DE4306586A1 - Verfahren zur photometrischen Erfassung einer Agglutinationsreaktion - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur photometrischen Erfassung einer Partikelagglutination aufgrund einer Antigen-Antikörper­ reaktion in einer Probe, die durchleuchtet und deren Lichtdurch­ lässigkeit gemessen wird.

Agglutinationsuntersuchungen an Erythrozyten werden für Blut­ gruppenbestimmungen und Blutverträglichkeitsproben durchgeführt. Auch werden zum Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit von Anti­ körpern oder Antigenen in Körperflüssigkeiten, z. B. Blutserum, Urin, cerebrospinaler Flüssigkeit o. ä., nach dem Stand der Technik immunochemische Agglutinationstests durchgeführt. Nach der sog. indirekten Methode wird die klinische Probe in geeigneter Ver­ dünnung mit einem Agglutinationsreagenz versetzt, das feinteilige Partikel enthält, an die für den Antikörpernachweis ein Antigen und für den Antigennachweis ein Antikörper gebunden ist. Unter der immunochemischen Antigen-Antikörperreaktion agglutinieren die Partikel.

Immunochemische Agglutinationstests werden überlicherweise durchge­ führt, indem man das Agglutinationsreagenz und die Körperflüssig­ keit auf einen Objektträger oder in einem Röhrchen reagieren läßt und die stattfindende oder auch nicht stattfindende Agglutination mit dem unbewaffneten Auge verfolgt und bewertet. Das ermöglicht nur einen qualitativen Nachweis, der von subjektiven Einflüssen nicht frei ist; man denke nur an die Sehschärfe der den Test durch­ führenden Person.

Es gibt eine Reihe von Vorschlägen, Agglutinationsreaktionen ob­ jektiv zu erfassen, und zwar vorwiegend nach photometrischen Ver­ fahren. Bildverarbeitungstechniken seien daneben erwähnt (vgl. die DE-A 40 40 726).

Der DE-A-29 18 342, DE-A-34 38 256 und DE-A-35 31 891 sind nephelo­ metrische Messungen zu entnehmen, bei denen die Intensität oder die Intensitätsschwankungen des von einer Probe gestreuten Lichts erfaßt werden. In der Beschreibungseinleitung der DE-A-34 38 265 ist eine in Transmission stattfindende spektralphotometrische Messung behandelt. Die DE-A-30 33 869 geht von dem Stand der Technik der US-A-38 83 308 aus, nach dem eine Opazitätsmessung in Transmission vorgesehen ist. Die Probe wird in einem Reaktions­ gefäß mit einem gewölbten Boden zentrifugiert und anschließend wieder aufgeschüttet. An zwei Meßpunkten in der Bodenmitte und am Rand des Bodens wird Licht eingestrahlt und die Intensität des durch die Probe hindurchtretenden Lichts erfaßt. Agglutinierende Partikel sedimentieren zur Mitte des gewölbten Bodens hin. Eine Verringerung der Lichtdurchlässigkeit in der Mitte bei gleich­ zeitiger Vergrößerung der Lichtdurchlässigkeit am Rand kann daher als Vorliegen von Agglutination interpretiert werden.

Mit dem Verfahren der US-A-38 83 308 einhergehende Referenz­ eichungs- und Streulichtprobleme sind in der DE-A-30 33 869 zu­ treffend behandelt. Überdies wird die Aussagekraft des Ergebnisses dadurch eingeschränkt, daß nicht die Agglutinationsreaktion selbst, sondern ein sekundärer Sedimentationsvorgang agglutinierter Par­ tikel photometrisch erfaßt wird.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur photometrischen Erfassung einer Partikelagglutination aufgrund einer Antigen-Anti­ körperreaktion zu schaffen, das sich einfach, schnell, mit einer großen Zahl von Proben und weitgehend automatisch durchführen läßt, qualitative und quantitative Antikörper- oder Antigenbestimmungen gleichermaßen gestattet und ein von subjektiven Einflüssen freies, hochsignifikantes Ergebnis liefert.

Diese Aufgabe wird mit einem Verfahren der eingangs genannten Art dadurch gelöst, daß man die Lichtdurchlässigkeit der Probe we­ nigstens zweimal in zeitlichem Abstand mißt, die Meßergebnisse vergleicht und so durch die Agglutinationsreaktion bedingte Ände­ rungen in der Lichtdurchlässigkeit der Probe erfaßt.

Erfindungsgemäß wird mit Messungen zu Beginn, während oder auch gegen Ende der Reaktionszeit der reaktionskinetische Einfluß der Agglutinationsreaktion auf die Lichtdurchlässigkeit der Probe in Transmission photometrisch erfaßt. Man erhält so mit geringem appa­ rativem Aufwand in kurzer Meßzeit ein hochsignifikantes Ergebnis. Der Vergleich von zwei an ein und derselben Probe gewonnenen Meßer­ gebnissen für die Lichtdurchlässigkeit macht das erfindungsgemäße Verfahren unempfindlich gegen Fehler, die durch Eigenfärbung der Probe, Variationen in der durchleuchteten Probenschichtdicke z. B. aufgrund ungenauer Mengendosierung, kleine optische Fehler des Reaktionsgefäßes u. a. eintreten können.

Es versteht sich, daß die Probe in einer Schichtdicke und Ver­ dünnung vorliegen muß, die ein Hindurchtreten von Licht ermöglicht und bei der eine Agglutinationsreaktion eine merkliche Änderung in der Lichtdurchlässigkeit bewirkt.

Zwei ist die Mindestzahl von Messungen. Wohlgemerkt können in zeit­ lichem Abstand auch mehr als zwei Messungen durchgeführt und die Meßergebnisse verglichen werden. Zweipunktkinetik-Bestimmungen und Mehrpunktkinetik-Bestimmungen während der Reaktionszeit der Agglutinationsreaktion sind ebenso möglich wie Endpunktbe­ stimmungen, bei denen man eine Messung der Lichtdurchlässigkeit im wesentlichen nach Verstreichen der Reaktionszeit vornimmt.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann an einer Probe durchgeführt werden, die sich in einer Küvette befindet. Die Küvette wird vor­ zugsweise von der Seite durchleuchtet, insbesondere in einer hori­ zontalen Zeile, entlang einer Z-förmigen Bahn o. ä.

In einer bevorzugten Variante wird das erfindungsgemäße Verfahren mit Proben durchgeführt, die sich auf einer Mikrotiterplatte be­ finden. Dabei empfiehlt es sich, die Mikrotiterplatte quer zu ihrer Hauptebene zu durchleuchten, d. h. von oben nach unten oder von unten nach oben. Auf der Mikrotiterplatte können schnell eine Viel­ zahl von Proben bearbeitet werden, und es ist eine weitgehende Automatisierung des Meßablaufs möglich. Durch Vorlegen ver­ schiedener Reagenzien können an ein und derselben Mikrotiterplatte verschiedene infektionsserologische Parameter untersucht werden. Entsprechend präparierte Mikrotiterplatten können industriell oder im Laborbetrieb hergestellt, in tiefgefrorenem Zustand längere Zeit aufbewahrt und bei Bedarf schnell aufgetaut werden.

Die Beschickung der Mikrotiterplatte wird vorzugsweise mit einer Mehrkanalpipette, insbesondere einer 96-Kanalpipette, durchgeführt. Das ermöglicht einen schnellen, weitgehend automatisierbaren Ar­ beitsablauf. Wohlgemerkt kann die Beschickung der Mikrotiterplatte auch in anderer Weise erfolgen, insbesondere durch herkömmliches Pipettieren oder mittels eines Pipettierroboters.

Gemäß einer bevorzugten Variante der Erfindung wird eine jede der in zeitlichem Abstand stattfindenden Lichtdurchlässigkeitsmessungen an mehreren voneinander versetzten Meßstellen durchgeführt. Dazu wird ein geeignetes Raster von Meßstellen über die Probe gelegt. Vorzugsweise erfolgt eine Messung an ca. 10 bis ca. 50, insbe­ sondere ca. 20 Meßstellen, die zweidimensional, z. B. in einem quadratischen Raster, mäanderförmig oder längs der Kanten eines Dreiecks über die Probenfläche verteilt, aber auch im wesentlichen äquidistant auf einer über die Probe sich erstreckenden linearen Zeile liegen können. In einer bevorzugten Variante wird die Licht­ durchlässigkeit an Zeilen von Meßstellen gemessen, die sich parallel zu Reihen oder Spalten von Mikrotiterplattenkavitäten und im wesentlichen diametral über eine jede Kavität erstrecken. Eine Mikrotiterplatte kann so in durchgehender Bewegung schnell und mit hoher Meßgenauigkeit durchgescant werden. Pro Kavität sollen ca. 10 bis ca. 50, vorzugsweise ca. 20 Meßstellen in die Auswertung einbezogen werden. Es wird so jeweils ein großer Teil der Probe erfaßt, was der Aussagekraft des Ergebnisses zugute kommt. Geometrische Effekte, insbesondere Prismeneffekte am Rand, Variationen in der durchleuchteten Probenschichtdicke, Streulicht­ effekte, kleine optische Fehler des Reaktionsgefäßes usw. werden im Mittel eliminiert.

Ein geeignetes Maß für die Lichtdurchlässigkeit der Probe ist die Intensität des hindurchtretenden Lichts.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann mit Erythrozyten eines Pro­ banden und einem Antiserum zur Blutgruppenbestimmung durchgeführt werden. Ebenso besteht die Möglichkeit, das Verfahren mit Blutserum eines Probanden und Erythrozyten bekannter Antigeneigenschaft durchzuführen. Legt man beispielsweise ein Serum Anti A vor, das für die Blutgruppe A charakteristische Antikörper enthält, so zeigen Erythrozyten mit der Antigeneigenschaft A, die aus Blut der Blutgruppe A stammen, eine Agglutination, die wie vorstehend beschrieben nachgewiesen wird. Das Ergebnis kann durch eine Gegen­ probe mit Blutserum des Probanden und Erythrozyten der Antigen­ eigenschaft A abgesichert werden. Bei der Serumgegenprobe darf keine Agglutination auftreten, es sei denn, es liegt der seltene Fall einer Autoimmunkrankheit (Autoaggressionskrankheit) vor.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch mit Erythrozyten eines Probanden und Blutserum eines anderen Porbanden durchgeführt werden. Mit solchen Kreuzproben werden Blutverträglichkeitsunter­ suchungen durchgeführt. Eine wie vorstehend beschrieben nachge­ wiesene Agglutination der Erythrozyten zeigt eine bestehende Unver­ träglichkeit an.

In einer weiteren Variante wird das erfindungsgemäße Verfahren mit einem immunochemischen Agglutinationsreagenz und einer Körper­ flüssigkeit, insbesonders Blutserum, durchgeführt. Vorzugsweise wird ein Agglutinationsreagenz auf Latexbasis verwendet. Typische Latex-Agglutinationsreagenzien sind milchig trüb. Kommt es unter der Antigen-Antikörperreaktion zu einer Agglutination, so klart die Probe auf, und die Intensität des hindurchtretenden Lichts steigt an. Wird während der potentiellen Reaktionszeit der Agglu­ tinationsreaktion anfangs ein niedriger und später ein signifikant höherer Intensitätswert des durch die Probe hindurchtretenden Lichts festgestellt, so ist das ein Zeichen dafür, daß eine Agglu­ tinationsreaktion stattgefunden hat. Tritt hingegen keine Agglu­ tination ein, weil der nachzuweisende Antikörper bzw. das nachzu­ weisende Antigen in der Probe nicht vorhanden ist, so bleibt die Intensität des durch die Probe hindurchtretenden Lichts im wesent­ lichen konstant.

Man kann zunächst ein immunochemisches Agglutinationsreagenz in die Kavität einer Mikrotiterplatte einbringen, Körperflüssigkeit, insbesondere Blutserum, dazugeben, erforderlichenfalls für eine gute Durchmischung von Reagenz und Körperflüssigkeit sorgen und eine erste Messung der Lichtdurchlässigkeit und nach einiger Zeit eine zweite Messung der Lichtdurchlässigkeit durchführen.

Es besteht aber auch die Möglichkeit, zunächst Körperflüssigkeit, insbesondere Blutserum, in die Kavität einer Mikrotiterplatte ein­ zubringen, immunochemisches Agglutinationsreagenz dazuzugeben, erforderlichenfalls für eine gute Durchmischung von Körperflüssig­ keit und Reagenz zu sorgen und eine erste Messung der Lichtdurch­ lässigkeit und nach einiger Zeit eine zweite Messung der Licht­ durchlässigkeit durchzuführen.

Schließlich kann man auch Körperflüssigkeit, insbesondere Blut­ serum, mit einer Pipette aufnehmen, gegebenenfalls weiter ein Ver­ dünnungsreagenz mit der Pipette aufnehmen, weiter ein immuno­ chemisches Agglutinationsreagenz mit der Pipette aufnehmen, alles zusammen in die Kavität einer Mikrotiterplatte einbringen, er­ forderlichenfalls für eine gute Durchmischung sorgen und eine erste Messung der Lichtdurchlässigkeit und nach einiger Zeit eine zweite Messung der Lichtdurchlässigkeit durchführen. Blutserum und Agglu­ tinationsreagenz können auch in umgekehrter Reihenfolge aufgenommen werden.

Bei Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens an einer Probe, die sich in einer Küvette befindet, wird letztere vor den Messungen der Lichtdurchlässigkeit vorzugsweise geschwenkt, in verschlossenem Zustand auf den Kopf und wieder zurück gestellt o. ä. Bei Durch­ führung des Verfahrens an einer Probe, die sich auf einer Mikro­ titerplatte befindet, empfiehlt es sich, die Mikrotiterplatte vor den Messungen der Lichtdurchlässigkeit zu rütteln oder zu schwenken. Dadurch wird eine innige Durchmischung erreicht und einem Absetzen agglutinierter Partikel entgegengewirkt, die wieder in den Schwebezustand überführt werden, was die Aussagekraft der Messung verbessert. Die Mikrotiterplatte kann die ganze Zeit zwischen den Messungen gerüttelt und/oder geschwenkt werden. Es besteht aber auch die Möglichkeit, die Mikrotiterplatte in Inter­ vallen zu rütteln und/oder zu schwenken, insbesondere zwischen aufeinanderfolgenden Messungen eine Zeitlang stehen zu lassen und unmittelbar vor der späteren Messung wieder zu rütteln und/oder zu schwenken. Das optimale Vorgehen hängt von den Reagenzien ab, mit denen die Agglutinationsmessung durchgeführt wird. Bei Messungen an Agglutinationsreagenzien mit kleinen und/oder leichten Partikeln, die mit schwacher Bindungskapazität agglutinieren, empfiehlt sich ein ständiges Rütteln und/oder Schwenken, da die Partikel so besser in einem reaktionssensiblen Schwebezustand ge­ halten werden können. Bei einem starken Aufschütteln sedimentierter Partikel besteht hier eher die Gefahr, die Antigen-Antikörperbindung aufzubrechen. Bei Messungen an Erythrozyten empfiehlt sich eher ein intervallweises Rütteln und/oder Schwenken, da die Erythrozyten mit starker Bindungskapazität agglu­ tinieren, die Antigen-Antikörperbindung entsprechend schwerer wieder aufzubrechen ist und die Erythrozyten leichter sedimen­ tieren.

Durch das Rütteln können Artefakte entstehen, d. h. Partikelan­ sammlungen in durch die Geometrie der Rüttelbewegung bestimmten Probezonen, die eine Agglutination vortäuschen. Man begegnet dem wirkungsvoll dadurch, daß man die Mikrotiterplatte in linearer oder vorzugsweise kreisender Bewegung rüttelt und diesem Rütteln ein wippendes Auf- und Niederschwenken in einer oder zwei zuein­ ander senkrechten Richtungen überlagert, die Mikrotiterplatte also eine Taumelbewegung durchführen läßt.

Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Verfahren mit einer als "Reader" bekannten Vorrichtung zur Messung des optischen Extink­ tionskoeffizienten von auf einer Mikrotiterplatte befindlichen Proben durchgeführt. Für die nachstehend beschriebenen Versuche kamen Reader von Typ Spectra I, II und III oder ATTC der Firma SLT Lab Instrument zum Einsatz. Die Messungen erfolgten in einem Lichtwellenlängenbereich von 340 nm bis 620 nm. Für die Messung an Erythrozyten empfehlen sich Lichtwellenlängen mehr im Blauen (z. B. 405 nm), und für Messungen an Latex-Agglutinationsreagenzien Lichtwellenlängen mehr im Roten (z. B. 620 nm).

1. Versuch

Es wird ein Versuch zum Nachweis von Cytomegalievirus (CMV)-Anti­ körpern im Blutserum einer Anzahl Probanden durchgeführt. Die ver­ wendeten Reagenzen entstammen dem Sortiment CMVSCAN® der Firma Becton Dickinson. Hauptreagenz ist ein passives (indirektes) Latex­ agglutinationsreagenz, das mit CMV-Antigen belegte mikroskopische Latexpartikel in einer Pufferflüssigkeit enthält. Das Latexagglu­ tinationsreagenz wird herkömmlicherweise für einen Kartentest ver­ wendet, bei dem das Latexagglutinationsreagenz mit einer Serumprobe auf einer Karte vermischt und die stattfindende bzw. nicht statt­ findende Agglutination mit dem unbewaffneten Auge festgestellt wird. Als Referenz enthält das Sortiment CMVSCAN® ein stark reaktives Kontrollserum (++Ktr), ein mittel reaktives Kontrollserum (+Ktr) und ein nicht reaktives Kontrollserum (-Ktr).

Eine Mikrotiterplatte hat sechsundneunzig kreisrunde Kavitäten im Raster acht mal zwölf. In Tabelle 1 sind die Zeilen der Mikro­ titerplatte mit den Buchstaben A bis H und ihre Spalten mit den Ziffern 1 bis 12 bezeichnet. Einzelne Kavitäten werden mit ihren Zeilen- und Spaltenkoordinaten bezeichnet.

Auf einer ersten Mikrotiterplatte wird in den Kavitäten A1 und B1 das nicht reaktive Kontrollserum (-Ktr), in den Kavitäten C1 und D1 das mittel reaktive Kontrollserum (+Ktr) und in den Kavi­ täten E1 und F1 das stark reaktive Kontrollserum (++Ktr) vorgelegt. Alle anderen Kavitäten werden in geeigneter Verdünnung, die der Verdünnung der Kontrollseren entspricht, mit Blutserumproben ver­ schiedener Probanden beschickt. Das geschieht mit einem Pipettier­ roboter.

Auf eine zweite Mikrotiterplatte wird mit einer 96-Kanalpipette das Latexagglutinationsreagenz aufpipettiert. Sodann werden mit der 96-Kanalpipette sechsundneunzig Serumproben von der ersten Mikrotiterplatte auf die zweite Mikrotiterplatte pipettiert.

Die zweite Mikrotiterplatte wird ca. 1 min stark gerüttelt und dann in einen Reader vom Typ Spectra II der Firma SLT Lab Instru­ ment gestellt. Mit dem Reader wird die Mikrotiterplatte zeilenweise gescant und der optische Transmissionsgrad der Proben in den Kavi­ täten gemessen. Pro Kavität sind auf einer Rasterzeile, die sich diametral über die Kavität erstreckt, vierzig äquidistante Meß­ stellen vorgesehen. Der Scan folgt den Kavitätenzeilen. Die Meß­ werte für den Transmissionsgrad werden gespeichert.

Sodann wird die zweite Mikrotiterplatte aus dem Reader genommen, ca. 15 min gerüttelt und geschwenkt und erneut in den Reader ge­ stellt, wo die Messung des optischen Transmissionsgrads wiederholt wird. Auch die Meßwerte der zweiten Messung werden gespeichert.

Zur Auswertung werden die Meßwerte der ersten und zweiten Messung miteinander verglichen. Das kann auf verschiedene Weise geschehen, beispielsweise einzeln für die Meßwerte an einer jeden Meßstelle einer Kavität, oder unter Bildung von Mittelwerten der Meßwerte der ersten und zweiten Messung an einer Kavität. Eine Differenz- und Quotientenbildung der Werte ist ebenso möglich wie eine Be­ rechnung von OD-Werten oder ΔE/t-Werten (Änderung Δ des Extink­ tionskoeffizienten E pro Zeit t).

Bei einer exemplarischen Auswertung wurden für eine jede Kavität die Transmissionsgrad-Meßwerte an den zwanzig mittleren Meßstellen herausgegriffen, der Mittelwert der Transmissionsgrad-Meßwerte der ersten und zweiten Messung gebildet und der Mittelwert der zweiten Messung durch den Mittelwert der ersten Messung dividiert. Die erhaltenen Ratio-Werte sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. Sie sind mit (-) für negativ, (+) für positiv und (?) für fraglich bewertet. Die Transmissionsgrad-Meßwerte der randnahen zehn Meß­ stellen beidseits der mittleren 20 Meßstellen wurden nicht in die Auswertung einbezogen, da sie eher einer Verfälschung durch geo­ metrische Effekte, Streulicht usw. unterliegen.

Stattgefundene Agglutination zeigt sich in einer signifikanten Erhöhung des optischen Transmissionsgrads von der ersten zur zweiten Messung. Ratio-Werte von 1,07 bzw. 1,04, wie sie das nicht reaktive Kontrollserum (-Ktr) in Kavität A1 und A2 zeigt, sind nicht signifikant. Ein Ratio-Wert von 1,11 in Kavität H2 ist im Ergebnis als fraglich zu betrachten. Ratio-Werte von 1,2 und mehr sind signifikant für einen positiven Nachweis von CMV-Antikörpern.

Die einzelnen gemessenen Transmissionsgrade sind für die Kavitäten AI (nicht reaktives Kontrollserum -Ktr), A12 (Serumprobe negativ), B3 (Serumprobe schwach positiv), D1 (mittel reaktives Kontrollserum +Ktr), D8 (Serumprobe stark positiv) und H2 (Serumprobe fraglich) in Fig. 1 bis Fig. 6 dargestellt. Eine zusammenfassende Darstellung der Meßergebnisse an allen Kavitäten gibt Fig. 7.

Die Auswertung der Meßergebnisse ist durch Warnfunktionen ge­ sichert. Ist der gemessene Transmissionsgrad einer Probe absolut zu gering, so wird das Serum als möglicherweise lipämisch gekenn­ zeichnet. Auch kann in diesem Fall zuviel Reagenz vorgelegt worden sein, so daß die zu durchleuchtende Probenschichtdicke zu groß ist, oder ein Fehler in der Verdünnung vorliegen. Ist der gemessene Transmissionsgrad absolute zu hoch, so mag fehlerhafterweise kein Serum und/oder kein Agglutinationsreagenz vorgelegt worden oder die Inkubationszeit vor der ersten Messung überschritten sein. Ein absolut zu hoher oder zu niedriger Ratio-Wert kann das Vor­ handensein einer Luftblase bei einer der Messungen oder eine Über­ reaktion anzeigen.

Die gemessenen Ratio-Werte des Transmissionsgrads unterliegen auf­ grund chargenbedingter Änderungen in der Zusammensetzung des Latex­ agglutinationsreagenz, aufgrund des Einflusses des Rüttelns, auf­ grund optischer Effekte u. a. gewissen Schwankungen. Ihre Bewertung wird daher durch die Messung an den Kontrollseren abgesichert. Insbesondere kann die Signifikanzbewertung dem Ratio-Werte anhand des Meßergebnisses an dem nicht reaktiven Kontrollserum (-Ktr) vorgenommen werden, was beim Rütteln entstehende Artefakte, Un­ regelmäßigkeiten im Rüttelvorgang u. a. zu erkennen ermöglicht. Wird beispielsweise bei einer Messung an dem nicht reaktiven Kon­ trollserum (-Ktr) ein Ratio-Wert von 1,15 festgestellt, so werden erst Ratio-Werte ab z. B. 1,2 als fraglich und ab z. B. 1,25 als positiv bewertet. Zur Schwellwertsetzung der Fraglichkeit und posi­ tiven Bewertung kann auf den Ratio-Wert des nichtreaktiven Kontroll­ serums (-Ktr) ein fester Betrag aufaddiert werden. Alternativ kann bei der Schwellwertsetzung die Streuung der (-Ktr)-Ratio-Werte nach statistischen oder empirischen Methoden berücksichtigt werden. Mit dem mittel reaktiven (+Ktr) und stark reaktiven Kontrollserum (++Ktr) wird die Reaktivität des Agglutinationsreagenz und das Einhalten ordnungsgemäßer Meßbedingungen kontrolliert.

Zur Überprüfung des Versuchsergebnisses wurde mit den auf der ersten Mikrotiterplatte vorgelegten Proben ein ELISA-Test (Enzyme- Linked Immuno Sorbent Assay) durchgeführt, der als klassischer Nachweis von CMV-Antikörpern gelten kann. Das Ergebnis des ELISA- Tests stimmte für 94 der 96 Kavitäten mit dem des Agglutinations­ tests überein. In den beiden abweichenden Fällen war das Ergebnis des ELISA-Tests negativ und das des Agglutinationstests schwach positiv. Zu erklären ist das durch die etwas höhere Empfindlichkeit des Agglutinationstests; vgl. Versuch 2.

Versuch 2

Nicht reaktives (-Ktr), mittel reaktives (+Ktr) und stark reaktives (++Ktr) Kontrollserum wird auf einer Mikrotiterplatte in Titer­ stufen von 1/2 heruntertitriert und mit den Proben die zuvor be­ schriebene Messung durchgeführt. Zeile A in Tabelle 2 enthält die von Kavität 1 in Kavität 2, von Kavität 2 in Kavität 3 usw. heruntertitrierten Proben des nicht reaktiven Kontrollserums (-Ktr), Zeile C die genauso heruntertitrierten Proben des mittel reaktiven Kontrollserums (+Ktr) und Zeile E die genauso herun­ tertitrierten Proben des stark reaktiven Kontrollserums (++Ktr). In den Zeilen C und E halbiert sich also die Konzentration der CMV-Antikörper von Kavität zu Nachbarkavität. Die Kavitäten der Zeilen B, D, F, G und H sind leer.

Die gemessenen Ratio-Werte des Transmissionsgrads sind in Tabelle 2 angeführt und in Fig. 8 dargestellt. Das mittel reaktive Kon­ trollserum (+Ktr) läßt sich über 4 bis 5 und das stark reaktive Kontrollserum (++Ktr) über 8 Titerstufen nachweisen. Das stark reaktive Kontrollserum (++Ktr) zeigt dabei in den niedrigen Titer­ stufen ein ausgeprägtes Prozonen-Phänomen (Heidelberger Kurve).

Zur Überprüfung wurde mit den Proben ein ELISA-Test durchgeführt. Der Agglutinationstest erwies sich gegenüber dem ELISA-Test als 1 bis 2 Titerstufen empfindlicher. Abgesehen von der so nachge­ wiesenen hohen Sensitivität des erfindungsgemäßen Verfahrens ist damit die Möglichkeit aufgezeigt, routinemäßig mit einem ent­ sprechend verdünnten Latexagglutinationsreagenz zu arbeiten, was aus Kostengründen bevorzugt ist.

Versuch 2 belegt die Möglichkeit, nicht nur qualitative, sondern auch quantitative Messungen hoher Genauigkeit mit dem erfindungsge­ mäßen Agglutinationsverfahren durchzuführen, d. h. Konzentrationen von Antikörpern oder Antigenen zu bestimmen, was für die Beur­ teilung von Stärke und Verlauf einer Infektion, die Erkennung einer Serumnarbe u. a. von Bedeutung ist. Hierzu wird mit einem Standard­ serum bekannter Konzentration eine Fig. 8 entsprechende Eichkurve oder ein Umrechnungsfaktor gewonnen, die eine Umrechnung in Konzen­ trationswerte ermöglichen.

Verglichen mit ELISA-Tests ist der erfindungsgemäße Agglutinations­ test schneller, in der Durchführung einfacher und vom apparativen Aufwand und den eingesetzten Reagenzien her unaufwendiger. Die Reagenzien sind billiger und lassen sich einfacher handhaben. Es entfallen umweltbelastende Reagenzien wie z. B. Chromogenlösung (z. B. Tetramethylbenzidin-Dihydrochlorid) und Stopplösung H₂SO₄. Auch läßt sich der Agglutinationstest leichter automatisieren.

Die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahren unter Einsatz eines Latexagglutinationsreagenz hat exemplarischen Charakter. Es können auch andere Reagenzien mit Partikeln verwendet werden, die ein Antigen oder einen Antikörper zu binden vermögen und unter einer Antigen-Antikörperreaktion agglutinieren, z. B. Glasperlen, Polybutadien, Polystyrol, Butadien-Styrol-Copolymerisate, Kohle­ partikel, Erythrozyten u. a. Die Partikel sollten eine Größe und ein Gewicht haben, so daß sie weitgehend in einem Schwebezustand gehalten werden können, d. h. vorzugsweise klein und leicht sein. Es kann, wie beschrieben, Agglutinationsreagenz vorgelegt und Kör­ perflüssigkeit, insbesondere Blutserum, dazugegeben werden, aber auch umgekehrt Körperflüssigkeit, insbesondere Blutserum, vorgelegt und Agglutinationsreagenz dazugegeben werden. Eine gleichzeitige Aufgabe ist ebenfalls möglich. Das Rütteln und/oder Schwenken der Mikrotiterplatte sind vorteilhaft, für die Erfindung aber nicht immer zwingend. Die Messung der Lichtdurchlässigkeit kann mehr als zweimal in zeitlichem Abstand durchgeführt werden (Agglu­ tionationszweipunktkinetik oder Agglutinationsmehrpunktkinetik oder Agglutinationsendpunktbestimmung). Hinzuweisen ist schließlich auch noch einmal auf die Möglichkeit, Agglutinationsuntersuchungen an Erythrozyten menschlichen Ursprungs mit bestimmten Antigen-Anti­ körpereigenschaften durchtuführen, insbesondere für Blutgruppenbe­ stimmungen und Kreuzproben.

Tabelle 1

Tabelle 2

Claims (23)

1. Verfahren zur photometrischen Erfassung einer Partikelagglu­ tination aufgrund einer Antigen-Antikörperreaktion in einer Probe, die durchleuchtet und deren Lichtdurchlässigkeit ge­ messen wird, dadurch gekennzeichnet, daß man die Lichtdurch­ lässigkeit der Probe wenigstens zweimal in zeitlichem Abstand mißt, die Meßergebnisse vergleicht und so durch die Agglu­ tinationsreaktion bedingte Änderungen in der Lichtdurchlässig­ keit der Probe erfaßt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man es an einer Probe durchführt, die sich in einer Küvette be­ findet, und vorzugsweise die Küvette von der Seite durch­ leuchtet, insbesondere in einer horizontalen Zeile, entlang einer Z-förmigen Bahn o. ä.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man es an einer Probe durchführt, die sich auf einer Mikrotiter­ platte befindet, und vorzugsweise die Mikrotiterplatte quer zu ihrer Hauptebene durchleuchtet.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Beschickung der Mikrotiterplatte mit einer Mehrkanal­ pipette, vorzugsweise 96-Kanalpipette, durchführt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man die Lichtdurchlässigkeit der Probe an mehreren voneinander versetzten Meßstellen mißt, insbesondere an ca. 10 bis ca. 50 Meßstellen, vorzugsweise an ca. 20 Meß­ stellen.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man die Lichtdurchlässigkeit der Probe an zwei­ dimensional, z. B. in einem quadratischen Raster, mäander­ förmig oder längs der Kanten eines Dreiecks über die Proben­ fläche verteilten Meßstellen mißt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man die Lichtdurchlässigkeit der Probe an Meß­ stellen mißt, die vorzugsweise im wesentlichen äquidistant auf einer über die Probe sich erstreckenden linearen Zeile liegen.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man die Lichtdurchlässigkeit an Zeilen von Meßstellen mißt, die sich parallel zu Reihen oder Spalten von Mikrotiterplatten­ kavitäten im wesentlichen diametral über eine jede Kavität erstrecken.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man die Intensität des durch die Probe hindurch­ tretenden Lichts mißt.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man es mit Erythrozyten eines Probanden und einem Antiserum zur Blutgruppenbestimmung durchführt.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man es mit Blutserum eines Probanden und Ery­ throzyten bekannter Antigeneigenschaft durchführt.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man es mit Erythrozyten eines Probanden und Blutserum eines anderen Probanden durchführt.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man es mit einem immunochemischen Agglu­ tinationsreagenz und einer Körperflüssigkeit, insbesondere Blutserum, durchführt.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Agglutinationsreagenz auf Latexbasis verwendet.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man das Aufklaren der Probe erfaßt.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man ein immunochemisches Agglutinationsreagenz in die Kavität einer Mikrotiterplatte einbringt, Körper­ flüssigkeit, insbesondere Blutserum, dazugibt, erforderlichen­ falls für eine gute Durchmischung von Reagenz und Körper­ flüssigkeit sorgt und eine erste Messung der Lichtdurchlässig­ keit und nach einiger Zeit eine zweite Messung der Lichtdurch­ lässigkeit durchführt.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man Körperflüssigkeit, insbesondere Blutserum, in die Kavität einer Mikrotiterplatte einbringt, ein immuno­ chemisches Agglutinationsreagenz dazugibt, erforderlichenfalls für eine gute Durchmischung von Körperflüssigkeit und Reagenz sorgt und eine erste Messung der Lichtdurchlässigkeit und nach einiger Zeit eine zweite Messung der Lichtdurchlässigkeit durchführt.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man Körperflüssigkeit, insbesondere Blutserum, mit einer Pipette aufnimmt, gegebenenfalls weiter ein Ver­ dünnungsreagenz mit der Pipette aufnimmt, weiter ein immuno­ chemisches Agglutinationsreagenz mit der Pipette aufnimmt, alles zusammen in die Kavität einer Mikrotiterplatte ein­ bringt, erforderlichenfalls für eine gute Durchmischung sorgt und eine erste Messung der Lichtdurchlässigkeit und nach einiger Zeit eine zweite Messung der Lichtdurchlässigkeit durchführt.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man ein immunochemisches Agglutinationsreagenz mit einer Pipette aufnimmt, gegebenenfalls weiter ein Ver­ dünnungsreagenz mit der Pipette aufnimmt, weiter Körper­ flüssigkeit, insbesondere Blutserum, mit der Pipette aufnimmt, alles zusammen in die Kavität einer Mikrotiterplatte ein­ bringt, erforderlichenfalls für eine gute Durchmischung sorgt und eine erste Messung der Lichtdurchlässigkeit und nach eini­ ger Zeit eine zweite Messung der Lichtdurchlässigkeit durch­ führt.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man die Küvette vor den Messungen der Licht­ durchlässigkeit schwenkt, die verschlossene Küvette auf den Kopf und wieder zurück stellt o. ä.

21. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man die Mikrotiterplatte ständig oder in Inter­ vallen insbesondere vor den Messungen der Lichtdurchlässigkeit rüttelt und/oder schwenkt.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man die Mikrotiterplatte in linearer oder vor­ zugsweise kreisender Bewegung rüttelt und diesem Rütteln ein wippendes Auf- und Niederschwenken in einer oder zwei zu­ einander senkrechten Richtungen überlagert.

23. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man die Messung der Lichtdurchlässigkeit mit einem Reader durchführt.