DE4341491A1

DE4341491A1 - Vorrichtung zum Peptidfragmentsammeln

Info

Publication number: DE4341491A1
Application number: DE4341491A
Authority: DE
Inventors: Kiyoshi Nokihara; Rintaro Yamamoto; Yoshiyuki Togawa; Mitsuhiro Hashimoto; Naoki Morita
Original assignee: Shimadzu Corp
Current assignee: Shimadzu Corp
Priority date: 1992-12-04
Filing date: 1993-12-06
Publication date: 1994-06-09
Also published as: US5431882A; JPH06172380A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung zum Peptidfragmentsammeln, genauer eine Vorrichtung zum Sammeln eines Peptidfragments mit einer terminalen Carboxylgruppe aus einer Mischung von Peptidfragmenten aus spezifischem Aufspalten der Peptidbindung in einem Polypeptid zwischen einem Lysinrest und dem benachbarten Aminosäurerest mit terminaler Carboxygruppe.

Zu Untersuchungsverfahren der terminalen Carboxylgruppe eines Peptids (im folgenden als "C-Terminal" bezeichnet) zählen das Hydrazinolyseverfahren, das Tritiummarkierverfahren und das Carboxypeptidaseverfahren. Sowohl das Hydrazinolyseverfahren als auch das Tritiummarkierverfahren können mit den endständigen C-terminalen Aminosäurerest bestimmen, keines kann alle C-termina len Aminosäurereste bestimmen. Das Carboxypeptidaseverfahren beruht auf einem sequentiellen Peptidbindungsbruch des C-Terminalen eines Polypeptids durch verschiedene Carboxypepti dasen. Allgemein hat dieses Verfahren die Nachteile schwieriger Durchführung, großen Probenvolumens, Ungenauigkeit bei der Aminosäuresequenzierung und geringer Anwendbarkeit auf relativ langkettige Polypeptide.

Ein Verfahren zum Peptidfragmentsammeln, das dieses Problem löst, ist in der japanischen Offenlegungsschrift Nr. 1-235600 offenbart. In diesem Verfahren werden Peptidbindungen zwischen Lysinresten und benachbarten C-terminalen Aminosäureresten selektiv aufgebrochen. Die entstehende Peptidfragmentmischung wird mit einem festen Träger umgesetzt, der auf seiner Oberfläche eine funktionelle Gruppe trägt, die zum Bilden einer covalenten Bindung durch eine Reaktion mit einer freien Aminogruppe in der Lage ist. Anschließend wird die Peptidbindung zwischen dem terminalen Rest mit der Aminogruppe und dem benachbarten Rest mit einer Säure, wie Trifluoressigsäure (TFA) gespalten; es wird eine 50%ige Acetonitril/2-Propanol-Mischung, die 0,1% TFA enthält, zugegeben und anschließend zentrifugiert.

Das so abgetrennte C-terminale Peptid wird gesammelt und dann im Vakuum getrocknet. In diesem Verfahren wird das C-terminale Peptid an den festen Träger nur an dessen α-Aminogruppe gebunden, während die anderen Peptide an dem festen Träger an der ε-Aminogruppe des Lysinrests als auch an der N-terminalen Aminogruppe gebunden werden. Wenn dieser Komplex aus Peptid und festem Träger mit einer geeigneten Säure unter geeigneten Bedingungen behandelt wird, wird nur die Peptidbindung zwischen dem amino-terminalen Rest und dem benachbarten Rest aufgebrochen, und das C-terminale Peptid wird in der Reaktionslösung mit dessen amino-terminalen Rest, der auf dem festen Träger zurückbleibt, abgetrennt, während die anderen Peptide auf dem festen Träger gebunden bleiben (Fig. 17).

Obwohl das zuvor beschriebene Verfahren ein vergleichsweise leichtes Trennen und Sammeln des C-terminalen Peptids erlaubt, bedarf es nach wie vor geschickter manueller Operationen in verschiedenen Verfahren, einschließlich Zentrifugieren und Vakuumtrocknen, um das C-terminale Peptidfragment aus der Peptidfragmentmischung, die durch Enzymbehandlung gewonnen wurden, zu sammeln. Hierdurch ist es schwierig, erschwert es, das C-terminale Peptid durch einfache Operation und mit hoher Genauigkeit zu sammeln, und die Reproduzierbarkeit ist gering.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine einfach handhabbare Vorrichtung zum Sammeln des C-terminalen Peptid fragments und mit hoher Reproduzierbarkeit zur Verfügung zu stellen.

Die Vorrichtung zum Peptidfragmentsammeln der vorliegenden Erfindung dient zum Sammeln eines C-terminalen Peptidfragments aus einer Peptidfragmentmischung, die beim spezifischen Auf spalten der Peptidbindung zwischen einem Lysinrest und dem benachbarten C-terminalen Aminosäurerest entsteht. Diese Vor richtung enthält ein Immobilisierungsmittel, ein Aufspaltmittel, Gewinnungsmittel und eine Steuerung.

Das Immobilisierungsmittel dient zum Immobilisieren einer Peptidfragmentmischung an einem festen Träger durch Ankuppeln der Peptidfragmentmischung. Das Aufspaltmittel spaltet die Peptidbin dung nach der Immobilisierung durch Säurebehandlung auf. Das Gewinnungsmittel gewinnt das C-terminale Peptidfragment, das nach der Aufspaltbehandlung erhalten wurde. Die Steuerung sorgt für die aufeinanderfolgende Durchführung der obigen Mittel.

Bei der Vorrichtung zum Peptidfragmentsammeln gemäß vor liegender Erfindung veranlaßt die Steuerung die Funktion des Immobilisierungsmittels, des Aufspaltmittels und des Gewinnungs mittels aufeinanderfolgend in dieser Reihenfolge, wobei die Peptidfragmentmischung mit einem festen Träger durch Immobilisie rungsmittel verbunden wird; die mit dem festen Träger verbundene Peptidfragmentmischung wird durch ein eine Säurebehandlung nutzendes Aufspaltmittel aufgespalten; und die nach der Spaltung erhaltenen C-terminalen Peptidfragmente werden durch das Gewinnungsmittel gewonnen.

Da die Steuerung die Immobilisierungsmittel, Aufspaltmittel und Gewinnungsmittel aufeinanderfolgend in dieser Reihenfolge funktionieren läßt, ist hierbei keine geschickte Arbeit zum Peptidfragmentsammeln notwendig, wodurch möglich wird, das C-terminale Peptidfragment durch einfache Bedienung und mit hoher Reproduzierbarkeit zu sammeln.

Die vorliegende Erfindung kann durch die im folgenden angegebene detaillierte Beschreibung und den beigefügten nur erklärenden Zeichnungen, die nicht die vorliegende Erfindung einschränken, besser verstanden werden,

Fig. 1 zeigt den perspektivischen Blick auf ein Beispiel der Vorrichtung zum Peptidfragmentsammeln der vorliegenden Erfindung;

Fig. 2 zeigt die Vorderansicht des Bedienungsfelds des in Fig. 1 gezeigten Beispiels;

Fig. 3 zeigt einen Plan des Leitungssystems des in Fig. 1 gezeigten Beispiels;

Fig. 4 zeigt ein Flußdiagramm des Steuersystems des Beispiels aus Fig. 1;

Fig. 5 zeigt ein Flußdiagramm einer Regelroutine des Steuersystems in Fig. 4;

Fig. 6 zeigt ein Flußdiagramm einer Regelroutine des Steuersystems in Fig. 4;

Fig. 7 zeigt ein Flußdiagramm einer Regelroutine des Steuersystems in Fig. 4;

Fig. 8 zeigt ein Flußdiagramm einer Regelroutine des Steuersystems in Fig. 4;

Fig. 9 zeigt ein Flußdiagramm einer Regelroutine des Steuersystems in Fig. 4;

Fig. 10 zeigt ein Flußdiagramm einer Regelroutine des Steuersystems in Fig. 4;

Fig. 11 zeigt ein Flußdiagramm einer Regelroutine des Kontrollsystems in Fig. 4;

Fig. 12 zeigt ein Flußdiagramm einer Regelroutine des Kontrollsystems in Fig. 4;

Fig. 13 zeigt ein Flußdiagramm einer Regelroutine des Steuersystems in Fig. 4;

Fig. 14 zeigt ein Flußdiagramm einer Regelroutine des Steuersystems in Fig. 4;

Fig. 15 zeigt ein Flußdiagramm einer Regelroutine des Steuersystems in Fig. 4,

Fig. 16 zeigt ein Flußdiagramm einer Regelroutine des Steuersystems in Fig. 4; und

Fig. 17 zeigt eine schematische Darstellung des chemischen Verfahren der C-terminal-Peptidfragmentabtrennung der vor liegenden Erfindung.

Die Bezugszahlen in den Fig. 1 bis 6 bezeichnen die folgenden Elemente:

Element 1 ist ein Peptidfragmentsammler, Element 2 ein Hauptgehäuse, Element 3 ein Bedienungsfeld, Element 4 eine erste Flaschenstation, Element 5 eine zweite Flaschenstation, Element 6 eine Gewinnungsflasche, Element 7 ein Gewinnungsflaschenhalter, Element 8 ein Heizblock, Element 9 eine Abfallflüssigkeits flasche, Element 10 ein Abfallflüssigkeitsflaschenhalter, Element 11 eine Gewinnungsflüssigkeitsflasche, Element 12 ein Gewinnungs flüssigkeitsflaschenhalter, Element 13 eine Aufspaltflüssigkeits flasche, Element 14 ein Aufspaltflüssigkeitsflaschenhalter, Element 15 eine Waschflüssigkeitsflasche, Element 16 ein Waschflüssigkeitsflaschenhalter, Element 19 ein Prozeßindikator anzeiger, Element 20 eine Eingabetasteneinheit, Element 21 einen Zustandsanzeiger, Element 31 ein Meßrohr, Element 32 eine Säule, Element 33 ein Flüssigkeitssensor, Element 34 ein Verteilerblock, Element 40 eine Regeleinheit, Element 41 eine Temperaturregel einheit und Element 42 ein Zeitgeber.

Genaue Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform

Eine Vorrichtung der vorliegenden Erfindung sammelt ein C-terminales Peptidfragment aus einer Peptidfragmentmischung, die aus spezifischen Aufspalten der Peptidbindung zwischen einem Lysinrest und dem benachbarten C-terminalen Aminosäurerest stammt. Diese Vorrichtung enthält ein Immobilisierungsmittel, Aufspaltmittel, Gewinnungsmittel und eine Steuerung.

Die Peptidfragmentmischung wird durch Aufspalten eines Peptids (Protein) mit einem Lys-C-spezifischen Spaltenzym, wie API (Achromobacter lyticus protease I) und Endoproteinase Lys-C (Handelsbezeichnung, hergestellt von Boehringer Mannheim) hergestellt.

Durch die Immobilisierungsmittel (d. h. Kupplungsmittel) gemäß vorliegender Erfindung wird die entstandene Peptidfragment mischung zum Kuppeln mit dem festen Träger gebracht, der eine funktionelle Gruppe besitzt, die mit der α-Aminogruppe jeden Fragments und der ε-Aminogruppe des Lys unter Ausbildung einer covalenten Bindung reagiert. Die funktionelle Gruppe ist beispielsweise eine Imidgruppe, Aldehydgruppe, Cyanogruppe, Acetylgruppe, Succinylgruppe, Maleylgruppe und Isothiocyanat gruppe; im Hinblick auf spezifische Reaktivität mit der Amino gruppe und spezifischem Aufspalten nach Bindung wird die Isothiocyanatgruppe bevorzugt. Der feste Träger mit solchen funktionellen Gruppen ist ein fester Träger aus einem Material wie poröses Glas, Silicagel oder Polystyrol, beispielsweise DITC- Polyvinylalkohol.

Durch das Aufspaltmittel wird die Peptidbindung zwischen dem α-Aminosäurerest und dem benachbarten Aminosäurerest jedes Fragments nach Kuppeln durch Säurebehandlung aufgespalten. Die für die Säurebehandlung verwendbare Säure gemäß vorliegender Erfindung ist nicht eingeschränkt, aber Trifluoressigsäure (TFA) wird aufgrund ihrer hohen Flüchtigkeit, hohen Reaktivität und dem geringen Vorkommen von Nebenreaktionen bevorzugt.

Durch die Gewinnungsmittel wird das freigesetzte C-terminale Peptidfragment in die Gewinnungsflasche geführt. Das Gewin nungsmittel dient zum Gewinnen des freigesetzten C-terminalen Peptidfragments in der Gewinnungsflasche durch den Fluß einer Gewinnungsflüssigkeit wie einer 50%ige Acetonitril/2-Propanol- Mischung, die 0,1% TFA enthält, durch die Säule.

Die Steuerung führt aufeinanderfolgend die Routinen für die oben genannten Mittel durch.

In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Peptidfragmentsammler 1 in der Fig. 1 erläutert. Er weist ein kastenförmiges Hauptgehäuse 2 und ein Bedienungsfeld 3, das im oberen Vorderbereich des Hauptgehäuses 2 angeordnet ist, auf. Auf der Vorderseite des Hauptgehäuses 2 befindet sich eine vertikal angeordnete erste Flaschenstation 4 und eine zweite Flaschen station 5.

Die erste Flaschenstation 4 ist mit einem Gewinnungs flaschenhalter 7 versehen, an dem eine Gewinnungsflasche 6, die das gewonnene C-terminale Peptid auffangen kann, befestigt wird, und einem Heizblock 8, der eine später beschriebene Säule 32 enthält. Die zweite Flaschenstation 5 ist mit einem Abfall flüssigkeitsflaschenhalter 10 zum Anbringen einer Abfallflüssig keitsflasche 9, einem Gewinnungsflüssigkeitsflaschenhalter 12 zum Anbringen einer Gewinnungsflüssigkeitsflasche 11 zum Auffangen der Gewinnungsflüssigkeit, einem Aufspaltflüssigkeitsflaschenhal ter 14 zum Anbringen einer Aufspaltflüssigkeitsflasche 13, die Trifluoressigsäure (TFA) als Aufspaltagenz enthält, und einem Waschflüssigkeitsflaschenhalter 16 zum Anbringen einer Wasch flüssigkeitsflasche 15, die eine Waschflüssigkeit enthält, ausgestattet.

Wie aus Fig. 2 deutlich wird, ist das Bedienungsfeld 3 mit einem Prozeßindikator 19, der aus acht parallel angeordneten Einheiten von LED 1 bis LED 8 besteht, einer Eingabetasteneinheit 20, die aus fünf Tasten K1 bis K5 in paralleler Anordnung jeweils besteht und einem Zustandsanzeiger 21, der aus sechs vertikal angeordneten LEDs besteht, versehen. Die LEDs 1 bis 8 stellen sich an beim Immobilisierungsverfahren, erstem Waschverfahren, zweiten Waschverfahren, Trocknungsverfahren, Spaltverfahren, Gewinnungsverfahren, Konzentrationsverfahren bzw. bei Abschluß aller Verfahren.

Die Waschtaste K1 (WASCHEN) wird ausschließlich zum Waschen der Leitungen betrieben. Die Taste K2 ist eine TFA-Rückgewin nungstaste (TFA-RÜCK), die zum später beschriebenen Rückgewinnen der TFA betrieben wird. Die Taste K3 ist eine Cursortaste zum Auswählen des Startverfahrens. Taste K4 ist eine Betriebstaste (RUN) für den automatischen Ablauf. Taste K5 ist eine Beendi gungstaste (STOP) zum erzwungenen Abbruch eines Verfahrens.

Im Hauptgehäuse 2 befindet sich ein Leitungssystem, das dreizehn Magnetventile SV1 bis SV13, wie in Fig. 3 gezeigt, enthält. Magnetventile SV1 bis SV7 und SV11 bis SV13 sind gewöhnlich geschlossene 2-Weg-Ventile. Diese Magnetventile öffnen sich, wenn Strom angelegt wird. Die Magnetventile SV8 bis SV10 sind 3-Weg-Ventile, von denen zwei einen normalerweise offenen Einlaß besitzen und das andere einen normalerweise geschlossenen Auslaß besitzt. Mit diesen Merkmalen haben die Magnetventile SV8 bis SV10 alle ihre Anschlüsse geöffnet, wenn Strom angelegt wird, und nur ihr Auslaß ist geschlossen, wenn der Strom ausgeschaltet ist.

Der Einlaß des Magnetventils SV1 ist mit einem Stickstoff gasbehälter (nicht gezeigt) verbunden. Der Auslaß des Magnetven tils SV1 ist fest mit den Einlässen der Magnetventile SV2 bis SV7 verbunden. Der Auslaß des Magnetventils SV2 ist mit der Säule 32 im Heizblock 8 über das Magnetventil SV8, das Magnetventil SV9, einer Meßleitung 31 und dem Magnetventil SV10 verbunden.

Der Auslaß des Magnetventils SV3 ist mit dem einen Ende einer Leitung, deren anderes Ende in der Waschflüssigkeitsflasche 15 steckt, verbunden. Der Auslaß des Magnetventils SV4 ist mit dem einen Ende einer Leitung, deren anderes Ende in der Gewin nungsflüssigkeitsflasche 11 steckt, verbunden. Der Auslaß des Magnetventils SV5 ist mit dem einen Ende einer Leitung, deren anderes Ende in der Aufspaltflüssigkeitsflasche 13 steckt, verbunden. Das Magnetventil SV6 ist mit dem einen Ende einer Leitung, deren anderes Ende in der Abfallflüssigkeitsflasche 9 steckt, verbunden. Der Auslaß des Magnetventils SV7 ist mit dem einen Ende einer Leitung, deren anderes Ende in der Gewinnungs flasche 6 steckt, verbunden.

Der Auslaß des Magnetventils SV8 ist mit dem einen Ende einer Leitung, deren anderes Ende in Bodennähe der Waschflüssig keitsflasche 15 reicht, verbunden. Der Auslaß des Magnetventils SV9 ist mit einem Ende einer Leitung verbunden, wobei das andere Ende in Bodennähe der Gewinnungsflüssigkeitsflasche 11 reicht. Der Auslaß des Magnetventils SV10 ist mit dem einen Ende einer Leitung verbunden, deren anderes Ende in Bodennähe der Aufspalt flüssigkeitsflasche 13 reicht. Diese Leitungen sind aus trans parentem Harz hergestellt, um Korrosionswiderstandsfähigkeit etc. zu gewährleisten.

Im Heizblock 8 kann sich eine Säule 32 befinden, in die ein Enzym behandeltes Peptid und ein fester Träger gepackt werden kann. Die Säule 32 ist mit dem Verteilerblock 34 über eine Leitung verbunden. Zwischen der Säule 32 und dem Verteilerblock 34 ist der Flüssigkeitssensor 33 angeordnet, um durch Erkennen der durchfließenden Flüssigkeit sicherzustellen, daß die Säule 32 mit Flüssigkeit gefüllt ist. Der Verteilerblock 34 verzweigt sich in zwei Richtungen; ein Zweig ist mit einer Leitung, die in der Abfallflüssigkeitsflasche 9 steckt, verbunden und der andere entsprechend mit einer Leitung, die in der Gewinnungsflasche 6 steckt. Die Aufspaltflüssigkeitsflasche 13, Abfallflüssigkeits flasche 9 und Gewinnungsflasche 6 sind mit den Einlässen der Magnetventile SV11, SV12 bzw. SV13 über Leitungen verbunden. Die Auslässe dieser Magnetventile SV11, SV12 und SV13 sind mit der umgebenden Luft verbunden.

Der Peptidfragmentesammler 1 besitzt eine Steuerung 40, wie in Fig. 4 gezeigt. Die Steuerung 40 enthält einen Kleincomputer mit Speichermöglichkeiten, wie ROM und RAM. Die Steuerung 40 ist mit den Magnetventilen SV1 bis SV13 verbunden. Ferner ist sie mit den Tasten K1 bis K5, dem Prozeßindikator 19 und dem Zustands anzeiger 21, einer Temperaturregeleinheit 41, die die Temperatur des Heizblocks 8 reguliert, einem Zeitgeber 42 zum Festlegen der Ablaufzeiten für jeden Prozeß und einem Flüssigkeitssensor 33 verbunden. Die Temperaturregeleinheit 41 ist mit einer Tempera tureinstelleinheit (nicht gezeigt) ausgestattet.

Im folgenden werden die Regelroutinen des so ausgebildeten Peptidfragmentsammlers 1 durch die Flußdiagramme der Fig. 5 bis 16 beschrieben.

Vor dem Beginn eines Steuerbetriebs gibt der Betreiber in die entsprechenden Flaschen Reagenzien ein und setzt die Flaschen in ihre jeweilige Halterung. Die Waschflüssigkeitsflasche 15 wird zuvor mit Methanol oder Acetonitril gefüllt. Die Gewinnungs flüssigkeitsflasche 11 wird mit einer 50%igen Acetonitril/2- Propanol-Mischung, die 0,1% TFA enthält, gefüllt. Die Aufspalt flüssigkeitsflasche 13 wird mit TFA gefüllt.

Die mit funktionalisiertem festen Träger (poröses Glas mit darin aufgebrachten Isothiocyanatgruppen) gepackte Säule 32 wird in den Heizblock 8 eingesetzt. Die Säule 32 wurde zuvor mit einer Peptidfragmentmischung gespritzt, die mit einem enzymhaltigen (Lysylendopeptidase) Aminosäurerest behandelt worden ist. Diese Peptidfragmentmischung enthält einen Restteil des für die Enzymbehandlung verwendeten Harnstoffs.

An der Steuerung 40 des Peptidfragmentsammlers 1 wird die Initialisierung in Stufe S1 durch Programmeinleitung, wie in Fig. 5 gezeigt, ausgeführt. Beispielsweise wird hierbei der Speicher der Steuerung 40 gelöscht. In Stufe S2 wird der Prozeßstatus angebende Variable "s" auf "1" gesetzt. In Stufe 3 leuchtet ein LED (anfänglich LED 1) des Proßezindikators 19 auf.

In den Stufen S4 bis S7 wird die Tastenfeststellung wiederholt. In Stufe S4 wird festgestellt, ob die RUN-Taste K4 eingeschaltet ist. In Stufe S5 wird festgestellt, ob die Taste "WASCHEN" K1 eingeschaltet ist. In Stufe S6 wird festgestellt, ob die TFA-Rückgewinnungstaste K2 eingeschaltet ist. In Stufe S7 wird festgestellt, ob die Cursortaste K3 eingeschaltet ist.

Wenn in Stufe S4 die RUN-Taste K4 auf "Ja" festgestellt wird, geht das Verfahren auf die Stufe S8 über. In Stufe S8 wird die Verfahrensfolge der Fig. 7 (RUN-Verfahren) ausgeführt. Wenn in Stufe S5 die Taste "WASCHEN" K1 auf "Ja" festgestellt wird, verläuft das Verfahren über Stufe S9. In Stufe S9 werden die Leitungen gewaschen. Wenn in Stufe S6 der Betrieb der TFA- Gewinnungstaste K2 erkannt wird, geht das Verfahren auf Stufe S10 über. In Stufe S10 wird die Routine für TFA-Rückgewinnung gemäß Fig. 16 durchgeführt. Wird in Stufe S7 der Betrieb der Cursorta ste K3 mit "Ja" festgestellt, geht das Verfahren auf Stufe S11 über. In Stufe S11 wird das Cursorverfahren durchgeführt. In diesem Cursorverfahren steigt die Variable "s" in Folge jeder Betätigung der Cursortaste K3. Die Variable "s" stellt sich auf "1", nachdem sie "7" betrug. Die Variable "s" stellt sich ebenso auf "1" zurück, nachdem sie "8" betrug.

In dem Verfahrensabfolge in Stufe S8 wird die Variable "s" zuerst in Stufe S31 gelesen, wie in Fig. 7 gezeigt. In Stufe S32 wird geprüft, ob die Variable "s" den Wert "1" besitzt oder nicht. Wenn die Variable "s" gleich "1" ist, läuft das Verfahren zu Stufe S33 weiter.

In Stufe S33 werden der in der Säule 32 gepackte feste Träger und die Peptidfragmentmischung immobilisiert. In Stufe S35 werden ungebundene Peptide gespült und es wird erstmals mit der Gewinnungsflüssigkeit gewaschen, wodurch die Mischung der nicht gebundenen Peptidfragmente ausgewaschen wird. In Stufe S36 erfolgt das zweite Waschen mit der Waschflüssigkeit, wodurch die Säule 32 und die Leitungen innen gewaschen werden. In Stufe S37 wird mit N₂-Gas eine Trockenbehandlung durchgeführt. In Stufe S38 erfolgt die Aufspaltbehandlung durch eine Säurebehandlung mit TFA. In Stufe S39 werden die Fragmente durch die Gewinnungs flüssigkeit rückgewonnen. In Stufe S40 wird das gewonnene Fragment mit N₂-Gas konzentriert.

Durch Beenden dieser Verfahren hat die Variable "s" in Stufe S41 den Wert "8" angenommen, das zum Leuchten von LED 8 führt um anzuzeigen, daß die Behandlungsabfolge der Sammlung beendet wurde und das Verfahren zur Hauptroutine zurückkehrt.

Wenn die Variable "s" in Stufe S32 nicht als "1" erkannt wird (die Behandlung wird in einem Zwischenschritt initiiert), wird festgestellt, ob die Variable "s" "2" in Stufe S43, "3" in Stufe S44, "4" in S45, "5" in Stufe S46 und "6" in Stufe S47 sind. Gemäß den Ergebnissen läuft das Verfahren ab jedem der Stufe S43 bis S47 zu denen der Stufe S35 bis S39 weiter. Wenn die Variable "s" "7" beträgt, verläuft das Verfahren von Stufe S47 zu Stufe S40 weiter.

Während der Immobilisierungsbehandlung von Stufe S33 leuchtet das LED der RUN-Taste in Stufe S51 der Fig. 8 auf, wodurch der Betreiber den Beginn einer Behandlungsabfolge erkennen kann. In Stufe S53 wird die Temperatur des Heizblocks innerhalb des Temperaturbereichs von 4°C bis 80°C (bevorzugt von 10°C bis 60°C) durch die Temperaturregeleinheit 41 geregelt. Die Temperaturregelung wird über eine Voreinstellzeit T₂ (z. B. 3 Minuten bis 5 Stunden) geführt. Anders ausgedrückt, nachdem die Voreinstellzeit T₂ in Stufe S54 vorüber ist, läuft das Verfahren weiter zu Stufe S55, um die Temperaturregelung zu beenden. In Stufe S56 schaltet LED 1 aus, um die Beendigung des Kuppelns zwischen dem festen Träger und der Peptidfragmentmischung anzuzeigen.

In der ersten Waschbehandlung des Stufes S35 in Fig. 7 leuchtet LED 2 in Stufe S60 der Fig. 9 auf. In Stufe S61 werden die Magnetventile SV1, SV2, SV7 und SV12 geöffnet, wodurch die Gewinnungsflasche 6 innen unter N₂-Gasdruck gesetzt wird, während die Abfallflüssigkeitsflasche 9 mit der umgebenden Luft verbunden wird. N₂-Gas wird der Säule 32 über die Magnetventile SV1, SV2, SV8, SV9 und SV10 zugeführt, wodurch das nicht gekuppelte Peptid in der Säule 32 in die Abfallflüssigkeitsflasche 9 gespült wird. In Stufe S62 wird der Ablauf der Voreinstellzeit T₃ abgewartet. Nachdem erkannt wurde, daß die Voreinstellzeit vorüber ist, läuft das Verfahren weiter zu Stufe S63. In Stufe S63 werden die Magnetventile SV1, SV2, SV7 und SV12 geschlossen. In Stufe S72 der Fig. 10 werden die Magnetventile SV1, SV4, SV9, SV7 und SV12 geöffnet, wodurch N₂-Gas in die Gewinnungsflüssigkeitsflasche 11 und die Gewinnungsflasche 6 eintritt. Da dieses zu einem im Vergleich zum Atmosphärendruck höheren Druck in der Gewinnungs flüssigkeitsflasche 11 und der Gewinnungsflasche 6 führt, wird die Gewinnungsflüssigkeitsfüllung der Gewinnungsflüssigkeits flasche 11 über die Magnetventile SV9 und SV10 der Säule 32 zugeführt. In Stufe S73 wird das Signal des Flüssigkeitssensors 33 abgewartet, bis er das Auffüllen der Säule 32 mit der Gewin nungsflüssigkeit anzeigt.

Wenn der Fluß der Gewinnungsflüssigkeit und das Auffüllen der Säule 32 mit der Gewinnungsflüssigkeit durch den Flüssig keitssensor 33 festgestellt ist, läuft das Verfahren zu Stufe S74 weiter. In Stufe S74 werden die Magnetventile SV1, SV4, SV9, SV7 und SV12 geschlossen. In Stufe S75 werden die Magnetventile SV1, SV2, SV7 und SV12 geöffnet, um die Gewinnungsflüssigkeit aus der Säule 32 und der Leitung zu entleeren. Da die Gewinnungsflasche 6 unter Druck steht und die Abfallflüssigkeitsflasche 9 mit der umgebenden Luft verbunden ist, wird die Gewinnungsflüssigkeits füllung der Säule 32 und der Leitung in die Abfallflüssigkeits flasche 9 über den Verteilerblock 34 entleert. In Stufe S76 wird der Ablauf der Voreinstelleinzeit T₄ abgewartet. Nach der Voreinstellzeit T₄ läuft das Verfahren zu Stufe S77 weiter. In Stufe S77 sind die Magnetventile SV1, SV2, SV7 und SV12 ge schlossen. Nachdem durch Abschalten des LED 2 in Stufe S78 das Ende des ersten Waschverfahrens angezeigt wird, läuft das Verfahren weiter zu Stufe S36 in Fig. 7.

In dem zweiten Waschverfahren des Stufes S36 in Fig. 7 leuchtet LED 3 in Stufe S81 auf, wie in Fig. 11 gezeigt. In dem darauffolgenden Stufe S82 werden die Magnetventile SV1, SV3, SV8, SV7 und SV12 geöffnet, wodurch die Waschflüssigkeitsflasche 15 und die Gewinnungsflasche 6 aufgefüllt werden und unter N₂- Gasdruck gesetzt werden, während das Innere der Abfallflüssig keitsflasche 9 mit der Umgebungsluft verbunden wird. Anschließend wird die in der Waschflüssigkeitsflasche 15 befindliche Wasch flüssigkeit auf die Säule 32 über die Magnetventile SV8, SV9 und SV10 gegeben. Die auf die Säule 32 gegebene Waschflüssigkeit fließt zu der Abfallflüssigkeitsflasche 9 in ähnlicher Weise wie im ersten Waschverfahren. In Stufe S83 wird darauf gewartet, daß der Flüssigkeitssensor 33 das Auffüllen der Säule 32 mit Wasch flüssigkeit feststellt. Nachdem der Flüssigkeitssensor die Wasch flüssigkeit feststellt, läuft das Verfahren zu Stufe S84. In Stufe S84 werden alle geöffneten Magnetventile geschlossen. Da die Abläufe der Stufe S85 bis S88 die gleichen wie in den Stufen S75 bis S78 des ersten Waschverfahrens sind, wird ihre Erklärung hier fortgelassen.

Im Trockenprozeß des Stufes S37 in Fig. 7 wird die LED 4 in Stufe S91 der Fig. 12 angestellt. In Stufe S92 werden die Magnetventile SV1, SV2, SV7 und SV12 geöffnet und N₂-Gas wird der Säule 32 zugeleitet. In Stufe S93 wird der Ablauf der Vorein stellzeit T₆ abgewartet. Wenn die Voreinstellzeit T₆ vorüber ist, läuft das Verfahren zu Stufe S94 und die Magnetventile SV1, SV2, SV7 und SV12 werden geschlossen. Dann läuft das Verfahren zu Stufe S95, um die LED 4 auszuschalten und zu Stufe S38 in Fig. 7. Da das Trocknen in N₂-Gas anstelle im Vakuum durchgeführt wird, kann das Trockenverfahren vereinfacht werden.

Das Aufspaltverfahren des Stufes S38 in Fig. 7 ist LED 5 in Stufe S101 der Fig. 13 angeschaltet. In Stufe S102 werden die Magnetventile SV1, SV5, SV10, SV7 und SV12 geöffnet, wobei das in der Aufspaltflüssigkeitsflasche 13 gelagerte TFA der Säule 32 über das Magnetventil SV10 zugeleitet wird. In Stufe S103 wird abgewartet, daß der Flüssigkeitssensor 33 die TFA-Flüssigkeit feststellt. Wenn die Säule 32 mit TFA gefüllt ist, und der Flüssigkeitssensor 33 die TFA-Flüssigkeit feststellt, läuft das Verfahren zu Stufe S104. In Stufe S104 werden die Magnetventile SV1, SV5, SV10, SV7 und SV12 geschlossen.

In Stufe S105 wird die Temperatur des Heizblocks 8 durch die Temperaturregeleinheit 41 geregelt. Die Temperatur wird in einem Bereich von 20°C bis 80°C, bevorzugt von 30°C bis 60°C, einge stellt. In Stufe S106 wird der Ablauf der Voreinstellzeit T₇ (5 Minuten bis 1 Stunde) abgewartet, und das Verfahren wird, nachdem die Voreinstellzeit T₇ vorüber ist, zu Stufe S107 weitergeführt. In Stufe S107 wird die Temperaturregelung beendet. In Stufe S108 werden die Magnetventile SV1, SV2, SV6 und SV13 geöffnet, wodurch das Innere der Abfallflüssigkeitsflasche 9 unter Druck gesetzt wird und das Innere der Gewinnungsflasche 6 mit der umgebenden Luft verbunden wird. Dann fließt N₂-Gas durch die Säule 32 und den Verteilblock 34 und in die Gewinnungsflasche 6, wodurch die Säule 32 gespült wird. In Stufe S109 wird der Ablauf der Voreinstellzeit T₈ abgewartet. Wenn die Voreinstellzeit T₈ vorüber ist, läuft das Verfahren zu Stufe S110, um die Magnetven tile SV1, SV2, SV6 und SV13 zu schließen. Nachdem LED 5 in Stufe S111 ausgeschaltet wird, läuft der Prozeß zu Stufe S39 in Fig. 7.

Im Gewinnungsverfahren des Stufes 539 in Fig. 7 wird LED 6 in Stufe S121 der Fig. 14 angestellt. In Stufe S122 werden die Magnetventile SV1, SV4, SV9, SV6 und SV13 geöffnet, wodurch die Gewinnungsflüssigkeitsflasche 11 und die Abfallflüssigkeits flasche 9 unter Druck gesetzt werden und das Innere der Gewin nungsflasche 6 mit der umgebenden Luft verbunden wird. Somit wird die Gewinnungsflüssigkeit der Gewinnungsflüssigkeitsflasche 11 in die Säule 32 über das Magnetventil SV9, Meßleitung 31 und das Magnetventil SV10 geleitet. In Stufe S123 wird abgewartet, bis der Flüssigkeitssensor 33 die Gewinnungsflüssigkeit feststellt. Wenn der Flüssigkeitssensor 33 die Gewinnungsflüssigkeit feststellt, läuft das Verfahren zu Stufe S124. In Stufe S124 werden die Magnetventile SV1, SV4, SV9, SV6 und SV13 geschlossen, gefolgt vom Öffnen der Magnetventile SV1, SV2, SV6 und SV13 in Stufe S125. Die Gewinnflüssigkeit für die C-terminalen Peptide, die in Säule 32 gespalten wurden, wird in der Gewinnungsflasche 6 über den Verteilerblock 34 gewonnen. In Stufe S126 wird der Ablauf der Voreinstellzeit T₉ abgewartet. Nachdem die Vorein stellzeit T₉ vorüber ist, läuft das Verfahren zu Stufe S127 und die Magnetventile SV1, SV2, SV6 und SV13 werden geschlossen. Durch Abschluß dieser Verfahren sind die in Säule 32 verbliebenen C-terminalen Peptide effizient in der Gewinnungsflasche 6 gewonnen. Nach Abschalten der LED 6 in Stufe S128 läuft das Verfahren zu Stufe S40 in Fig. 7.

In der Konzentrationsbehandlung des Stufes S40 in Fig. 7 wird LED 7 in Stufe S131 der Fig. 15 angestellt. In Stufe 132 werden die Magnetventile SV1, SV7 und SV13 geöffnet, wodurch N₂- Gas in die Gewinnungsflasche 6 fließt, um die Gewinnungsflüssig keit zu verdampfen und zu konzentrieren. In Stufe S133 wird der Ablauf der Voreinstellzeit T₁₀ abgewartet. Diese Voreinstellzeit beträgt beispielsweise etwa 3 Stunden. In Stufe S134 werden die Magnetventile SV1, SV7 und SV13 geschlossen. Nachdem LED 7 in Stufe S135 abgestellt ist, läuft das Verfahren zu Stufe S41 in Fig. 7.

In Stufe S41 wird die Variable "s" auf "1" gesetzt, damit LED 8 in Stufe S3, wie in Fig. 5 gezeigt, angestellt wird.

Im Zeitpunkt des Abschluß dieser Behandlungsabfolgen muß die Aufspaltflüssigkeitsflasche 13 unter Druck bleiben, und TFA verbleibt in der Leitungsverbindung zwischen Magnetventil SV10 und der Aufspaltflüssigkeitsflasche 13. Um die in der Leitung verbliebene TFA zu entfernen, muß die TFA-Rückgewinnungstaste K2 eingeschaltet werden.

Im TFA-Rückgewinnungsbehandlung des Stufe S10 in Fig. 5 wird die LED für die TFA-Rückgewinnungstaste K2 in Stufe S141 der Fig. 16 angestellt. In Stufe S142 werden die Magnetventile SV1, SV2, SV10 und SV11 geöffnet, wodurch das Innere der Aufspaltflüssig keitsflasche 13 mit der umgebenden Luft verbunden wird und N₂-Gas in die Aufspaltflüssigkeitsflasche 13 über das Magnetventil SV10 fließt, was das Rückgewinnen der restlichen TFA in die Aufspalt flüssigkeitsflasche 13 ermöglicht. In Stufe S143 wird der Ablauf der Voreinstellzeit T₁₁ abgewartet. Die Voreinstellzeit T₁₁ ist ausreichend lang, um die in der Leitung verbliebene TFA zurück zugewinnen. Nachdem erkannt worden ist, daß die Voreinstellzeit T₁₁ vorüber ist, geht das Verfahren zu Stufe S144 über.

In Stufe S144 werden die Magnetventile SV1, SV2 und SV10 geschlossen. In Stufe S145 wird der Ablauf der Voreinstellzeit T₁₂ abgewartet. Die Voreinstellzeit T₁₂ reicht aus, um Atmosphä rendruck in der Aufspaltflüssigkeitsflasche 13 wieder herzustel len. Nachdem erkannt worden ist, daß die Voreinstellzeit T₁₂ vorüber ist, wird das Verfahren mit Stufe S146 fortgesetzt. Nachdem das Magnetventil SV11 in Stufe S146 geschlossen wird, kehrt das Verfahren zur Hauptroutine zurück.

Zum Unterbrechen der zuvor beschriebenen Behandlungsabfolge muß die STOP-Taste K5 gedrückt werden. Durch Einschalten der STOP-Taste K5 setzt eine Unterbrechung ein, und das Stoppver fahren der Fig. 6 läuft ab.

In Stufe S21 der Fig. 6 wird ein Betrieb der Behandlungs abfolgen ausgesetzt. In Stufe S22 wird festgestellt, ob die STOP- Taste K5 wieder gedrückt wurde oder nicht. Wenn erkannt wird, daß die STOP-Taste K5 nicht betätigt wird, wird das Verfahren in Stufe S24 fortgesetzt. In Stufe S24 wird festgestellt, ob die RUN-Taste K4 eingeschaltet wurde. Wenn die RUN-Taste K4 nicht eingeschaltet wurde, kehrt das Verfahren zu Stufe S21 zurück, wobei die Behandlung ausgesetzt bleibt.

Wenn die STOP-Taste K5 wieder gedrückt wird, läuft das Programm hier von Stufe S22 zu Stufe S23. In Stufe S23 wird der Programmzähler geändert, so daß die nächste Routine Stufe S2 in Fig. 5 ist, um zum Startverfahren zurückzukehren. Wenn die RUN- Taste K4 gedrückt wird, wechselt das Programm zu Stufe S25. In Stufe S25 wird der ausgesetzte Betrieb wieder aufgenommen.

In dem zuvor beschriebenen Beispiel kann das C-terminale Peptidfragment aus einer Peptidfragmentmischung durch einfachen Betrieb gesammelt werden; dazu wird die Säule 32 mit einem festen Träger gepackt, eine Peptidfragmentmischung injiziert, die Säule in den Heizblock 8 eingesetzt und jede Flasche in den ent sprechenden Halter eingesetzt. Dieses ermöglicht einfaches Sammeln von C-terminalen Peptidfragmenten ohne Geschicklichkeit und mit guter Reproduzierbarkeit.

Da das TFA-Rückgewinnungsverfahren es erlaubt, die restli chen Reagenzien in der Leitung zurückzugewinnen, kann auch die Diffusion von TFA-Dampf aus der Leitung verringert werden, was zu geringeren Problemen wie Korrosion führt.

Weiterhin ist es nicht notwendig, ein Magnetventil in den Flußteilerabschnitt einzubauen, da der Flüssigkeitsstrom aus der Säule 32 durch selektives Unterdrucksetzen der Abfallflüssig keitsflasche 9 und der Gewinnungsflasche 6, oder durch deren Anschluß an die umgebende Luft, aufgeteilt wird. Dieses ver ringert das stromabwärtige Totvolumen der Reaktionssäule etc., wodurch Langzeitnutzung solcher Proben und Reagenzien, wie Harnstoff, der während des Trocknens kristallisiert, ermöglicht wird.

In dem zuvor gezeigten Beispiel sind die Routinen so konfiguriert, daß das TFA-Rückgewinnungsverfahren unabhängig durchgeführt werden kann. In einer anderen bevorzugten Aus führungsform der vorliegenden Erfindung wird das Rückgewinnungs verfahren automatisch, nach Beenden der jeweiligen Aufspaltbe handlung mit TFA-Lösung, durchgeführt.

Die so beschriebene vorliegende Erfindung kann viele Abwandlungen erfahren. Diese Abwandlungen können nicht als Abweichung vom Geist und Umfang der Erfindung angesehen werden, und diese Abwandlungen, die für den Fachmann offensichtlich sind, sollen vom Schutzbereich der folgenden Ansprüche erfaßt werden.

Claims

1. Vorrichtung zum Peptidfragmentsammeln, worin ein C-terminales Peptidfragment aus einer Peptidfragmentmischung gesammelt wird, die aus spezifischen Aufspaltung der Peptidbin dung zwischen einem Lysinrest und dem benachbarten C-terminalen Aminosäurerest stammt, mit einem Immobilisierungsmittel, durch das die Peptidfragmentmischung mit einem festen Träger gekoppelt wird; einem Aufspaltmittel, durch das die besagte Peptidfragment mischung, die mit besagtem festen Träger durch besagtes Immobili sierungsmittel gekoppelt ist, durch Säurebehandlung gespalten wird; einem Gewinnungsmittel, durch das das durch besagtes Aufspaltmittel aufgespaltene Fragment gewonnen wird; und einer Steuerung durch das besagte Immobilisierungsmittel, Aufspalt mittel und Gewinnungsmittel in einer Verfahrensabfolge durch geführt werden.

2. Vorrichtung gemäß Anspruch 1, wobei bei der Verfahrens abfolge Immobilisieren der Peptidfragmentmischung auf den festen Träger, Waschen des immobilisierten Peptidfragments, Trocknen des gewaschenen Peptidfragments, Aufspalten des getrockneten Peptidfragments, Gewinnen des aufgespaltenen Peptidfragments und Konzentrieren des gewonnenen Peptidfragments durchgeführt wird.

3. Vorrichtung gemäß Anspruch 2, wobei sich bei jeder Immobilisierungs-, Wasch-, Trocken-, Aufspalt-, Gewinnungs- und Konzentrationsbehandlung eine LED jeweils zu Beginn jeder Behand lung einschaltet und am Ende ausschaltet.