DE4314271A1 - Verfahren zur Elimination bakterieller DNA aus hitzestabiler DNA-Polymerase mittels eines DNA verdauenden Enzyms - Google Patents
Verfahren zur Elimination bakterieller DNA aus hitzestabiler DNA-Polymerase mittels eines DNA verdauenden EnzymsInfo
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Description
Das Verfahren betrifft die Elimination von bakterieller DNA, die
herstellungsbedingt in der Enzympräparation Taq DNA-Polymerase
enthalten ist, welche für das Verfahren der Polymerase-
Kettenreaktion benötigt wird.
Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist ein Verfahren, das es erlaubt,
kleinste Mengen an DNA auf enzymatischem Wege zu vervielfältigen
und somit nachzuweisen (U.S.-Patente Nr. 4,683,195 und 4,683,202,
Patenteigentümer: Fa. Hoffmann-La Roche). Hierzu werden
Startersequenzen (Primer) verwendet, die eine spezifische Auswahl
des zu vervielfältigenden Stücks ermöglichen. Die Reaktion verläuft in
einem sich zyklisch wiederholenden Temperaturprofil und benötigt
den Zusatz einer hitzestabilen DNA-Polymerase, die in der Regel aus
dem thermophilen Bakterium Thermus aquaticus stammt (Taq
DNA-Polymerase). Dieses Enzym ist im Handel erhältlich als natives Enzym
oder als gentechnologisch in E. coli produziertes Enzym (U.S.-Patente
Nr. 4,889,818 und 5,079,352). Produktionstechnisch bedingt enthält
das Enzym Reste an bakterieller DNA, die in der Mehrzahl der
Anwendungen nicht störend in Erscheinung tritt. Werden jedoch
Primer verwendet, die einen hohen Grad an Homologie zwischen
verschiedenen Bakterienarten aufweisen (Primer für sogenannte
hochkonservierte Gene), kommt es zum Entstehen eines
Reaktionsprodukts in den Negativkontrollen der PCR (Böttger, 1990;
Rand und Houck, 1990; Schmidt et al., 1991). Dies kann dann zur
Beeinträchtigung der Versuchsergebnisse führen, wenn mittels
solcher hochkonservierter Primer im Untersuchungsmaterial nach
unbekannten Bakterien gesucht wird. Eine Amplifikation von DNA
unbekannter Bakterien mittels hochkonservierter Primer ist bislang
nur erfolgversprechend, wenn die Anzahl der nachzuweisenden
Bakterien im Untersuchungsmaterial die Zahl der Kopien bakterieller
DNA in Taq DNA-Polymerase wesentlich übersteigt. Die Firma Perkin-
Elmer produziert seit kürzerem eine "low DNA Taq", eine
Enzympräparation mit deutlich herabgesetztem DNA-Gehalt (Perkin-
Elmer, Best. Nr. N808-0107). Außerdem ist erst seit kürzerem eine
Methode zur Elimination von DNA aus Taq-Polymerase beschrieben,
die unter Verwendung von 8-Methoxypsoralen und anschließender
Bestrahlung mit langwelligem UV-Licht abläuft (Meier et al., 1993).
Eine Behandlung des Enzyms mit DNase ist bereits von Rand und
Houck versucht worden und war erfolglos. Die letzteren Autoren
machen allerdings keine Angaben zu den Reaktionsbedingungen ihres
DNase-Verdaus.
Die von der Firma Perkin-Elmer hergestellte "low DNA Taq" erfordert
höhere Produktions- und Verkaufskosten als konventionelle Taq
DNA-Polymerase und ist überdies nicht frei von bakterieller DNA,
sondern besitzt lediglich einen herabgesetzten DNA-Gehalt, so daß bei
Amplifikation geringer Ausgangs-DNA-Mengen und unter
Verwendung hoher Zykluszahlen die kontaminierende DNA immer
noch in Erscheinung tritt (Meier et al., 1993). Die Elimination
bakterieller DNA in Taq-Polymerase mittels 8-Methoxypsoralen und
UV-Licht ist umständlich bezüglich ihrer Durchführung und benötigt
Reagenzien (8-Methoxypsoralen und Dimethylsulfoxyd), die ihrerseits
die PCR hemmen, wenn eine zu hohe Menge verwendet wird (Meier et
al., 1993). Ferner wird in Form des langwelligen UV-Strahlers
zusätzliche Laborausrüstung benötigt. Die UV-Inaktivierung ist nur in
einem schmalen Dosisbereich effektiv und die Dosis ist sehr starken
Schwankungen unterworfen je nach Durchlässigkeit der verwendeten
Reagenzgefäße für UV-Licht und je nach Zustand und Alter des
UV-Strahlers. Diese zeigen mit zunehmendem Alter des Brenners starke
Dosisverluste, die einer Kalkulation nicht zugänglich sind.
Aufgabenstellung des vorliegenden Verfahrens ist es, mit einfachen
Hilfsmitteln und Reagenzien, die in jedem Labor, das PCR betreibt, zur
Verfügung stehen, eine effektive Elimination bakterieller DNA aus Taq
DNA-Polymerase zu ermöglichen.
Die Suche nach unbekannten Erregern im Patientenmaterial ist eine
der Hauptaufgaben der medizinischen Mikrobiologie. Das Verfahren
der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist in der Lage, sehr sensitiv
Mikroorganismen nachzuweisen, für die spezifische Primersequenzen
gewählt werden. Wenn dagegen nach unbekannten bakteriellen
Erregern gesucht wird, kann die bakterielle DNA im thermostabilen
Enzym für die PCR störend wirken. Mit einem Verfahren zur
Elimination der DNA in diesem Enzym ist es nun möglich, in
üblicherweise sterilen Untersuchungsmaterialien von Patienten wie
zum Beispiel Liquor oder Blut nach unbekannten bakteriellen
Erregern zu suchen. Dies kann eine wertvolle medizinische Hilfe bei
der Sepsisdiagnostik oder ähnlichen Fragestellungen sein und
ermöglicht ferner den Nachweis und die Charakterisierung von
Erregern, die nicht mit konventionellen mikrobiologischen Methoden
kultiviert werden können. Das vorliegende Verfahren kann als
Bestandteil eines käuflichen Reagenzienkits verwendet werden, mit
dessen Hilfe mittels PCR-Technik nach unbekannten Erregern
gefahndet wird.
Das beschriebene Verfahren zur Elimination bakterieller DNA in Taq
DNA-Polymerase ist ein einfaches enzymatisches Verfahren, das in
jedem Labor, welches PCR betreibt, unter Verwendung eines
Minimums an Hilfsmitteln möglich ist. Es beinhaltet einen Schritt, in
dem die Versuchsansätze geteilt werden, so daß die aus DNA
bestehenden Primer nicht der Wirkung des Enzyms ausgesetzt sind.
Die Eliminierung der DNA-Kontaminationen aus der Taq DNA-
Polymerase erfolgt im Tris-gepufferten alkalischen Milieu um pH 9,
anschließend erfolgt eine Hitzeinaktivierung des DNA verdauenden
Enzyms, die die Aktivität der hitzestabilen DNA-Polymerase nicht
wesentlich beeinträchtigt, so daß anschließend eine normale PCR-
Reaktion durchgeführt werden kann. Die wesentlichen Vorteile des
Verfahrens bestehen in der Einfachheit der Durchführung und in der
Effektivität der Beseitigung der DNA. Außerdem werden keine
Hilfsmittel wie UV-Strahler benötigt, deren Einwirkung nur in einem
schmalen Dosisbereich effektiv sind und deren erbrachte Dosis schwer
abzuschätzen ist.
Das Verfahren wurde durchgeführt unter Zuhilfenahme eines
Primersystems für die 5S-rRNA von Legionella sp. (Mahbubani et al.,
1990), das bei Verwendung einer Annealing-Temperatur von 50°C
regelmäßig eine mittels Gelelektrophorese sichtbare Bande in den
Negativkontrollen zeigte, die amplifizierter DNA aus Taq
DNA-Polymerase entspricht. Diese Bande zeigte aber keine Hybridisierung
mit einem Legionella-spezifischen Oligonukleotid und somit war eine
Unterscheidung zwischen Legionella-DNA und DNA aus Taq
DNA-Polymerase möglich. Zur Durchführung der Behandlung mit DNase I
wurde der Reaktionsansatz geteilt: Teil A enthielt 5 µmol KCl, 1 µmol
Tris-HCl, pH 8,3, 0,02 µmol von jedem dNTP, 50 pmol von jedem
Primer und 0,1 µmol MgCl₂ in einem Volumen von 50 µl. Teil B
enthielt 4 µmol Tris-HCl, pH 9,0, 0,1 µmol MgCl₂ und 2,5 U Taq
DNA-Polymerase (AmpliTaq® DNA Polymerase, Perkin-Elmer) in einem
Volumen von 40 µl. Teil B wurde mit 3 U DNase I (Boehringer
Mannheim) bei 25°C für 2 Stunden inkubiert und anschließend für
10 min bei 95°C erhitzt. Die beiden Teile des PCR-Ansatzes wurden
zusammengegeben, 10 µl Probe wurde dazugegeben und anschließend
erfolgte eine PCR im Thermocycler. Abb. 1A und 1B zeigt die
Ergebnisse des Versuchsansatzes. Ohne Behandlung mit DNase und
Hitze ist eine Bande in der Negativkontrolle zu sehen (Abb. 1A, Spur
4), die nicht mit dem Legionella-spezifischen Oligonukleotid
hybridisiert (Abb. 1B, Spur 4). Bei Einsatz von 100 fg oder 10 fg an
Legionella-DNA erfolgt eine Hybridisierung (Abb. 1B, Spur 2 und 3).
Unter Verwendung von DNase und Hitze ist auf dem Gel (Abb. 1A)
eine schwache Bande jeweils bei 100 fg und 10 fg an Legionella-DNA
zu sehen (Spur 5 und 6), während in der Negativkontrolle keine DNA
auf dem Gel zu sehen ist (Spur 7). Die Hybridisierung jedoch zeigt, daß
kein signifikanter Unterschied in der Amplifikation der Legionella
spezifischen DNA zu sehen ist zwischen behandelter und
unbehandelter Taq DNA-Polymerase (Spur 5 und 6 im Vergleich zu
Spur 2 und 3). Die Spuren 8-10 zeigen die Ergebnisse nach alleiniger
Hitzebehandlung (ohne DNase) von Teil B des Versuchsansatzes. Hier
ist in Abb. 1A und 1B kein Unterschied zu sehen zum unbehandelten
Versuchsansatz (Spuren 2-4). Diese Ergebnisse zeigen, daß eine
Behandlung mit DNase I und Hitze in der Lage ist, die Amplifikation
kontaminierender DNA aus Taq DNA-Polymerase zu unterbinden,
während die Amplifikation von Legionella-spezifischer DNA
unbeeinträchtigt bleibt.
Abb. 1. (A) Ethidiumbromidgefärbtes Polyacrylamidgel (8%) und (B)
Southern Blot mit anschließender Hybridisierung. Spuren: (1) 100 bp
DNA-Längenstandard; (2) 100 fg an Legionella-DNA, keine
Vorbehandlung; (3) 10 fg an Legionella-DNA, keine Vorbehandlung;
(4) keine DNA zugesetzt, keine Vorbehandlung; (5) 100 fg an
Legionella-DNA, Vorbehandlung mit DNase und Hitze; (6) 10 fg an
Legionella-DNA, Vorbehandlung mit DNase und Hitze; (7) keine DNA
zugesetzt, Vorbehandlung mit DNase und Hitze; (8) 100 fg an
Legionella-DNA, Vorbehandlung mit Hitze; (9) 10 fg an Legionella-
DNA, Vorbehandlung mit Hitze; (10) keine DNA zugesetzt,
Vorbehandlung mit Hitze.
Böttger, E. C. 1990. Frequent contamination of Taq polymerase with
DNA. Clin. Chem. 36: 1258.
Mahbubani, M. H., A. K. Bej, R. Miller, L. Haff, J. DiCesare, and R. M.
Atlas. 1990. Detection of Legioflella with polymerase chain reaction
and gene probe methods. Mol. Cell. Probes 4: 175-187.
Meier, A., D. H. Persing, M. Finken, and E. C. Böttger. 1993. Elimination
of contaminating DNA within polymerase chain reaction reagents:
implications for a general approach to detection of uncultured
pathogens. J Clin. Microbiol. 31: 646-652.
Rand, K. H., and H. Houck. 1990. Taq polymerase contains bacterial
DNA of unknown origin. Mol. Cell. Probes 4: 445-450.
Schmidt, T., B. Pace, and N. R. Pace. 1991. Detection of DNA
contamination in Taq polymerase. BioTechniques 11: 176-177.
Claims (3)
1. Verfahren zur Elimination bakterieller DNA aus hitzestabiler
DNA-Polymerase mittels eines DNA verdauenden Enzyms,
das dadurch gekennzeichnet ist, daß eine Behandlung einer hitze
stabilen DNA-Polymerase, insbesondere Taq-Polymerase, stattfindet
unter Verwendung eines DNA-verdauenden Enzyms, insbesondere
DNase I, und anschließender Inaktivierung des verdauenden Enzyms.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die
Behandlung der hitzestabilen DNA-Polymerase stattfindet im
alkalischen Milieu, insbesondere pH 8-9,5, in Anwesenheit von
Magnesiumchlorid.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß
während der Enzymbehandlung eine Teilung der für das Verfahren
der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) vorgesehenen Reaktionsansätze
stattfindet dergestalt, daß die hierfür benötigte hitzestabile DNA-
Polymerase der verdauenden Wirkung des Enzyms ausgesetzt ist,
während die aus DNA bestehenden Primer erst nach der Reaktion mit
dem verdauenden Enzym und einer Hitzeinaktivierung desselben
zugesetzt werden.
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999007887A3 (en) * | 1997-08-06 | 1999-04-29 | Norwegian Inst Of Fisheries An | A method of removing nucleic acid contamination in amplification reactions |
-
1993
- 1993-04-30 DE DE4314271A patent/DE4314271A1/de not_active Withdrawn
Cited By (2)
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| WO1999007887A3 (en) * | 1997-08-06 | 1999-04-29 | Norwegian Inst Of Fisheries An | A method of removing nucleic acid contamination in amplification reactions |
| US6541204B2 (en) | 1997-08-06 | 2003-04-01 | Norwegian Institute Of Fisheries & Aquaculture Ltd. | Method of removing nucleic acid contamination in amplification reactions |
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