DE4410809C1 - Laminierte Enzymschicht und Verfahren zu ihrer Herstellung - Google Patents

Laminierte Enzymschicht und Verfahren zu ihrer Herstellung

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Description

Die Erfindung betrifft laminierte Enzymschichten, die als biologische Komponente in Enzymsensoren verwendbar sind sowie deren Herstellung. Anwendungsgebiete der resultierenden Enzymsensoren und damit der Erfindung sind neben der Labordiagnostik von klinisch wichtigen Substanzen die Intensivmedizin (direkte invasive Kontrolle von Überwachungsparametern), die Lebensmitteluntersuchung und die Umweltkontrolle.
Es sind mehrere Möglichkeiten der Herstellung von biologischen, speziell enzymatischen, Schichten beschrieben. Die einfachste und älteste Möglichkeit ist das Einschließen einer Enzymlösung zwischen zwei semipermeablen Membranen (DD 24 33 212) oder in einer Multilayeranordnung (EP 0 079 502 A1). Es ist bekannt, Enzyme in Hydrogelen einzuschließen (DD 2 22 129 A1, DE 38 12 442 A1, DD 1 50 508, DD 1 50 500, L.P.Kusnetzova et al. 1990 Journal of Analyt. Chem. USSR 45/7, 1033-1038). Weiterhin ist die kovalente Bindung von Enzymen mit Hilfe von Glutaraldehyd bekannt ( DE 29 26 647 A1). Auch der Einschluß in Klebern ist beschrieben (DD 2 79 587 A3, DE 39 27 056, DT 26 38 193 A1).
Die Fixierung einer Enzymlösung zwischen zwei semipermeablen Membranen ist auf Grund der geringen Stabilität des Systems heute als nachteilig zu bezeichnen.
Der Einschluß in Hydrogelen wie Gelatine oder Polyvinylalkohol ist im Vergleich zur kovalenten Bindung als ausgesprochen milde Immobilisierungsmethode zu bezeichnen. Die Immobilisierungseffekte wie reduzierte Aktivität, veränderter pH-Bereich und veränderte Kinetik sind hier sehr klein. Der hervorzuhebende Vorteil des Einsatzes von Hydrogelen ist die erzielbare homogene Verteilung der Proteinmoleküle im Hydrogel durch vorheriges Lösen in demselben. Als signifikante Nachteile stehen dem gegenüber starke Quellfähigkeit des Gels auch nach der Immobilisierung von Proteinen und damit ein relativ instabiles System, mechanische Instabilität, thermische Instabilität sowie relativ dicke Schichten. Dadurch kann eine brauchbare Funktionsstabilität in den meisten Fällen nicht gewährleistet werden.
Die oben genannten Nachteile der Hydrogel-Immobilisierung treffen auf den Einschluß von Enzymen in wasserunlöslichen Klebern nicht zu, da die in organischen Lösungsmitteln gemischten Kleber dünne und quellstabile Schichten zulassen.
Aus DD 2 79 587 A3 und DD 2 90 913 A5 sind Enzymschichten bekannt, die aus einer Mischung von Polyurethanpräpolymer in wasserfreiem Lösemittel und wasserfreiem Enzym aufgebaut sind. In der daraus entstehenden Suspension sind die Enzympartikel nicht gelöst, woraus sich eine nicht optimale Verteilung ergibt. Die Enzymsuspension wird auf einen festen Träger verteilt, wodurch nach Trocknung eine filmartige poröse Schicht entsteht, die ungleichmäßig verteilte enzymatisch aktive Partikel enthält. Der feste Träger kann in einer Membranschicht oder in einer Elektrodenoberfläche bestehen. Dieser Aufbau läßt nur eine mehr oder weniger gute Verteilung, z. B. durch Ultraschallbehandlung, zu. Außerdem ist bei Produktions-Chargen eine definierte Verarbeitung der Suspensionen in organischen Lösemitteln mit hohem Dampfdruck selbst unter Kühlung schwierig. Daraus ergeben sich zwangsläufig hohe Verluste aktiver Partikel und unzuverlässige Qualität der resultierenden Enzymschichten.
Ziel der Erfindung ist es, eine laminierte Membran zu erhalten, die sich neben einer hohen Empfindlichkeit und Stabilität sowie geringer Ansprechzeit durch eine reproduzierbar homogene Verteilung der biologisch aktiven Enzympartikel auszeichnet.
Die Erfindung wird durch eine Enzymschicht realisiert, die gemäß Anspruch 1 aus Enzym­ partikeln besteht, die in einem hydrophilen Polymer gelöst sind, wobei die nach Trocknung entstehende Enzymschicht wasserunlöslich ist. Damit werden die Vorteile von wasserunlöslichen Klebstoffen und von Hydrogelen kombiniert. Die Anwendung dieser neuen laminierten Enzymschicht wird entweder gemäß Anspruch 2 und 3 in Enzymmembranen oder gemäß Anspruch 4 in Enzymnadelsensoren realisiert. Die Herstellung der erfindungsgemäßen Enzymschicht erfolgt gemäß Anspruch 9, die Unteransprüche sind Vorzugsvarianten.
Im Gegensatz zu den bekannten Enzymschichten auf der Basis von wasserunlöslichen Polymeren wird durch den erfindungsgemäßen Einsatz von wäßrigen Polymersuspensionen oder -dispersionen eine Lösung, nicht aber eine Suspendierung der Enzympartikel in dem Matrix formenden Trägerpolymer vorgenommen. Damit wird die optimale Verteilung der biologisch aktiven Partikel garantiert.
Die Lösung von enzymatischen Partikeln in wäßrigen Polymeren führt zu Enzymlösungen, aus der durch die optimale Verteilung reproduzierbar hochaktive Schichten mit geringster Dicke hergestellt werden können. Diese Schichten zeichnen sich auf Grund ihrer geringen Dicke durch eine sehr geringe Ansprechzeit aus. Da die Polymer-Enzymschicht nach Lufttrocknung wasserunlöslich ist und ein geringes Quellverhalten zeigt, ist die resultierende dünne hochreaktive Schicht auch sehr stabil, sowohl mechanisch als auch thermisch (im Gegensatz zu Hydrogelen, die bei < 40°C in flüssigen Zustand übergehen). In den Enzymschichten können sowohl einzelne Enzyme als auch Multienzymsysteme immobilisiert werden. Um die Enzymschichten in Enzymsensoren einsetzen zu können, werden sie weiterhin mit Unterlage- und/oder Deckmembranen kombiniert oder mit weiteren Polymerschichten überzogen.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen Enzymschichten erfolgt im wesentlichen nach den im folgenden beschriebenen Varianten:
  • A) Enzymschicht für Enzymmembran
    Das Enzym oder Multienzymsystem wird in dem in wäßriger Phase emulgierten Acrylat oder dispergierten Polyurethan durch Rühren gelöst und auf eine Dialysemembran getropft oder gestrichen oder gedruckt. Der Vorgang kann in Abhängigkeit von dem Einsatzzweck ein bis mehrfach wiederholt werden. Dabei kann sowohl das gleiche Enzym oder Enzymsystem mehrfach übereinander angeordnet werden als auch ein Schichtsystem unterschiedlicher Enzyme, die in Sequenz reagieren,aufgebracht werden. Die Enzymschicht/en kann/können anschließend durch eine zweite semipermeable Membran abgedeckt werden, es kann aber auch eine einseitig bedeckte Enzymschicht eingesetzt werden.
  • B) Enzymschicht für Nadelsensoren
    Für den Einsatz in Enzym-Nadelsensoren wird die Enzymschicht über Tauchverfahren auf dem Sensor aufgebracht. Das Enzym oder Multienzymsystem wird in gleicher Weise wie unter A) mit dem wäßrigen Polymer verarbeitet. Der gereinigte Nadelsensor wird anschließend in das wäßrige Enzym-Polymer-Gemisch getaucht und danach getrocknet. Dieser Vorgang kann in gleicher Weise wie bei A) wiederholt werden. Da Nadelsensoren vor allem für den Einsatz im invasiven Bereich benutzt werden, ist als letzte (äußerste) Schicht eine bio- und hämokompatible Schicht erforderlich. Dazu können z. B. Silikone und Polyurethane dienen.
Ausführungsbeispiele
Die Erfindung soll nachstehend an 4 Beispielen erläutert werden.
Beispiel 1
Zu 0.5 ml Lösung einer 5%igen Emulsion eines anionischen Reinacrylates (Formulierung durch langsames Zugeben des Reinacrylates zu einer Mischung aus Wasser und/oder Alkohol) werden 20 mg Glucoseoxidase mit der spezifischen Aktivität von 130 U/mg gegeben und in der Polymeremulsion durch 2 min Rühren gelöst. 2 µl dieser enzymhaltigen Lösung, die eine Schichtdicke von < 2 µm ergeben, werden auf eine Dialysemembran mit einer Dicke < 5 µm aufgedruckt und sofort mit einer zweiten Dialysemembran abgedeckt. Die resultierende kombinierte Enzymschicht ist < 20 µm dick. Die GOD-Membran ist nach 30 min einsatzfähig und geeignet für den Einsatz in Enzymanalysatoren.
Beispiel 2
Zu 0.2 ml Lösung einer 10%igen Dispersion eines aliphatischem Polycarbonates werden 12.5 mg Lactatoxidase mit einer spezifischen Aktivität von 35 U/mg gegeben und darin durch 1 min Rühren bei + 4°C gelöst. Die Spitze einer amperometrischen Nadelelektrode bestehend aus Pt-Arbeitselektrode und Ag/AgCl-Gegenelektrode wird nach Reinigung mit Alkohol für t = 3 s drehend in die Enzym-Polymer-Lösung eingetaucht und anschließend t = 30 s an der Luft getrocknet. Dieser Vorgang wird 5 mal wiederholt. Anschließend wird die Enzymschicht durch einmaliges Tauchen in 1,2% Polyetherurethan für den subcutanen Einsatz präpariert.
Beispiel 3
Zu 0.2 ml einer 10%igen wäßrigen kolloidalen Dispersion eines aromatischen Urethans werden 5 mg des Enzyms Laccase (spezifische Aktivität 1200 U/mg) und 10 mg des Enzyms Oligosacchariddehydrogenase (spezifische Aktivität ca. 120 U/mg) gegeben und durch leichtes Rühren gelöst. 2 µl dieser Lösung werden auf eine Dialysemembran (Dicke < 10 µm) getropft. Dieser Vorgang wird 3 mal nach jeweils 5 Minuten wiederholt.
In dieser Bienzymmembran sind geeignete Bedingungen für ein stabiles und hohes Substratrecycling geschaffen. Damit ist diese Enzymschicht bei Kombination mit einer polyethylenbeschichteten Sauerstoffelektrode zur Analyse von Neurotransmittern und Hormonen wie Adrenalin und Noradrenalin geeignet, die in Serum und Vollblut im subnanomolaren Bereich vorkommen.
Beispiel 4
Zu 0.2 ml einer 10%igen Emulsion eines anionischen Reinacrylates (Formulierung durch langsames Zugeben des Reinacrylates zu einer Mischung aus Wasser und/oder Alkohol) werden 8 mg Glucoseoxidase mit der spezifischen Aktivität von 130 U/mg gegeben und in der Polymeremulsion durch 2 min Rühren gelöst. Die Spitze einer amperometrischen Pt-Ag7AgCl-Nadelelektrode wird nach Alkoholreinigung für t = 3 s drehend (1 U/s) in die Polymerlösung getaucht und anschließend einer 30 s Lufttrocknung ausgesetzt. Dieser Vorgang wird 3 mal wiederholt. Anschließend wird die Nadelelektrode samt Enzymschicht einer einmaligen Tauchung in microporöses Silizium unterzogen. Die Außenschicht wird durch Tauchen in 1,2% Polyetherurethan formuliert.

Claims (18)

1. Laminierte Enzymschicht für Enzymsensoren, dadurch gekennzeichnet, daß die Enzymschicht aus hydrophilem, in wäßriger Phase vorliegendem Polymer und darin gelösten Enzympartikeln besteht.
2. Laminierte Enzymschicht nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Schicht als biologisches Erkennungsmaterial in Enzymmembranen eingesetzt wird.
3. Enzymmembran nach Anspruch 1-2, dadurch gekennzeichnet, daß die Enzymschicht auf einer Membran oder zwischen zwei Membranen fixiert ist, die gegebenenfalls über die Enzymschicht hinausragen und dann dort die Schicht einhüllend fest miteinander verbunden sind.
4. Laminierte Enzymschicht nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Schicht auf Nadelsensoren als biologisch aktives Material eingesetzt wird.
5. Laminierte Enzymschicht nach Anspruch 1 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Enzymschicht auf einem festen Träger fixiert ist und mit einer oder ggf. mehreren weiteren Polymerschichten bedeckt bzw. abgedeckt ist.
6. Laminierte Enzymschicht nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß sie feinteilige niedermolekulare enzymatische Reaktionen beeinflussende Substanzen enthält.
7. Laminierte Enzymschicht nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Größe der die enzymatische Reaktion beeinflussenden Substanzen kleiner als 1 µm beträgt.
8. Laminierte Enzymschichten nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Polymere in wäßriger Phase emulgierte Acrylate oder dispergierte Polyurethane sind.
9. Verfahren zur Herstellung einer laminierten Enzymschicht nach Anspruch 1 für die Verwendung in einer Enzymmembran-Elektrode gemäß Anspruch 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß eine wäßrige Polymeremulsion oder -dispersion, in der Enzyme gelöst sind, auf eine Membran aufgetragen und durch Luftstrom getrocknet wird und gegebenenfalls eine zweite Membran aufgedrückt wird, wobei in diesem Fall gegebenenfalls vor dem Aufdrücken der zweiten Membran zusätzlich eine die getrocknete Enzymschicht nicht anlösende Vernetzungsmittellösung auf die beschichtete Membran gebracht wird.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Auftragen der in der Polymerdispersion gelösten Enzyme nach an sich bekannten Methoden gleichmäßig über eine Teilfläche erfolgt.
11. Verfahren nach Anspruch 9-10, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite Membran nach vorherigem Auftragen einer Vernetzungsmittellösung auf die Schicht und auf die darüber hinausreichende Membran so aufgedrückt wird, daß die Enzymschicht von beiden Membranen eingehüllt wird.
12. Verfahren nach Anspruch 9-11, dadurch gekennzeichnet, daß als Vernetzungsmittel in wäßriger Phase vorliegende Acrylate und Polyurethane verwendet werden.
13. Verfahren nach Anspruch 9-12 dadurch gekennzeichnet, daß Enzyme wie Glucoseoxidase, Lactatoxidase, Urease, Uricase, Glutamatoxidase, Lysinoxidase, Laccase, Glucoamylase, Mutarotase, β-Galactosidase, Invertase, Glucosedehydrogenase, Oligosacchariddehydrogenase, Tyrosinase eingearbeitet werden.
14. Verfahren nach Anspruch 9-13, dadurch gekennzeichnet, daß enzymatische Reaktionen beeinflussende Substanzen wie Aminotriazol eingearbeitet werden.
15. Verfahren zur Herstellung einer Enzymschicht nach Anspruch 1 zum Einsatz in Nadelsensoren gemäß Anspruch 4 und 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Nadelelektrode in eine Polymerdispersion oder Polymeremulsion, in der Enzyme gelöst sind, eingetaucht wird.
16. Verfahren zur Herstellung einer Enzymschicht nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß nach Trocknung der Enzymschicht der Nadelsensor durch eine oder ggf. mehrere Polymerschichten ohne Enzym durch Eintauchen beschichtet und gegebenenfalls nachfolgend mit einer biokompatiblen Außenhülle versehen wird.
17. Verfahren nach Anspruch 15 und 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Polymerschichten aus Reinacrylaten, Acrylat-Styrol-Copolymeren, aliphatischen Polycarbonaten, aliphatischen Polyurethanen oder Siliziumoxid bestehen.
18. Verfahren nach Anspruch 15-17, dadurch gekennzeichnet, daß Enzyme wie Glucoseoxidase, Lactatoxidase, Laccase, Oligosacchariddehydrogenase, Uricase, Tyrosinase eingearbeitet werden.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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DD290913A5 (de) * 1988-08-26 1991-06-13 Akad Wissenschaften Verfahren zur immobilisierung biologisch aktiver materialien

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