DE4325872C1

DE4325872C1 - Virusinaktivierte Faktor Xa-Präparation

Info

Publication number: DE4325872C1
Application number: DE4325872A
Authority: DE
Inventors: Peter Dr Turecek; Johann Dr Eibl; Hans Peter Schwarz
Original assignee: Immuno AG
Current assignee: Oesterreichisches Institut fuer Haemoderivate
Priority date: 1993-08-02
Filing date: 1993-08-02
Publication date: 1994-08-04
Anticipated expiration: 2013-08-03
Also published as: EP0651054A1; US5593968A; JPH0775572A; CA2129155A1; AT407705B; ATA148894A

Description

Die Erfindung betrifft eine virusinaktivierte Faktor Xa-Präparation, insbesondere eine Faktor Xa-Präparation von hoher Reinheit. Es wird ein Verfahren zur Herstellung dieser virusinaktivierten, hochreinen Faktor Xa-Präparation beschrieben, wobei es dieses Verfahren auch erlaubt, insbesondere eine virusinaktivierte, hochreine beta-Faktor Xa-Präparation zu erhalten, die sich durch besondere Stabilität auszeichnet.

Der Blutgerinnungsfaktor X stellt ein plasmatisches Glykoprotein dar, welches sowohl in der intrinsischen als auch extrinsischen Blutgerinnungskaskade involviert ist. Während der Blutgerinnung wird Faktor X zu Faktor Xa aktiviert. Letzterer stellt eine Serinprotease dar, die die Umwandlung von Prothrombin zu Thrombin katalysiert.

Faktor X besteht aus zwei Untereinheiten, nämlich einer schweren Ketten mit einer Molmasse von 49 kD und einer leichten Kette mit einer Molmasse von 17 kD, welche über eine Disulfidbrücke verbunden sind. Bei der enzymkatalysierten Aktivierung des Zymogens zu Faktor Xa wird ein aminoterminales Peptid der schweren Kette mit einer Molmasse von 11 kD abgespalten. Dabei entsteht alpha-Faktor Xa mit einer Molmasse von etwa 55 kD, welcher den proteolytisch aktiven Faktor Xa darstellt (J.C. Giddings, Molecular Genetics and Immunoanalysis in Blood Coagulation, Weinheim, Cambridge, New York, Basel, Verlag Chemie 1988, S. 47 ff).

Durch weitere Abspaltung eines 4,5 kD-Peptides vom carboxyterminalen Ende der schweren Kette des alpha-Faktor Xa entsteht beta-Faktor Xa. Aus der Literatur (J. Biol.Chem., 250 : 4497-4504 (1975) und 249 : 5614-5622 (1972)) geht hervor, daß es sich hierbei um eine autokatalytische Umwandlung des alpha-Faktor Xa in beta-Faktor Xa handelt (siehe auch Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 72 : 3359-3363 (1975)). Daher enthalten kommerziell erhältliche Faktor Xa-Präparationen Mischungen aus alpha-Faktor Xa und beta-Faktor Xa. Die kommerziell erhältlichen Faktor Xa-Präparationen werden vornehmlich durch Aktivierung von Faktor X mittels Russell′s Viper Venom hergestellt. Aus J. Biol.Chem., 250 : 4497-4504 (1975) ist bekannt, daß diese enzymatische Aktivierung nur zu alpha-Faktor Xa führt. Daran schließt sich dann eine nachfolgende unkontrollierte autokatalytische weitere Umwandlung zu beta-Faktor Xa an, wobei Mischungen der beiden Formen von Faktor Xa entstehen.

Aus der Literatur ist bekannt, daß alpha-Faktor Xa und beta-Faktor Xa die gleichen enzymatischen Aktivitäten besitzen. Für eine pharmazeutische Präparation ist es aber von wesentlicher Bedeutung, daß ein Faktor Xa-Produkt mit molekularer Integrität des Wirkstoffes vorliegt, welche auch bei einer längerfristigen Lagerung gewahrt bleibt und ausgeschlossen ist, daß keine weiteren Umwandlungen von Faktor Xa auftreten.

Aus Thrombosis Research 22 : 213-220 (1981) ist ein Verfahren bekannt, welches den Erhalt einer möglichst stabilen beta-Faktor Xa-Präparation erlaubt. Nach diesem Verfahren wird beta-Faktor Xa in 50% Glycerin bei pH 7,2 in 0,03 M Imidazolpuffer gekühlt gelagert. Jedoch tritt auch bei diesem Verfahren selbst bei einer Lagerung von beta-Faktor Xa in dem genannten Puffer bei 4°C eine weitere Umwandlung zu inaktiven Fragmenten auf. In ähnlicher Weise wird auch in J. Biol. Chem., 248 : 7729-7741 (1973) die Instabilität von Faktor Xa in Glyzerin-Wasser-Gemischen beschrieben.

Aus J.Biol.Chem., 248 : 7729-7741 (1973) ist ein Verfahren zur Reinigung von Faktor X aus Rinder-Plasma bekannt. Dieses Reinigungsverfahren umfaßt die Adsorption des Faktor X an Bariumchlorid, die Elution desselben und die anschließende fraktionierte Reinigung mit Ammoniumsulfat. Eine weitere Reinigung erfolgt chromatographisch mit Anionenaustauschern. Der gereinigte Faktor X wird dann durch Einwirkung von immobilisiertem Trypsin bzw. RVV (Russel′s Viper Venom) aktiviert.

Die Aktivierung von gereinigtem humanem plasmatischem Faktor X wird in J. Biochem. 185, 647-658 (1980), beschrieben. Als Aktivatoren werden RVV bzw. gereinigte physiologische Aktivatoren herangezogen. Zu den letzteren gehören Faktor VII, gemeinsam mit "tissue factor", und Faktor IXa/Faktor VIII. Als Ergebnis wird der aktivierte Faktor X erhalten.

Als Ausgangsmaterial für die Gewinnung von Faktor X bzw. Xa dient z. B. Plasma. Außerdem kann Faktor X bzw. Xa rekombinant hergestellt werden.

Die Verwendung von biologischen Materialien als Ausgangsmaterial bzw. zur Aktivierung von Faktor X birgt das Risiko des Vorhandenseins von infektiösen Agenzien im Präparat mit sich. Deshalb ist eine Behandlung zur Inaktivierung, insbesondere von Viren, unbedingt erforderlich. Der aktivierte Faktor Xa gilt aber als ein labiles Enzym (im Vergleich zum Zymogen), weshalb es vorgezogen wird, das Zymogen (Faktor X) einer Behandlung zur Virusinaktivierung zu unterziehen.

Aus Gründen der Sicherheit sowie aus Stabilitätsgründen wird daher in US-PS 4,501,731 vorgeschlagen, anstelle von Faktor Xa das Zymogen Faktor X zur Behandlung von Blutstörungen zu verabreichen.

Wie vorstehend bereits erwähnt, können Faktor X bzw. der aktivierte Faktor Xa auch rekombinant gewonnen werden. So wird z. B. in J.Biol.Chem. 266, 13726-13730 (1991), die Expression von Faktor X und der aktivierten Form in transformierten CHO-Zellen beschrieben. Die erhaltenen Gerinnungsfaktoren werden durch Anionenaustausch- und Immunaffinitätschromatographie gereinigt. Obwohl es sich hierbei um schonende Verfahren handelt, wurden geringere spezifische Aktivitäten im Vergleich zu plasmatischem Faktor Xa gefunden. Bei den Vergleichsprodukten handelte es sich um plasmatische Gerinnungsfaktoren, wie sie kommerziell durch Hematologic Technologies erhältlich sind. Im übrigen ist auch bekannt, daß rekombinant hergestellter Faktor Xa in seiner gereinigten Form einer Autoproteolyse unterliegt.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein virusinaktiviertes Faktor Xa-Präparat von hoher Reinheit zur Verfügung zu stellen. Eine weitere Aufgabe gemäß der Erfindung ist es, ein virusinaktiviertes, stabiles beta-Faktor Xa-Präparat von hoher Reinheit zu schaffen.

Die vorstehende Aufgabe wird gemäß der Erfindung dadurch gelöst, daß eine virusinaktivierte Faktor Xa-Präparation mit mindestens 100 Einheiten Gerinnungsfaktor Xa-Aktivität pro mg Protein zur Verfügung gestellt wird.

Außerdem wird ein virusinaktiviertes Faktor Xa-Präparat mit mindestens 100 Einheiten Gerinnungsfaktor beta-Xa-Aktivität pro mg Protein zur Verfügung gestellt.

Bevorzugt ist es, ein virusinaktiviertes Faktor Xa-Präparat mit mindestens 500 bzw. 1000 Einheiten pro mg Protein zur Verfügung zu stellen. Außerdem wird ein stabiles virusinaktiviertes beta-Faktor Xa-Präparat mit mindestens 100, bevorzugt 500 bzw. 1000 Einheiten Gerinnungsfaktor Xa-Aktivität pro mg zur Verfügung zu stellen.

Dies wird erreicht durch ein neues Verfahren, bei welchem ein Faktor X-enthaltendes Ausgangsmaterial nach Aktivierung auf mindestens 100 Einheiten Faktor Xa-Aktivität pro mg Protein gereinigt und anschließend einer Behandlung zur Inaktivierung von infektiösen Agenzien, insbesondere von Viren, unterzogen wird.

Die vorstehend genannte Virusinaktivierung erfolgt vorzugsweise durch eine Hitzebehandlung. Besonders bevorzugt ist es, die Hitzebehandlung gemäß dem Verfahren von EP-159,311 durchzuführen, wobei die zu inaktivierende Präparation in festem Zustand, wie z. B. in lyophilisierter Form, auf einen Gehalt an Wasser, Methanol oder Ethanol von mehr als 0,05 (entsprechend 5 Gew.-%) und weniger als 0,70 (70 Gew.-%) eingestellt und in einem geschlossenen Behälter bei einer Temperatur im Bereich von 50 bis 121°C unter Erhöhung des Partialdampfdruckes des Wassers, Methanols oder Ethanols behandelt wird.

Vorzugsweise erfolgt die Hitzebehandlung zur Virus-Inaktivierung bei einem Wassergehalt von 0,06 bis 0,30 (Gew.-%). Bevorzugte Temperaturen zur Hitzebehandlung liegen im Bereich von 50 bis 90°C.

Überraschenderweise hat sich erfindungsgemäß herausgestellt, daß im Gegensatz zur bisher bekannten Meinung der Fachwelt der aktivierte Faktor X (Faktor Xa) in hochreiner Form ausreichend stabil ist, so das er sowohl hitzebehandelt als auch über längere Zeit gelagert werden kann, ohne daß wesentliche Verluste der biologischen Aktivität in Kauf genommen werden müssen. Dieser Effekt war unerwartet, da im allgemeinen Proteine umso stabiler sind, wenn sie zusammen mit Begleitproteinen, insbesondere Trägerproteinen, vorliegen. So ist es dem Fachmann bekannt, daß z. B. Albumin als ein solches Trägerprotein agiert, welches eine Stabilisierung von u. a. Blutfaktoren bewirkt.

Es ist bekannt, daß hochgereinigter Faktor X (Zymogen) gegenüber Hitzebehandlung wesentlich labiler ist als eine Faktor X-Präparation, die in Form des Prothrombin-Komplexes, also einer Fraktion, welche aus mehreren Proteinen besteht, vorliegt. Somit konnte nicht erwartet werden, daß aktivierter Faktor X in hochgereinigter Form ausreichend stabil ist, um ihn zur Virusinaktivierung einer Wärmedenaturierung zu unterziehen.

Wie nachfolgend in den Beispielen gezeigt wird, kann das erfindungsgemäße Präparat durch chromatographische Reinigung eines geeigneten Ausgangsmaterials, welches Faktor Xa enthält, Aktivierung und anschließende Hitzebehandlung, vorzugsweise in festem Zustand, hergestellt werden. Die Hitzebehandlung kann gemäß EP-159 311 während 10 Stunden bei 60°C und 1 Stunde bei 80°C erfolgen. Außerdem ist es möglich, die Hitzebehandlung des Proteins in wäßriger Lösung, gegebenenfalls unter Zusatz von Stabilisatoren, durchzuführen.

Nach einer bevorzugten Ausführungsform gemäß der Erfindung wird Faktor X aus einer Faktor X-haltigen Fraktion gereinigt, gegebenenfalls zur Inaktivierung lipidumhüllter Viren mit einem Tensid behandelt und der gereinigte Faktor X durch Einwirkung eines Enzyms zum Faktor Xa aktiviert; daran schließt sich eine weitere Reinigung von Faktor Xa sowie eine Hitzebehandlung desselben. Als Ausgangsmaterial dient dabei entweder eine Plasmafraktion, insbesondere ein Prothrombin-Komplex oder ein Zellkulturüberstand, welcher den rekombinanten Faktor X enthält. Um bezüglich der Übertragung infektiöser Agenzien eine maximale Sicherheit zu gewährleisten, ist es vorteilhaft, bereits das Ausgangsmaterial vor der Gewinnung des Faktor X zur Inaktivierung von infektiösen Agenzien, insbesondere Viren, zu behandeln. Auf diese Weise umfaßt das Herstellungsverfahren mindestens zwei Maßnahmen zur Inaktivierung von Viren.

Als aktivierendes Enzym kann Schlangengift, insbesondere RVV, in immobilisierter Form oder als lösliches Enzym, verwendet werden. Außerdem kann auch Trypsin oder eine Protease mit "Trypsin-ähnlicher Aktivität" oder ein physiologischer Aktivator der intrinsischen oder extrinsischen Gerinnung verwendet werden. Als letzterer dient z. B. ein aktivierter Gerinnungsfaktor, gegebenenfalls mit einem Co-Faktor, wie Faktor VIIa und "tissue factor".

Es wird angenommen, daß Faktor Xa-Präparate therapeutisch dann besonders wertvoll zur Behandlung von Haemophilie sind, wenn sie gemeinsam mit Phospholipid-Präparaten verabreicht werden (siehe hierzu EP-129 998). Es ist aber bekannt, daß die autokatalytische Umwandlung von alpha-Faktor Xa zu beta-Faktor Xa durch Lipide verstärkt wird. Eine hohe Stabilität von Faktor Xa-Präparationen ist daher vor allem wünschenswert, wenn diese gemeinsam mit Phospholipid-Präparaten verabreicht werden.

Es hat sich gezeigt, daß die erfindungsgemäßen virusinaktivierten, hochreinen Präparate hervorragend geeignet sind zur Behandlung von Haemophilie A-Inhibitor-Patienten, vor allem wenn sie in Kombination mit Phospholipidpräparaten verabreicht werden. Dies ist insbesondere auf das Vorliegen der stabilen beta-Form zurückzuführen.

Neben der therapeutischen Anwendung der erfindungsgemäßen hochreinen Faktor Xa-Präparate finden diese auch eine vorteilhafte Anwendung in der Diagnostik.

Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele näher beschrieben.

Beispiel 1 Herstellung von Faktor X aus einer virusinaktivierten Plasmafraktion mittels Ionenaustauschchromatographie

Als Ausgangsmaterial wurde ein Lyophilisat einer Prothrombin-Komplexfaktoren-Präparation, welche die Faktoren II, IX, X sowie Protein C und Protein S enthielt, verwendet. Dieses Ausgangsmaterial wurde nach der Methode von H.G.J. Brummelhuis (Preparation of the prothrombin complex; in Curling, J.M., Methods of Plasma Protein Fractionation, S. 117-128 (Acad.Press, New York, 1980)) hergestellt und zur Virusinaktivierung nach EP-159,311 hitzebehandelt.

Entsprechend wurde das Lyophilisat (1000 E FX/g) in destilliertem Wasser gelöst, so daß dieses 50 000 E FX/l enthielt, und auf pH 7,0 eingestellt. Nach Zusatz von 12% (V/V) Tween 80 wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde mit destilliertem Wasser auf das 5fache Volumen verdünnt (entsprechend 10 000 E FX/l), mit Trinatrium-Citrat-Dihydrat (7 g/l) versetzt und auf pH 7,0 eingestellt. Durch Zusatz von 80 ml 1M BaCl₂-Lösung pro 10 000 E FX wurden die Proteine des Prothrombin-Komplexes copräzipitiert. Das Präzipitat wurde durch Zentrifugation (10 min, 4°C) sedimentiert und dreimal mit 1 l pro 10 000 E FX Waschpuffer durch Resuspendieren und erneute Zentifugation gewaschen. (Waschpuffer: hierzu wurde eine Lösung von 20 mM/l Trinatrium-Citrat-Dihydrat, 100 mM/l NaCl, 1 mM/l Benzamidin-HCl und 10 mg/l Sojabohnen-Trypsininhibitor, pH 6,0, mit 80 ml 1M BaCl₂-Lösung pro Liter versetzt und das entsprechende Präzipitat abgetrennt.)

Das gewaschene Präzipitat wurde mit 200 ml/10 000 E eingesetztem FX einer 25%igen (G/V) Ammoniumsulfat-Lösung, welche 50 mM Benzamidin-HCl enthielt, bei 4°C 30 Minuten unter Rühren resuspendiert und anschließend zentrifugiert. Der Überstand wurde abgetrennt und das Pellet nochmals mit Ammoniumsulfat-Lösung resuspendiert und erneut zentrifugiert. Die Zentrifugationsüberstände wurden vereinigt und mit Ammoniumsulfat auf 80% Sättigung gebracht und bei 4°C 15 h lang gerührt. Das dabei entstandene Präzipitat wurde durch Zentrifugation gewonnen. Das Pellet wurde in Puffer (25 mM Trinatrium-Citrat-Dihydrat, 100 mM NaCl, 1 mM Benzamidin-HCl, pH 6,0) in einer Konzentration von 50 000 E FX/l gelöst und gegen denselben Puffer über eine Sephadex®G25-Säule chromatographiert und die Fraktionen gesammelt. Dabei wurde im Eluatstrom die UV-Absorption bei 280 nm und die elektrische Leitfähigkeit gemessen. Die Protein enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und auf 40 000 E FX/l eingestellt.

Anschließend wurden durch Chromatographie über DEAE-Sepharose-Fast-Flow® die Prothrombin-Komplexfaktoren getrennt. Dazu wurden auf einer Säule (Innendurchmesser: Gelbetthöhe = 1 : 8,3), mit gequollenem, gewaschenem DEAE-Sepharose-Gel, 10 E FX/ml Gel bei einer Flußrate von 2 ml/min adsorbiert. Danach wurde die Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von 2 ml/min mit dem 1,7fachen Gelvolumen an 100 mm NaCl in 25 mM Trinatrium-Citrat-Dihydat, pH 6,0, und anschließend mit dem 2,6fachen Gelvolumen an 250 mM NaCl in 25 mM Citrat-Puffer, pH 6,0, gespült. Die Elution von FX erfolgte mit dem 5,2fachen Gelvolumen an 280 mM NaCl in Citrat-Puffer, pH 6,0. (Noch am Gel gebundenes Protein wurde mit 1 M NaCl in Puffer und durch Waschen mit Lauge entfernt.)

Bei der Elution wurden Fraktionen gesammelt, die auf den Gehalt an FX, Protein C, FIX und FII analysiert wurden. Die FX-enthaltenden Fraktionen, die frei von FII und arm an FIX und Protein C waren, wurden vereinigt, mit Ammoniumsulfat auf 80% Sättigung gebracht und 15 h bei 4°C gerührt. Der entstandene Niederschlag wurde durch Zentrifugation abgetrennt und in 20 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,4, welcher 50 mM NaCl und 2 mM CaCl₂ (TBSC-Puffer), enthielt gelöst, durch Chromatographie über eine Säule gefüllt mit Sephadex®G25 gegen 20 mM TBSC-Puffer umgepuffert, und auf 3 E FX/ml eingestellt.

Bezüglich der Verfahrensbedingungen zur Hitzebehandlung wird auf den Gesamtinhalt von EP-159 311 verwiesen. Diese europäische Patentschrift soll damit Bestandteil der vorliegenden Beschreibung sein.

Beispiel 2 Alternatives Verfahren zur Herstellung von Faktor X

Das Lyophilisat einer Prothrombin-Komplexfaktoren-Präparation wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, gelöst und mit Tween 80 behandelt. Nach Verdünnen auf 10 000 E FX/l wurde mit 30 g /l Ca₃(PO₄)₂ versetzt und 1 h bei Raumtemperatur gerührt. Danach wurde die feste Phase durch Zentrifugation abgetrennt und zweimal mit je 25 ml/g Calciumphosphat eines Puffers von 20 mM Tris-HCl, pH 7,0, enthaltend 10% Ammoniumsulfat, durch Resuspendieren gewaschen und jeweils neuerlich abzentrifugiert. Danach wurde eine dritte Waschung mit 25 ml/g Calciumphosphat eines Puffers von 20 mM Tris-HCl, pH 7,0, enthaltend 150 mM NaCl, durch neuerliches Resuspendieren und anschließendes Abzentrifugieren durchgeführt.

Zur Elution des adsorbierten Faktor X wurde das Pellet mit 1 M Natriumphosphat-Puffer, pH 7,0 (25 ml Elutionslösung/g eingesetztem Calciumphosphat) 1 h bei Raumtemperatur gerührt. Danach wurde die feste Phase durch Zentrifugation abgetrennt und der Faktor X-enthaltende Überstand mit Ammoniumsulfat auf 80% Sättigung gebracht und 15 h bei 4°C gerührt.

Das dabei entstehende Präzipitat wurde durch Zentrifugation gewonnen. Das Pellet wurde, wie in Beispiel 1, Absatz 4 beschrieben, über Sephadex G25 umgepuffert und anschließend zur Chromatographie über DEAE-Sepharose-Fast-Flow gebracht.

Beispiel 3 Herstellung von Faktor X aus einer virusinaktivierten Plasmafraktion mittels Ionenaustausch- und Affinitätschromatographie

Die nach Beispiel 1 oder 2 hergestellte, Faktor X-enthaltende Lösung wurde nach der Methode von J.P. Miletich et al (Analytical Biochemistry, 105, 304-310 (1980)) über ein Dextransulfatgel weiter gereinigt. Die so erhaltene FX-enthaltende Fraktion wurde mit Ammoniumsulfat auf 80% Sättigung gebracht und 15 h bei 4°C gerührt. Der entstandene Niederschlag wurde durch Zentrifugation abgetrennt und in 20 mM Tris-HCl-Puffer, enthaltend 150 mM NaCl und 2 mM CaCl₂, pH 7,4 (TBSC-Puffer), gelöst, durch Chromatographie über eine mit Sephadex®G25 gefüllte Säule gegen 20 mM TBSC-Puffer umgepuffert und auf 3 E FX/ml eingestellt.

Beispiel 4 Quantitative Bestimmung von Faktor Xa Testprinzip

Das chromogene Peptidsubstrat CH₃OCO-D-CHA-Gly-Arg-pNA wird durch Faktor Xa hydrolysiert, wobei CH₃OCO-D-CHA-Gly-Arg-OH und Paranitroanilin entsteht. Die Kinetik der Zunahme von Paranitroanilin wird spektrophotometrisch bei 405 nm gemessen. Die Zunahme der optischen Dichte (o.D.) ist proportional dem Gehalt an Faktor Xa in der zu quantifizierenden Probe.

Reagenzien

Verdünnungspuffer:
3,7 g/l Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
2,1 g/l Imidazol
18,0 g/l NaCl
1,0 g/l Humanalbumin
pH 8,4

Substratlösung:
1,3 mM/l CH₃OCO-D-CHA-Gly-Arg-pNA
in Verdünnungspuffer

Methode

50 µl einer Faktor Xa enthaltenden Probe werden mit 50 µl Verdünnungspuffer versetzt und 90 Sekunden bei 37°C inkubiert. Dann werden 100 µl der Substratlösung zugesetzt und die Zunahme der o. D. pro Minute bei 37°C bei 405 nm bestimmt. Die Zunahme der O.D. muß über den Meßzeitraum konstant linear bleiben.

Zur Erstellung einer Bezugskurve wird die Standardpräparation von bovinem Faktor Xa "NIBSC-Reagent 75/595" verwendet, wobei eine Ampulle nach Rekonstitution mit 1 ml A. dest. 1 E FXa enthält (s. Datasheet, National Institute for Biological Standards and Controls).

Beispiel 5 Herstellung von beta-Faktor Xa aus Faktor X

Die nach den Beispielen 1, 2 oder 3 hergestellte FX-Lösung wurde mit 0,14 mg RVV (FX-aktivierende Protease aus Vipera russellii) pro 100 E FX versetzt und 1 h bei Raumtemperatur gerührt. Danach wurde das Inkubationsgemisch an Benzamidin-Sepharose® (gewaschen und gequollen), gepackt in eine Säule (innerer Querschnitt: Gelbetthöhe = 1 : 3) entsprechend 5 E FX/ml Gel bei einem Fluß von 3 ml/min adsorbiert. Zur Entfernung inerter Proteine wurde mit dem 3,5fachen Gelvolumen bei gleichem Fluß mit TBSC-Puffer gewaschen. Faktor Xa wurde mit 30 mM Benzamidin-HCl in TBSC-Puffer eluiert und in Fraktionen gesammelt. Die alpha- und beta-FXa enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt, mit Ammoniumsulfat (80% Sättigung) versetzt und 15 h bei 4°C gerührt. Das entstandene Präzipitat wurde durch Zentrifugation bei 4°C vom Überstand abgetrennt und in 20 mM Tris-HCl-Puffer, enthaltend 150 mM NaCl, pH 7,4 (TBS) gelöst.

Zur quantitativen Umwandlung des FXa in reinen beta-FXa wurde die vorstehend erhaltene Lösung 3 h bei 37°C inkubiert. Daraufhin wurde über Sephadex®-G25 gegen TBS umgepuffert, steril filtriert (0,22 µm-Filter) und anschließend auf 200 E beta-FXa/ml eingestellt (die Präparation lag somit in TBS vor).

Eine nach diesem Verfahren hergestellte beta-FXa-Präparation wies eine spezifische Aktivität von 2.550 E FXa/mg Protein auf.

Variante A

Eine nach Beispiel 5 hergestellte beta-FXa-Lösung wurde mit Saccharose versetzt, so daß die endgültige Präparation 5 g/100 ml enthielt.

Die spezifische Aktivität war wie vorstehend beschrieben.

Variante B

Eine nach Variante A hergestellte beta-FXa-Lösung wurde mit l g/100 ml Humanalbumin (Humanalbumin 20% Haemoderivate hitzeinaktiviert) versetzt.

Eine nach diesem Verfahren hergestellte beta-FXa-Präparation wies eine spezifische Aktivität von mindestens 20 E FXa/mg Protein auf (vor Albumin-Zugabe betrug die spezifische Aktivität 2550 E/mg Protein).

Beispiel 6 Lyophilisierung von Faktor Xa

Ein nach Beispiel 5 hergestellte beta-FXa-Präparation wurde schockgefroren und lyophilisiert.

Nach Rekonstituierung des Lyophilisates im Originalvolumen konnten in allen Fällen mehr als 50% der Ausgangsaktivität an FXa nachgewiesen werden.

Beispiel 7 Hitzebehandlung von lyophilisiertem beta-Faktor Xa

Zur Inaktivierung eventuell enthaltener Krankheitserreger wurden die lyophilisierten beta-FXa-Präparationen aus Beispiel 6 nach dem im Patent EP-159 311 beschriebenen Verfahren unter Erhöhung des partiellen Wasserdampfdruckes erhitzt bzw. im Anschluß an die Behandlung bei 60°C noch 1 h bei 80°C ebenso behandelt. Die Ausbeute an FXa betrug in jedem Fall mehr als 90%.

Beispiel 8 Thermostabilität von Faktor X aus einem Prothrombinkomplex- Präparat im Vergleich zu hochgereinigtem Faktor X

Die folgenden Versuche geben einen Vergleich der Stabilität im Hinblick auf die Hitzedenaturierung von Faktor X bei unterschiedlich reinen Präparaten. Während dem Fachmann bekannt war, daß das Zymogen von Faktor X wesentlich stabiler ist als der aktivierte Faktor Xa, hat sich erfindungsgemäß überraschenderweise gezeigt, daß dieser aktivierte Faktor Xa dennoch einer Hitzebehandlung unterworfen werden kann, ohne eine nennenswerte Einbuße der biologischen Aktivität. Dies war für den Fachmann nicht vorhersehbar.

Für einen Stabilitätsvergleich unterschiedlich reiner Faktor X-Präparate wurden folgende Versuche durchgeführt: Eine Prothrombinkomplexfaktoren-Präparation wurde nach der Methode von H.G.J. Brummelhuis (Preparation of the prothrombin complex; in Curling, J.M., Methods of Plasma Protein Fractionation, S. 117-128 (Acad. Press, New York, 1980)) hergestellt und zur Virusinaktivierung nach dem Verfahren gemäß EP-159 311 hitzebehandelt. Die spezifische Aktivität von Faktor X in dieser Präparation betrug 1,36 E/mg Protein. Daneben lagen Faktor II mit einer spezifischen Aktivität von 101,33 E/mg Protein und Faktor IX mit einer spezifischen Aktivität von 1,12 E/mg Protein vor.

In einem weiteren Versuch wurde Faktor X wie in Beispiel 1 hergestellt, jedoch nach erfolgter Ammoniumsulfatfällung gegen einen Puffer, bestehend aus 6 g/l Trinatrium-Citrat und 7 g/l NaCl, pH 7,35, durch Chromatographie über Sephadex G25 umgepuffert. Die spezifische Aktivität dieser Faktor X-Präparation betrug 45 E/mg Protein.

Die beiden Faktor X-Präparationen wurden in dem vorstehend genannten Puffer auf 7 E FX/ml verdünnt und lyophilisiert. Anschließend wurde auf 7,5% Wasser befeuchtet und jeweils entweder 1 h bei 95°C, 2 h bei 95°C oder 10 h bei 60°C erhitzt. Danach wurde der Faktor X-Gehalt der Proben bestimmt und die Aktivitätsabnahme gegen nicht erhitzten Faktor X, jeweils hochrein und aus Prothrombin-Komplex ermittelt (siehe Tabelle 1). Dabei zeigte sich, daß der hochreinere Faktor X durch die Thermobehandlung eine Aktivitätsabnahme von durchschnittlich 20% aufwies, während die Aktivität von Faktor X im Prothrombin-Komplex weitgehend unverändert blieb.

Tabelle 1

Während also das hochgereinigte Zymogen von Faktor X bei einer Hitzebehandlung weniger stabil ist als die vorstehend eingesetzte Vergleichssubstanz, mußte der Fachmann erwarten, daß bei einer gleichen Behandlung von hochreinem aktivierten Faktor Xa ein wesentlich höherer Verlust der biologischen Aktivität auftritt. Überraschenderweise ist dies aber bei dem erfindungsgemäßen Verfahren nicht der Fall.

Beispiel 9 Lagerstabilität von beta-Faktor Xa

Es wurde eine Präparation von beta-Faktor Xa gemäß Beispiel 5 hergestellt und in einer Verdünnung von 2,8 E/ml zu je 1 ml lyophilisiert. Die Lyophilisate wurden bei 37°C über 6 Wochen gelagert, wobei einmal pro Woche eine Probe gezogen und, wie in Beispiel 4 beschrieben, auf ihren Gehalt an Faktor Xa untersucht wurde. Über den Lagerungszeitraum ergab sich keine Veränderung der Aktivität von beta-Faktor Xa.

Claims

1. Virusinaktiviertes Faktor Xa-Präparat mit mindestens 100 Einheiten Cerinnungsfaktor Xa-Aktivität pro mg Protein.

2. Virusinaktiviertes Faktor Xa-Präparat mit mindestens 100 Einheiten Gerinnungsfaktor beta-Xa-Aktivität pro mg Protein.

3. Präparat nach Anspruch 1 oder 2 mit mindestens 500 Einheiten pro mg Protein.

4. Präparat nach Anspruch 1 oder 2 mit mindestens 1000 Einheiten pro mg Protein.

5. Präparat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das bereits hochgereinigte Präparat einer Behandlung zur Virus-Inaktivierung unterzogen wurde.

6. Präparat nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß zur Virus-Inaktivierung eine Hitzebehandlung durchgeführt wurde.

7. Verfahren zur Herstellung eines virusinaktivierten Faktor Xa- Präparates gemäß Ansprüchen 1, 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß ein Faktor X-enthaltendes Ausgangsmaterial nach Aktivierung auf mindestens 100 Einheiten Faktor Xa-Aktivität pro mg Protein gereinigt und anschließend einer Behandlung zur Inaktivierung von infektiösen Agenzien, insbesondere von Viren, unterzogen wird.

8. Verfahren zur Herstellung eines virusinaktivierten beta-Faktor Xa-Präparates gemäß Ansprüchen 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß ein Faktor X-enthaltendes Ausgangsmaterial nach Aktivierung auf mindestens 100 Einheiten beta-Faktor Xa-Aktivität pro mg Protein gereinigt, der vorliegende Faktor Xa bzw. das vorliegende Gemisch aus alpha-Faktor Xa und beta-Faktor Xa in ausschließlich beta-Faktor Xa umgewandelt und einer Behandlung zur Virus-Inaktivierung unterzogen wird.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der vorliegende Faktor Xa bzw. das Gemisch aus alpha-Faktor Xa und beta-Faktor Xa zunächst einer Behandlung zur Virus-Inaktivierung und dann einer Umwandlung in ausschließlich beta-Faktor Xa unterzogen wird.

10. Verfahren nach Ansprüchen 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß als Ausgangsmaterial eine Plasmafraktion, insbesondere ein Prothrombinkomplex, oder rekombinanter Faktor X verwendet wird.

11. Verfahren nach einem oder mehreren der vorangehenden Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Reinigung der Faktor Xa-Präparation auf mindestens 500 Einheiten pro mg Protein erfolgt.

12. Verfahren nach einem oder mehreren der vorangehenden Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Reinigung der Faktor Xa-Präparation auf mindestens 1000 Einheiten pro mg Protein erfolgt.

13. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 7 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Reinigung von Faktor X chromatografisch erfolgt.

14. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 7 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Aktivierung von Faktor X zu Faktor Xa enzymatisch erfolgt.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß als Enzym ein Schlangengift, insbesondere Russel′s Viper Venom, in immobilisierter Form oder als lösliches Enzym, oder eine Protease mit Trypsin-ähnlicher Aktivität oder ein aktivierter Gerinnungsfaktor gegebenenfalls mit einem Co-Faktor, wie Faktor VIIa und "tissue factor", verwendet werden.

16. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 7 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß zur Virus-Inaktivierung eine Hitzebehandlung erfolgt.

17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Hitzebehandlung bei einer Temperatur von 50 bis 90°C durchgeführt wird.

18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Hitzedenaturierung in festem Zustand bei einem Wassergehalt von 0,06 bis 0,30 (Gew.-%) erfolgt.

19. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 8 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Umwandlung von alpha-Faktor Xa zu beta-Faktor Xa durch Inkubation erfolgt.

20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß eine alpha-Faktor Xa-enthaltende Lösung 1 bis 24 h bei 4 bis 40°C, vorzugsweise 2 bis 4 h bei 17 bis 37°C, inkubiert wird.

21. Verwendung eines Präparates mit Gerinnungsfaktor Xa-Aktivität bzw. beta-Faktor Xa-Aktivität nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6 zur Herstellung eines Mittels zur Behandlung von Haemophilie-A-Inhibitor-Patienten.