〜１３９　 （１９８９）参照〕。

〔発明の概要〕

本発明に従って我々は染色体トランスロケーションか存在するか否かを決定する のに有用な方法を開発し、た。

本発明にしたかって我々はまた、もし存在するならば、染色体のトランスロケー ションの存在を決定するのに有用な方法を開発した。さらに本発明にしたかって 我々は観察された病態に対する分子的根拠を区別するのに回動な方法を開発した 。

染色体１１ｑに予め印したコスミドマーカーのパネルを用いて染色体ｉｎ　５ｉ ｔｕ抑制ハイブリツド形成技術（ＣＩＳＳＨ）をＥＳ及びＰＮＥ中期染色体に適 用することによってＣＬｉｃｈｔｅｒ　ら、５ｃｉｅｎｃｅ２４７　６４−６９ （１９９０）参照〕、接近して存在する２個のニスミドクローン間のブレークポ イントの位置を確認することができる。これらのクローンを用いて、ＥＳ及びＰ ＮＥ間期核の高分解能分析により、１ｍｂ以下の領域に最も近く隣接している２ 個のコメミド間の染色体ｌｌ上のトランスロケーションブレークポイントの位置 を確認することかできる。

さらにヒト染色体２２上ＥＳブレークポイントの近くに位置していることか知ら れている白血病阻害因子遺伝子（ＬＩＦ）をエンコードしている遺伝子かＥＳ及 びＰＮＰ誘導染色体ＩＩへ、最も動原体に隣接するコスミドマーカーのすぐ近く てトランスロケーションされることか知られている。ＬＩＦかｉｎ　ｖｉｔｒｏ て骨髄性白血病細胞系の増殖を抑制し、培養胚細胞の分化を妨げることか知られ ているので、この遺伝子は付近における染色体のトランスロケーションは発がん を誘導するのに十分であったかも知れない。しかしパルスフィールドゲル電気泳 動によってこの遺伝子座周囲の６５０ｋｂ領域に異常は認められなかった。

したかってラントマークのコスミドクローンのパネルと連結してのＣｌ５ＳＨの 使用がＥＳ及びＰＮＥブレークポイントの迅速な位置確認と分子クローニングを 可能にした。本発明はまた、ＥＳ及びＰＮＥのみが細胞遺伝学的異常を示すこの 混合円形細胞腫のグループ内において分別診断するための診断道具として使用で きる。

〔図の簡単な説明〕

図１はコスミドクローニングベクター５Ｃｏｓ　−１の構造を詳細に示す図式的 図である。

図２はコスミドクローニングベクター５Ｃｏｓ　−１の詳細な制限地図である。

図３は染色体１１由来の多数のプローブのマツピングを図表的に総括したもので ある。トランスロケーションがユーイング肉腫や末梢神経上皮腫の何処に起こる かを示しである。

〔発明の詳細な説明〕

本発明に従って、生体のゲノム中の染色体異常の存在を確認する方法を提供する 。この方法は次のものを含む・ （ａ）上記生体からの無傷の染色体のＤＮＡを何らの異常もない無傷の染色体か らの全ＤＮＡを認識するクローンのパネルとハイブリットを形成させること。こ れによって最初のハイブリッド形成パターンかできる。

（ｂ）上記の最初のハイブリッド形成パターンを対照ハイブリッド形成パターン と比較することによって染色体異常の存在を確認すること、ここで上記対照ハイ ブリット形成パターンは、上記パネルか何ら異常のない無傷の染色体を認識する ＤＮＡとハイブリッドを形成する時に得られるパターンを含む。

本発明の他の実施態様に従って、生体のゲノム中の染色体異常の存在及び位置を 確認する方法を提供する。この方法は次のものを含む・ （ａ）上記生体からの無傷の染色体のＤＮＡを、上記異常を含むことか疑われる 染色体に相当する単一の異常のない染色体に特異的なりローンのパネルとハイブ リッドを形成させること。これによって最初のハイブリッド形成パターンを作り 、そして （ｂ）上述の最初のハイブリッド形成パターンを対照のハイブリッド形成パター ンと比較することによって染色体異常の存在と位置を確認すること：ここで上記 対照ハイブリット形成パターンは、上記パネルが何ら異常のない無傷の染色体を 認識するＤＮＡとハイブリッドを形成する時に得られるパターンを含む。

本発明のもう１つの実施態様に従って、生体のゲノム中の特定の染色体の異常の 存在を確認する方法を提供する、この方法は次のものを含む・ （ａ）前述の生体からの無傷のＤＮＡを、上述の特定の染色体の異常の存在を診 断するのに役立つ少なくとも１個のクローンとハイブリッドを形成させること。

及び（ｂ）上記クローンか何ら異常の無い無傷の染色体ＤＮＡとハイブリッドを 形成する時のハイブリッド形成パターンと比較して異なったハイブリッド形成パ ターンを生ずるこれらの生体を上記特定の染色体異常を含むと同定すること。

本発明のさらにもう１つの実施態様に従って、染色体１１．２２トランスロケー シヨンと関連のある神経上皮腫瘍の被検における存在あるいは該腫瘍に対する被 検者の感受性を決定する方法を提供する。該方法は次のものを含む： （ａ）上記被検者からの無傷の染色体ＤＮＡを、染色体１１．１２トランスロケ ーンヨンの存在の診断に役立つところの、染色体１１及び／又は染色体１２に特 異的なりローンの少なくとも１つとハイブリッドを形成すること、及び （ｂ）何ら異常のない無傷の染色体ＤＮＡとハイブリツドを形成させる時、上記 パネルのハイブリツド形成パターンと比較して異なったハイブリッド形成パター ンを持つ無傷の染色体ＤＮＡを、染色体重、１２トランスロケーシヨンと関係の ある神経上皮腫瘍の存在、又は該腫瘍への感受性を暗示するものと同定すること 。

本発明の技術か使用できる生体は広く、すべてのを椎動物種、例えばニワｌ−Ｉ Ｊ、サカナ、爬虫類、両性動物、哺乳動物その地回種類のものが含まれる。現在 本発明の技術を使用して試験するのに好ましい生体はヒトである。

それは観察された病態の病因がある程度の確実性をもって判明した時治療に適合 する能力を持っているからである。

本発明の技術は多くの染色体異常、例えば欠失、逆位、重複、トランスロケーシ ョン、環状染色体の生成、その地回様な異常などの存在を確認することかできる 。

本発明に従って、被検生物からの細胞試料を、被検生物と同じ種の生物由来の染 色体ＤＮＡからなる１個以上のクローンと接触させる。特定のハイブリッド形成 反応から得られる細部の情報量は、ハイブリッド形成反応にどれだけ多くのクロ ーンか使用されるか、使用される各プローブについてどれだけ多く知られている かということに比例する。例えば単クローンか関心事の特定の異常、例えば染色 体１１と２２間のトランスロケーションの診断に役立つならば、その単クローン は使用することができる。このようなりローンは、染色体ＤＮＡの喪失及び／又 は増加かトランスロケーションで起こる。その部分の染色体１１及び／又は染色 体２２に由来するものである。したがってハイブリッド形成の際、正常ＤＮＡで 得られるハイブリッド形成パターンと比較して、プローブと被検ＤＮＡ間のハイ ブリッド形成で異なったパターンか観察される。

あるいはまた、染色体の異常が疑われる生体からの細胞試料をクローンのパネル と接触させてもよい。典型的な″クローンのパネル”には十分な数のクローンか 含まれており、そのため平均して各染色体に対してクローン間は約３００キロベ ースである。パネルは異常のない無傷の染色体からの全ＤＮＡを認識するクロー ンのコレクションであり、１個以上の異なった染色体に由来する。

正常染色体ＤＮＡと被検試料とのハイブリッド形成パターンを上記パネルとのハ イブリッド形成パターンと比較して差かないかどうかを調べることができる。異 なるハイブリッド形成パターンは被検染色体ＤＮＡ中に１個以上の異常が存在す ることを意味する。

使用するクローンのパネルのメンバーについて十分な情報か利用できさえすれば 、観察された特定の異常の性格は、対照と被検試料のハイブリッド形成パターン 間に観察された特定の差を各試料で各様にハイブリッドを形成する特定のクロー ンと関係づけることによって決定することかできる。

本発明の実施に当たって使用するクローンは各種の伝達体を使用して調製するこ とができる。このような伝達体として、例えば、コスミド、酵母の人工染色体〔 例えばＢｔ＋ｒｋｅらの５ｃ１ｅｎｃｅ　２３６：８０８〜８１２　（＋９８７ ）参照）、Ｆｌプラスミド〔例えばＯ’　Ｃｏｎｎｏｒらの照〕、Ｐ１バクテリ オファージ〔例えばＳｔｅｒｎｂｅｒｇのＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、 　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、８７　：　ｌ　０３〜１０７（＋９９０）参照〕、そ の他が使用できる。例えばコスミドライブラリーの構築はＥｖａｎｓら、Ｇｅｎ ｅ　７９　：　９〜２０（＋９８９）に報告されている。例えばコスミドベクタ ー５Ｃｏｓ　−１はＣ１ａ　Ｉ　＋　Ｓａｌ　ＩでｐＷＥＩ　５ＤＮＡを分解し ［Ｅｖａｎｓ、　Ｗａｈｌ　Ｉ：よってＭｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、１５ 主＝６０４〜６１０（１９８７）に報告されている〕、Ｃｏｓ配列を欠＜　６− ｋｂ　Ｃ１ａＩ　−Ｓａｔ　Ｉフラグメントを精製することによって調製される （図１）。コスミドｐＤＶｃｏｓ　Ｉ　３４をＣ１ａ　Ｉ　＋　Ｘｈｏ　Ｉで分 解し、重複Ｃｏ５ｆｌ城を含むフラグメントをＬＰＭ寒天ゲル上で精製した。精 製フラグメントをＴ４　ＤＮＡリガーゼを用いて結合し、宿主株ＤＨ５中へ形質 転換した。

ゲノムライブラリーは例えば５Ｃｏｓ　−１のようなコスミドベクター中に構築 され、高能率マイクロクローニングのための重複Ｃｏｓ部位、ユニークＢａｍＨ ［クローニング部位に隣接するＴ３及びＴ７バクテリオフアージプロモーター、 ゲノム挿入断片を除去するための２つのＮｏｔｒ部位、哺乳動物遺伝子トランス ファー用の選択遺伝子（ＳＶ２　ｎｅｏ’）及び複製のＣｏ］Ｅ　ｌ起点を含有 している（図２）。このベクター中のコスミドベクターの詳細な制限地図はＴ３ −又はＴ７特異オリゴヌクレオチドを用いる末端標識マツピング法によって迅速 に確定することができる。

本研究に使用されたゲノムコスミドライブラリーはｌ。

５Ｘ１０７の独立したクローンからなり、ゲノムＤＮＡをＭｂｏ　Ｉで平均１０ ０〜１２０キロベースの大きさに切断し、ウシ腸ホスファターゼで脱燐酸し、５ Ｃｏｓ　−Ｉ　Ｄ　ＮＡと連結したものを用いて構築され、Ｇｉｇａｐａｋ　Ｇ ｏｌｄ（Ｓｔｒａｔｄｇｅｎｅ）　ｉｎ　ｖｉｔｒｏパッケージングライゼート と一緒に包装されている、非増幅ライブラリーのみが用いられ、コスミドベクー ンは９６大のマイクロタイタープレートに集められ、グリセロール１５％（ｖｏ ｌ／ｖｏｌ　）、硫酸カナマイシン２５ｇ／ｍｌを含むＬＢ培地中−７０″Ｃで 保存された。

本発明の実施に有用な特定コスミドは次のものである： ＰＹＧＭ、　ＺＣ７，ＸＢ　１１．９．２７．６．６．３．１６゜２３．２０． ＮＣＡＭ、ＺＢ８．ＣＤ３．ＴＨＹＩ、９．４゜ＥＴＳ　１，２３．２，５．８ ．Ｌ　ＩＦ３Ｅ２１１．その他（図３参照）。現在の好ましいコスミドベクーブ は次のものを含む： ２３．２、これは次の確認配列を存する：５−ＡＴＡＣＣＣＡＡＣＴ−ＣＡＣＡ ＧＧＡＴＧＣ−ＴＴＣＣＴＧＧＧＡＴ−３’５．８、これは次の確認配列を有す る：５−ＡＧＣＣＴＴＣＴＴＧ−ＡＣＡＣＣＣＴＴＧＣ−ＴＧＣＴＴＴＧＧＣＣ −３’及びＬＩＦ３Ｅ２１ｒ、これは次の確認配列を育する：５’　−ＧＴＧＡ ＧＴＧＣＡＧ−ＧＧＡＴＧＧＡＡＧＴ−ＡＣＴＴＧ−３’本発明技術によって分 析される細胞試料は何ら特別の調製をすることなしに使用できるし、または増殖 促進条件下に置いた後分裂中期で止めてもよい〔例えばＣ１１ｎｉｃａｌ　Ｄｉ ａｇｎｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ　ｂｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ、　Ｊ、　Ｇ、　Ｈｅｎｒｙ編（Ｓａｕｎｄｅｒｓ、　Ｐｈ１ｌ ａｄｅｌｐｈｉａ）　１６版、９８０１〜８５６　（１９７９）にＹｕｎｉｓ　 とＣｈａｎｄｌｅｒによって報告されているように〕。現在のところ後者の方法 の方が好ましい。その理由は、後者は分析で全染色体を見ることかできるのに対 し、ノλイブリ・ノド形成前の細胞調製をしないと一般にノ＼イブリ・ノド形成 部位のみしか見ることかできない。

本発明の実施において使用される現在の好ましいノ＼イブリッド形成法は、最近 ５ｃｉｅｎｃｅ　２４７　：　６４〜６９（＋９９０）に報告されている染色体 ｉｎ　５ｉｔｕ抑制ハイブリノｔ’形成技術（以後“Ｃｌ５ＳＨ“と呼ぶ）であ る。

本発明の実施において使用される同様な技術は次の報告に記載されている Ｌａｗｒｅｎｃｅら、Ｃｅ１ｌ　４２：５１〜６１　（＋９８８）Ｐｉｎｋｅｌ ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、８３　：　 ２９３４〜２９３８　（１９８６）、−８１：９１３８〜Ｔｒａｐｈ　ら、　Ｇ ｅｎｏｍｉｃｓ　５　：　７　１　０〜７　１　７　（＋　９　８９）。

Ｃｌ５ＳＨは次のようにして実施する：標識プローブＤＮＡ　２０〜５０％ｇを ヒト胎盤ＤＮＡ１゜５〜３ｇ及びハイブリット形成反応混液針１０４７を得るの に十分な量のサケ精子ＤＮＡと混合する。プローブ混液を変性後（７５°Ｃ１５ 分）、別々に変性した染色体試料に適用する前に反復ＤＮＡ配列のブレアニーリ ングを５〜１５分間（３７°Ｃ）行う。あるいはまた抑制が無い場合、したかっ て競合ＤＮＡか必要で無い場合には、プローブ混合物を変性し、氷上で冷却する 。コスミドシグナルか染色体１１の特異的デコレーションと同時に得られる時に は、染色体１１ライブラリーからのプールし標識した挿入断片３００ｎｇを分別 的に標識したニスミドＤＮＡプローブと混合する。ヒト染色体１１の輪郭を知る ために、選別染色体１１由来のライブラＩＪ−ＬＡＩＩＮＳＯ２の全ＤＮＡ挿入 断片ＣＭ、　Ａ、　ＶａｎＤｉｌｌａら、に従って調製した。プローブシグナル と同時にＡｌｕバンドを得るために競合ＤＮＡを分別標識ｐＢＳ−Ａｌｕ４３０ ０ｎｇで置換し、ブレアニーリングを数秒に短縮する。

あるいはまた、標識ｐＢＳ−Ａｌｕ　４　１００％ｇをノ）イブリッド形成反応 混液中で変性し、氷上で冷却し、スライドに塗布する直前にブレアニーリングし たプローブと混合する。１晩インキユベートし、ハイブリッド形成後の洗浄を行 った後（Ｌｉｃｈｔｅｒら、上記論文参照〕試料をブロック溶液〔３％ウシ血清 アルブミン（ＢＳＡ）、４ＸＳＳＣ（クエン酸ナトリウム生理食塩水）又は、Ｂ ＳＡ交叉反応ＤＮＰ抗体（ａｎｔｉ　−Ｄ　Ｎ　Ｐ　）を使用する時は５％無脂 肪トライミルク、４ＸＳＳＣ）と３７°Ｃて３０〜６０分間インキュベートする 。検出には、蛋白質試薬はすへて１％ＢＳＡ、４ＸＳＳＣ，及び０，１％　Ｔｗ ｅｅｎ　２０て調製しくＢＳＡ交叉反応抗体は予めこの溶液中で３７”Ｃ３０分 間インキュベートする）、次に試料とインキュペー）Ｌ（３７°Ｃ１３０分）、 洗浄（４ＸＳＳＣ１及び０．１％　Ｔｗｅｅｎ　２０．３分間３回、４２°Ｃ） する。ビオチン標識プローブはフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ） −抱合アビジン（ＤＣ３ｇｒａｄｅ　；　５　ｇ／ｍｌ　；Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、　ＣＡから入手）又はＴｅｘ ａｓ　Ｒｅｄ　’−イソチオンアネート（ＴＲＩＴＣ）−抱合Ｅｘｔｒａ　Ａｖ ｉｄｉｎ　（５ｇ／ｍｌ）　（Ｓｉｇｍａ）とインキュベートすることにより検 出される。多少短いＤＮＡプローブ（例えば、ｐ　Ｔ　２４−Ｈｒａｓ）のシグ ナルはり、　Ｐｉｎｋｅｌ　ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ 、　Ｕ、Ｓ、Ａ、８３　：　２９３４　（１９８６）の報告に従って増幅される 。ＤＮＰ−標識プローブはウサギ抗ＤＮＰ　（７ｇ／ｍｌ）　（Ｓｉｇｍａ　） とのインキユベーシヨン及びＦＩＴＣ−又はローダミン−抱合ヤギ抗ウサギ抗体 （８ｇ／ｍｌ）　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　）と２次インキ ュベーションによって検出される。ジゴキシゲニン標識プローブは最初ヤギ抗ジ ゴキシゲニンＦａｂフラゲメント　（２，５ｇ／ｍｌ）　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ ｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　）　と、次にＦ　ＩＴＣ抱合ロバ抗ヤギ抗体（７ｇ／ｍ ｌ）　（Ｓｉｇｍａ）とインキュベートする。単プローブハイブリッド形成では 、標識ＤＮＡはＦＩＴＣ抱合体で検出し、染色体ＤＮＡはプロピジウムヨート（ Ｐ　Ｉ）　（２００％ｇ／ｍｌ　ｉｎ　２ＸＳＳＣ１室温５分間）で対比染色す る。多分側標識プローブとのハイブリット形成では、染色体ＤＮＡはジアミジノ フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で対比染色ＣＬｉｃｈｔｅｒら、上記文献参照 〕又はバンド化ＣＤ。

Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ、　Ｈｕｍ、　Ｇｅｎｅｔ、５７　：　１　（１９８１）） する。

抗退色液中で固定後ＣＬｉｃｈｔｅｒら、上記文献参照〕スライドを従来の後蛍 光顧微鏡検査のために準備したＮ１ｋｏｎＯｐｔｉｐｈｏｔｉｉ微鏡で検査する 。精密なマツピングにはＢｉ。

−Ｒａｄレーサースキャンニング同焦点顕微鏡の改変型（Ｌａｓｅｒｓｈａｒｐ 　ＭＲＣ５００）をデジタル像を作るために光量子計測モード（積分期間０．１ 〜０．３　ｍｓ／　ｐｉｘｅｌ　）で使用する。励起にはアルゴンイオンレーザ −からの４８８％ｍ光線を使用する。２重標識実験では、各蛍光色素の別々の像 を得るために細帯通過フィルターを使用する（ＦＩＴＣには５５０％ｍフィルタ ー、ＰＴ又はローダミンには６１０％ｍフィルター）。ある場合にはローダミン を励起するためにＡｍｏｃｏ　Ｍｉｃｒｏｌａｓｅｒからの５３２％ｍ光線（ｆ ｒｅｑｕｅｎｃｙ　−ｄｏｕｂｌｅｄ　ｄｉｏｄｅ−ｐｕｍｐｅｄ　Ｎｄ’　： 　ＹＡＧ　（イツトリウム−アルミニウムーざくろ石）〕を使用する。１つの対 象からの２つの別れた像は保存しておき、あとて電子的に重ね合わせる。像を最 適化するために、デジタル濾過を適用する。ビデオスクリーンから写真を撮るこ とができる。

次の実施例を引用してさらに詳細に本発明について説明するが、これは本発明を 制限するものではない。

ユーイング肉腫由来のヒト腫瘍細胞系ＴＣ７１及び６６７４、末梢神経上皮腫由 来のＴＣ３２かＧｒｉｆｆｉｎらによってＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、 　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、８３　：　６１２２−６１２６　（＋９８６）に報告 されているように、国立予防衛生研究所において樹立された。細胞系はすべて前 述のｔ　（ＩＩｑ２４；２２ｑ１２）ｈランスロケーションを保持することが細 胞遺伝学的分析によって示され、また前に認めたように、他の広範囲の数的及び ／又は構造的染色体異常を示した。正常な抜型をもつヒト線維芽細胞系ＣＲＬ　 ｌ　６３４はＨｕｍａｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｍｕｔａｎｔ　Ｃｅ１ｌＲｅｐｏｓ ｉｔｏｒｙ　（Ｃａｍｄｅｎ、　ＮＪ）から入手し、正常対照として使用した。

コスミドクローン １１ｑ１３−１１ｑｔｅｒに７−／ピングしている１０００以上の１組のコスミ ドクローンかＥｖａｎｓら（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

ってすてに報告されており、これらコスミドの１群がＣＩ　ＳＳＨによって位置 確認された。この実施例では１１ｑ２４ユーイング肉腫トランスロケーションブ レークポイント近くに位置するコスミドを選択し、ｉｎ　５ｉｔｕハイブリツド 形成に使用した。ｒｈｙ−１遺伝子〔例えばＷａｈｌら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ 、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、８４　：　２１６０−２１６４　（１ ９８７）参照〕、ＣＤ３遺伝子〔例えば、［！ｖａｎｓ　ら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅ ｎ、２８　：　３６５−３７３　（１９８８）〕及び叶ｅｔｓ−１遺伝子〔例え ばＥｖａｎｓら、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、８６　：　５０３０−５０３４（１ ９８９）参照〕を含むコスミドをＤＮＡ又はオリゴヌクレオチド又はｃＤＮＡプ ローブを用いて同定した。

ヒトＬＩＦ遺伝子を持つコスミドＬＩＦ３Ｅ２１１ドベクターｐＷＥ　Ｉ　５　 ＣＷａ旧ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’１．　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８４　：２１６０−２１６４　（１９８７）参照〕中 に構築されているヒトゲノムコスミドライブラリーから、ＬＩＦ遺伝子をコード する領域の塩基８６３−９１３及び９０１７９５１　（Ｇｏｕｇｈら、Ｐｒｏｃ 、　Ｎａｔ’ｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、８５　：　２６２３−２６２７　（１９８ ８）参照〕に相当する２つの合成５０塩基オリゴヌクレオチドを用いて単離した 。ヒト染色体２２ｑｌｌにマツピングする免疫グロブリンラムダ不変部遺伝子に 相当するコスミドクローンＨｕ−１ａｍｂｄａ　９　（Ｕｄｅｙ　＆　Ｂｌｏｏ ｍｂｅｒｇ。

Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ　２５　：　６３−７０　（１９８７）参照〕を混合コスミ ドプローブを用いるｉｎ　５ｉｔｕ　／％イブリッド形成実験において染色体２ ２を同定するのに利用した。

コスミドＤＮＡは塩化セシウム密度平衡遠沈、続いてリボヌクレアーゼ処理によ り調製した。プローブはｂｉ。

−＋　１−ｄＵＴＰ　（εｎｚｏ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　Ｎ、Ｙ、）及びｂｉ ｏ　−１１−ｄＣＴＰの存在下でランダムオリゴマーを用いてプライマー・エク ステンション法により標識した。２００−３００ｂｐの範囲にある平均の大きさ のプローブはコスミドＤＮＡをデオキシリボヌクレアーゼで１４°Ｃ，１時間前 処理することによって得られ、大きさの分布はアルカリ性寒天ゲル電気泳動によ り決定した。標識した後、ビオチニル化したコスミドブローブを５ｅｐｈａｄｅ ｘ　Ｇ−５０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の１ｍｌマイクロカラムを通して未結合ヌ クレオチドから精製した。

スライド調製及びｉｎ　５ｉｔｕ抑制ハイブリツド形成（ＣＩＳＳＨ） 中期染色体は増殖中の細胞の有糸分裂をブロックして調製し、染色体は標準技法 〔例えば、ＣＯ旧ｃａｌＤｉａｇｎｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ　 ｂｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍｅｔｈｏｄ、Ｊ。

Ｂ、　Ｈｅｎｒｙａｉ集（Ｓａｕｎｄｅｒｓ、　Ｐｈ１ｌａｄｅｌｐｈｉａ）　 １６版、ｐ。

８０１−８５６　（１９７９）にＵｎｉｓとＣｈａｎｄｌｅｒによって記述され ている方法〕を若干改変して顕微鏡用スライド上に拡げた。培養を同調化した後 、コルセミド（０，１ｇ／ｍ１）を３０〜６０分間加え、細胞を０．０７５Ｍ塩 化カリウム（ＫＣＩ）で１３−１８分間処理したのちメタノール／酢酸中で固定 した。最適の染色体プレパラートを作るための厳密な低張膨潤条件及び固定化条 件は各細胞型別に経験的に決定した。スライドはハイブリッド形成前は一２０° Ｃに保存した。

６１期の比較的純粋な細胞集団を得るため、細胞か完全に全面成長した後５〜６ 日目に間期細胞を採集した。

ＣＲＬ１６３４細胞ではこれが容易に達成されたかＥＳ及びＰＮＥ細胞を用いた 時には分析の期間中Ｇ２及びＭ期集団が存在した。細胞を１５分間０．０７５Ｍ 　ＫＣＩ中にインキュベートと、メタノール中で固定し、スライド上に滴下した 。ハイブリッド形成用にスライドをＲＮＡ５ｅ　（０，３Ｍ　ＮａＣ！／　３０ 　ｍＭ　クエン酸ナトリウム（２×ＳＳＣ）１ｍｌ中１００ｇで３７°Ｃ１時間 ）で処理後、７０％、８５％及び１００％エタノール中で脱水し、プロテアーゼ にで分解（２０ｍＭ　トリス／　２　ｍＭ　ＣａＣＬ　１　ｍｌ中０１５ｇで３ ７°Ｃ７分間）した。次にスライドを５０ｍＭＭｇＣＩ２含有燐酸緩衝生理食塩 水中４％パラホルムアルデヒドで室温で１０分間固定した。染色体を変性させる ため、スライドを７０％ホルムアルデヒド／２ＸＳＳＣ（ｐＨ７，０）中に７０ °Ｃで２分間浸漬し、水冷７０％、８５％次に１００％エタノールで脱水した。

ハイブリッド形成反応及び抑制反応は前述の方法の改変法を用いて実施した。簡 単に述べると、ビオチニル化コスミドＤＮＡ２５−５００ｇを胎盤ＤＮＡ２ｇ、 ヒトＡｌｕ反復配列ｐＢＬＵＲ８を含むプラスミドからのＤＮＡ　１〜２　ｇ　 ＣＥｖａｎｓ　ら、Ｇｅｎｅ　７９：９−２０　（１９８９）〕及びサケ精子Ｄ ＮＡ７ｇで沈澱させた。競合ＤＮＡ５及びサケ精子ＤＮＡをリボヌクレアーゼで 処理し、フェノール及びクロロホルムで抽出し、使用前に超音波をハイブリッド 形成バッファー（５０％ホルムアミド／２ＸＳＳＣ，ｐＨ７，０，１０％デキス トラン硫酸）１０１中に再懸濁し、７５°Ｃで５分間変性させた。ブレアニーリ ングを４２°Ｃで１５分間行い、ハイブリッド形成反応を湿潤チャンバー内で３ ７°Ｃ１２〜１６時間実施した。

ハイブリッド形成後のスライドの洗浄を前述のごとく行い、最後の洗浄を０．ｌ Ｘ５ＳＣ中６５°Ｃで実施した。

スライドを前述のようにフルオレセイン化アビジン及びビオチニル化ヤギ抗アビ ジンＣＶｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。

Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、　ＣＡ）の何れも５　ｇ／ｍｌの濃度で処理して、ハイ ブリット形成ソゲナルが目で見えるようにした。アビジン処理とヤギ抗アビジン 処理の間に４ＸＳＳＣ，４ＸＳＳＣ１０，１％トリトンＸ及び０．１Ｍ燐酸バッ ファーｐＨ８１０，１％Ｎｏｎ１ｄｅｔ　Ｐ　−４０中での各３分間の洗浄を３ 回行って両者の処理を分離した。最後のアビジン処理後、プロビジラムヨード２ ００　ｇ／ｍｌを含む蛍光抗退色溶液による対比染色をカバーグラスの下で実施 した。

顕微鏡検査 スライドは最初従来の後蛍光顕微鏡を使用して検査した。微細構造の分析には、 像をレーザースキャンニング同焦点穎微鏡（ＢｉｏＲａｄ　ＭＲＣ５００）を用 いて作り、Ｆ　Ｉ　ＴＣ（５５０ｎｍ）とプロビジラムヨード（６１０ｎｍ）の 分離した像を得るために細帯通過フィルターを使用し、両者はその後電子工学的 に重ね合わされた。

パルスフィールドゲル電気泳動 ＤＮＡは５ｅｌｌｅｒｉ　らによって以前に報告されている方法（Ｂｌｏｏｄ　 ７５　：１１４６−１１５３　（１９９０）　）によって寒天プラグ中の線維芽 細胞系ＣＲＬ　Ｉ　６３４、ＴＣ３２、ＴＣ７１及び６６７４から得た。ＤＮＡ をＮｏｔ　Ｉ、　Ｂｓ５Ｈ［［、５ｆｉｌ及びＭｌｕ　Ｉ等のいくつかの異なっ たレアーカッティング酵素で分解し、ＨＥＸ−ＣＨＥＦシステム（ＣＢＳ　５ｃ ｉｅｎｔｉｆｉｃ、　Ｄｅｌ　Ｍａｒ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）を用い、プロ グラムＢを用いて１８０　ｖ／ａｍで２４時間分析した。ＤＮＡをハイブリッド 形成用ナイロン膜に移し、ランダムオリゴマーブライミングによって！！ｐ　ｄ ＣＴＰ標識ＤＮＡプローブとハイブリッドを形成させた。

サイズマーカーとしてＳ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの染色体を用いた。

〔結果〕

ＥＳ及びＰＮＥと関係のある１１：２２トランスロケーシヨンの精密な部位を同 定するために、Ｃｌ５ＨＨによって染色体ｌｌｑ上に予めマツプされた１組の定 序コスミドＤＮＡマーカーを使用した。これらの定序コスミドクローンを標識し て順次正常細胞、ＥＳ又はＰＮＥ細胞系からの中期染色体とハイブリッドを形成 させて、正常染色体及び誘導染色体！■又は２２上のハイブリット′形成シグナ ルの部位を決定した。従来の細胞遺伝学的“バンド“が無い場合には、染色体は さらに染色体２２上にヒト免疫グロブリンラムダ不変部遺伝子を含む追加のコス ミトクローンＨｕ　−ｌａｍｂｄａ　９とハイブリッドを形成させるか又は染色 体Ｉｆに予めマツプされたコスミドとハイブリッドを形成させることによって同 定した。正常染色体あるいは誘導染色体の両方の姉妹染色分体へのハイブリツド 形成は試験した中期染色体の８５〜９０％に見られ、同焦点レーザースキャンニ ングＩＩＩ微鏡を用いての電子工学的拡大によって、染色体断片の長さくＦＬｐ ｔｅｒ）か正常ＤＮＡ誘導染色体上で決定された。以前の報告〔例えば、Ｇｒｉ ｆｆｉｎら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ。

８３・６１２２〜６１２６　（１９８６）参照〕と一致して、遺伝子ｃ−ｅｔｓ 　−１、Ｔｈｙ　−１、及びＣＤ３を含むコスミドはトランスロケーションブレ ークポイントに対してセントロメリックな位置に局在していた。追加のコスミド クローンはブレークポイントに関してセントロメリックな又はテレメトリツクな 位置に基づいて分離した。

図３に示されているＥＳブレークポイントのすぐ横にある２つのコスミドクロー ンが確認された。予めＦＬｐｔｅｒＯ１９８にマツプされたコスミトクローン２ ３．２は、染色体２２の転座したフラグメントにより染色体が顕著に伸長した結 果、誘導染色体上ＦＬｐｔｅｒ　Ｏ，８８に存在していた（図３）。予め０，９ ８のＦＬｐｔｅｒでマツプされたコスミドクローン５．８はＥＳ及びＰＮＥの両 中期において誘導染色体２２に転座されていることが認められた（図３）。

クローン２３．２と５．８は１１ｐテロメアからの距離の測定によって、染色体 の長さの１％以下（約１．５　ｍｂ以下）だけ離れていることが予め認められて いたので、これら２つのクローンの物理的間隔のより精密な測定をコスミドの対 のハイブリッド形成法によって行った。クローン２３．２及び５．８を標識し、 そして正常な中期染色体及びＥＳ、ＰＮＥ中期染色体に同時にハイブリッド形成 反応を行ったところ、検査した中期染色体の７０％において、正常染色体１１の 上に４個の蛍光スポットを示した。誘導染色体１１及び２２それぞれに２個の蛍 光スポットが観察され、トランスロケーションかこれら２つの接近して配置され ているマーカーを分離することを示した。この分離はこれら２つのインディケー タ間の物理的距離が約１ｍｂに相当することをこの分析は示している。

５ｕｔｈｅｒｌａｎｄら　（Ｌｅｕｋｅｍｉａ　３　：　９−１３　（１９８９ ）〕による以前の分析により、細胞増殖の調節に関与するインターロイキンであ るＬＩＦをエンコードしている遺伝子は、ＥＳトランスロケーションブレークポ イントの細胞遺伝学的近辺にある染色体２２ｑ１２に位置することか確立された 。トランスロケーションがこの遺伝子の近くに起こったかどうかを調べるために 、合成プローブを用いてＬＩＦ遺伝子を含む一連のコスミドクローンをヒトゲノ ムコスミドライブラリーから、発表されている配列に基づいて単離することによ り、ＬＩＦ遺伝子のＥＳブレークポイントに対する相互関係を調べた。他のコス ミドマーカーに関して染色体の精密な部位を決定するため、正常なヒト、ＥＳ及 びＰＮＨの細胞からの中期染色体を用いてＣｌ５ＳＨを実施した。ＬＩＦ遺伝子 はバンド２２ｑ１２に相当するＦＬｐｔｅｒ　Ｏ，６０の正常染色体２２に位置 していた。ＬＩＦコスミドをＥＳ細胞系のＴＣ７１及び６６４７からの中期染色 体に対する／％イブリッド形成に使用した時、２つのノ＼イブリッド形成シグナ ルが正常染色体２２上に認められ、ハイブリ・ノド形成シグナルは誘導染色体１ １上ＦＬｐｔｅｒ　０．９２に観察された。したかって、ＬＩＦ遺伝子は染色体 ２２上ｔ（１１；２２）トランスロケーションブレークポイントからの遠位に位 置しているように思われ、そしてこの染色体の転位の結果として誘導染色体１１ 上に再配置される。

同様なハイブリッド形成位置かＰＮＥ細胞系のＴＣ３２からの中期のものに観察 され、ＥＳとＰＮＥのトランスロケーションは同じ相対的位置にあることを示し ている。

染色体１１のブレークポイントに隣接するコスミドに対する転座したＬＩＦ遺伝 子の位置及び距離を決定するため、ＬＩＦコスミド及びクローン２３．３を用し するＣｌ５ＳＨ分析をＥＳ及びＰＮＥの細胞系を用いて同時に実施し、その結果 、誘導染色体１１上ＦＬｐｔｅｒ０．８８〜０．９２間に４個の蛍光スポット、 各染色分体上に２個、か局在していることか示された。上記と同し大きさの標準 を用いての中期と同期の距離の分析により、誘導染色体上のＬＩＦ−２３，２の 距離は１ｍｂ以下であることが示された。

ＬＴＦ遺伝子は細胞増殖に対して顕著な発育作用を有するインターロイキンをエ ンコードしているので、ＥＳトランスロケーションはＬＩＦ遺伝子を阻止するか あるいは活性化し、そして悪性疾患の病因に重要な役を果たしているように考え られる。ＬＩＦ遺伝子がトランスロケーションによって阻止されるかどうか、し たがってその発現を変更するかどうかについて調べるため、転位の証拠について ＬＩＦ遺伝子付近の染色体２２の領域を精査するためにパルスフィールドゲル分 析を行った。正常線維芽細胞系及び正常末梢血リンパ球からのＤＮＡ、ならびに ＥＳ及びＰＮＥ細胞系から単離したＤＮＡを各種のレアーカッティング制限酵素 （Ｍｌｕ　Ｉ　、Ｂｓ５Ｈ［［、Ｓｆｉ　Ｉ、Ｎｏｔｌ）で切断し、コスミドＬ ＩＦ３Ｅ２１１から調製した反復の無いプローブにハイブリッドさせた。１種類 のフラグメントが正常、ＥＳ及びＰＮＥのＤＮＡサンプルに確認され、これらの フラグメント内で起る転位の証拠は観察されなかった。コスミドＬＩＦ３Ｅ２Ｔ Ｉ（これから反復の無いプローブか生ずる）は内部ＮｏｔＩ又はＢｓ５ｈ［［部 位を含んでいなかったので、このデータは、ＥＳ及びＰＮＥの両細胞系のｔ　（ １１；２２）　トランスロケーションブレークポイントはＬＩＦ遺伝子にまたが る６５０ｋｂゲノムフラグメントの外側に存在することを示している。ＬＩＦと クローン２３．２が１ｍｂ以下の誘導染色体上で分離されれば、これはブレーク ポイントの領域を狭いゲノム領域に制限するものである。

本発明の好ましい態様について特定の引用例を用いて詳細に説明したか、本発明 の精神と範囲内での変更と改変か可能であることは当然とするところである。

Ｎｏｔｌ ＦＩＧ、　２ 補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. １．生物のゲノム中の染色体異常の存在を確認する方法で、その方法は以下のこ とを含む： （ａ）前記生物から得た無傷の染色体のＤＮＡを、何らの異常もない無傷の染色 体からの全ＤＮＡを認識するクローンのパネルとハイブリッドを形成させ、それ によって最初のハイブリッド形成パターンを作り出し、そして （ｂ）前記最初のハイブリッド形成パターンと対照ハイブリッド形成パターンを 比較することによって染色体異常の存在を確認する；ここでの対照ハイブリッド 形成パターンは前記パネルがいかなる異常もない無傷の染色体を認識するＤＮＡ とハイブリッドを作るときに得られるパターンを含む。
2. ２．前記パネルは、各染色体に関して、平均として各クローン間に約３００キロ 塩基が存在するような十分な数のクローンを含む請求項１記載の方法。
3. ３．前記クローンはコスミド、酵母人工染色体、Ｆ１プラスミド、またはＰ１バ クテリオファージから選択される請求項２記載の方法。
4. ４．さらに以下のことを含む請求項１記載の方法：（ｃ）前記最初のハイブリッ ド形成パターンと前記対照ハイブリッド形成パターンとの間の特定の差を、観察 されたハイブリッド形成パターン差の原因となる特定クローンと相関させること によって、その生物を苦しめ、またはその生物が感受性を有する特定の疾患を同 定する。
5. ５．前記細胞はステップ（ａ）に先立って、まず前記の細胞を発育相におき、次 いで前記細胞のかなりの数の増殖が中期で止まる相におき、これによって無傷の 染色体ＤＮＡを視覚化させることにより、前処理される請求項１記載の方法。
6. ６．無傷の染色体からのＤＮＡの起原は脊椎動物である請求項１記載の方法。
7. ７．前記の脊椎生物は鳥、魚、爬虫動物、両性動物または哺乳動物から選択され る請求項６記載の方法。
8. ８．前記の脊椎生物は哺乳動物である請求項６記載の方法。
9. ９．生物のゲノム中の染色体異常の存在と位置を同定する方法であって、以下の ことを含む方法：（ａ）前記生物から得た無傷の染色体のＤＮＡを、前記異常を 含むと思われる染色体に対応する異常なしの単一染色体に対して特異的なクロー ンのパネルとハイブリッド形成させ、それによって最初のハイブリッド形成パタ ーンを作り出し、そして（ｂ）前記最初のハイブリッド形成パターンを対照ハイ ブリッド形成パターンと比較することによって染色体異常の存在と位置を同定す る；そこで前記対照ハイブリッド形成パターンは、前記パネルがいかなる異常も ない無傷の染色体を認識するＤＮＡとハイブリッド形成するときに得られるパタ ーンを含む。
10. １０．さらに以下のことを含む請求項９記載の方法：（ｃ）前記最初のハイブリ ッド形成パターンと前記対照ハイブリッド形成パターンを相関させて分別ハイブ リッド形成パターンを作り出し、次いでさらに分別ハイブリッド形成パターンを 既知の特定的な異常と相関させることによって、その生物を苦しめ、またはその 生物が感受性を有する特定の疾患を同定する。
11. １１．前記クローンのパネルは、各染色体について平均としてクローン間に約３ ００キロ塩基があるような十分な数のクローンを含んでいる請求項９記載の方法 。
12. １２．前記染色体−特異的クローンは、コスミド、酵母人工染色体、Ｆ１プラス ミドまたはＰ１バクテリオファージから選択される請求項１１記載の方法。
13. １３．生物のゲノム中の特異的な染色体異常の存在を確認する方法であって、以 下のことを含む方法：（ａ）前記生物からの無傷の染色体のＤＮＡを、前記特異 的染色体異常の存在の診断に役立つ少なくとも１つのクローンとハイブリッド形 成させ、そして（ｂ）前記クローンを何らの異常もない無傷の染色体ＤＮＡとハ イブリッド形成させたときのハイブリッド形成パターンに対して、前記クローン を以って、異なるハイブリッド形成パターンを作り出すような生物を、前記特異 的染色体異常を含むものとして同定する。
14. １４．前記特異的染色体異常の存在を診断するのに役立つ前記クローンが、１つ またはより多くの異常を含むと思われる染色体から導出される請求項１３記載の 方法。
15. １５．前記染色体−特異的クローンはコスミド、酵母人工染色体、Ｆ１プラスミ ド、またはＰ１バクテリオファージから選択される請求項１３記載の方法。
16. １６．染色体１１、２２トランスロケーションと関連する神経上皮腫瘍の被験者 における存在、またはこの腫瘍に対する被験者の感受性を決定するための方法で あって、以下のことを含む方法： （ａ）前記被験者からの無傷の染色体ＤＮＡを、染色体１１、１２トランスロケ ーションの存在を診断するのに役立つ染色体１１および／または染色体２２に対 して特異的な少なくとも１つのクローンとハイブリッド形成させ、そして （ｂ）いかなる異常もない無傷の染色体ＤＮＡとハイブリッド形成させたとき、 前記パネルのハイブリッド形成のパターンに対して異なるハイブリッド形成パタ ーンを有する無傷の染色体ＤＮＡを、染色体１１、２２トランスロケーションと 関連した神経上皮腫瘍の存在またはそれに対する感受性を示すものとして同定す る。
17. １７．神経上皮腫瘍、Ｅｗｉｎｇ肉腫の存在が他の骨腫瘍の存在と区別される請 求項１６記載の方法。
18. １８．神経上皮腫瘍、末梢神経上皮腫の存在が他の腫瘍の存在と区別される請求 項１６記載の方法。
19. １９．神経上皮腫瘍、Ａｓｋｉｎ腫瘍の存在が他の胸壁腫瘍の存在と区別される 請求項１９記載の方法。
20. ２０．染色体１１に特異的な前記少なくとも１つのクローンは、クローン２３． ２またはクローン５．８から選択される請求項１６記載の方法。
21. ２１．染色体２２に特異的な前記少なくとも１つのクローンはクローンＬＩＦ３ Ｅ２ＩＩである請求項１６記載の方法。
22. ２２．プローブ２３．２、５．８またはＬＩＦ３Ｅ２ＩＩの同定配列と実質的に 同じ同定配列を有するプローブ。