DE4314271A1 - Method for eliminating bacterial DNA from thermally stable DNA polymerase using a DNA-digesting enzyme - Google Patents

Method for eliminating bacterial DNA from thermally stable DNA polymerase using a DNA-digesting enzyme

Info

Publication number
DE4314271A1
DE4314271A1 DE4314271A DE4314271A DE4314271A1 DE 4314271 A1 DE4314271 A1 DE 4314271A1 DE 4314271 A DE4314271 A DE 4314271A DE 4314271 A DE4314271 A DE 4314271A DE 4314271 A1 DE4314271 A1 DE 4314271A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
dna
polymerase
enzyme
thermally stable
chain reaction
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
DE4314271A
Other languages
German (de)
Inventor
Matthias Dr Maiwald
Doeberitz Knebel
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
MAIWALD, MATTHIAS, PRIV.-DOZ. DR.MED., 69429 WALDB
Original Assignee
MAIWALD MATTHIAS DR MED
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by MAIWALD MATTHIAS DR MED filed Critical MAIWALD MATTHIAS DR MED
Priority to DE4314271A priority Critical patent/DE4314271A1/en
Publication of DE4314271A1 publication Critical patent/DE4314271A1/en
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Technical problem> In the method of the polymerase chain reaction it is possible , owing to the DNA present in the required thermally stable enzyme due to its preparation, for there to be adverse effects on the test results in certain applications. The novel method is intended to make it possible to eliminate the DNA from the thermally stable enzyme in a simple and efficient manner. Solution of the problem The thermally stable DNA polymerase is treated with a DNA-digesting enzyme in an alkaline medium containing magnesium chloride, and subsequently the digesting enzyme is inactivated. Moreover a division of the reagents required for a polymerase chain reaction takes place so that the primers consisting of DNA are added only after the pretreatment. Areas of application The described method makes it possible to eliminate bacterial DNA from a thermally stable DNA polymerase employed for the polymerase chain reaction in a simple manner and thus makes it possible to use the polymerase chain reaction for efficient screening for unknown bacterial pathogens.

Description

Technisches GebietTechnical field

Das Verfahren betrifft die Elimination von bakterieller DNA, die herstellungsbedingt in der Enzympräparation Taq DNA-Polymerase enthalten ist, welche für das Verfahren der Polymerase- Kettenreaktion benötigt wird.The method concerns the elimination of bacterial DNA that production-related in the enzyme preparation Taq DNA polymerase is included, which for the process of polymerase Chain reaction is needed.

Stand der TechnikState of the art

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist ein Verfahren, das es erlaubt, kleinste Mengen an DNA auf enzymatischem Wege zu vervielfältigen und somit nachzuweisen (U.S.-Patente Nr. 4,683,195 und 4,683,202, Patenteigentümer: Fa. Hoffmann-La Roche). Hierzu werden Startersequenzen (Primer) verwendet, die eine spezifische Auswahl des zu vervielfältigenden Stücks ermöglichen. Die Reaktion verläuft in einem sich zyklisch wiederholenden Temperaturprofil und benötigt den Zusatz einer hitzestabilen DNA-Polymerase, die in der Regel aus dem thermophilen Bakterium Thermus aquaticus stammt (Taq DNA-Polymerase). Dieses Enzym ist im Handel erhältlich als natives Enzym oder als gentechnologisch in E. coli produziertes Enzym (U.S.-Patente Nr. 4,889,818 und 5,079,352). Produktionstechnisch bedingt enthält das Enzym Reste an bakterieller DNA, die in der Mehrzahl der Anwendungen nicht störend in Erscheinung tritt. Werden jedoch Primer verwendet, die einen hohen Grad an Homologie zwischen verschiedenen Bakterienarten aufweisen (Primer für sogenannte hochkonservierte Gene), kommt es zum Entstehen eines Reaktionsprodukts in den Negativkontrollen der PCR (Böttger, 1990; Rand und Houck, 1990; Schmidt et al., 1991). Dies kann dann zur Beeinträchtigung der Versuchsergebnisse führen, wenn mittels solcher hochkonservierter Primer im Untersuchungsmaterial nach unbekannten Bakterien gesucht wird. Eine Amplifikation von DNA unbekannter Bakterien mittels hochkonservierter Primer ist bislang nur erfolgversprechend, wenn die Anzahl der nachzuweisenden Bakterien im Untersuchungsmaterial die Zahl der Kopien bakterieller DNA in Taq DNA-Polymerase wesentlich übersteigt. Die Firma Perkin- Elmer produziert seit kürzerem eine "low DNA Taq", eine Enzympräparation mit deutlich herabgesetztem DNA-Gehalt (Perkin- Elmer, Best. Nr. N808-0107). Außerdem ist erst seit kürzerem eine Methode zur Elimination von DNA aus Taq-Polymerase beschrieben, die unter Verwendung von 8-Methoxypsoralen und anschließender Bestrahlung mit langwelligem UV-Licht abläuft (Meier et al., 1993). Eine Behandlung des Enzyms mit DNase ist bereits von Rand und Houck versucht worden und war erfolglos. Die letzteren Autoren machen allerdings keine Angaben zu den Reaktionsbedingungen ihres DNase-Verdaus.The polymerase chain reaction (PCR) is a process that allows to reproduce the smallest amounts of DNA by enzymatic means and thus to demonstrate (U.S. Patents Nos. 4,683,195 and 4,683,202, Patent owner: Hoffmann-La Roche). To do this Starter sequences (primers) used that have a specific selection of the piece to be reproduced. The reaction proceeds in a cyclically repeating temperature profile and required the addition of a heat-stable DNA polymerase, which usually consists of the thermophilic bacterium Thermus aquaticus (Taq DNA polymerase). This enzyme is commercially available as a native enzyme or as an enzyme produced by genetic engineering in E. coli (U.S. patents No. 4,889,818 and 5,079,352). Contains for production reasons the enzyme residues of bacterial DNA found in the majority of the Applications does not interfere. However Primer used that has a high degree of homology between different types of bacteria (primers for so-called highly conserved genes), a Reaction product in the negative controls of the PCR (Böttger, 1990; Rand and Houck, 1990; Schmidt et al., 1991). This can then be used The test results are adversely affected if by means of such highly conserved primer in the test material unknown bacteria is sought. An amplification of DNA  unknown bacteria using highly conserved primers is so far only promising if the number of demonstrable Bacteria in the test material the number of copies of bacterial DNA in Taq DNA polymerase significantly exceeds. The Perkin- company Elmer has recently been producing a "low DNA Taq", one Enzyme preparation with significantly reduced DNA content (Perkin- Elmer, Order No. N808-0107). In addition, there has only been one recently Described method for eliminating DNA from Taq polymerase, that using 8-methoxypsoralen and subsequent Irradiation with long-wave UV light takes place (Meier et al., 1993). Treatment of the enzyme with DNase is already out of the question Houck was tried and was unsuccessful. The latter authors however, do not provide any information on the reaction conditions of your DNase digestion.

Kritik des Standes der TechnikCritique of the state of the art

Die von der Firma Perkin-Elmer hergestellte "low DNA Taq" erfordert höhere Produktions- und Verkaufskosten als konventionelle Taq DNA-Polymerase und ist überdies nicht frei von bakterieller DNA, sondern besitzt lediglich einen herabgesetzten DNA-Gehalt, so daß bei Amplifikation geringer Ausgangs-DNA-Mengen und unter Verwendung hoher Zykluszahlen die kontaminierende DNA immer noch in Erscheinung tritt (Meier et al., 1993). Die Elimination bakterieller DNA in Taq-Polymerase mittels 8-Methoxypsoralen und UV-Licht ist umständlich bezüglich ihrer Durchführung und benötigt Reagenzien (8-Methoxypsoralen und Dimethylsulfoxyd), die ihrerseits die PCR hemmen, wenn eine zu hohe Menge verwendet wird (Meier et al., 1993). Ferner wird in Form des langwelligen UV-Strahlers zusätzliche Laborausrüstung benötigt. Die UV-Inaktivierung ist nur in einem schmalen Dosisbereich effektiv und die Dosis ist sehr starken Schwankungen unterworfen je nach Durchlässigkeit der verwendeten Reagenzgefäße für UV-Licht und je nach Zustand und Alter des UV-Strahlers. Diese zeigen mit zunehmendem Alter des Brenners starke Dosisverluste, die einer Kalkulation nicht zugänglich sind.The "low DNA Taq" manufactured by Perkin-Elmer requires higher production and sales costs than conventional Taq DNA polymerase and is also not free of bacterial DNA, but only has a reduced DNA content, so that at Amplification of small amounts of starting DNA and below Always use high cycle numbers to contaminate the DNA still appears (Meier et al., 1993). The elimination bacterial DNA in Taq polymerase using 8-methoxypsoralen and UV light is cumbersome to carry out and required Reagents (8-methoxypsoralen and dimethyl sulfoxide), in turn inhibit PCR if too much is used (Meier et al., 1993). Furthermore, in the form of the long-wave UV lamp additional laboratory equipment needed. UV inactivation is only in effective in a narrow dose range and the dose is very strong Subject to fluctuations depending on the permeability of the used Test tubes for UV light and depending on the condition and age of the UV lamp. These show strong as the burner ages Dose losses that cannot be calculated.

Aufgabetask

Aufgabenstellung des vorliegenden Verfahrens ist es, mit einfachen Hilfsmitteln und Reagenzien, die in jedem Labor, das PCR betreibt, zur Verfügung stehen, eine effektive Elimination bakterieller DNA aus Taq DNA-Polymerase zu ermöglichen.The task of the present method is simple Aids and reagents used in every laboratory that operates PCR Are available to effectively eliminate bacterial DNA from Taq To enable DNA polymerase.

Gewerbliche AnwendbarkeitIndustrial applicability

Die Suche nach unbekannten Erregern im Patientenmaterial ist eine der Hauptaufgaben der medizinischen Mikrobiologie. Das Verfahren der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist in der Lage, sehr sensitiv Mikroorganismen nachzuweisen, für die spezifische Primersequenzen gewählt werden. Wenn dagegen nach unbekannten bakteriellen Erregern gesucht wird, kann die bakterielle DNA im thermostabilen Enzym für die PCR störend wirken. Mit einem Verfahren zur Elimination der DNA in diesem Enzym ist es nun möglich, in üblicherweise sterilen Untersuchungsmaterialien von Patienten wie zum Beispiel Liquor oder Blut nach unbekannten bakteriellen Erregern zu suchen. Dies kann eine wertvolle medizinische Hilfe bei der Sepsisdiagnostik oder ähnlichen Fragestellungen sein und ermöglicht ferner den Nachweis und die Charakterisierung von Erregern, die nicht mit konventionellen mikrobiologischen Methoden kultiviert werden können. Das vorliegende Verfahren kann als Bestandteil eines käuflichen Reagenzienkits verwendet werden, mit dessen Hilfe mittels PCR-Technik nach unbekannten Erregern gefahndet wird.The search for unknown pathogens in patient material is one the main tasks of medical microbiology. The procedure The polymerase chain reaction (PCR) is able to be very sensitive Detect microorganisms for specific primer sequences to get voted. If, on the other hand, after unknown bacterial Pathogen is sought, the bacterial DNA in the thermostable Enzyme disrupt the PCR. With a procedure for Elimination of the DNA in this enzyme is now possible in usually sterile test materials from patients such as for example cerebrospinal fluid or blood after unknown bacterial To look for pathogens. This can be a valuable medical aid the diagnosis of sepsis or similar questions and also enables the detection and characterization of Pathogens that are not using conventional microbiological methods can be cultivated. The present method can be used as Part of a commercially available reagent kit used with its help using PCR technology for unknown pathogens is searched.

Erzielbare Vorteile des VerfahrensAchievable advantages of the procedure

Das beschriebene Verfahren zur Elimination bakterieller DNA in Taq DNA-Polymerase ist ein einfaches enzymatisches Verfahren, das in jedem Labor, welches PCR betreibt, unter Verwendung eines Minimums an Hilfsmitteln möglich ist. Es beinhaltet einen Schritt, in dem die Versuchsansätze geteilt werden, so daß die aus DNA bestehenden Primer nicht der Wirkung des Enzyms ausgesetzt sind. Die Eliminierung der DNA-Kontaminationen aus der Taq DNA- Polymerase erfolgt im Tris-gepufferten alkalischen Milieu um pH 9, anschließend erfolgt eine Hitzeinaktivierung des DNA verdauenden Enzyms, die die Aktivität der hitzestabilen DNA-Polymerase nicht wesentlich beeinträchtigt, so daß anschließend eine normale PCR- Reaktion durchgeführt werden kann. Die wesentlichen Vorteile des Verfahrens bestehen in der Einfachheit der Durchführung und in der Effektivität der Beseitigung der DNA. Außerdem werden keine Hilfsmittel wie UV-Strahler benötigt, deren Einwirkung nur in einem schmalen Dosisbereich effektiv sind und deren erbrachte Dosis schwer abzuschätzen ist.The described method for eliminating bacterial DNA in Taq DNA polymerase is a simple enzymatic process, which in any laboratory that operates PCR using a Minimum of aids is possible. It involves a step in which the test approaches are divided so that the DNA existing primers are not exposed to the action of the enzyme. Eliminating DNA Contamination from Taq DNA Polymerase occurs in a Tris-buffered alkaline medium around pH 9,  the DNA digesting is then heat-inactivated Enzyme that does not have the activity of heat-stable DNA polymerase significantly impaired, so that a normal PCR Reaction can be carried out. The main advantages of The procedure consists in the simplicity of implementation and in the Effectiveness of removing DNA. Besides, none Aids such as UV lamps are required, their action only in one narrow dose range are effective and the dose delivered is difficult is to be estimated.

AusführungsbeispielEmbodiment

Das Verfahren wurde durchgeführt unter Zuhilfenahme eines Primersystems für die 5S-rRNA von Legionella sp. (Mahbubani et al., 1990), das bei Verwendung einer Annealing-Temperatur von 50°C regelmäßig eine mittels Gelelektrophorese sichtbare Bande in den Negativkontrollen zeigte, die amplifizierter DNA aus Taq DNA-Polymerase entspricht. Diese Bande zeigte aber keine Hybridisierung mit einem Legionella-spezifischen Oligonukleotid und somit war eine Unterscheidung zwischen Legionella-DNA und DNA aus Taq DNA-Polymerase möglich. Zur Durchführung der Behandlung mit DNase I wurde der Reaktionsansatz geteilt: Teil A enthielt 5 µmol KCl, 1 µmol Tris-HCl, pH 8,3, 0,02 µmol von jedem dNTP, 50 pmol von jedem Primer und 0,1 µmol MgCl₂ in einem Volumen von 50 µl. Teil B enthielt 4 µmol Tris-HCl, pH 9,0, 0,1 µmol MgCl₂ und 2,5 U Taq DNA-Polymerase (AmpliTaq® DNA Polymerase, Perkin-Elmer) in einem Volumen von 40 µl. Teil B wurde mit 3 U DNase I (Boehringer Mannheim) bei 25°C für 2 Stunden inkubiert und anschließend für 10 min bei 95°C erhitzt. Die beiden Teile des PCR-Ansatzes wurden zusammengegeben, 10 µl Probe wurde dazugegeben und anschließend erfolgte eine PCR im Thermocycler. Abb. 1A und 1B zeigt die Ergebnisse des Versuchsansatzes. Ohne Behandlung mit DNase und Hitze ist eine Bande in der Negativkontrolle zu sehen (Abb. 1A, Spur 4), die nicht mit dem Legionella-spezifischen Oligonukleotid hybridisiert (Abb. 1B, Spur 4). Bei Einsatz von 100 fg oder 10 fg an Legionella-DNA erfolgt eine Hybridisierung (Abb. 1B, Spur 2 und 3). Unter Verwendung von DNase und Hitze ist auf dem Gel (Abb. 1A) eine schwache Bande jeweils bei 100 fg und 10 fg an Legionella-DNA zu sehen (Spur 5 und 6), während in der Negativkontrolle keine DNA auf dem Gel zu sehen ist (Spur 7). Die Hybridisierung jedoch zeigt, daß kein signifikanter Unterschied in der Amplifikation der Legionella­ spezifischen DNA zu sehen ist zwischen behandelter und unbehandelter Taq DNA-Polymerase (Spur 5 und 6 im Vergleich zu Spur 2 und 3). Die Spuren 8-10 zeigen die Ergebnisse nach alleiniger Hitzebehandlung (ohne DNase) von Teil B des Versuchsansatzes. Hier ist in Abb. 1A und 1B kein Unterschied zu sehen zum unbehandelten Versuchsansatz (Spuren 2-4). Diese Ergebnisse zeigen, daß eine Behandlung mit DNase I und Hitze in der Lage ist, die Amplifikation kontaminierender DNA aus Taq DNA-Polymerase zu unterbinden, während die Amplifikation von Legionella-spezifischer DNA unbeeinträchtigt bleibt.The method was carried out with the aid of a primer system for the 5S rRNA from Legionella sp. (Mahbubani et al., 1990) who, when using an annealing temperature of 50 ° C., regularly showed a band visible in the negative controls by gel electrophoresis, which corresponds to amplified DNA from Taq DNA polymerase. However, this band showed no hybridization with a Legionella-specific oligonucleotide and thus a distinction between Legionella DNA and DNA from Taq DNA polymerase was possible. To carry out the treatment with DNase I, the reaction mixture was divided: Part A contained 5 μmol KCl, 1 μmol Tris-HCl, pH 8.3, 0.02 μmol from each dNTP, 50 pmol from each primer and 0.1 μmol MgCl₂ in a volume of 50 µl. Part B contained 4 µmol Tris-HCl, pH 9.0, 0.1 µmol MgCl₂ and 2.5 U Taq DNA polymerase (AmpliTaq® DNA Polymerase, Perkin-Elmer) in a volume of 40 µl. Part B was incubated with 3 U DNase I (Boehringer Mannheim) at 25 ° C for 2 hours and then heated at 95 ° C for 10 min. The two parts of the PCR mixture were combined, 10 μl sample was added and then a PCR was carried out in the thermal cycler. Figures 1A and 1B show the results of the experimental approach. Without treatment with DNase and heat, a band can be seen in the negative control ( Fig. 1A, lane 4 ) that does not hybridize with the Legionella-specific oligonucleotide ( Fig. 1B, lane 4 ). If 100 fg or 10 fg of Legionella DNA is used, hybridization takes place ( Fig. 1B, lanes 2 and 3 ). Using DNase and heat, a weak band at 100 fg and 10 fg of Legionella DNA can be seen on the gel ( Fig. 1A) (lanes 5 and 6 ), while no DNA is visible on the gel in the negative control (Lane 7 ). The hybridization, however, shows that there is no significant difference in the amplification of the Legionella-specific DNA between treated and untreated Taq DNA polymerase (lanes 5 and 6 compared to lanes 2 and 3 ). Lanes 8-10 show the results after heat treatment alone (without DNase) of part B of the test batch. Here, in Fig. 1A and 1B no difference seen with the untreated test batch (lanes 2-4). These results show that treatment with DNase I and heat is able to inhibit the amplification of contaminating DNA from Taq DNA polymerase, while the amplification of Legionella-specific DNA remains unaffected.

Legende zur Abbildung:Legend for illustration:

Abb. 1. (A) Ethidiumbromidgefärbtes Polyacrylamidgel (8%) und (B) Southern Blot mit anschließender Hybridisierung. Spuren: (1) 100 bp DNA-Längenstandard; (2) 100 fg an Legionella-DNA, keine Vorbehandlung; (3) 10 fg an Legionella-DNA, keine Vorbehandlung; (4) keine DNA zugesetzt, keine Vorbehandlung; (5) 100 fg an Legionella-DNA, Vorbehandlung mit DNase und Hitze; (6) 10 fg an Legionella-DNA, Vorbehandlung mit DNase und Hitze; (7) keine DNA zugesetzt, Vorbehandlung mit DNase und Hitze; (8) 100 fg an Legionella-DNA, Vorbehandlung mit Hitze; (9) 10 fg an Legionella- DNA, Vorbehandlung mit Hitze; (10) keine DNA zugesetzt, Vorbehandlung mit Hitze. Fig. 1. (A) Ethidium bromide stained polyacrylamide gel (8%) and (B) Southern blot with subsequent hybridization. Lanes: ( 1 ) 100 bp DNA length standard; ( 2 ) 100 fg of Legionella DNA, no pretreatment; ( 3 ) 10 fg of Legionella DNA, no pretreatment; ( 4 ) no DNA added, no pretreatment; ( 5 ) 100 fg of Legionella DNA, pretreatment with DNase and heat; ( 6 ) 10 fg of Legionella DNA, pretreatment with DNase and heat; ( 7 ) no DNA added, pretreatment with DNase and heat; ( 8 ) 100 fg of Legionella DNA, pretreatment with heat; ( 9 ) 10 fg of Legionella DNA, pretreatment with heat; ( 10 ) no DNA added, pretreatment with heat.

Literaturliterature

Böttger, E. C. 1990. Frequent contamination of Taq polymerase with DNA. Clin. Chem. 36: 1258.Boettger, E.C. 1990. Frequent contamination of Taq polymerase with DNA. Clin. Chem. 36: 1258.

Mahbubani, M. H., A. K. Bej, R. Miller, L. Haff, J. DiCesare, and R. M. Atlas. 1990. Detection of Legioflella with polymerase chain reaction and gene probe methods. Mol. Cell. Probes 4: 175-187.Mahbubani, M.H., A.K. Bej, R. Miller, L. Haff, J. DiCesare, and R. M. Atlas. 1990. Detection of Legioflella with polymerase chain reaction and gene probe methods. Mol. Cell. Probes 4: 175-187.

Meier, A., D. H. Persing, M. Finken, and E. C. Böttger. 1993. Elimination of contaminating DNA within polymerase chain reaction reagents: implications for a general approach to detection of uncultured pathogens. J Clin. Microbiol. 31: 646-652.Meier, A., D.H. Persing, M. Finken, and E.C. Böttger. 1993. Elimination of contaminating DNA within polymerase chain reaction reagents: implications for a general approach to detection of uncultured pathogens. J Clin. Microbiol. 31: 646-652.

Rand, K. H., and H. Houck. 1990. Taq polymerase contains bacterial DNA of unknown origin. Mol. Cell. Probes 4: 445-450.Rand, K.H., and H. Houck. 1990. Taq polymerase contains bacterial DNA of unknown origin. Mol. Cell. Probes 4: 445-450.

Schmidt, T., B. Pace, and N. R. Pace. 1991. Detection of DNA contamination in Taq polymerase. BioTechniques 11: 176-177.Schmidt, T., B. Pace, and N.R. Pace. 1991. Detection of DNA contamination in Taq polymerase. BioTechniques 11: 176-177.

Claims (3)

1. Verfahren zur Elimination bakterieller DNA aus hitzestabiler DNA-Polymerase mittels eines DNA verdauenden Enzyms, das dadurch gekennzeichnet ist, daß eine Behandlung einer hitze­ stabilen DNA-Polymerase, insbesondere Taq-Polymerase, stattfindet unter Verwendung eines DNA-verdauenden Enzyms, insbesondere DNase I, und anschließender Inaktivierung des verdauenden Enzyms.1. A method for eliminating bacterial DNA from heat-stable DNA polymerase by means of a DNA-digesting enzyme, which is characterized in that a treatment of a heat-stable DNA polymerase, in particular Taq polymerase, takes place using a DNA-digesting enzyme, in particular DNase I , and then inactivating the digestive enzyme. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Behandlung der hitzestabilen DNA-Polymerase stattfindet im alkalischen Milieu, insbesondere pH 8-9,5, in Anwesenheit von Magnesiumchlorid.2. The method according to claim 1, characterized in that the Treatment of the heat-stable DNA polymerase takes place in the alkaline environment, especially pH 8-9.5, in the presence of Magnesium chloride. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß während der Enzymbehandlung eine Teilung der für das Verfahren der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) vorgesehenen Reaktionsansätze stattfindet dergestalt, daß die hierfür benötigte hitzestabile DNA- Polymerase der verdauenden Wirkung des Enzyms ausgesetzt ist, während die aus DNA bestehenden Primer erst nach der Reaktion mit dem verdauenden Enzym und einer Hitzeinaktivierung desselben zugesetzt werden.3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that during enzyme treatment a division of that for the process the polymerase chain reaction (PCR) reaction approaches takes place in such a way that the heat-stable DNA Polymerase is exposed to the digestive effects of the enzyme, while the primers consisting of DNA only after the reaction with the digesting enzyme and heat inactivation thereof be added.
DE4314271A 1993-04-30 1993-04-30 Method for eliminating bacterial DNA from thermally stable DNA polymerase using a DNA-digesting enzyme Withdrawn DE4314271A1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE4314271A DE4314271A1 (en) 1993-04-30 1993-04-30 Method for eliminating bacterial DNA from thermally stable DNA polymerase using a DNA-digesting enzyme

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE4314271A DE4314271A1 (en) 1993-04-30 1993-04-30 Method for eliminating bacterial DNA from thermally stable DNA polymerase using a DNA-digesting enzyme

Publications (1)

Publication Number Publication Date
DE4314271A1 true DE4314271A1 (en) 1994-11-03

Family

ID=6486832

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE4314271A Withdrawn DE4314271A1 (en) 1993-04-30 1993-04-30 Method for eliminating bacterial DNA from thermally stable DNA polymerase using a DNA-digesting enzyme

Country Status (1)

Country Link
DE (1) DE4314271A1 (en)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999007887A2 (en) * 1997-08-06 1999-02-18 Norwegian Institute Of Fisheries And Aquaculture Ltd. A method of removing nucleic acid contamination in amplification reactions

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999007887A2 (en) * 1997-08-06 1999-02-18 Norwegian Institute Of Fisheries And Aquaculture Ltd. A method of removing nucleic acid contamination in amplification reactions
WO1999007887A3 (en) * 1997-08-06 1999-04-29 Norwegian Inst Of Fisheries An A method of removing nucleic acid contamination in amplification reactions
US6541204B2 (en) 1997-08-06 2003-04-01 Norwegian Institute Of Fisheries & Aquaculture Ltd. Method of removing nucleic acid contamination in amplification reactions

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69022291T2 (en) Process for controlling contamination of nucleic acid amplification.
DE3486467T3 (en) Methods for the detection, identification and quantification of organisms and viruses
DE60034878T2 (en) A method of amplifying a nucleic acid sequence using a chimeric primer
AT402203B (en) METHOD FOR TRANSCRIPTION-FREE AMPLIFICATION OF NUCLEIC ACIDS
DE69233041T2 (en) Treatment of amplified DNA with alkaline phosphatase
DE69030131T2 (en) Generation of specific probes against target nucleotide sequences
DE60029927T2 (en) THERMOSTASTIC ENZYME INCREASING THE ACCURACY OF THERMOSTATIC DNA POLYMERASES - TO IMPROVE IN VITRO NUCLEIC ACID SYNTHESIS AND AMPLIFICATION
DE69833160T2 (en) Amplification and detection of HIV-1 and / or HIV-2
EP1082465A2 (en) Method for detecting microorganisms in products
EP1711600B1 (en) Mutated dna polymerases with increased mispairing discrimination
DE69024286T2 (en) Procedure for checking the contamination of oligonucleotide-dependent nucleic acid amplification reactions
US5654144A (en) Detection of Yersinia using the polymerase chain reaction
US20210324453A1 (en) Detection of bacterial (mollicuties) contamination
EP0865488B1 (en) Thermolabile uracil-dna-glycosylase, process for its preparation and use for removing uracil from dna
DE10214232A1 (en) Method and device for DNA methylation analysis
WO2016005768A1 (en) Method and kit of detecting the absence of micro-organisms
DE10236406C1 (en) Method for the amplification of nucleic acids of low complexity
DE4314271A1 (en) Method for eliminating bacterial DNA from thermally stable DNA polymerase using a DNA-digesting enzyme
US11124843B2 (en) Method and kit for detecting bacteria of genus nitrobacter
WO2007137701A1 (en) Mutated dna polymerase with increased reverse transcriptase activity
Sharma et al. Reliability of nested polymerase chain reaction in the diagnosis of bacterial endophthalmitis
DE69833864T2 (en) METHODS FOR DNA REPRODUCTION AND MATERIALS FOR THIS
Goodfellow et al. Polynucleotide sequence divergence among some coagulase-negative staphylococci
Goldenberger Detection of bacterial pathogens in clinical specimens by broad-range PCR amplification and direct sequencing of part of the 16S rRNA gene
DE60029351T2 (en) Single-stranded oligonucleotides, probes, primers and a method for the detection of biochrons

Legal Events

Date Code Title Description
8127 New person/name/address of the applicant

Owner name: MAIWALD, MATTHIAS, PRIV.-DOZ. DR.MED., 69429 WALDB

8110 Request for examination paragraph 44
8125 Change of the main classification

Ipc: C12N 9/10

8139 Disposal/non-payment of the annual fee