DE4300723A1 - Gerät zur Messung der Fluoreszenz einer Probe, inbesondere zur medizinisch-analytischen Bestimmung der Konzentration eines Bestandteils einer Körperflüssigkeit - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Gerät zur Messung der Fluores­ zenz einer Probe, bei dem ein Anregungslichtstrahl von einer Anregungslichtquelle entlang entlang einem Anre­ gungslichtweg auf die Probe gerichtet und die Intensität des von der Probe ausgehenden entlang einem Detektions­ lichtweg auf einen Photodetektor fallenden Fluoreszenz­ lichts bestimmt wird.

Fluoreszenz-Meßgeräte werden für unterschiedliche Anwen­ dungszwecke benötigt. Die Erfindung befaßt sich insbeson­ dere mit der medizinisch-analytischen Bestimmung der Kon­ zentration eines Bestandteils einer Körperflüssigkeit ("klinische Chemie") mit Hilfe eines Analyseelementes. Das Analyseelement enthält - üblicherweise in einer oder mehreren Testschichten aus einem absorbierenden Material, wie beispielsweise Papier - ein Reagenzsystem. Um die Kon­ zentration eines für medizinische Zwecke wesentlichen Be­ standteils einer Körperflüssigkeit zu bestimmen, wird diese mit dem Analyseelement in Kontakt gebracht. Die Re­ aktion der Körperflüssigkeit mit dem Analyseelement führt zu einer für die Konzentration des Bestandteils charakte­ ristischen Fluoreszenz in einem Nachweisbereich des Ana­ lyseelementes, welche genau gemessen werden muß, um die gewünschte Konzentration bestimmen zu können. In der Pra­ xis werden solche Analyseelemente und die Fluoreszenz- Meßgeräte zu ihrer Auswertung genau aufeinander abge­ stimmt und in der Regel vom gleichen Hersteller (als "Analysesystem") angeboten.

Solche Systeme bestehend aus Analyseelementen und einem Fluoreszenz-Meßgerät für immunchemische Analysen werden in dem Artikel "Immunoassays with Time-Resolved Fluorescence Spectroscopy: Principles and Applications" von E.B. Diamandis beschrieben, welcher in Clinical Bio­ chemistry, 1988, 139-150, veröffentlicht ist. Darin wer­ den zwei kommerziell erhältliche Systeme miteinander verglichen. Die Fluoreszenz-Meßgeräte weisen dabei je­ weils eine energiereiche Lichtquelle, nämlich im einen Fall eine Xenon-Blitzlampe, im anderen Fall einen Stick­ stofflaser, auf. Die besonderen Probleme, die mit der Fluoreszenzmessung für die genannten analytischen Zwecke verbunden sind, werden eingehend geschildert. Insbeson­ dere wird darauf hingewiesen, daß das sehr kleine Fluo­ reszenzsignal von verschiedenen Störlichtsignalen ge­ trennt werden muß, die vor allem auf das Anregungslicht zurückzuführen sind. Hierzu gehört die Streuung des Anre­ gungslichtes sowie die Hintergrundfluoreszenz der Küvet­ ten, der optischen Elemente und der Probe. Die Lichtin­ tensität dieser Störquellen ist um viele Größenordnungen höher als die des zu messenden Fluoreszenzlichts selbst. Um das Nutzsignal von den Störsignalen abzutrennen, wird ein aufwendiges optisches System verwendet, welches u. a. Interferenzfilter und einen Flüssigfilter aufweist.

Dieser hohe technische Aufwand ist bei Analysegeräten für klinisch-chemische Labors tolerierbar. In der medizini­ schen Analytik gibt es jedoch zahlreiche Anwendungsfälle, bei denen ein Analysesystem dezentral in der einzelnen Arztpraxis zur Verfügung stehen soll. Im Rahmen des "home-monitoring" werden darüberhinaus zunehmend Analy­ sesysteme auch vom Patienten selbst eingesetzt, um seinen Gesundheitszustand zu überwachen. Für derartige Anwen­ dungsfälle sind die bisher bekannten Fluoreszenz-Meßge­ räte wegen ihrer großen Abmessungen, ihres hohen Ge­ wichtes und vor allem wegen der durch den hohen konstruk­ tiven Aufwand bedingten Kosten nicht geeignet. Die auf diesen Anwendungsgebieten eingesetzten Analysesysteme ba­ sieren auf meßtechnisch wesentlich einfacheren optischen Meßverfahren, insbesondere der Photometrie.

Die Fluoreszenzmessung hat gegenüber der Photometrie je­ doch große potentielle Vorteile. Insbesondere kann eine außerordentlich hohe Empfindlichkeit der Analyse erreicht werden, wenn es gelingt, das Fluoreszenzlicht mit ausrei­ chender Genauigkeit zu bestimmen.

Medizinisch-analytische Verfahren, bei denen das von fluoreszierenden Molekülen ausgehende Fluoreszenzlicht bestimmt werden muß, haben wegen ihrer Vorteile, vor al­ lem wegen ihrer Empfindlichkeit, auf vielen Gebieten der klinischen Chemie und Biochemie Anwendung gefunden. Hierzu gehören beispielsweise der Fluoreszenz-Immunoassay (FIA), die Fluoreszenzmikroskopie und die fluoreszenzak­ tivierte Zellsortierung (FACS). Die Erfindung richtet sich auf alle derartigen Verfahren, soweit die Intensität des Fluoreszenzlichts als Meßsignal bestimmt wird, nicht jedoch auf Fluoreszenzpolarisations-Immunoassays (FPIA), für die andere meßtechnische Verhältnisse gelten.

Allgemein werden bei Analysesystemen zunehmend kleinere Probenvolumina verwendet. Die räumliche Ausdehnung des Nachweisbereichs des Analyseelementes, in dem das Fluo­ reszenzsignal gemessen werden soll, ist dadurch extrem klein. Meist handelt es sich nicht um eine konventionelle Fluoreszenz-Küvette, sondern der Nachweisbereich, dessen Fluoreszenz gemessen werden soll, wird von der diffus reflektierenden Oberfläche einer Testschicht des Analyse­ elementes gebildet. Demzufolge ist eine Reflexions-Fluo­ reszenzmessung (welche auch als "front face" bezeichnet wird) erforderlich. Hieraus resultieren zusätzliche meß­ technische Probleme.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Fluo­ reszenz-Meßgerät zu schaffen, welches für hoch­ empfindliche medizinische Analysen geeignet ist, insbe­ sondere die Detektion sehr geringer Konzentrationen von fluoreszierenden Molekülen ermöglicht und dennoch so ein­ fach und kostengünstig herstellbar und so klein und leicht ist, daß es für die Arztpraxis oder home-monito­ ring-Anwendungen geeignet ist.

Die Aufgabe wird bei einem Gerät der eingangs bezeichne­ ten Art dadurch gelöst, daß in dem aus Anregungslichtweg und Detektionslichtweg bestehenden Gesamtlichtweg minde­ stens ein Polarisationsfilter angeordnet ist, um Stör­ licht zu unterdrücken. Das Störlicht kann dabei aus ver­ schiedenen Anteilen bestehen, insbesondere geht es um ge­ streutes oder reflektiertes Licht der Anregungslicht­ quelle.

Bevorzugt ist die Anregungslichtquelle eine Laserdiode. Die Verwendung von Laserdioden als Anregungslichtquellen für Fluoreszenzmessungen wird in den folgenden wissen­ schaftlichen Publikationen beschrieben:

T. Imasaka, A. Yoschitake, and N. Ishibashi, "Semiconductor laser fluorimetry in the near-infrared region", Anai. Chem., Vol. 56, pp. 1077-1079 (1984).

T. Imasaka and N. Ishibashi, "Semiconductor laser fluorimetry: a review", Amer. Biotechnol. Lab., Vol. 6 (nr. 8), pp. 34-35 (1988).

T. Imasaka, A. Tsukamoto, and N. Ishibashi, "Visible semiconductor laser fluorometry", Anal. Chem., Vol. 61, pp. 2285-2288 (1989).

P.A. Johnson, T.E. Barber, B.W. Smith, and J.D. Winefordner "Ultralow detection limits for an organic dye determined by fluorescence spectroscopy with laser diode excitation", Anal. Chem., Vol 61, pp. 861-863 (1989).

Durch die Verwendung einer Laserdiode wird eine bedeu­ tende Kostenreduzierung erreicht. In den genannten Publi­ kationen werden jedoch weiterhin aufwendige optische Ele­ mente eingesetzt, um die Selektion des gesuchten Fluores­ zenzsignals aus den Störlichtanteilen zu gewährleisten. Insbesondere werden optische Monochromatoren und Interfe­ renzfilter verwendet, um durch eine scharfe Wellenlängen­ selektion die Lichtwellenlänge des Anregungslichtes na­ hezu vollständig abzutrennen und praktisch nur die Wel­ lenlänge des gesuchten Fluoreszenzsignals zum Detektor gelangen zu lassen. Derartige Bauteile können bei den An­ wendungszwecken, auf die sich die vorliegende Erfindung richtet, jedoch nicht eingesetzt werden.

Im Rahmen der Erfindung wurde festgestellt, daß durch die Verwendung von Polarisationsfiltern im Anregungs­ und/oder Detektionslichtweg auf sehr einfache Weise eine so wesentliche Verbesserung der Relation zwischen Nutz­ signal und Störsignal (meßtechnisch ausgedrückt des Signal/Rausch-Verhältnisses) erreicht werden kann, daß fluoreszierende Moleküle mit einer für praktische Zwecke ausreichenden Empfindlichkeit und Genauigkeit gemessen werden können. Dies gilt vor allem in Kombination mit den nachfolgend näher erläuterten bevorzugten Maßnahmen.

Im allgemeinen sollte ein Polarisationsfilter zumindest im Detektionslichtweg angeordnet sein. Eine weitere Ver­ besserung des Signal-Rauschverhaltens wird erreicht, wenn (auch) im Anregungslichtweg ein Polarisationsfilter vor­ gesehen ist. Dies gilt insbesondere auch für den Fall, daß die Anregungslichtquelle eine Laserdiode ist, wobei deren Laserlicht polarisiert ist und der im Anregungs­ lichtweg angeordnete Polarisationsfilter parallel zur Po­ larisationsebene des Laserlichts polarisiert. Wenn zwei Filter verwendet werden, sollten ihre Polarisationsebenen näherungsweise senkrecht zueinander verlaufen.

Vorzugsweise ist das erfindungsgemäße Gerät so ausgebil­ det, daß es sich zur Messung der Oberflächenfluoreszenz einer Probe mit einer diffus reflektierenden Oberfläche eignet. Meßtechnisch ist eine "front-face"-Anordnung vor­ teilhaft, weil die geringere Selbstabsorption zu einem größeren Dynamikbereich führt. Dabei verlaufen der Anre­ gungslichtweg und der Detektionslichtweg schräg zu der fluoreszierenden Oberfläche, wobei die Winkel so gewählt sind, daß der Einfallswinkel ungleich dem Ausfallswinkel ist (d. h. die Spiegelbedingung wird vermieden). In diesem Fall ist das Anregungslicht bevorzugt parallel zu der durch den Anregungslichtweg und den Detektionslichtweg gebildeten Lichtwegebene polarisiert. Bei Verwendung einer Anregungslichtquelle, die polarisiertes Licht emittert (Laser), kann dies durch entsprechend Orientie­ rung der Lichtquelle selbst erreicht werden. Bei einer nichtpolarisierten Anregungslichtquelle wird in den Anre­ gungslichtweg ein entsprechender Polarisationsfilter ein­ gesetzt. Wie erwähnt kann es auch zweckmäßig sein, beides zu kombinieren.

Besonders vorteilhaft ist die Erfindung auch bei der Mes­ sung der Fluoreszenz einer Probe in einer Mikroküvette, wobei vorzugsweise eine Küvette mit rechteckigem Quer­ schnitt und einer kleineren Kantenlänge von beispiels­ weise etwa 2 mm so angeordnet wird, daß der Anregungs­ lichtstrahl durch die Schmalseite eindringt. Auch eine sogenannte Transflexions-Anordnung, bei der das Anre­ gungslicht schräg auf die Breitseite einer Rechteck- Küvette gerichtet und das aus der gleichen Breitseite austretende Fluoreszenzlicht gemessen wird, kann vorteil­ haft verwendet werden.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weist das Gerät einen Fluoreszenzstandard auf, auf den der An­ regungslichtweg alternativ zu der Probe gerichtet werden kann. Dies kann beispielsweise mittels einer beweglichen Probenhalterung geschehen, die den Standard alternativ zu der Probe in den Anregungslichtweg schiebt oder dreht. Selbstverständlich kann jedoch auch der Anregungslichtweg mit Hilfe eines in den Strahlengang geschobenen Spiegels oder dergleichen alternierend auf den Standard und die Probe gerichtet werden. Diese Ausführungsform ist von be­ sonderer Bedeutung bei der Fluoreszenzmessung an Analyse­ elementen, deren Fluoreszenzsignal in einem Nachweisbe­ reich - wie weiter oben erläutert - für die gesuchte Kon­ zentration eines Analyten in einer Probe charakteristisch ist. Durch Vergleich der an dem Analyseelement und an dem Standard gemessenen Meßwerte wird ein langzeitstabiler geräteunabhängiger Fluoreszenzmeßwert gewonnen. Dadurch ist es möglich, die gesuchte Konzentration des Analyten aus dem Fluoreszenzmeßwert mit Hilfe einer in dem Gerät elektronisch abgespeicherten Kalibrationskurve unmittel­ bar zu bestimmen. Dadurch entfallen die bei bisherigen Fluoreszenz-Meßgeräten für das klinische Labor üblichen umständlichen Kalibrationsmessungen mit Hilfe von Eich­ proben, die den Analyt in bekannter Konzentration enthal­ ten.

Die Erfindung wird im folgenden anhand eines in den Figu­ ren schematisch dargestellten Ausführungsbeispiels näher erläutert; es zeigt

Fig. 1 die Meßoptik eines erfindungsgemäßen Fluores­ zenz-Meßgerätes in einer perspektivischen Prin­ zipdarstellung,

Fig. 2 eine perspektivische Prinzipdarstellung des von einer Laserdiode ausgehenden Lichts,

Fig. 3 bis 5 Prinzipdarstellungen zur Erläuterung be­ vorzugter Fertigungsmaßnahmen bei der Herstel­ lung eines erfindungsgemäßen Gerätes.

Fig. 1 zeigt in-einer perspektivischen Prinzipdarstel­ lung die Optikeinheit 10 eines erfindungsgemäßen Fluores­ zenz-Meßgerätes mit dem aus dem Anregungslichtweg 11a und dem Detektionslichtweg 11b bestehenden Gesamtlichtweg 11.

Als Anregungslichtquelle 13 dient eine Laserdiode 14, die in einem Thermoelektrik-Modul 15 sitzt. Dieser enthält Peltier-Elemente in thermischem Kontakt mit der Laserdi­ ode 14, um deren Temperatur zu kontrollieren. Der Peltier-Strom wird mit Hilfe eines PI-Reglers in Abhän­ gigkeit vom Signal eines Temperatursensors geregelt, um die Temperatur der Laserdiode konstant zu halten. In ei­ ner praktischen Ausführungsform wurde eine Temperaturkon­ stanz von 10 mK/h erzielt.

Der Strom, der die Laserdiode speist, wird in üblicher Weise geregelt. Die Temperaturregelung und (in geringem Ausmaß) die Stromregelung können - wie ebenfalls bekannt ist - dazu verwendet werden, die Emissionswellenlänge der Laserdiode innerhalb bestimmter Grenzen zu variieren.

Im Anregungslichtweg 11a befindet sich zwischen der Anre­ gungslichtquelle 13 und der Probe 17 eine Lochblende 18, ein Farbglasfilter 19 und ein Polarisationsfilter 20.

Die fluoreszierende Probe 17 ist der Nachweisbereich (21) eines Analyseelementes, das ein Reagenzsystem enthält, dessen Reaktion mit einer Körperflüssigkeit zu einer für die Konzentration eines darin enthaltenen Analyten cha­ rakteristischen Fluoreszenzsignals führt. In der Figur ist vereinfachend lediglich eine rechteckige Fläche als Nachweisbereich 21 dargestellt. In der Praxis kann ein Analyseelement beispielsweise als Teststreifen mit einer langgestreckten Tragschicht und darauf angebrachten Test­ schichten oder als sogenannter "Analyse-Chip" ausgebildet sein, der ähnlich einem photographischen Diapositiv in einem Rahmen ein (mehrschichtiges) Testfeld enthält, in dem die Reagenzien enthalten sind. Im Rahmen der vorlie­ genden Erfindung ist nur wichtig, daß die Reaktion der Probe mit den in dem Analyseelement enthaltenen Reagen­ zien zu einem für den gesuchten Analysewert charakteri­ stischen Fluoreszenzsignal in einem Teilbereich des Ana­ lyseelementes (nämlich dem Nachweisbereich) führt, wel­ ches mit dem erfindungsgemäßen Fluoreszenz-Meßgerät ge­ messen wird.

Der Nachweisbereich 21 besteht aus einem saugfähigen po­ rösen Matrixmaterial, wie beispielsweise Papier, einem Fließ oder porösem Kunststoff. Alle diese Materialien sind optisch nicht transparent, sondern reflektieren auf­ treffendes Licht diffus. Dementsprechend ist eine reflek­ tierende oder "front face"-Fluoreszenzmessung erforder­ lich.

Das von der Oberfläche 22 der Probe 17 ausgehende Fluo­ reszenzlicht fällt entlang dem Detektionslichtweg 11b auf einen Photodetektor 23, der im dargestellten bevorzugten Fall ein Photomultiplier 26 ist. In dem Detektionslicht­ weg 11b ist ein zweiter Polarisationsfilter 24 und ein zweiter Farbglasfilter 25 angeordnet.

In der Prinzipdarstellung von Fig. 1 sind die mechani­ schen Elemente, die die einzelnen Bauteile halten, der Übersichtlichkeit halber nicht dargestellt. Sie sind kon­ ventionell ausgebildet. Bevorzugt läuft der Gesamtlicht­ weg 11 durch drei voneinander durch Trennwände getrennte Kammern, nämlich eine Anregungslicht-Kammer, eine Proben­ kammer und eine Detektorkammer. Auch dies ist bei ent­ sprechenden Geräten üblich.

Die Probe 17 enthält fluoreszierende Moleküle, welche bei Bestrahlung mit Licht einer entsprechenden Anregungswel­ lenlänge ein Fluoreszenzlicht mit niedrigerer Wellenlänge abstrahlen. Die Differenz zwischen dem Maximum des Anre­ gungsspektrums (d. h. der Lichtwellenlänge mit maximaler Anregungsintensität) und dem Maximum des Emissionsspek­ trums (d. h. der intensitätsstärksten Wellenlänge des Fluoreszenzlichtes) wird als Stokes-shift bezeichnet.

Die Intensität des von der Probe 17 erzeugten Fluores­ zenzlichtes ist ein Maß für die Konzentration der fluoreszierenden Moleküle, welche wiederum für die Kon­ zentration eines zu bestimmenden Analyten einer Körper­ flüssigkeit charakteristisch ist. Die Genauigkeit und Empfindlichkeit der Analyse hängt deswegen davon ab, daß der Photodetektor 23 das Fluoreszenzlicht der Probe 17 (d. h. das Nutzsignal) möglichst ungestört empfängt. Stör­ lichtanteile (die man insgesamt als Rauschsignal bezeich­ nen kann) sollen möglichst weitgehend unterdrückt werden. Zu diesem Zweck werden bei dem dargestellten Gerät ver­ schiedene Maßnahmen miteinander kombiniert.

Zunächst erfolgt eine Raumwinkelselektion des von der La­ serdiode 14 ausgehenden Lichts mit Hilfe der Lochblende 18. Dies wird anhand von Fig. 2 verdeutlicht.

Die Laserdiode 14 strahlt neben dem für die Anregung der Fluoreszenz in der Probe 17 verwendeten Laserlicht unver­ meidlich auch Spontanemissionslicht aus, welches dem Licht einer normalen Leuchtdiode entspricht. Das Spon­ tanemissionslicht hat unter normalen Betriebsbedingungen zwar eine wesentlich geringere Amplitude als das Laser­ licht, führt aber - wie im Rahmen der Erfindung festge­ stellt wurde - gleichwohl zu einer erheblichen Störung vor allem wegen seines breiten Spektrums, welches zwangsläu­ fig auch Anteile im Bereich der Wellenlänge des Fluores­ zenzlichts der Probe enthält.

Bei der Raumwinkelselektion macht man sich die Tatsache zunutze, daß das Laserlicht praktisch ausschließlich in einem engen Winkel begrenzt nach vorne abgestrahlt wird (Kegel 28 in Fig. 2), während das Spontanemissionslicht 29 in einem wesentlich breiteren Winkel von der Laserdi­ ode 14 ausgeht. Infolgedessen wird durch die als Strahl­ begrenzungselement 30 wirkende Lochblende 18 der Raumwin­ kelanteil ausgeblendet, der vorwiegend das Spontanemissi­ onslicht 29 enthält, während das Laserlicht 27 durch das Loch der Lochblende 18 ungehindert zu der Probe 17 ge­ langt. Die Größe des Raumwinkels, den das Strahlbegren­ zungselement 30 frei läßt, läßt sich empirisch festlegen. Als Richtwert kann man angeben, daß dieser Raumwinkel etwa zwischen 0,02 und 0,3 steradian betragen sollte.

Als zweite Maßnahme der Störlichtunterdrückung erfolgt eine Wellenlängenselektion. Dabei macht man sich die er­ wähnte Stokes-shift, also den Unterschied der Wellenlän­ gen des Anregungslichtes und des emittierten Fluoreszenz­ lichtes zunutze. Da die Stokes-shift verhältnismäßig klein ist, werden zu diesem Zweck üblicherweise optische Filter mit hoher Flankensteilheit, insbesondere Interfe­ renzfilter eingesetzt. Mit Hilfe eines Interferenzfilters im Detektionslichtweg 11b läßt sich das Anregungslicht sehr weitgehend abtrennen, so daß ein gutes Signal/Rauschverhältnis erreicht wird. Ein Interferenzfilter kann jedoch für die Anwendungszwecke, auf die sich die Erfindung in erster Linie richtet, wegen der hohen Kosten nicht eingesetzt werden.

Im Rahmen der Erfindung wurde festgestellt, daß mit Hilfe eines einfachen und kostengünstigen Farbglasfilters in Kombination mit den übrigen erfindungsgemäßen Maßnahmen ausgezeichnete Signal/Rauschverhältnisse und infolgedes­ sen sehr gute Analyseempfindlichkeiten erreicht werden können. Dabei wird vorzugsweise im Anregungslichtweg ein Farbglasfilter 19 eingesetzt, der zu kürzeren Wellenlän­ gen hin öffnet und zu längeren hin sperrt. Beispielsweise wurde bei einer Wellenlänge des Anregungslichtes von 676 nm ein Blaufilter eingesetzt.

In dem Detektionslichtweg 11b wird vorzugsweise ein Farb­ glasfilter 25 verwendet, welches zu höheren Wellenlängen hin öffnet und zu kürzeren hin sperrt. Für den vorerwähn­ ten Beispielsfall wurde ein Rotfilter erfolgreich einge­ setzt, welches bei 715 nm eine Transmission von 50% hat.

Die Auswahl geeigneter Farbglasfilter läßt sich experi­ mentell treffen. Als allgemeine Regel kann man dabei da­ von ausgehen, daß die Transmission bei der Anregungswel­ lenlänge sowohl für den detektionsseitigen Farbglasfilter 25, als auch für den anregungsseitigen Farbglasfilter 19 verhältnismäßig niedrig, vorzugsweise unter 30% liegen sollte. Es können auch mehrere (gleiche oder ungleiche) Farbglasfilter in jedem Teil des Lichtweges kombiniert werden.

Im Hinblick auf die Wellenlängenselektion ist es vorteil­ haft, eine Laserdiode einzusetzen, welche weitestgehend monomode (einmodig) arbeitet und demzufolge Laserlicht mit einem extrem schmalbandigen Spektrum emittiert.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird die Raumwinkel­ selektion und die Wellenlängenselektion durch eine Pola­ risationsselektion ergänzt.

Die Laserdiode 14 emittiert polarisiertes Licht, wobei ihre Polarisationsrichtung (Pfeile 32) parallel zu der durch den Anregungslichtweg 11a und den Detektionslicht­ weg 11b gebildeten Lichtwegebene verläuft. Dadurch wird, vor allem bei einer diffus reflektierenden Probe 17, eine verbesserte Unterdrückung von spiegelnder Reflexion er­ reicht.

Obwohl die Laserdiode 14 polarisiertes Licht aussendet, ist vorzugsweise zusätzlich im Anregungslichtweg 11a der Polarisator 20 angeordnet, dessen Polarisationsrichtung 32 mit der Polarisationsrichtung der Anregungslichtquelle 13 übereinstimmt. Zunächst erscheint es nachteilig, das Licht einer polarisierten Lichtquelle nochmals durch einen Polarisationsfilter zu schicken, weil damit notwen­ digerweise ein Intensitätsverlust verbunden ist. Überra­ schenderweise hat sich dies jedoch als vorteilhaft erwie­ sen, weil durch den zusätzlichen Polarisationsfilter 20 die Störungen durch Spontanemissionslicht der Laserdiode 14 nochmals vermindert werden.

Der Polarisator 24 in dem Detektionslichtweg 11b polari­ siert etwa senkrecht zu der Polarisationsrichtung 32 des Anregungslichtwegs 11a (Pfeil 33). In der Praxis können sich jedoch geringfügige Verschiebungen ergeben, so daß die exakte optimale Orientierung des detektionsseitigen Polarisationsfilters 24 empirisch bestimmt werden sollte.

Wie erwähnt sollte der Winkel α, unter dem der Anregungs­ lichtweg 11a zu der Oberfläche 22 der Probe 17 orientiert ist, verschieden sein von dem Winkel β, unter dem der De­ tektionslichtweg 11b zu der Oberfläche 22 orientiert ist. In Fig. 1 ist gestrichelt ein Hilfsgitter 34 eingezeich­ net, welches senkrecht zu der von dem Anregungslichtweg 11a und dem Detektionslichtweg 11b aufgespannten Licht­ wegebene orientiert ist und dessen obere Begrenzung 34a die Projektion der Flächennormalen der Flächen 22 auf die Lichtwegebene ist. Der Winkel α zwischen dem Anregungs­ lichtweg 11a und dieser Projektion 34a liegt vorzugsweise zwischen 0° und 30°. Der Winkel β zwischen der Achse des Detektionslichtwegs 11b und der Projektion 34a sollte stets größer sein als α und zwar in der Regel um 10° bis 50° größer.

Um Störungen durch spiegelnde Reflexion möglichst weitge­ hend zu unterdrücken, ist die Oberfläche 22 der Probe 17 zusätzlich - wie dargestellt - derartig geneigt, daß sie die Lichtwegebene nicht senkrecht schneidet. Bevorzugt beträgt der Winkel zwischen dem Lot auf die Oberfläche 22 und der Projektion 34a etwa 10° bis 30°.

Wie erwähnt, ist die erfindungsgemäße Vorrichtung vor­ zugsweise so ausgebildet, daß ein Fluoreszenzstandard al­ ternativ zu der Probe in den Anregungslichtweg 11a ge­ bracht werden kann. Zu diesem Zweck ist bei der darge­ stellten Ausführungsform der Probenhalter 36, an dem die Probe 17 befestigt ist, um 180° rotierbar. Auf der in der Figur nicht dargestellten Rückseite des Probenhalters 36 befindet sich ein Fluoreszenzstandard 37. Es sollte sich dabei um ein möglichst probenanaloges Material handeln, d. h. im Falle einer diffus reflektierenden Probe 17 sollte auch der Fluoreszenzstandard 37 diffus reflektie­ ren und zwar mit ähnlicher Intensität wie die Probe 17. Vorzugsweise sollten auch die Abmessungen der Probe 17 und des Standards 37 übereinstimmen.

Der Fluoreszenzstandard 37 hat die Aufgabe, unabhängig von den spezifischen Besonderheiten des einzelnen Gerätes und selbstverständlich unabhängig von eventuellen Ände­ rungen in den Charakteristika der verwendeten optischen Elemente reproduzierbare Fluoreszenzmeßwerte - jeweils be­ zogen auf den Standard 37 - zu ermöglichen. Damit diese Meßwerte zwischen unterschiedlichen Geräten auch über lange Zeiträume übereinstimmen, muß der Fluoreszenzstan­ dard 37 in einer für viele Geräte ausreichenden Menge re­ produzierbar herstellbar sein und langfristig konstant stets die gleiche Fluoreszenzemission liefern.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde festgestellt, daß diese Bedingungen besonders gut mit Hilfe eines Stan­ dards auf Basis von Rubinpulver erfüllt werden können. Um einen solchen Standard herzustellen, wird synthetischer Rubinkristall in einem Wolfram-Karbid-Mahlwerk fein ge­ mahlen und in Fraktionen unterschiedlicher Korngröße ge­ trennt. Als optimal hat sich ein Pulver in einem Durch­ messerbereich zwischen 50 und 70 µm erwiesen. Das Rubin­ pulver wird intensiv mit etwa dem doppelten Volumen an Wasserglas gemischt und auf eine Glasoberfläche gesprüht. Es entsteht eine diffus-transluzente Beschichtung, die mit hoher Stabilität stets das gleiche Fluoreszenzlicht emittiert.

Um die Intensität der Fluoreszenz des Standards den Er­ fordernissen anzupassen, hat es sich als vorteilhaft er­ wiesen, das Rubinpulver mit einer nichtfluoreszierenden Matrix aus Quarzstaub zu verdünnen. Alternativ oder zu­ sätzlich kann beispielsweise ein Graufilter zur Anpassung der Intensität eingesetzt werden.

In Ergänzung zu dem in Fig. 1 dargestellten Aufbau kann optional ein optisches Abbildungssystem sowohl im Anre­ gungslichtweg 11a, als auch im Detektionslichtweg 11b vorgesehen sein. Auf der Anregungsseite können optische Elemente vorteilhaft mit der Leuchtdiode integriert sein (sogenannte "customized laser unit").

Mit dem anhand von Fig. 1 beschriebenen Aufbau einer Op­ tikeinheit konnte bei einem statischen Signal/Rausch­ verhältnis von 1 : 1 und einer Probenmenge von 20 µl eine Konzentrations-Nachweisgrenze von weniger als 1 nmolar (nanomolar) erreicht werden.

Wie erwähnt, sind die Vorzüge der Erfindung vor allem darin zu sehen, daß mit einfachen und preisgünstigen Bau­ elementen insgesamt eine sehr gute Empfindlichkeit der Fluoreszenzmessung und damit eine sehr gute Analyse­ empfindlichkeit erreicht wird. Um die Herstellungskosten entsprechender Geräte zu minimieren, ist selbstverständ­ lich auch wichtig, daß die Montage ohne aufwendige Ju­ stierungsmaßnahmen möglich ist.

Wie in Fig. 3 dargestellt ist, können aus einer entspre­ chend dem Pfeil 40 polarisierten Polarisationsfolie 41 rechteckige Streifen 42 geschnitten werden, die exakt die gleiche Polarisierung (beispielsweise parallel zu ihrer Längskante) haben. Diese Streifen können dann entweder - wie in Fig. 4 dargestellt - insgesamt in ein Gerät einge­ setzt werden, wobei die Orientierung der Streifen zugleich die Orientierung der Polarisierung definiert. Alternativ können sie auch in rechteckige Stücke 43a, 43b unterteilt werden, die - wie in Fig. 5 dargestellt ist - in einer durch ihre Längskanten definierten Position in entsprechende Halterungen im Gerät eingesetzt werden kön­ nen. Falls die Polarisationsrichtung nicht parallel zu der Kante verläuft, kann eine Bezugsmarke 44 vorgesehen sein, die dazu dient, die Lage der Rechtecke eindeutig zu definieren. Im Gegensatz zu den allgemein üblichen runden Polarisationsfiltern oder -folien ist bei diesen Maßnah­ men keine nachträgliche Justierung erforderlich, sondern durch die mechanische Orientierung der Folienstücke in dem Gerät ist zugleich die optische Orientierung der Polarisationsebene definiert.

Claims (12)

1. Gerät zur Messung der Fluoreszenz einer Probe (17) bei dem ein Anregungslichtstrahl von einer Anregungs­ lichtquelle (13) entlang einem Anregungslichtweg (11a) auf die Probe (17) gerichtet und die Intensität des von der Probe (17) ausgehenden, entlang einem De­ tektionslichtweg (11b) auf einen Photodetektor (23) fallenden Fluoreszenzlichts bestimmt wird, dadurch gekennzeichnet, daß in dem aus Anregungslichtweg (11a) und Detektionslichtweg (11b) bestehenden Ge­ samtlichtweg (11) mindestens ein Polarisationsfilter (24) angeordnet ist, um Störlicht zu unterdrücken.

2. Gerät nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Anregungslichtquelle (13) eine Laserdiode (14) ist.

3. Gerät nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch ge­ kennzeichnet, daß ein Polarisationsfilter (24) im De­ tektionslichtweg (11b) angeordnet ist.

4. Gerät nach einem der vorhergehenden Ansprüche, da­ durch gekennzeichnet, daß ein Polarisationsfilter (20) im Anregungslichtweg (11a) angeordnet ist.

5. Gerät nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch ge­ kennzeichnet, daß der Anregungslichtweg (11a) ein Strahlbegrenzungselement (30) aufweist, durch das der vorwiegend spontan emittiertes Licht der Laserdiode (14) enthaltende Raumwinkelanteil (29) eliminiert wird.

6. Gerät nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch ge­ kennzeichnet, daß die Laserdiode (14) im Monomode ar­ beitet.

7. Gerät nach einem der vorhergehenden Ansprüche, da­ durch gekennzeichnet, daß in dem Gesamtlichtweg (11) mindestens ein Farbglasfilter (19; 25) angeordnet ist.

8. Gerät nach einem der vorhergehenden Ansprüche, da­ durch gekennzeichnet, daß es zur Messung der Oberflä­ chenfluoreszenz einer Probe (17) mit einer diffus re­ flektierenden Oberfläche ausgebildet ist.

9. Gerät nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das auf die Oberfläche der Probe auftreffende Anre­ gungslicht parallel zu der durch den Anregungslicht­ weg (11a) und den Detektionslichtweg (11b) gebildeten Lichtwegebene polarisiert ist.

10. Gerät nach einem der vorhergehenden Ansprüche, da­ durch gekennzeichnet, daß es einen langzeitstabilen Fluoreszenzstandard (37) aufweist, auf den der Anre­ gungslichtstrahl alternativ zu der Probe (17) gerich­ tet wird, wobei die Intensität des von dem Fluores­ zenzstandard (37) entlang des Detektionslichtwegs (11b) auf den Photodetektor (23) auftreffenden Fluoreszenzlichts bestimmt wird.

11. Gerät nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Fluoreszenzstandard (37) pulverisierten Rubin enthält.

12. Gerät nach einem der Ansprüche 10 oder 11 zur medizi­ nisch-analytischen Bestimmung der Konzentration eines Bestandteils einer Körperflüssigkeit mit Hilfe eines Analyseelementes, das ein Reagenzsystem enthält, des­ sen Reaktion mit der Körperflüssigkeit zu einer für die Konzentration des Bestandteils charakteristischen Fluoreszenz in einem Nachweisbereich (21) führt, da­ durch gekennzeichnet, daß der durch Vergleich der Fluoreszenz des Nachweisbereichs (21) als fluoreszie­ rende Probe (17) mit der Fluoreszenz des Standards (37) gewonnene Fluoreszenzmeßwert mit Hilfe einer in dem Gerät gespeicherten Kalibrationskurve, welche ge­ räteunabhängig den Zusammenhang zwischen dem Fluores­ zenzmeßwert und der Konzentration des Bestandteils beschreibt, in den gesuchten Konzentrationsmeßwert umgerechnet wird.