DE4341238A1 - Mikrobielles Verfahren zur Herstellung von Dihydroxyaceton - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein mikrobielles Verfahren zur Herstellung von Dihy­ droxyaceton, wobei die Umsetzung von Glycerin zu Dihydroxyaceton mit Hilfe eines dehydrogenaseaktiven Mikroorganismus bei einem durch Zu­ gabe von Calciumhydroxid-Suspension konstant gehaltenen pH-Wert zwischen 3.8 und 4.8, vorzugsweise von 4.2, durchgeführt wird.

Die Gewinnung von Dihydroxyaceton aus Glycerin mit geeigneten Mikro­ organismen ist seit langem allgemein bekannt. Da Dihydroxyaceton ein wertvolles Ausgangsprodukt für die chemische und pharmazeutische Industrie darstellt, besteht ein permanentes Interesse, die Verbindung auf möglichst einfache und wirtschaftliche Weise im großtechnischen Maßstab zur Verfügung zu stellen. Entsprechend wurden im Laufe der Jahre Varia­ tionen an den Kultivierungs- und Fermentationsbedingungen vorgenom­ men mit dem Ziel, ständig die Ausbeute zu erhöhen (z. B. US 2,948,658, US 4,076,589, DD 2 30 713, DD 2 53 836). Insbesondere wurde der Tat­ sache Aufmerksamkeit geschenkt, daß sowohl der Menge an Edukt (Glycerin) als auch an synthetisiertem Produkt (Dihydroxyaceton) offen­ sichtlich eine entscheidende Rolle beigemessen werden muß, da beide Verbindungen, wenn sie in größeren Konzentrationen in der Fermenta­ tionsbrühe vorliegen, Wachstum und/oder Produktivität des eingesetzten Mikroorganismus in negativer Weise beeinflussen (z. B. Claret et al. (1992), Current Microbiol. 25(3), 149). Die Fermentationsbrühen des Standes der Technik enthalten Glycerin zumeist in 5-20%iger Konzen­ tration, das in einigen wenigen Fällen zugefüttert wird. Zusatzstoffe wie Glucose, Sorbit, Hefe-Extrakte, Maisquellwasser und bei der Zellkultivie­ rung übliche Salze sind in Konzentrationen in der Regel zwischen unter 1% und bis zu 15% im Fermentationsansatz enthalten. Der pH-Wert während der mikrobiellen Synthese von Dihydroxyaceton variiert in der Regel zwischen 5 und 7; nur in einigen Fällen, insbesondere bei denen Acetobacter als Mikroorganismus eingesetzt wurde, wird ein pH-Wert zwischen 3 und 5 beschrieben (DD 2 53 836). Die im Stand der Technik angegebenen Ausbeuten an Dihydroxyaceton variieren durchschnittlich zwischen 10 und 150 g/l bei einer Kultivierungs- bzw. Reaktionszeit von 20 bis 70 h.

Es wurde nun gefunden, daß auf einfache Weise die Ausbeute an Dihy­ droxyaceton deutlich gesteigert werden kann, wenn die mikrobielle Um­ setzung bei einem konstant gehaltenen pH-Wert zwischen 3.8 und 4.8 durchgeführt wird, wobei die Einhaltung des pH-Wertes durch Titration mit Calciumhydroxid-Suspension erreicht wird. Die Verwendung von Calcium­ hydroxid hat erfindungsgemäß gegenüber Alkali- oder anderer Erdalkali­ laugen klare Vorteile.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung von Dihydroxyaceton durch Dehydrierung von Glycerin mittels dehydogenase­ aktiver Mikroorganismen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die Reaktion durch Titration mittels Calciumhydroxid-Suspension bei einem konstant gehaltenen pH-Wert, ausgewählt in einem Bereich zwischen 3.8 und 4.8, durchführt. In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Um­ setzung bei einem pH-Wert von 4.2.

Weiterhin wurde gefunden, daß die Ausbeuten besonders hoch sind, wenn die Glycerinkonzentration konstant gehalten wird.

Gegenstand der Erfindung ist somit auch ein entsprechendes Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß der Glyceringehalt durch Zudosie­ rung konstant zwischen 1 und 3% (w/v) gehalten wird.

Erfindungsgemäß eignen sich alle jenen bekannten Mikroorganismen, die aufgrund aktiver Dehydrogenasen zu oxidieren vermögen und Glycerin als Substrat erkennen. Vor allem die Gattungen Acetobacter und Gluconob­ acter sind hierfür einsetzbar, insbesondere Gluconobacter. Unter den Gluconobacter-Arten ist vorzugsweise Gluconobacter oxydans geeignet. Beispiele für allgemein zugängliche Gluconobacter oxydans Stämme sind die Stämme ATCC 621 (DSM 50049), DSM 2343, ATCC 9324, ATCC 23771 und DSM 2003.

Die Mikroorganismen können vorteilhafterweise in üblichen für diese Zwecke geeigneten Kulturmedien vorkultiviert werden. Das eigentliche erfindungsgemäße Fermentationsmedium setzt sich qualitativ aus übli­ chen Bestandteilen zusammen. Vorteilhaft für das beanspruchte Verfahren hat sich beispielsweise der Einsatz von Hefeextrakt (0.3-0.7%) (anstelle von Maisquellwasser), Glucose (0.5-1%) und Magnesiumchlorid (0.1-0.2%) erwiesen. Eine Anfangskonzentration von Calciumchlorid von 0.1-0.3% ist ebenfalls günstig.

Erfindungsgemäß wird nun der pH-Wert des Mediums konstant bei einem bestimmten pH-Wert zwischen 3.8 und 4.8 gehalten. Vorzugsweise wird ein pH-Wert von 4.0 und 4.5, insbesondere aber 4.2 eingestellt. Dieser für die Umsetzung günstige pH-Wertbereich ist überraschend niedrig im Ver­ gleich zu den meisten bekannten Verfahren, insbesondere bei Einsatz von Gluconobacter oxydans. Die Einstellung erfolgt kontinuierlich und über die gesamte Fermentationszeit durch Titration mit Calciumhydroxyd. Die ge­ eignete Calciumhydroxyd-Suspension besteht aus handelsüblicher Kalk­ milch, welcher zusätzlich Calciumoxid beigesetzt werden kann, so daß ein Gehalt an Calciumhydroxyd von mindestens 20% vorliegt. Auch deutlich höhere Gehalte an Calciumhydroxid sind geeignet.

Die Fermentationstemperatur liegt erfindungsgemäß zwischen 28 und 34°C, vorzugsweise zwischen 30 und 32°C. Die Fermentationsbrühe wird in üblicher Weise mit Luft oder Sauerstoff belüftet.

In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der Glyceringehalt in der Reaktionssuspension konstant bei 1-3% (w/w) gehalten. Dies erfolgt durch kontinuierliches Zufüttern von Glycerin. Der jeweilige Glyceringehalt in der Reaktionssuspension wird nach allgemein bekannten Methoden bestimmt, beispielsweise durch Probenentnahme und Glycerinbestimmung mittels chromatographischer Bestimmungen.

Das erfindungsgemäße Verfahren liefert ausgezeichnete Ausbeuten an Dihydroxyaceton. So werden bereits in ca. 30 h 200 bis 260, durch­ schnittlich etwa 220 g/l, an Produkt ins Fermentationsmedium freigesetzt. Dabei werden 96-98% des vorhandenen Glycerins umgesetzt. Es wird eine mittlere Produktivität von 6.8 bis 7.1 g/l h erreicht. Besonders vorteil­ haft ist, daß die maximale Produktivität schon sehr früh nach 6 bis 10 h Fermentation erreicht wird. Sie beträgt für diesem Zeitraum 17 bis 20 g/l h. Somit werden die diesbezüglichen Werte des Standes der Technik über­ troffen. Das Zufüttern von Substrat (Glycerin) bewirkt unter anderm, daß die Ausbeuten bereits in einer frühen Fermentationsphase erzielt werden.

Das gebildete Dihydroxyaceton kann aus der Fermentationsbrühe nach Standardmethoden isoliert und aufgereinigt werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist hervorragend geeignet auch im großtechnischen Maßstab eingesetzt zu werden.

Beispiel 1

Mikroorganismen des Stammes Gluconobacter oxydans wurden nach Standardverfahren vorkultiviert (Yamada et al. 1978, J. Ferment. Technol. 56, 29).

In ein 5000-l-Fermenter wurde ein Medium folgender Zusammensetzung eingebracht:

Gluconobacter oxydans ATCC 621
(2.5 g Trockenmasse/l)
Hefeextrakt|5 g/l
Glucose	5 g/l
Ammoniumsulfat	2 g/l
Magnesiumsulfat (7-Hydrat)	1 g/l
Calciumchlorid	3 g/l
Glycerin	20 g/l

Der Ausgangs-pH wurde mit Phosphorsäure auf 4.2 und die Fermenta­ tionstemperatur zwischen 30 und 32°C eingestellt. Das Medium wurde während der gesamten Fermentation durch Einleiten von Luft belüftet. Der Glycerinverbrauch wurde durch etwa halbstündige Probenentnahme be­ stimmt und neues Glycerin durch Einrühren hinzugegeben, so daß wie­ derum eine Glycerinkonzentration von etwa 20 g/l im Fermentationsansatz vorlag. Ebenso wurde durch pH-Messung und gegebenenfalls permanen­ tes automatisches Hinzutitrieren von Calciumhydroxid-Suspension (20%ig) der pH-Wert auf 4.5 fixiert.

Nach etwa 5 h wurden Proben entnommen und der Gehalt an Dihydroxy­ aceton nach Standardmethoden bestimmt. Es hatten sich etwa 25 g/l Produkt gebildet. Nach 10 Stunden wurde ein Dihydroxyacetongehalt von bereits ca. 100 g/l im Medium gefunden. In diesem Zeitraum wurde die stärkste Produktivität des Verfahrens (18.5 g/l h Dihydroxyaceton) ermit­ telt. Nach 20 h Fermentation ließ sich ein Gehalt von etwa 170 g/l Produkt feststellen, nach 31 h wurden 219 g/l Dihydroxyaceton gemessen. Weite­ res Fermentieren erbrachte nur noch geringfügig höhere Mengen (bis 260 g/I).

Beispiel 2

Analog Beispiel 1 wurde eine Fermentation durchgeführt, bei der die kon­ tinuierliche Zugabe von Calciumhydroxid-Suspension weggelassen wurde, so daß der pH-Wert nicht nachreguliert wurde. Nach 10 h Fermentation wurde ein Dihydroxyaceton-Gehalt von etwa 75 g/l ermittelt. Nach 31 h wurde der entsprechende Gehalt zu etwa 190 g/l bestimmt. Die Produkti­ vität im Zeitraum zwischen 5 und 15 h betrug maximal 13 g/l h. Bei dem verwendeten 5000-l-Fermenter sind dies etwa 20 kg/h weniger Ausbeute an Dihydroxyaceton als in Beispiel 1.

Beispiel 3

Analog Beispiel 1 wurde eine Fermentation durchgeführt, bei der die kon­ stante Zufütterung von Substrat (Glycerin, zwischen 1-3%) ersetzt wurde durch eine einmalige Glyceringabe (130 g/l) zu Beginn der Fermentation. Nach 80 h Fermentation wurden 106 g/l Dihydroxyaceton gebildet.

Beispiel 4

Es wurde eine Fermentation analog Beispiel 1 durchgeführt, wobei an­ stelle von Gluconobacter oxydans der Mikroorganismus Acetobacter xylinum eingesetzt wurde. Nach 28 h Fermentation konnten etwa 975 kg Dihydroxyaceton (195 g/l) aus dem Medium isoliert werden.

Beispiel 5

Es wurde eine Fermentation analog Beispiel 1 durchgeführt, wobei das Medium 2 g/l Hefeextrakt, 2 g/l Maisquellwasser und 2 g/l Glucose enthält. Nach 30 h Fermentation betrug der Gehalt an Dihydroxyaceton im Medium 198 g/l.

Beispiel 6

Es wurde eine Fermentation analog Beispiel 1 bei einem pH-Wert von 3.8 durchgeführt. Nach 31 h Fermentation betrug der Gehalt an Dihydroxy­ aceton im Medium 179 g/l.

Beispiel 7

Es wurde eine Fermentation analog Beispiel 1 bei einem pH-Wert von 4.8 durchgeführt. Nach 31 h Fermentation betrug der Gehalt an Dihydroxy­ aceton im Medium 205 g/l.

Claims (6)

1. Verfahren zur Herstellung von Dihydroxyaceton durch Dehydrierung von Glycerin mittels dehydrogenaseaktiver Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reaktion durch Titration mittels Calci­ umhydroxid-Suspension bei einem konstant gehaltenen pH-Wert, ausgewählt in einem Bereich zwischen 3.8 und 4.8, durchführt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion in einem pH-Bereich zwischen 4.0 und 4.5 durchgeführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion bei einem pH-Wert von 4.2 durchgeführt wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekenn­ zeichnet, daß der Glyceringehalt durch Zudosierung konstant zwischen i und 3% (w/w) gehalten wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekenn­ zeichnet, daß als Mikroorganismus ein Bakterium der Gattung Gluconobacter eingesetzt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Gluconobacter oxidans eingesetzt wird.