DE4217101A1

DE4217101A1 - Oberflächenmodifiziertes anorganisches oxidisches Material für die Chromatographie, Herstellungsverfahren und Verwendung

Info

Publication number: DE4217101A1
Application number: DE19924217101
Authority: DE
Inventors: Birger Dr Anspach
Original assignee: GESELLSCHAFT fur BIOTECHNOLOGISCHE FORSCHUNG MBH (GBF) 38124 BRAUNSCHWEIG DE
Current assignee: GESELLSCHAFT fur BIOTECHNOLOGISCHE FORSCHUNG MBH (GBF) 38124 BRAUNSCHWEIG DE
Priority date: 1992-05-22
Filing date: 1992-05-22
Publication date: 1993-11-25

Description

Die Affinitätschromatographie hat sich als die selektivste Methode zur Isolierung von biologisch aktiven Verbindungen erwiesen.

Als Beispiel für heute gebräuchliche Methoden der Addition orga nischer Verbindungen an die Oberfläche von metalloxidischen Mate rialien, speziell Kieselgelen, läßt sich die Umsetzung eines che misch reaktiven Silans mit anorganischen Hydroxylgruppen anfüh ren. Für Anwendungen in der Affinitäts- und Ausschlußchroma tographie werden hierzu größtenteils Alkoxysilane verwendet, die unter Ausbildung einer Siloxanbindung kovalent mit den anorga nischen Hydroxylgruppen reagieren. Durch sterische Hinderung ist die Addition dieser organischen Gruppen nicht quantitativ, und es verbleibt eine Anzahl freier Hydroxylgruppen.

Die Wahl des Lösungsmittels bei der Addition richtet sich primär nach dem eingesetzten funktionellen Silan. Die Umsetzung in wäs seriger Lösung ist allerdings mit fast allen biologisch aktiven Aminoverbindungen möglich. Da außerdem die Reaktionsführung in wässeriger Lösung einfach ist und die Entsorgung nicht quantita tiv umgesetzter Reaktionskomponenten weniger kritisch ist, sieht man diese Methode zur Umsetzung in wasserfreien organischen Lösungsmitteln vor.

Die Immobilisierung niedermolekularer biologisch aktiver Ligan den, wie sie beispielsweise in der Affinitätschromatographie ver wendet werden, führt dabei über ein funktionelles Silan, das in einer ersten Stufe mit einem Kieselgel oder anderen metalloxidi schen Trägern umgesetzt wird. Dieses Silan trägt eine chemisch reaktive Gruppe in omega-Stellung einer Kohlenstoffkette, die mindestens drei Kohlenstoff-Atome umfaßt und bei größeren Ketten längen auch durch Hetero-Atome unterbrochen sein kann. Als reak tive Gruppe wird sehr häufig eine Glycidethergruppe eingesetzt. In einer nachfolgenden Reaktionsstufe wird die biologisch aktive Verbindung, bei der es sich sehr oft um ein primäres oder sekun däres Amin handelt, mit der reaktiven Gruppe umgesetzt. Diese Reaktion ist bei der Verwendung von Siliziumdioxiden auf einen pH-Wert kleiner 8,5 eingeschränkt, da oberhalb dieses pH-Wertes Hydrolyse eintritt. Deshalb liefert diese Methode nur bei der Anwendung von solchen Verbindungen hohe Ligandendichte, die bei diesem pH-Wert eine starke Nucleophilie aufweisen, wie beispiels weise Merkapto-Gruppen und aromatische Amine. Aliphatische Amine werden selbst im Überschuß nur in ganz geringem Umfang gebunden.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein biologisch selektives Material verfügbar zu machen, das beständig und reproduktionsfähig ist. Ferner ist es Aufgabe der Erfindung, ein biologisch selektives Material vorzusehen, das hervorragende chromatographische Eigen schaften besitzt. Die Aufgabe der Erfindung besteht auch darin, ein biologisch selektives Material vorzusehen, das einfach und ohne große Kosten hergestellt werden kann. Das erfindungsgemäße biologisch selektive Material soll sich durch hohe Liganden dichten auszeichnen.

Dazu wird gemäß einer Ausführungsform der Erfindung ein ober flächenmodifiziertes anorganisches oxidisches Material für die Chromatographie vorgesehen, das dadurch herstellbar ist, daß man stufenweise

a) in einem wässerigen Medium ein Alkoxysilan, das in omega- Stellung zum Silizium-Atom eine Epoxidgruppe besitzt, mit einer Verbindung der Formel H-NRR′ umsetzt, in der R und R′ einen Alkyl-, Aryl- oder Acylrest bedeuten, die gleich oder verschieden sein können, und R auch ein Wasserstoff-Atom bedeuten kann, und mit Hilfe dieser Verbindung in das Alkoxysilan eine N-haltige Gruppe einführt, die in an sich bekannter Weise bei der Chromato graphie als Ligand dienen kann,
b) das Produkt der Umsetzung gemäß (a) in an sich bekannter Weise mit einem anorganischen oxidischen und für die Chromato graphie üblichen Trägermaterial umsetzt und
c) das Produkt der Umsetzung gemäß (b) nach Abtrennen des wässe rigen Mediums einer Wärmenachbehandlung unterwirft und stabi lisiert.

Dazu kann man ein Trägermaterial aus der durch Siliziumdioxid und Metalloxide, die mit Silizium Mischoxide bilden, wie Aluminium oxid, Titandioxid und Zirkondioxid, gebildeten Gruppe verwenden.

Das erfindungsgemäße Material kann dadurch herstellbar sein, daß man ein Alkoxysilan der folgenden Formel verwendet:

worin R¹ eine Methoxy- oder Ethoxygruppe ist,
R² eine C_1-3-Alkylgruppe ist und
A eine C_0-5-Alkylenoxygruppe ist, beispielsweise eine -(CH₂)₃-O- Gruppe.

Die Stufe (a) kann man in stark alkalischem Bereich durchführen, beispielsweise bei einem pH-Wert im Bereich von 10 bis 13 und insbesondere von 11 bis 12.

Die Stufe (b) kann man im schwach alkalischen bis leicht sauren Bereich durchführen, beispielsweise bei einem pH-Wert im Bereich von 2 bis 8,5, insbesondere 2 bis 6 und vorzugsweise 3 bis 5.

Stufe (b) kann bei erhöhter Temperatur durchführt werden.

Stufe (c) kann man bei einer Temperatur im Bereich von 100 bis 160°C und insbesondere 120 bis 150°C durchführen.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Ver fahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Materials vorgese hen, wobei das Verfahren durch die vorstehend angeführten Merk male gekennzeichnet ist.

Bei der Herstellung des oberflächenmodifizierten erfindungsge mäßen Materials kann man zuerst eine Verbindung, die eine primäre oder sekundäre Aminogruppe aufweist, zum Beispiel Glycin oder Iminodiessigsäure, mit einem funktionellen Silan, beispielsweise Glycidoxypropyltrimethoxysilan, in stark alkalischer wässeriger Lösung umsetzen. Danach kann man die Lösung mit einer Säure ver setzen, beispielsweise HCl, so daß die Lösung leicht sauer ist. Die erhaltene Lösung kann man mit einer hinreichenden Menge eines anorganischen Materials, beispielsweise Siliziumdioxid, Alumi niumoxid, Titanoxid oder Zirkonoxid, umsetzen, so daß die maximal mögliche Anzahl anorganischer Hydroxylgruppen reagiert. Das ge trocknete oberflächenmodifizierte Material kann man danach einer Temperaturbehandlung unterziehen, um die Stabilität des Materials insbesondere in wässeriger Lösung zu verbessern.

Das erfindungsgemäße Material läßt sich für Chromatographie ver wenden, beispielsweise zum Trennen niedermolekularer oder hoch molekularer Verbindungen. So ist das erfindungsgemäße Material in hervorragender Weise beispielsweise in Form chromatographischer Füllkörper, beispielsweise zur Trennung von Proteinen, Poly peptiden und anderen biologisch aktiven Verbindungen geeignet.

Im folgenden wird die Erfindung unter Bezugnahme auf die Zeichnungen beschrieben.

Fig. 1 zeigt das Reaktionsschema der Erfindung,

Fig. 2 zeigt die Retention von Aminosäuren an einem Chelatbildner,

Fig. 3 zeigt die Retention von Standardproteinen am Chelatbildner.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern.

Beispiel 1

1,35 g Natriumhydroxid werden in 25 ml destilliertem Wasser gelöst und 0,9 g Iminodiessigsäure in die alkalische Lösung eingewogen. In einem Eiswasserbad werden 1,6 g Glycidoxypropyltrimethoxysilan unter Rühren zugetropft. Das Eiswasser wird anschließend entfernt und 4 Stunden bei Raumtemperatur weitergerührt. Das Reaktionsgefäß wurde dann in ein 333 K warmes Bad überführt und die Reaktionsmischung über Nacht weitergerührt. Im Laufe dieser Reaktion reagiert das sekundäre Amin der Iminodiessigsäure mit dem Epoxid unter Ausbildung eines tertiären Amins.

Nach Abkühlung der Reaktionslösung auf Raumtemperatur wird diese mit 25%-iger Salzsäure auf pH 3,5 angesäuert und 5 g Polygosil 500-1525 (von Xacherey-Nagel, Düren) zugegeben. Die Suspension wird am Wasserstrahlvakuum 2mal entgast und bei 368 K Badtemperatur 3 Stunden gerührt, wobei ein Großteil der Hydroxylgruppen an der Oberfläche von Polygosil mit dem Silan unter Ausbildung von Siloxangruppen reagiert. Das so modifizierte Polygosil wurde in einem Sinterglastrichter isoliert, 3mal mit Wasser gewaschen und in einem Vakuumexikkator getrocknet.

Nach der Trocknung wurde das modifizierte Polygosil in ein evakuierbarbares Gefäß überführt, auf 20 Pa evakuiert und einer Temperaturnachbehandlung bei 413 K über 16 Stunden unterzogen. Es darf davon ausgegangen werden, daß bei dieser Temperaturnachbehandlung ein Teil nicht umgesetzter Hydroxylgruppen des Silans mit Hydroxylgruppen an der Oberfläche von Polygosil sowie ein Teil nicht umgesetzter Hydroxylgruppen des Silans untereinander unter Ausbildung von Siloxangruppen reagieren. Ein Diagramm, das das Reaktionsschema mit Iminodiessigsäure illustriert, ist in Fig. 1 dargestellt.

Beispiel 2

Im folgenden werden die Ergebnisse verschiedener Methoden zur Quantifizierung der auf unterschiedlichen chemischen Wegen immobilisierten Liganden miteinander verglichen. Tabelle 1 zeigt die Daten aus der Elementaranalyse und Adsorption von Kupferionen.

Tabelle 1

Ligandendichte nach verschiedenen Methoden an Polygosil 500-1225

Die Ligandendichte aus Daten der Elementaranalyse wurde nach der Methode von Kováts¹ bestimmt. Die Adsorption von Cu²⁺ wurde in 50 mM Acetatpuffer, pH 5,0 bei einer Konzentration von 2-20 mM Cu²⁺ durchgeführt und die verfügbare Ligandendichte aus Daten der Langmuirisotherme berechnet.

Das Material 1 ist nach der konventionellen Methode hergestellt durch Immobilisierung von Iminodiessigsäure an Glymo-modifiziertes Siliciumdioxid. Die Daten der Elementaranalyse täuschen dabei eine erheblich höhere Ligandendichte vor, da ein Großteil der Glycidoxygruppen unter den Reaktionsbedingungen (pH 8,3) nicht reagiert.

Ein nach dem Verfahren von Gimpel et al.² hergestelltes Material wies zwar zu Beginn eine höhere Ligandendichte, aber nur eine geringe Langzeitstabilität auf, wie bereits von dem Autor vermerkt war. Außerdem wies dieses Material von Anfang an Bereiche auf, die selbst für Cu²⁺-Ionen nicht zugänglich waren, wie aus dem Verhältnis von organischem C und Cu²⁺-Adsorption ersichtlich.

Das Material 3, das nach dem hier vorgestellten Verfahren synthetisiert wurde, erwies sich im Gegensatz zu den anderen Methoden als so stabil, daß keine Kapazitätsminderung beobachtet werden konnte. Außerdem wird beim Vergleich der obigen Daten deutlich, daß der größte Teil des Glycidoxypropyltrimethoxysilan, das der Reaktion zugegeben wurde, mit Iminodiessigsäure reagiert hat, d. h. die Ligandendichte aus organischem C und Kupferadsorption sind nahezu identisch.

Beispiel 3

Je etwa 200 mg des Metallchelatbildners aus Beispiel 1 wurden in einzelne 0,5×3 cm ID Säulen zur isokratischen Chromatographie von Aminosäuren gepackt. Diese Säulen wurden dann nacheinander mit jeweils 15 mM CaCl₂-, CoCl₂-, NiCl₂-, CuCl₂- und Fe₂(SO₃)₂-Lösung beladen zur Chromatographie von je 4,8 µg Proben Glycin, Serin, Lysin und Malonsäure sowie 2 µg von Cystein, Histidin, Phenylalanin und Tryptophan verwendet. Eine Chromatographie wurde auch ohne die Anwesenheit eines Metallions durchgeführt. Zur Durchführung der Chromatographie (mit einem Pharmacia LCC 500 PLUS) wurde als Eluierungsmittel ein 25 mM Phosphatpuffer mit einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min verwendet. Die Retention wurde nach der Formel

k′ = (t_R-t₀)/t₀

bestimmt, worin t_R die Retentionszeit der gelösten Substanz und t₀ die Totzeit ist. Die Aminosäuren, die nucleophile Gruppen in der Seitenkette tragen, werden am stärksten retardiert (Tabelle 2 und Fig. 2). Dies deckt sich mit den Erwartungen, die sich auch mit anderen Metallchelatträgern auf der Basis von Iminodiessigsäure verifizieren lassen. Die Wechselwirkungen der verschiedenen Aminosäuren sind am stärksten ausgeprägt mit komplexierten Cu²⁺-Ionen, wie dies auch für andere Chelatbildner beschrieben ist.

Tabelle 2

Zonenanalyse von Aminosäure an Kupferchelaten

Beispiel 4

Jeweils 60 µg Humanserumalbumin, Hundeserumalbumin, Hühnereialbumin, β-Lactoglobulin vom Rind und Ribonuclease A von Rinderpankreas sowie 24 µg Hühnereilysozym und Cytochrom C vom Pferdeherz wurden nacheinander an den gleichen Chelat-gebundenen Metallsalzen untersucht wie in Beispiel 3 beschrieben.

Verwendet wurde das Chromatographieinstrumentarium von Beispiel 2, als Bindungspuffer (A) 25 mM Phosphatpuffer, pH 7,0, als Elutionspuffer (B) zusätzlich 1 M NaCl dem Bindungspuffer zugesetzt. Das Elutionsverhalten der Proteine wurde in einem Gradienten (10 Minuten, linearer Gradient von 0% B zu 50% B, 3 Minuten von 50% B zu 100% B, 2 Minuten 100% B) mit einer Fließmittelgeschwindigkeit von 1 ml/min untersucht. Der Nachweis erfolgte bei A₂₇₈ mit einem LKB 2510 Uvicord SD. Der k′-Wert der Proteine ist in Fig. 3 graphisch dargestellt. Alle Proteine werden an Cu²⁺-beladenen Chelatbildnern auch bei hohen Salzkonzentrationen nicht eluiert. Dies ermöglicht den Einsatz hoher Salzkonzentration zur Adsorption von Proteinen, die Histidin an der Proteinoberfläche tragen, wodurch unspezifische ionische Wechselwirkungen unterbunden werden. Proteine, wie Ribonuclease A, die 2 Histidin-Aminosäuren an der Proteinoberfläche tragen, werden auch an Ni²⁺-beladenen Chelatbildnern nicht eluiert. Dies läßt sich für die spezifische Bindung und Isolierung ebensolcher Proteine ausnutzen.

Beispiel 5

Die Kapazität eines Kupferchelatträgers wurde mit den Testproteinen Hühnereilysozym und Rinderserumalbumin durchgeführt (Tab. 3). Verwendet wurde das Chromatographieinstrumentarium von Beispiel 2, als Bindungspuffer wurde ein 25 mM Phosphatpuffer mit 0,5 M NaCl, pH 7,0 verwendet.

Tabelle 3

Kenngrößen eines Kupferchelatträgers

Literatur
1. J. Gobet, E. sz. Kováts, Ads. Sci. Technol. 1 (1984), 77.
2. M. Gimpel und K. Unger, Chromatographia 16 (1982), 117-125.

Claims

1. Oberflächenmodifiziertes anorganisches oxidisches Material für die Chromatographie, dadurch herstellbar, daß man stufen weise

a) in einem wässerigen Medium ein Alkoxysilan, das in omega- Stellung zum Silizium-Atom eine Epoxidgruppe besitzt, mit einer Verbindung der Formel H-NRR′ umsetzt, in der R und R′ einen Al kyl-, Aryl- oder Acylrest bedeuten, die gleich oder verschieden sein können, und R auch ein Wasserstoff-Atom bedeuten kann, und mit Hilfe dieser Verbindung in das Alkoxysilan eine N-haltige Gruppe einführt, die in an sich bekannter Weise bei der Chroma tographie als Ligand dienen kann,
b) das Produkt der Umsetzung gemäß (a) in an sich bekannter Weise mit einem anorganischen oxidischen und für die Chromato graphie üblichen Trägermaterial umsetzt und
c) das Produkt der Umsetzung gemäß (b) nach Abtrennen des wässerigen Mediums einer Wärmenachbehandlung unterwirft und stabilisiert.

2. Material nach Anspruch 1 , dadurch herstellbar, daß man ein Trägermaterial aus der durch Siliziumdioxid und Metalloxide, die mit Silizium Mischoxide bilden, wie Aluminiumoxid, Titandioxid und Zirkondioxid, gebildeten Gruppe verwendet.

3. Material nach Anspruch 1 oder 2, dadurch herstellbar, daß man ein Alkoxysilan der folgenden Formel verwendet: worin R¹ eine Methoxy- oder Ethoxygruppe ist,
R² eine Ci_1-3-Alkylgruppe ist und
A eine C_0-5-Alkylenoxygruppe ist, beispielsweise eine -(CH₂)₃-O- Gruppe.

4. Material nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch herstellbar, daß man Stufe (a) gemäß Anspruch 1 in stark alka lischem Bereich durchführt, beispielsweise bei einem pH-Wert im Bereich von 10 bis 13 und insbesondere von 11 bis 12.

5. Material nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch herstellbar, daß man Stufe (b) gemäß Anspruch 1 im schwach alka lischen bis leicht sauren Bereich durchführt, beispielsweise bei einem pH-Wert im Bereich von 2 bis 8,5, insbesondere 2 bis 6 und vorzugsweise 3 bis 5.

6. Material nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch herstellbar, daß man Stufe (b) gemäß Anspruch 1 bei erhöhter Temperatur durchführt.

7. Material nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch herstellbar, daß man Stufe (c) gemäß Anspruch 1 bei einer Tempe ratur im Bereich von 100 bis 160°C und insbesondere 120 bis 150°C durchführt.

8. Verfahren zur Herstellung eines Materials gemäß einem der An sprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man stufenweise

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Trägermaterial aus der durch Siliziumdioxid und Metalloxide, die mit Silizium Mischoxide bilden, wie Aluminiumoxid, Titandioxid und Zirkondioxid, gebildeten Gruppe verwendet.

10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Alkoxysilan der folgenden Formel verwendet: worin R¹ eine Methoxy- oder Ethoxygruppe ist,
R² eine C_1-3-Alkylgruppe ist und
A eine C_0-5-Alkylenoxygruppe ist, beispielsweise eine -(CH3)3-O- Gruppe.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekenn zeichnet, daß man Stufe (a) gemäß Anspruch 1 in stark alka lischem Bereich durchführt, beispielsweise bei einem pH-Wert im Bereich von 10 bis 13 und insbesondere von 11 bis 12.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekenn zeichnet, daß man Stufe (b) gemäß Anspruch 1 im schwach alka lischen bis leicht sauren Bereich durchführt, beispielsweise bei einem pH-Wert im Bereich von 2 bis 3,5, insbesondere 2 bis 6 und vorzugsweise 3 bis 5.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 12, dadurch gekenn zeichnet, daß man Stufe (b) gemäß Anspruch 8 bei erhöhter Tempe ratur durchführt.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 13, dadurch gekenn zeichnet, daß man Stufe (c) gemäß Anspruch 8 bei einer Tempera tur im Bereich 100 bis 160°C und insbesondere 120 bis 150°C durchführt.

15. Verwendung des Materials gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 für die Chromatographie.

16. Verwendung nach Anspruch 15 zum Trennen niedermolekularer oder hochmolekularer Verbindungen.